Inleiding tot lichtmicroscopie

De lichtmicroscoop is een instrument dat wordt gebruikt voor het vergroten van onderzoeksspecimens. Lichtmicroscopen zijn een onschatbaar analytisch hulpmiddel waarmee wetenschappelijke onderzoekers objecten tot 1000 keer hun oorspronkelijke grootte kunnen bekijken. Zoals u zult zien, werkt de lichtmicroscoop volgens enkele zeer basisprincipes, maar heeft deze vrijwel onbeperkte toepassingen voor het visualiseren van specimens in het laboratorium.

Zoals de naam al aangeeft, heeft de lichtmicroscoop een lichtbron nodig, die licht produceert dat door een condensorlens op het monster kan worden gefocust.

Het licht dat het preparaat verlicht, bereikt een lens die bekend staat als de objectieflens, die een vergroot beeld creëert dat omgekeerd, of ondersteboven, is. Het oculair, of de oculairlens, vergroot het beeld verder, waarna het door het oog wordt waargenomen. Aanvullende optische elementen kunnen in het lichtpad worden geplaatst om het beeld recht te zetten, zodat het oog het in de juiste oriëntatie ziet. Microscopen die gebruikmaken van meerdere lenzen, zoals degene die u hier ziet, worden samengestelde microscopen genoemd.

Bij een samengestelde microscoop wordt de totale vergroting berekend door de vergroting van de objectieflens te vermenigvuldigen met de vergroting van de oculairlens, of het oculair. Met een 40X objectieflens en een 10X oculairlens is de totale vergroting 400X.

Om te helpen bij het schatten van de grootte van objecten onder de microscoop, kan een oculairreticle worden gebruikt, een schaalverdeling die over het beeld wordt geprojecteerd. Bij een hogere vergroting vertegenwoordigen de streepjes in het oculairreticle kleinere afstanden dan wanneer ze bij lagere vergrotingen worden bekeken.

Naast vergroting is resolutie een ander aspect van de microscoopoptica. Resolutie verwijst naar de kortste oplosbare afstand tussen twee objecten onder de microscoop. Naarmate de koppen van deze tekens steeds duidelijker worden en de resolutie toeneemt, neemt de kortste observeerbare afstand tussen hen af.

De belangrijkste componenten van de lichtmicroscoop zijn de objectieven, de oculieren, de objecttafel en objecthouder, de lichtbron, het veldiafragma, de condensor en diafragma, en de grof- en fijninstelknoppen.

De objectieven zijn verantwoordelijk voor het grootste deel van de vergroting en resolutie van de microscoop. Ze zijn gemonteerd op een draaibare revolver op zo'n manier dat het brandvlak gelijk blijft wanneer de objectieven worden gewisseld – een eigenschap die parafocaliteit wordt genoemd. Een objectief kan zijn gemarkeerd met de vergroting, de numerieke apertuur of N.A., het vereiste type immersievloeistof, de dekglasdikte die gebruikt moet worden bij het monteren van monsters, en de werkafstand - de afstand van de punt van het lenselement tot het brandvlak in het monster.

De numerieke apertuur, aangeduid als N.A., is een maat voor hoe goed een microscoopobjectief licht kan verzamelen. Objectieven met een hoge N.A. laten licht onder schuine hoeken door, terwijl objectieven met een lage N.A. directer licht vereisen. De resolutie van een objectief kan worden berekend op basis van de numerieke apertuur, gegeven de golflengte van het licht.

De lichtbron, het veldiafragma, het diafragma en de condensor zijn gezamenlijk verantwoordelijk voor het produceren van het licht en het geleiden ervan naar het monster.

De lichtbron is doorgaans een halogeenlamp met een laag voltage waarvan de lichtintensiteit kan worden geregeld.

Het licht gaat vervolgens door een reeks filters en in het veldiafragma, dat het te verlichten gebied van het preparaat reguleert.

Vervolgens volgt de condensor, die helder licht op het preparaat focust; de verlichtingskegel rond het preparaat wordt door de condensor geregeld en moet worden aangepast afhankelijk van het gebruikte objectief.

Om het lichtmicroscoop te gebruiken, plaatst u een monster met het interessegebied op de objecttafel van de microscoop, centreert u dit direct boven het objectief en zet u het vast met de klemmen van de objecttafel.

Schakel vervolgens de lichtbron in en schakel over naar het objectief met de laagste vergroting.

Stel daarna het objectief met lage vergroting scherp door het in de z-richting te bewegen met een eerste aanpassing van de grove focusknop, en draai vervolgens aan de fijnfocusknoppen om het object scherp te stellen. Let erop dat het objectief het preparaatglas of de objecttafel niet raakt, omdat dit de lens kan beschadigen.

Lokaliseer vervolgens het interessegebied door door de oculairs te kijken terwijl u aan de knoppen draait om het preparaat in de x- en y-richting te bewegen. De grootte van het gezichtsveld zal drastisch afnemen naarmate u overgaat van een lage naar een hogere vergroting.

Het centreren van het objectief met de laagste vergroting op het interessegebied voordat u overgaat naar een hogere vergroting, vergroot de kansen aanzienlijk om het gewenste specimen te vinden.

Zodra het monster bij lage vergroting is gelokaliseerd en in focus is, schakelt u over naar het objectief met hogere vergroting dat zal worden gebruikt voor het verkrijgen van beelden.

Optimaliseer de lichtkwaliteit door eerst het velddiafragma zo af te stellen dat het diafragma zelf zich net buiten het gezichtsveld bevindt.

Stel vervolgens het condensor-diafragma zo in dat de instellingen overeenkomen met de numerieke apertuur van het gebruikte objectief.

Stel tot slot de focus opnieuw in, ditmaal uitsluitend met de fijnfocusknop.

U bent nu klaar om beelden van uw specimen te maken.

Lichtmicroscopie biedt de mogelijkheid om een breed scala aan preparaten te visualiseren, en er bestaan diverse configuraties van de samengestelde microscoop die geschikt zijn voor vele verschillende toepassingen.

Hier ziet u een onderzoeker die zich voorbereidt om te werken met een chirurgische microscoop. Deze microscopen zijn over het algemeen opgehangen aan een beweegbare arm en zijn stereoscopisch, wat betekent dat ze licht doorlaten naar de kijker en ook naar een camera die op de microscoop is gemonteerd. Deze chirurgische microscoop wordt gebruikt bij een niertransplantatieprocedure bij muizen.

In dit fragment ziet u een onderzoeker door een dissectiemicroscoop kijken, terwijl hij de perfecte drosophila-larven selecteert voor verdere dissectie, om de spieren van de lichaamswand bloot te leggen zodat de neuromusculaire overgang kan worden bestudeerd.

Hier ziet u een omgekeerde samengestelde microscoop, met een objectief onder de tafel, die wordt klaargemaakt voor een microinjectietechniek. Deze procedure, bekend als somatische celkernoverdracht, is een belangrijke methode voor het genereren van transgene dieren en het maken van klonen.

U heeft zojuist de introductie van JoVE over lichtmicroscopie bekeken.

In deze video hebben we besproken: wat een microscoop is en hoe deze werkt, de vele componenten, hoe deze kunnen worden afgesteld en hoe kwalitatieve beelden kunnen worden verkregen. Bedankt voor het kijken!