Een eenvoudige en efficiënte methode om de Nucleaire Factor Activering Detect in menselijke neutrofielen door flowcytometrie

In dit experiment wordt flowcytometrie gebruikt om nucleaire eiwitten te detecteren en te kwantificeren in geïsoleerde en immunogemarkeerde kernen van neutrofielen, om zo de neutrofielen uit menselijk perifeer bloed te zuiveren. Verwijder de rode bloedcellen met dextrine, gevolgd door dichtheidsgradiëntcentrifugatie van het plasma. Stimuleer vervolgens de gezuiverde neutrofielen via integrines of FC-receptoren met behulp van antireceptor-antilichamen.

Vervolgens worden de kernen geïsoleerd en de monsters gefixeerd voor immunolabelling met specifieke antilichamen tegen de relevante nucleaire factor. Voor NF kappa B bijvoorbeeld worden de kernen tenslotte geanalyseerd via flowcytometrie om kleine veranderingen in de activatie van de nucleaire factor te detecteren. De resultaten tonen aan dat stimulatie van neutrofielen via hun integrines leidt tot een toename van de nucleaire concentratie van de transcriptiefactor NF kappa B. Signaleringsroutes die leiden tot activatie van de nucleaire factor worden gewoonlijk bestudeerd met reportergene-assays of met electrophoretic mobility shift assays in primaire cellen.

Vaak zijn deze methoden niet geschikt. Flowcytometrie maakt snelle detectie en kwantificering van nucleaire eiwitten in geïsoleerde kernen mogelijk. Begin met 10 milliliters vers afgenomen bloed van gezonde volwassen vrijwilligers.

Pipetteer 2 mL van een 6% dextrin T 500-oplossing in een conische centrifugebuis van 15 mL. Voeg vervolgens 10 mL bloed toe, meng dit door de buis twee of drie keer om te keren en laat de erytrocyten gedurende 45 minuten bezinken door zwaartekracht in een nieuwe conische centrifugebuis van 15 mL. Plaats 5 mL in een FI fial pack.

Oogst het leukocytenrijk plasma dat zich boven de gesedimenteerde erytrocyten heeft gevormd. Breng dit voorzichtig in laagjes aan bovenop de fial pack om twee fasen te vormen, en centrifugeer 20 minuten bij 516 Gs bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en breek de celpellet door de buis tegen het rek te tikken.

Resuspendeer de cellen vervolgens in 10 milliliters koud PBS. Breng de cel-suspensie over naar een conische centrifugebuis van 50 milliliter en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 290 Gs bij vier graden Celsius. Breek het celpellet zoals eerder beschreven en voeg 10 milliliters koude hypotone oplossing toe om erytrocyten te lyseren.

Meng door de buis precies één minuut voorzichtig te zwenken. Voeg vervolgens 10 milliliters koude hypertone oplossingmix toe en bewaar op ijs. Tel nu de cellen nadat de neutrofielen door centrifugatie zijn neergeslagen.

We suspenderen de PMN op 10^7 cellen per milliliter. Bewaar de cellen op ijs in koude PBS. Pipetteer aliquots van 100 µL PMN-suspensie in 1,5 ml Eppendorf-buisjes.

Voeg vervolgens het corresponderende monoklonale antilichaam toe in een concentratie van 10 µg/mL en incubeer 15 minuten op ijs. Om de cellen te wassen, voegt u 1 mL koud PBS toe, centrifugeert u en aspireert u het supernatant. Resuspendeer vervolgens voorzichtig de celpellet en was deze nog twee keer met PBS.

Om ongebonden antilichamen te verwijderen, wordt het gewassen PMN opnieuw gesuspendeerd in hetzelfde initiële volume warme PBS met 60 µg/mL goat anti-mouse IgG en geïncubeerd bij 37 °C gedurende 1 tot 20 minuten, afhankelijk van de betreffende nucleaire factor. Voeg vervolgens 1 mL koude PBS toe. Na het pelleten van de cellen door centrifugatie wordt het supernatant verwijderd en worden de celpellets onmiddellijk ingevroren in een bad van droogijs en ethanol. Verwijder voor elk monster de buis uit het bad van droogijs en ethanol, veeg deze schoon en resus

Suspendeer de bevroren PMN-pellets in 100 µL koude hypotone oplossing. Plaats alle monsters op ijs om de integriteit van de kernen te bewaken. Kleur een aliquot van de kernsuspensie met trypaanblauw.

Als de kernsuspensie veel intacte cellen of debris bevat, is het beter om de preparatie weg te gooien en de procedure met een ander monster opnieuw te starten. Nadat de kernen door centrifugatie zijn gepellet, dient het supernatant zeer voorzichtig te worden verwijderd, waarna de kernen worden gefixeerd in 100 µL koude 4% paraformaldehydeloplossing en op ijs worden geïncubeerd. Nadat de kernen zijn gepellet, wordt het supernatant voorzichtig verwijderd en worden de monsters in 100 µL koude permeabilisatiebuffer gedurende 10 minuten op ijs geïncubeerd.

Oogst vervolgens de permeabele kernen door middel van centrifugatie. Op dit punt hechten de kernpellets niet goed aan de bodem van de buis. Het wordt aanbevolen om nogmaals te centrifugeren.

Indien de pellet loskomt. Om aspecifieke bindingsplaatsen te blokkeren, suspenderen we de kernen in 500 µL koude, 4% foetaal runderserum in PBS en incuberen we dit 20 minuten op ijs. Pelleteer de kernen door centrifugatie en resuspendeer de kernen vervolgens in 100 µL koud PBS met 4%FBS en 2,5 µg/mL van het monoclonale antilichaam tegen de nucleaire factor van interesse. Incubeer de monsters 20 minuten op ijs. Na het tweemaal wassen van de monsters met 500 µL koud PBS met 4%FBS, suspenderen we de kernen in 100 µL koud PBS met 4%FBS en 10 µg/mL van het overeenkomstige FZ-gelabelde secundaire antilichaam en incuberen we dit 20 minuten op ijs. Na twee wasbeurten resuspenderen we de kernen in 400 µL koud 4%paraldehyde in PBS.

Analyseer de immunogelabelde kernen in een flowcytometer, zoals een FACScan of een soortgelijk apparaat. Stel de acquisitie-instellingen in op FSC op logaritmische schaal bij 10⁻¹, SSC op logaritmische schaal bij 196 en gate de kernen in een dot plot. Verzamel 10.000 kernen per monster.

Analyse vervolgens de fluorescentie van de met fitsy gekleurde kernen via het FL1-kanaal, ingesteld op een logaritmische schaal bij 400. Deze PMN-zuiveringsmethode levert gewoonlijk ongestimuleerde neutrofielen op met een zuiverheid van meer dan 95%; PMN-kernen worden met hoge opbrengsten geïsoleerd en kunnen in de flowcytometer via een dot plot na stimulatie gemakkelijk worden herkend als een andere populatie dan intacte PMN. Door crosslinking van bèta 1-integrines wordt NF-kappaB naar de kern getransloceerd, en deze toename van nucleair NF-kappaB wordt gedetecteerd als een stijging van de fluorescentie.

Op dezelfde manier induceert stimulatie van PMN door cross-linking van bèta twee integrines ook activatie van NF kappa B, wat wordt aangetoond door een toename in fluorescentie. De gevoeligheid van deze methode maakt het mogelijk om kleine veranderingen in de spiegels van nucleaire factoren te detecteren, zoals blijkt uit het feit dat bèta een integrines, die binden aan extracellulaire matrixeiwitten zoals fibronectine, een sterkere activatie van NF kappa B induceren dan bèta twee integrines, die binden aan adhesiemoleculen op andere cellen. Deze methode biedt een grote flexibiliteit omdat er veel verschillende fluorochromen kunnen worden gebruikt en omdat het de preparatie van kernen uit verschillende celtypen mogelijk maakt; gebruik deze eenvoudige en economische aanpak voor signaaltransductiestudies waarbij veranderingen in eiwitniveaus in de kern van diverse celtypen betrokken zijn.