Een eenvoudige en efficiënte methode om de Nucleaire Factor Activering Detect in menselijke neutrofielen door flowcytometrie
April 9th, 2013
Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in het bloed. Neutrofielen bezitten transcriptioneel gereguleerd functies zoals de productie van pro-inflammatoire cytokines en remming van apoptose. Deze functies kunnen worden bestudeerd met de methode die hier gepresenteerd, die detectie en kwantificering van nucleaire factoren maakt het mogelijk door middel van flowcytometrie in geïsoleerde kernen
Dit experiment gebruikt flowcytometrie om nucleaire eiwitten te detecteren en kwantificeren in geïsoleerde en immuno-gelabelde kernen van neutrofielen om de neutrofielen uit menselijk perifeer bloed te zuiveren. Verwijder de rode bloedcellen met dextrine gevolgd door dichtheidsgradiëntcentrifugering van het plasma. Gebruik vervolgens anti-receptorantilichamen om de gezuiverde neutrofielen te stimuleren via integrinen of FC-receptoren.
Ga door met het isoleren van de kernen en fixeer de monsters voor immuno-labeling met specifieke antilichamen tegen de NU-kernfactor van belang. Bijvoorbeeld, NF kappa B analyseer uiteindelijk de kernen door flowcytometrie om kleine veranderingen in kernfactoractivatie te detecteren. Er worden resultaten verkregen die aantonen dat stimulatie van neutrofielen via hun integrinen leidt tot een toename van de nucleaire concentratie van de transcriptiefactor N van kappa B. Signaalroutes die tot kernfactoractivatie leiden, worden meestal bestudeerd door reportergen-assays of door elektroforetische mobiliteitsverschuivingsassays in primaire cellen.
Vaak zijn deze methoden niet geschikt. Flowcytometrie biedt snelle detectie en kwantificering van nucleaire eiwitten in geïsoleerde kernen. Begin met 10 milliliter vers verzameld bloed van gezonde volwassen vrijwilligers.
Pipetteer twee milliliter van een 6% dextrine T 500-oplossing in een 15 milliliter conische centrifugeerbuis. Voeg vervolgens 10 milliliter bloed toe, mengen door de buis twee of drie keer te keren, en laat 45 minuten erytrocytsedimentatie door zwaartekracht in een verse 15 milliliter conische centrifugeerbuis. Plaats vijf milliliter van FI fial pack.
Verzamel het leukocytenrijke plasma dat zich boven de gesedimeneerde erytrocyten heeft gevormd. Leg het voorzichtig bovenop de fial pack om twee fasen te vormen, centrifugeer gedurende 20 minuten bij 516 Gs bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en breek de cellage door de buis tegen een rek te tikken.
Suspeneer vervolgens de cellen in 10 milliliter koud PBS. Breng de celsuspensie over naar een 50 milliliter conische centrifugeerbuis en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 290 Gs bij vier graden Celsius. Breek de cellage zoals eerder en voeg 10 milliliter koud hypotoon oplossing toe om erytrocyten te lysen.
Meng door de buis voorzichtig te schudden gedurende exact één minuut. Voeg vervolgens 10 milliliter koud hypertoon oplossing toe, meng en bewaar op ijs. Tel nu de cellen na het pellen van de neutrofielen door centrifugatie.
We suspenderen de PMN bij 10 tot de zeven cellen per milliliter. Houd de cellen in koud PBS op ijs. Pipetteer 100 microliter PMN-suspensie in 1,5 milliliter einor buisjes.
Voeg vervolgens het corresponderende monoklonale antilichaam toe bij 10 microgram per milliliter en incubeer gedurende 15 minuten op ijs. Om de cellen te wassen, voeg een milliliter koud PBS toe, centrifugeer en aspirieer het supernatant. Breek vervolgens voorzichtig de cellage en was twee keer meer met PBS.
Om ongebonden antilichaam te verwijderen, suspendeer de gewassen PMN in hetzelfde initiële volume warm PBS dat 60 microgram per milliliter go anti muse IgG bevat, incubeer gedurende één tot 20 minuten op 37 graden Celsius, afhankelijk van de kernfactor van belang. Voeg nu een milliliter koud PBS toe. Na het pellen van de cellen door centrifugatie, verwijder het snat en bevriest de cellage onmiddellijk in een dry ice ethanol bad. Voor elk monster verwijdert u de buis uit de dry ice set ethanol bad, veegt schoon en hersuspendeert u.
Suspeneer de bevroren PMN-pellets in 100 microliter koud hypotoon oplossing. Plaats alle monsters op ijs om monsters voor kernintegriteit te controleren. Vlek een Eloqua van de kernsuspensie met trian blauw.
Als kernsuspensie veel intacte cellen of puin bevat, is het beter om de bereiding weg te gooien en de procedure met een ander monster te beginnen. Na het pellen van de kernen door centrifugatie, verwijder voorzichtig het supernatant om vervolgens de kernen te fixeren bij 100 microliter koud, 4% Paraform aldehyde-oplossing en incubeer de kernen op ijs. Na het pellen van de kernen verwijder voorzichtig het snat bij 100 microliter koud permeabilisatiebuffer en incubeer de monsters gedurende 10 minuten op ijs.
Verzamel vervolgens de perme kernen door centrifugatie. Op dit punt hechten de kernpellets niet goed aan de bodem van de buis. Het wordt aanbevolen om opnieuw te centrifugeren.
Als de pellet los raakt Om niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren, suspenderen we de kernen in 500 microliter koud, 4% foetaal bovien serum in PBS en incuberen op ijs gedurende 20 minuten. Pellet de kernen door centrifugatie, suspendeer vervolgens de kernen en 100 microliter koud PBS bevattend 4%FBS en 2,5 microgram per milliliter van het monoklonale antilichaam tegen de kernfactor van belang. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten op ijs. Na het wassen van de monsters twee keer met 500 microliter koud PBS bevattend 4%FBS, suspenderen we de kernen in 100 microliter koud PBS bevattend 4%FBS en 10 microgram milliliter van het corresponderende FZ-gelabelde secundaire antilichaam. Incubeer gedurende 20 minuten op ijs. Na twee wasbeurten, suspendeer de kernen in 400 microliter koud 4% Paraldehyde in PBS.
Analyseer de immuno-gelabelde kernen in een flowcytometra zoals een fact scan of soortgelijk apparaat. Pas de acquisitie-instellingen aan, twee FSC op log-schaal bij 10 tot de min één SSC op log-schaal bij 196 en kernen op adopt plot. Verzamel 10.000 kernen per monster.
Analyseer vervolgens de fluorescentie van fitsy gekleurde kernen door de FL een kanaal ingesteld op log-schaal bij 400. Deze PMN-zuiveringsmethode levert meestal niet-geïnduceerde neutrofielen op met een zuiverheid groter dan 95% van PMN-kernen worden geïsoleerd met hoge opbrengsten, geïsoleerd naar kernen, kunnen gemakkelijk worden herkend als een verschillende populatie van intacte PMN in de flowcytometra met een dot plot bij stimulatie. Door het cross-linken van bèta één integrinen wordt NF
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het detecteren en kwantificeren van nucleaire eiwitten in neutrofielen met behulp van flowcytometrie. De aanpak stelt onderzoekers in staat om de activering van transcriptiefactoren, zoals NF kappa B, in geïsoleerde kernen te analyseren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Flowcytometrie
Achtergrond
- Neutrofielen zijn het meest voorkomende type leukocyt in het bloed.
- Ze spelen een cruciale rol in de immuunrespons door de productie van pro-inflammatoire cytokinen.
- Het begrijpen van hun nucleaire functies is essentieel voor inzichten in immuunregulatie.
- Flowcytometrie is een krachtig hulpmiddel voor het analyseren van cellulaire componenten.
Doel van studie
- Om neutrofielen uit menselijk perifeer bloed te zuiveren.
- Om de activering van nucleaire factoren in reactie op stimulatie te bestuderen.
- Om een gedetailleerde methodologie te bieden voor het kwantificeren van nucleaire eiwitniveaus.
Gebruikte methoden
- Isolatie van neutrofielen uit menselijk bloed met behulp van dextrine en dichtheidsgradiëntcentrifugering.
- Stimulatie van neutrofielen met anti-receptorantilichamen gericht op integrinen of FC-receptoren.
- Isolatie en fixatie van kernen voor immunolabeling met specifieke antilichamen.
- Analyse van kernen door flowcytometrie om veranderingen in activering van nucleaire factoren te detecteren.
Belangrijkste resultaten
- Stimulatie van neutrofielen via integrinen leidt tot een verhoogde nucleaire concentratie van NF kappa B.
- Flowcytometrie detecteert effectief kleine veranderingen in de activering van nucleaire factoren.
- De resultaten dragen bij aan het begrijpen van signaalroutes in neutrofielen.
- De methodologie kan worden toegepast om verschillende nucleaire factoren in primaire cellen te bestuderen.
Conclusies
- Deze methode biedt een betrouwbare aanpak om de activering van nucleaire factoren in neutrofielen te bestuderen.
- Flowcytometrie is een waardevolle techniek voor het analyseren van immuuncelfuncties.
- Verder onderzoek kan aanvullende signaalroutes en hun implicaties onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Detecting nuclear factor activation in primary human neutrophils enables mechanistic de-risking of inflammatory signaling pathways in drug discovery. This flow cytometry-based method provides quantitative, reproducible readouts of transcription factor dynamics, supporting target validation and assay development in immunology-focused programs. By overcoming transfection limitations in short-lived primary cells, it offers a scalable solution for early-stage biomarker alignment and predictive confidence in lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of NF-κB and Elk-1 activation in primary human neutrophils to clarify proinflammatory signaling mechanisms.
- Operational Value: Provides a transfection-independent method for studying transcriptionally regulated responses in difficult-to-transduce primary immune cells.
- Predictive Value: Supports functional target validation by linking receptor stimulation (e.g., integrins, Fc receptors) to nuclear translocation of key inflammatory mediators.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates isolated, immunolabeled neutrophil nuclei suitable for high-throughput flow cytometric screening of modulators of nuclear factor activation.
- Quantitative Output: Enables detection of small changes in nuclear protein concentration, facilitating dose-response and IC50 determination in compound screening.
- Reproducibility: Standardized neutrophil isolation and nuclear preparation workflows yield consistent fluorescence readouts across replicates and donors.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to studying neutrophil-driven inflammatory pathways in models of infection, autoimmunity, and tissue injury.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mechanism elucidation with preclinical validation by providing a primary human cell-based readout of target engagement.
- Mechanistic De-risking: Reduces reliance on surrogate systems by enabling direct measurement of transcription factor activation in the therapeutically relevant cell type.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in immunology and enabling progression from target engagement assays to functional validation in primary human neutrophils before lead optimization.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification by quantifying nuclear translocation of transcription factors downstream of receptor stimulation (e.g., β1/β2 integrins, Fc receptors).
- Screening: Delivers assay-ready nuclei with quantitative fluorescence outputs suitable for screening compound libraries for modulators of NF-κB or Elk-1 activation.
- Analytics: Provides single-nucleus resolution and fluorescence intensity measurements enabling statistical comparison of stimulated vs. basal conditions.
- Translational Research: Uses primary human neutrophils to enhance clinical relevance of mechanistic findings, supporting biomarker alignment in inflammatory disease models.
- Enterprise Reuse: Adaptable to multiple nuclear factors and fluorophores, allowing reuse across projects targeting different signaling pathways in neutrophils or other primary cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by providing direct, quantitative evidence of nuclear factor activation in primary human immune cells.
- Operational Value: Delivers a standardized, scalable workflow for neutrophil isolation, nuclear preparation, and flow cytometric analysis with minimal specialized equipment.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in early-stage immunomodulator programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on target pathway modulation in a disease-relevant primary cell system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human blood processing, neutrophil isolation, and flow cytometry compensation and gating.
- Dependent on access to flow cytometers capable of fluorescence detection in the appropriate channels (e.g., FL1 for FITC-labeled antibodies).
- Necessitates standardization of stimulation conditions, antibody titers, and nuclear fixation/permeabilization protocols across users and sites.
- Adaptation to other cell types requires optimization of hypotonic/hypertonic lysis conditions and validation of nuclear integrity.
- Practical limitations include neutrophil donor variability and the short ex vivo lifespan of primary neutrophils, necessitating same-day experimentation.
