Name: Een eenvoudige en efficiënte methode om de Nucleaire Factor Activering Detect in menselijke neutrofielen door flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Leer een eenvoudige methode voor detectie van nucleaire factoren in menselijke neutrofielen door flowcytometrie. Deze aanpak kwantificeert NF kappa B-activering in geïsoleerde kernen voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag Nancy Mora bedanken voor haar technische bijstand. Dit werk werd gefinancierd door subsidies voor onderzoek 48573-M en 168098 van Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, Mexico, en door subsidies IN212308 en IN205311-2 van Dirección General de Asuntos del Persoonlijke academico, Universidad Nacional Autónoma de Mexico, Mexico.

1. Isolatie van neutrofielen (PMN) uit humaan bloed <ol><li> Gebruik ongeveer 20 ml menselijk bloed met heparine (10 U / ml) als antistollingsmiddel. Bloed werd verzameld van volwassen gezonde vrijwilligers door venopuncture. Alle experimenten werden uitgevoerd onder goedkeuring van de bio-ethiek Comite aan het Instituto de Investigaciones Biomédicas - UNAM. </li><li> Doe 2 ml van 6% dextran T500 in PBS in een 15 ml conische centrifugebuis 10 ml bloed. Meng door de buis twee of drie keer en laat het gedurende 45 minuten om voor bezinking. </li><li> In een nieuwe 15 ml conische centrifugebuis gezet 5 ml Ficoll-Paque. </li><li> Neem de leukocyt-rijke plasma dat gevormd boven gesedimenteerd erytrocyten en voorzichtig pipetteren bovenop de Ficoll-Paque vormen van een tweede laag. Zorg ervoor dat er twee fasen. </li><li> Centrifugeer bij 516 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Na centrifugatie bij de interfase van plasma en Ficoll-Paque er een laag van mononucleaire cellen. Neutrophils zijn aan de onderkant van de buis. </li><li> Elimineer de supernatant, breken de celpellet door op de buis tegen een rek en resuspendeer de cellen door het toevoegen van 10 ml koud (4 ° C) PBS. Opmerking: Het mengen van de cellen en neer te pipetteren wordt niet aanbevolen omdat dit te schadelijk voor de cellen. </li><li> Breng de celsuspensie in een 50 ml conische centrifugebuis en centrifugeer bij 290 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Breken de cel pellet voor en voeg 10 ml koude (4 ° C) hypotone oplossing (0,2% NaCl, 1% BSA, 20 mM Hepes, pH = 7,4) tot erytrocyten te lyseren. Meng door werveling van de buis voorzichtig met de hand gedurende precies een minuut. </li><li> Voeg 10 ml koude (4 ° C) hypertone oplossing (1,6% NaCl, 1% BSA, 20 mM HEPES, pH = 7,4), mix en tel de cellen met een hemocytometer (gewoonlijk&gt; 95% zijn PMN). Opmerking: Bewaar de buis met de celsuspensie op ijs, terwijl het tellen van de cellen. </li><li> Centrifugeer als hiervoor Resuspendeer PMN bij 107 cellen / ml in koud (4 ° C) PBS. Blijf op ijs. Opmerking: Neutrofielen levensvatbaar blijven en functionele bij 4 ° C gedurende ongeveer 6 tot 8 uur. </li></ol> 2. Activeren van PMN <ol><li> Doe 100 pl PMN suspensie (1 x 10 7 cellen / ml) in een 1,5 ml Eppendorf buis. Opmerking: Voorbeeld van buizen moeten worden gedaan ten minste in duplo. Gebruikelijke negatieve controles behelzen een eerste antilichaam alleen, en secundaire antilichaam alleen. </li><li> Voeg de overeenkomstige anti-integrine of anti-Fc receptor monoklonaal antilichaam (mAb) bij 10 ug / ml en geïncubeerd op ijs gedurende 15 minuten. </li><li> PMN wassen door toevoeging van 1 ml koude (4 ° C) PBS, centrifugeren bij 1743 xg (4.500 rpm) in een microcentrifuge, en afzuigen van het supernatant. </li><li> Breken de celpellet door op de bodem van de buis tegen een rack, voeg 1 ml koude PBS en was twee keer in de vorige stap. Opmerking: Deze wast verwijder ongebonden antilichaam. </li><li> Resuspendeer PMN in dezelfde (initial) volume van warm (37 ° C) PBS die 60 ug / ml F (ab &#39;) 2 geiten anti-muis IgG. Opmerking: De secundaire anti-muis IgG antilichaam zal binden aan de eerste anti-receptor antilichaam en verknoping van de receptor veroorzaken. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 tot 20 min, afhankelijk van de nucleaire factor van belang. Voor NF-KB gewoonlijk 15 min, en Elk-1 meestal 5 min. Opmerking: de cellen te incuberen bij 37 ° C induceert receptor crosslinking, die niet plaatsvinden bij 4 ° C. </li><li> Voeg 1 ml koude PBS en centrifugeer 3 min bij 1743 xg in microcentrifuge. </li><li> Verwijder supernatant </li><li> Freeze PMN onmiddellijk in dry-ice/ethanol bad en er hen gedurende 10 minuten te houden. </li></ol> 3. Isolatie en fixatie van Kernen <ol><li> Hersuspendeer pellet bevroren PMN in 100 pi koude (4 ° C) hypotonische buffer (10 mM HEPES, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 en 1 mM vers toegevoegde DL-dithiothreitol [DTT]; PH = 7,9). Het wordt aanbevolen om de buizen te nemen uit het bad dry-ice/ethanol een voor een, en het reinigen van de bodem van de buis vegen voordat u de hypotonische buffer. </li><li> Plaats op ijs, en controleer of kernen integriteit door kleuring een hoeveelheid van de kernen suspensie met trypan blauw. Kernen kijken rond en blauw. Intact PMN niet vies, en celresten verschijnt als blauwe deeltjes met een onregelmatige vorm. Opmerking: Als kernen suspensie veel intacte cellen of vuil, is het beter om de voorbereiding verwijderen en de procedure met een ander monster herhalen. </li><li> Centrifugeer kernen op 775 xg (3.000 rpm) in microcentrifuge gedurende 10 min in een koude kamer. Op dit punt kernen zijn zeer kwetsbaar en extra zorg moeten worden genomen in het houden van de monsters koud en niet centrifugeren bij overmatige krachten. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof door heel voorzichtig pipetteren. </li><li> Voeg 100 ul koude 4% paraformaldehyde in PBS om kernen te lossen. Opmerking: De pellet is zeer los eend toevoegen van de buffer voldoende is om de kernen te resuspenderen. En neer te pipetteren moet worden vermeden. </li><li> Incubeer op ijs gedurende 20 minuten. </li><li> Immunolabel kernen voor flowcytometrie of houden gedurende 24 uur bij 4 ° C. </li></ol> 4. Kernen immunokleuring voor flowcytometrie-analyse <ol><li> Centrifugeer bij 1743 xg kernen (4.500 rpm) in microcentrifuge gedurende 1 minuut en verwijder supernatant door zeer zacht pipetteren. </li><li> Voeg 100 pl koude (4 ° C) 0,1% Triton X-100, 4% paraformaldehyde in PBS om kernen permeabiliseren. Incubeer in ijs gedurende 10 minuten. </li><li> Centrifugeer gepermeabiliseerd kernen op 1.743 xg in microcentrifuge en verwijder voorzichtig het supernatant. Op dit punt kernen pellets niet goed hechten aan de bodem van de buis. Het wordt aanbevolen om opnieuw gecentrifugeerd indien de pellet losraken. </li><li> Resuspendeer kernen in 500 ul koude 4% foetaal bovine serum (FBS) in PBS om niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren, en incubeer op ijs gedurende 20 minuten. Centrifugeerkernen op 1.743 xg gedurende 3 min in microcentrifuge en verwijder voorzichtig het supernatant. </li><li> Resuspendeer kernen in 100 ul koude PBS met 4% FBS en 2,5 ug / ml van mAb tegen de nucleaire factor van belang. Incubeer op ijs gedurende 20 minuten. Opmerking: De gebruikelijke negatieve controles dienen anti-nucleaire factor antilichaam alleen, en FITC-gelabeld secundair antilichaam alleen. </li><li> Was tweemaal met 500 pi koude PBS met 4% FBS en centrifugeren bij 1743 xg gedurende 3 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant zorgvuldig, resuspendeer kernen in 100 ul koude PBS met 4% FBS en 10 ug / ml van de overeenkomstige FITC-gelabeld secundair antilichaam en incubeer op ijs gedurende 20 minuten. </li><li> Was tweemaal kernen met 500 pi koude PBS met 4% FBS als in de vorige stap. </li><li> Resuspendeer kernen in 400 ul koude 4% paraformaldehyde in PBS. Opmerking: Kernen worden in paraformaldehyde om de monster worden bewaard enkele dagen zonder besmettingproblemen die kunnen optreden in de aanwezigheid van serum. </li><li> Analyseren onmiddellijk door flowcytometrie of slaan in het donker bij 4 ° C gedurende drie dagen. </li></ol> 5. Flowcytometrie-analyse <ol><li> Analyseren immunolabeled kernen in een flowcytometer dergelijke FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) of soortgelijke inrichting. </li><li> Pas overname instellingen: FSC op log-schaal 10-1, SSC bij log-schaal op 196, en poort kernen in een dot-plot. </li><li> Acquire tienduizend kernen per monster. </li><li> Analyseer fluorescentie van FITC-gekleurde kernen door middel van de FL-1-kanaal (506 nm) ingesteld op log-schaal op 400. </li></ol>

<ol><li>Sendo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neutrophil+apoptosis%3A+its+biological+significance+in+inflammation+and+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response.</a> Human Cell. 9, 215-222 (1996).</li>
<li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%2C+from+marrow+to+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33, 657-670 (2010).</li>
<li>Naussef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+human+neutrophils+kill+and+degrade+microbes.+An+integrated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">How human neutrophils kill and degrade microbes. An integrated view.</a> Immunol. Rev. 219, 88-102 (2007).</li>
<li>Scapini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neutrophil+as+a+cellular+source+of+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The neutrophil as a cellular source of chemokines.</a> Immunol. Rev. 177, 195-203 (2000).</li>
<li>Hamilton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-+and+stimulus-specific+mechanisms+for+post-transcriptional+control+of+neutrophil+chemokine+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell type- and stimulus-specific mechanisms for post-transcriptional control of neutrophil chemokine gene expression.</a> J. Leukoc. Biol. 91, 377-383 (2012).</li>
<li>Simon, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+apoptosis+pathways+and+their+modifications+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation.</a> Immunol. Rev. 193, 101-110 (2003).</li>
<li>Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+neutrophil+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Molecular control of neutrophil apoptosis.</a> FEBS Lett. 487, 318-322 (2001).</li>
<li>Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+neutrophil+apoptosis%3A+new+players+enter+the+game%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game.</a> Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).</li>
<li>Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+and+NF-%CE%BAB+in+T+cell+activation%3A+life+at+the+edge%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Death and NF-κB in T cell activation: life at the edge.</a> Mol. Cell. 11, 551-552 (2003).</li>
<li>Papa, S., Zazzeroni, F., Pham, C. G., Bubici, C., Franzoso, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+JNK+signaling+to+NF-%CE%BAB%3A+a+key+to+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Linking JNK signaling to NF-κB: a key to survival.</a> J. Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).</li>
<li>Valente, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF+increases+camptothecin-induced+apoptosis+by+inhibition+of+NF-%CE%BAB%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-κB.</a> Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).</li>
<li>Choi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+NF-%CE%BAB+by+a+TAT-NEMO-binding+domain+peptide+accelerates+constitutive+apoptosis+and+abrogates+LPS-delayed+neutrophil+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inhibition of NF-κB by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis.</a> Blood. 102, 2259-2267 (2003).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+neutrophil+apoptosis+by+type+1+IFN+depends+on+cross-talk+between+phosphoinositol+3-kinase%2C+protein+kinase+C-d%2C+and+NF-%CE%BAB+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-κB signaling pathways.</a> J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).</li>
<li>Schnoor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+non-viral+transfection+of+THP-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Efficient non-viral transfection of THP-1 cells.</a> J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).</li>
<li>Garcia-Garcia, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+factor+activation+by+Fc%CE%B3R+in+human+peripheral+blood+neutrophils+detected+by+a+novel+flow+cytometry-based+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Nuclear factor activation by FcγR in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method.</a> J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).</li>
<li>Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc%CE%B3RIIA+and+Fc%CE%B3RIIIB+mediate+nuclear+factor+activation+through+separate+signaling+pathways+in+human+neuthophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">FcγRIIA and FcγRIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils.</a> J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

De zuiveringswerkwijze hier beschreven kan de isolatie van gestimuleerde neutrofielen (PMN) met zuiverheid van meer dan 95% (bepaald door microscopische waarneming), in een korte tijd. Soms neutrofielen kunnen worden verontreinigd door erytrocyten indien deze niet volledig gelyseerd. Dit heeft meestal geen invloed de techniek, aangezien erytrocyten en PMN kan gemakkelijk worden onderscheiden als afzonderlijke celpopulaties door flowcytometrie. Geïsoleerde PMN kan dan worden gestimuleerd door verknoping bijzonder recepto...

Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in perifeer bloed 1. Tijdens ontsteking en infectie neutrofielen de eerste cellen te verschijnen op de aangetaste plaats waar zij als eerste verdedigingslijn 2. Neutrofielen bezitten verscheidene antimicrobiële mechanismen 3 met fagocytose, productie van zuurstofradicalen, afgifte van lytische enzymen door degranulatie en productie van pro-inflammatoire cytokines 4,5. Neutrofielen zijn kortstondige cellen die snel krijgen geactiveerd door middel van signalering van verschillende receptoren op het celoppervlak. Hoewel neutrofielen werden beschouwd terminale cellen vanwege hun korte levensduur en omdat ze apoptose ondergaan tenzij geactiveerd tijdens het ontstekingsproces 6 is nu duidelijk dat zij ook hun fenotype wijzigen door het niveau van transcriptie van bepaalde genen. De productie van cytokines 5 en de remming van apoptose 7,8 zijn twee iELANGRIJKE activatie-afhankelijke cel functies geregeld op het niveau van transcriptie in neutrofielen. Nucleaire factor kB (NF-kB) participeert in de transcriptionele controle van cytokineproductie 4 en in de regulatie van cel overleving en apoptose 9-11 in verschillende celtypes. De signaalwegen die leiden tot activatie nuclear factor meestal bestudeerd door reportergen assays of door elektroforetische mobiliteit shift assays (EMSA). Omdat neutrofielen kortstondige cellen, kan de studie van transcriptioneel gereguleerd responsen in deze cellen niet worden uitgevoerd met reportergen assays, omdat er geen efficiënte technieken voor neutrofiel transfectie. EMSA assays zijn gebruikt in neutrofielen nucleaire factor activatie 12,13 ontdekken, maar deze methode is ingewikkeld en duur omdat het het gebruik van radioactief materiaal. Nucleofectie is een andere techniek die gebruikt successfully aan monocyten 14 transfecteren. Dus, althans in theorie zouden nucleaire factor activering gedetecteerd in neutrofielen door transfectie (ondanks laag rendement). Dit zou echter techniek duurder, tijdrovend en waarschijnlijk minder kwantitatieve. Microscopische analyse van immuun-cellen kunnen ook worden gebruikt om nucleaire factoren detecteren in de kern. Inderdaad hebben we ontdekt NF-kB translocatie naar de kern zo 15. Helaas is deze techniek ook tijdrovend, minder kwantitatieve, en onder voorbehoud van vooringenomenheid van de waarnemer. Hier geven we een eenvoudige en efficiënte methode die detectie en kwantificering van nucleaire factoren in geïsoleerde en immunolabeled kernen door flowcytometrie mogelijk. We beschrijven technieken voor neutrofielen uit humaan perifeer bloed te isoleren, stimuleren deze cellen via integrines of Fc-receptoren met anti-receptor antilichamen, isoleren en immunolabel kernen en analyseren kernen door flowcytometrie (Figure 1). De werkwijze is met succes gebruikt om NF-kB 15 en Elk-1 16 nucleaire factoren in neutrofielen kernen detecteren. De gevoeligheid van deze methode kan de aanwezigheid van kleine wijzigingen in de nucleaire factor niveaus in de kern. Deze methode kan ook worden gebruikt om het niveau van transcriptiefactoren in kernen van andere celtypen analyseren.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Heparin </td><td>PiSA (Mexico)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextran T500</td><td>Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark)</td><td>T1-Dextran T500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Pharmacia</td><td>17-0320-01</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride </td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Cohn Fraction V</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride anhydrous </td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DL-dithiothreitol (DTT) </td><td>Sigma</td><td>D9163</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue (0.4 % solution)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 </td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>GIBCO</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal antibody IV.3</td><td>Medarex (Annandale, NJ)</td><td>025-1</td><td>Human-specific anti-FcRII (CD32) </td></tr><tr><td>Monoclonal antibody 3G8</td><td>Medarex (Annandale, NJ)</td><td>028-2</td><td>Human-specific anti-FcRIII (CD16) </td></tr><tr><td>Monoclonal antibody TS2/16</td><td>Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA)</td><td>Donated by Dr. Martin Hemler</td><td>Human-specific anti-&#946;1 integrin (CD29)</td></tr><tr><td>Monoclonal antibody IB4</td><td>University of California, San Francisco</td><td>Donated by Dr. Eric J. Brown</td><td>Human-specific anti-&#946;2 integrin (CD18)</td></tr><tr><td>F(ab')2 goat anti-mouse IgG </td><td>Cappel (Aurora, OH)</td><td>55468</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG</td><td>Cappel (Aurora, OH)</td><td>55522</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG</td><td>Cappel (Aurora, OH)</td><td>55665</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NF-&#954;B p50</td><td>Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)</td><td>sc-114</td><td>Rabbit polyclonal antibody</td></tr><tr><td>Anti-NF-&#954;B p65</td><td>Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)</td><td>sc-109</td><td>Rabbit polyclonal antibody</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>15-ml centrifuge tube</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50-ml centrifuge tube</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge, Sorvall Tabletop</td><td>Dupont Instruments</td><td>RT 6000D</td><td></td></tr><tr><td>pH-meter</td><td>Corning</td><td>340</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman pipette P-20</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman pipette P-200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman pipette P-1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>2IS-M</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5414C</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5418</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ)</td><td>FACScalibur</td><td></td></tr></tbody></table>

een eenvoudige en efficiënte methode om de nucleaire factor activering detect in menselijke neutrofielen door flowcytometrie

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in perifeer bloed. Deze cellen zijn de eerste om te verschijnen op plaatsen van ontsteking en infectie, zo wordend de eerste lijn van verdediging tegen binnendringende micro-organismen. Neutrofielen over belangrijke antimicrobiële functies zoals fagocytose, afgifte van lytische enzymen en de productie van reactieve zuurstof species. Naast deze belangrijke afweerfuncties, neutrofielen andere taken in reactie op infectie, zoals de productie van pro-inflammatoire cytokines en remming van apoptose. Cytokines werven andere leukocyten waarmee de infectie, en remming van apoptose kan de neutrofielen langer leven op de plaats van infectie. Deze functies worden geregeld op het niveau van transcriptie. Omdat neutrofielen kortstondige cellen, kan de studie van transcriptioneel gereguleerd responsen in deze cellen niet worden uitgevoerd met conventionele methoden reportergen aangezien er geen effidoende technieken voor neutrofiel transfectie. Hier geven we een eenvoudige en efficiënte methode die detectie en kwantificering van nucleaire factoren in geïsoleerde en immunolabeled kernen door flowcytometrie mogelijk. We beschrijven technieken pure neutrofielen uit humaan perifeer bloed te isoleren, stimuleren deze cellen met anti-receptor antilichamen, isoleren en immunolabel kernen en analyseren kernen door flowcytometrie. De werkwijze is met succes gebruikt om NF-kB en Elk-1 nucleaire factoren detecteren kernen van neutrofielen en andere celtypes. Aldus is deze methode is een optie voor het analyseren activering van transcriptiefactoren in geïsoleerde kernen van verschillende celtypen.

De zuiveringswerkwijze beschreven meestal biedt gestimuleerde neutrofielen (PMN) met een zuiverheid van meer dan 95% (Figuur 1A). Geïsoleerde PMN kan dan worden gestimuleerd door verknoping bijzonder receptoren met specifieke monoklonale antilichamen. We hebben gestimuleerd PMN door Fc receptoren en integrinen (Figuur 1B). Zodra gestimuleerd worden PMN gelyseerd en kernen die met hoge opbrengsten. Kernen worden vervolgens immunolabeled voor een bepaalde nucleaire factor, zoals de nuclea...

Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in het bloed. Neutrofielen bezitten transcriptioneel gereguleerd functies zoals de productie van pro-inflammatoire cytokines en remming van apoptose. Deze functies kunnen worden bestudeerd met de methode die hier gepresenteerd, die detectie en kwantificering van nucleaire factoren maakt het mogelijk door middel van flowcytometrie in geïsoleerde kernen

Een eenvoudige en efficiënte methode om de Nucleaire Factor Activering Detect in menselijke neutrofielen door flowcytometrie

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

In dit experiment wordt flowcytometrie gebruikt om nucleaire eiwitten te detecteren en te kwantificeren in geïsoleerde en immunogemarkeerde kernen van neutrofielen, om zo de neutrofielen uit menselijk perifeer bloed te zuiveren. Verwijder de rode bloedcellen met dextrine, gevolgd door dichtheidsgradiëntcentrifugatie van het plasma. Stimuleer vervolgens de gezuiverde neutrofielen via integrines of FC-receptoren met behulp van antireceptor-antilichamen.Vervolgens worden de kernen geïsoleerd en de monsters gefixeerd voor immunolabelling met specifieke antilichamen tegen de relevante nucleaire factor. Voor NF kappa B bijvoorbeeld worden de kernen tenslotte geanalyseerd via flowcytometrie om kleine veranderingen in de activatie van de nucleaire factor te detecteren. De resultaten tonen aan dat stimulatie van neutrofielen via hun integrines leidt tot een toename van de nucleaire concentratie van de transcriptiefactor NF kappa B. Signaleringsroutes die leiden tot activatie van de nucleaire factor worden gewoonlijk bestudeerd met reportergene-assays of met electrophoretic mobility shift assays in primaire cellen.Vaak zijn deze methoden niet geschikt. Flowcytometrie maakt snelle detectie en

a-simple-efficient-method-to-detect-nuclear-factor-activation-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Werkwijze voor het kwantificeren neutrofieladhesie gerapporteerd. Deze methode een dynamisch omgeving vergelijkbaar met die aangetroffen in een bloedvat. Het maakt het onderzoek neutrofieladhesie ofwel gezuiverd adhesiemoleculen (ligand) of endotheelcel substraat (HUVEC) in een context vergelijkbaar met de in vivo omgeving met afschuifspanning.

Human Neutrophil Flow Kamer adhesietest

Er worden high throughput-assays gepresenteerd die in combinatie uitstekende tools bieden om NET-afgifte van humane neutrofielen te kwantificeren.

High Throughput Meting van extracellulaire DNA los en Kwantitatieve NET Formation in menselijke neutrofielen<em&gt; In Vitro</em

Een eenvoudige en betrouwbare werkwijze is beschreven om een ​​set van NK celfuncties zoals degranulatie cytokine en chemokine productie in verschillende NK cel subsets te analyseren.

Flowcytometrie-gebaseerde test voor het toezicht op NK celfuncties

Neutrofielen extracellulaire vallen (NET's) zijn netwerken van DNA, histonen en neutrofielen eiwitten. Hoewel een deel van de aangeboren immuunrespons zijn NET betrokken bij autoimmuniteit en trombose. Dit protocol beschrijft een eenvoudige werkwijze voor honden neutrofielen isolatie en kwantificering van netten met een microplaat fluorescentie assay.

A Simple Fluorescence Assay voor het kwantificeren van Canine neutrofielen extracellulaire inklembeveiliging

Dit artikel geeft de gedetailleerde methode om een ​​snelle neutrofiele chemotaxis-analyse te verrichten door de integratie van de on-chip neutrofiele isolatie uit volledig bloed en de chemotaxis-test op een enkele microfluïdische chip.

Een all-on-chip methode voor snelle neutrofiele chemotaxis analyse direct van een druppel bloed

Een stroom cytometry gebaseerde methode om kwantitatief de cytotoxische activiteit van menselijke natural killer cellen wordt hier weergegeven.

Een stroom Cytometry gebaseerde cytotoxiciteit Assay voor de beoordeling van menselijke NK cel activiteit

Hier presenteren we een protocol voor het detecteren van de aanwezigheid van neutrofielen in secties van de histologie vaste/permeabel en beoordelen van de activeringsstatus van levende gezuiverde neutrofielen. In het bijzonder de MUB40 peptide gebonden Lactoferrine in submodules neutrofiele-specifieke en tertiaire aanwezig. Blootstelling van de submodule inhoud via permeabilization of neutrofiele activering zorgt voor de markering van de neutrofielen.

De MUB40 Peptide voor gebruik bij de opsporing van ontsteking neutrofiele-gemedieerde gebeurtenissen

Dit protocol beschrijft een zeer gevoelige en hoge doorvoer neutrofiele extracellulaire val (NET) assay voor de semi-automatische kwantificering van ex vivo NET vorming door immunofluorescentie driedimensionale confocale microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt voor het evalueren van de netto vorming en afbraak na verschillende prikkels en kan worden gebruikt voor het bestuderen van potentiële NET-gerichte therapieën.

Een High-throughput Assay voor het beoordelen en kwantificeren van neutrofiele extracellulaire Trap vorming

Dit protocol bevat een reeks neutrofiele functionele assays die kunnen worden gebruikt als screeningsmethode om functies van verschillende signaalroutes te dekken. Het protocol omvat een eerste en eenvoudige evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen, zuiverheid, productie van reactieve zuurstofsoorten, real-time migratie, fagocytose en een voorlopige suggestie van extracellulaire neutrofiele vallen.

Een reeks screeningstechnieken voor een snel overzicht van de neutrofielenfunctie

We presenteren een geautomatiseerde high-throughput methode om neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) te kwantificeren met behulp van het live cell analysesysteem, gekoppeld aan een membraanpermeabiliteit-afhankelijke dual-dye benadering.

Real-time High Throughput-techniek om de vorming van extracellulaire neutrofielen in menselijke neutrofielen te kwantificeren

Dit gedefinieerde protocol beschrijft een real-time high-throughput microscopiebenadering om de afgifte van humane neutrofielen extracellulaire val (NET) in vitro te visualiseren en te kwantificeren. De reproduceerbare methode maakt onderzoek mogelijk naar de kenmerken en kinetiek van NETosis-afgifte na stimulatie met verschillende NETosis-inductoren en maakt beoordeling van de farmacologie van NETosis-antagonisten mogelijk.

Realtime, high-throughput microscopische kwantificering van de afgifte van extracellulaire vallen van menselijke neutrofielen en beoordeling van de farmacologie van antagonisten

Leer een eenvoudige methode voor detectie van nucleaire factoren in menselijke neutrofielen door flowcytometrie. Deze aanpak kwantificeert NF kappa B-activering in geïsoleerde kernen voor immunologisch onderzoek.

Een eenvoudige en efficiënte methode om de Nucleaire Factor Activering Detect in menselijke neutrofielen door flowcytometrie

Meer video's verkennen