Technieken voor verwerking Ogen geïmplanteerd met een Retina Prothese voor Gelokaliseerde histopathologisch Analysis

Het algemene doel van deze procedure is het verbeteren van de evaluatie van de veiligheid van retinale prosthesisen. Dit wordt bereikt door eerst het oppervlak van een optimaal gefixeerd enucleerd oog te labelen met weefselkleurstoffen om de positie van een geïmplanteerde elektrode aan te geven. In de tweede stap wordt de elektrode-array verwijderd en wordt het oogweefsel in strips gedissecteerd.

Vervolgens worden de strips gestabiliseerd in agar en daarna ingebed in paraffine. In de laatste stap worden de gemarkeerde gebieden van belang gesneden en op objectglazen verzameld voor kleuring. Uiteindelijk kan de gezondheid van de geïmplanteerde gebieden naast elke elektrode worden geëvalueerd met brightfield- en immunofluorescentiemicroscopie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat fixatiegerelateerde artefacten en delaminatie tot een minimum kunnen worden beperkt, terwijl weefselregio's grenzend aan de elektrode nauwkeurig kunnen worden gevolgd in grote monsters. Het kan ook worden gebruikt bij het evalueren van de veiligheid van nieuwe implantaten voor andere oogziekten. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode dit uitdagend vinden, omdat een retina gevoelig is voor delaminatie en een hoge mate van behendigheid vereist is bij het hanteren van de monsters.

Een visuele demonstratie van deze methode is belangrijk omdat het markeren en hanteren van het fragiele weefsel moeilijk te leren is. Voorafgaand aan deze studie werden de ogen na implantatie van een suprachoroïdale elektrode-array verwerkt met een niet-optimale techniek, zoals aangegeven door de ster. Deze eerste afbeelding toont een representatieve orthogonale doorsnede door de caviteit van de elektrode-array.

Let op dat het netvlies is losgekomen van het buitenste oogweefsel. Dit is bijzonder duidelijk onder het geïmplanteerde gebied, zoals aangegeven door de pijlpunt. Let er ook op dat het niet mogelijk is om vast te stellen welk deel van het netvlies grenzend was aan elke individuele elektrode van de array.

Bij deze hogere vergroting zijn er verschillende regelmatige artefacten door weefselvrijgave in de retinale lagen zichtbaar, zoals aangegeven door de pijlpunten, evenals een aanzienlijke loslating van de torpedo-laag, de reflecterende laag in het oog van de kat. Bij verdere vergroting kan worden waargenomen dat de buitenste segmenten van de fotoreceptoren, evenals het gepigmenteerde epitheel, echter intact blijven, wat suggereert dat eerder waargenomen loslatingen artefactuele neveneffecten van de verwerking waren in plaats van het resultaat van in vivo trauma of pathologie. Daarom is de volgende techniek geïmplementeerd om deze fixatie-gerelateerde artefacten en delaminatie te minimaliseren.

Nadat de ogen zijn gekernd en gefixeerd, begint u met het verwijderen van een geïmplanteerde oogbol uit ethanol en het zorgvuldig wegsnijden van het overtollige weefsel, inclusief het conjunctiva en de kapsel van de pees. Trim de oogzenuw tot een lengte van twee tot drie millimeter. De elektrode-array is zichtbaar door de semi-translucente sclera.

Gebruik vervolgens een fijngepenseel om voorzichtig histologische kleurstoffen op het weefsel aan te brengen, zodat de elektroden met een vooraf gedefinieerde kleurcode kunnen worden gelabeld. Let er hierbij op dat de kleurstof niet wordt uitgesmeerd. Aanvullende kleurmarkeringen kunnen worden aangebracht om interessante punten te definiëren of om te helpen bij het uitlijnen van de coupes.

Hier zijn de maximaal gestimuleerde elektroden groen gemarkeerd. De overige actieve elektroden zijn rood gemarkeerd. De retour-elektroden met een grotere diameter zijn geel gekleurd, en eventuele aanvullende geleiders of anatomische markeringen zijn met blauwe kleurstof gemarkeerd.

Laat de oogbol vijf minuten aan de lucht drogen en plaats deze vervolgens terug in de 70% ethanol om de kleurstof te dehydrateren. Trim daarna het overtollige weefsel van de niet-geïmplanteerde controle-oogbol, zoals zojuist gedemonstreerd, en gebruik de acht nylon hechtingen die tijdens de nucleatie- en fixatiestap zijn aangebracht om de controle- en geïmplanteerde ogen als een gespiegeld paar uit te lijnen. Plaats vervolgens een siliconen mal met dezelfde afmetingen als de elektrode-array op een gespiegelde locatie op de controle-oogbol, overeenkomend met de locatie van de array in het geïmplanteerde oog.

Label vervolgens de controloog zoals zojuist gedemonstreerd, zodat elke plek van de geïmplanteerde elektrode een controlepaar heeft op een anatomisch vergelijkbare locatie. Verwijder daarna de implantaatmatrix uit het oog en verwijder vervolgens de voorzijde van het oog, inclusief het hoornvlies, de iris en de lens. Verwijder daarna de glasvochtvloeistof uit de resterende oogkom.

Dissekeer nu het geïmplanteerde oog in meerdere stroken van twee millimeter dik. Elke strook bevat een subset van de gemarkeerde stansgebieden. De oriëntatie van de stroken moet worden gekozen om de beoordeling van verschillende aspecten van de weefselreactie op het implantaat te vergemakkelijken; documenteer de positie van de stansmarkeringen op de monsters zorgvuldig voor toekomstig referentiegebruik.

Plaats vervolgens de strip, met de zijde die eerst gesneden moet worden naar beneden gericht, in een ondiepe plas vloeibare agar. Zodra de agar is gestold, snijdt u rond het monster en plaatst u dit in een weefselcassette ondersteund door schuiminlegstukken. Na het dissekeren en inbedden van het controle-oog plaatst u de cassettes in neutraal gebufferd formine en verwerkt u deze gedurende de nacht via een standaard geautomatiseerde paraffine-verwerkingstechniek van 12 uur.

Inbed de bewerkte weefsels de volgende dag in paraffine, waarbij de zijde die als eerste gesneden moet worden naar beneden is gericht. Snijd de paraffineblokken vervolgens in coupes van vijf micron. Monteer daarna de coupes van elk van de gekleurde regio's op objectglazen.

Controleer de coupes regelmatig onder een microscoop om de DY-regio te lokaliseren. De gebieden die direct grenzen aan elke gekleurde plek van de sclera zijn de gebieden die zich het dichtst bij de corresponderende elektrode van de array bevonden. Kleur tot slot de coupes naar wens.

Hoog dynamisch bereik. Macrofotografieën van een geënucleerd kattenoog met een suprachoroidale elektrode-array in situ worden getoond na fixatie met Davidson-fixatief en vóór het verwijderen van de array. De doorschijnende sclera maakt visualisatie van de individuele elektroden in de array mogelijk.

Zoals aangegeven met de pijl, zijn de elektroden gemarkeerd met een vooraf gedefinieerd kleurenschema van kleurstoffen. Deze kleurmarkeringen, die met regelmatige tussenpozen ten opzichte van anatomische referentiepunten zijn aangebracht, worden gebruikt om consistentie tussen experimenten te waarborgen. Na verwijdering van de elektrode-array wordt het oog met de hand gedisseceerd in monsterstroken.

De pijlpunten geven twee van de elektrode-nabijgelegen plaatsen op de sclera aan. De stippellijn geeft het doorsnedevlak aan in deze representatieve sectie, verkregen door het monster uit de vorige figuur te snijden; de grove vorm van de monsterstrip is behouden met minimale differentiële weefselartefacten. Beide kleuringstekeningen zijn nog steeds zichtbaar op de sclera, zoals aangegeven door de pijlpunten.

Hoewel de groene kleurstof beständiger was dan de rode, geeft de locatie van de kleurstof de positie van een elektrode aan. Daarom kan het aangrenzende retinaweefsel worden beoordeeld op schade, indien aanwezig, veroorzaakt door elektrische stimulatie; zoals te zien is bij deze vergroting, waren de retinalagen grenzend aan de groene kleurstof in de vorige afbeelding feitelijk niet losgelaten en was de retinale morfologie hier behouden. Representatieve speciale kleuringen en immunohistochemie van retinaweefselcoupes, verwerkt volgens het huidige protocol, worden getoond in deze eerste afbeelding.

Hematine kleurde de celkernen blauw, terwijl eosine het cytoplasma van de cellen, collageen en steunweefsel in diverse tinten roze kleurde. In deze afbeelding kleurde luxol fast blue het myeline blauw. De tegenkleuring met cresylviolet werd gebruikt om de ganglioncellen te identificeren door de Nissl-lichaampjes binnen de pericarya blauw te kleuren en de omringende satellietcellen te accentueren. In deze met Masson's trichroom blauw behandelde sectie kleurde de BRIC Scarlet acid fuchsine-oplossing de spiervezels rood, terwijl anilineblauw het collageen kleurde.

In dit geval zijn voor deze sectie de sclera-blauwe kleuring met periodic acid-Schiff gebruikt, waarbij de glycoproteïnecomponenten van het basaalmembraan en de bindweefselcomponenten paars verschijnen, terwijl de celkernen door de hematoxyline-tegenkleuring blauw verschijnen. De in deze afbeelding getoonde subsclerale sectie is behandeld met Pearl's Prussian blue op de plaats van de bloeding. De vorming van hemosiderine uit afgebroken rode bloedcellen en het vrijkomen van ijzercomplexen zorgden voor een paarse kleur.

De toevoeging van neutraalrood kleurde de lysosomen rood in deze afbeelding; anti-glutamine synthetase werd gekleurd. Dit neurotransmitter-afbrekende enzym, dat in het groen zichtbaar is in Müllercellen, strekt zich uit in beide richtingen, met de Müllercelkernen in de binnenste kernlaag en de voetjes van de Müllercellen die het binnenste begrensende membraan vormen. Voor de kleuring van het neurofilament-eiwit werd dit zware keten cytoskelet-eiwit groen gelabeld; het bevindt zich in het cellichaam en de uitlopers. Het neurofilament-eiwit vormt crosslinks met andere neurofilamenten om de structuur van neuronen te behouden.

Ganglioncellen en hun axonen kunnen worden waargenomen in de ganglioncellaag en de zenuwvezellaag, terwijl de axonen van de horizontale cellen, die zich aan de buitenrand van de binnenste nucleaire laag in het kattenretina bevinden, groen kleuren. In deze laatste afbeelding wordt gliaal fibrillair zuur eiwit getoond; dit cytoskelet-eiwit, in rood, prolifereert in Müller-cellen en astrocyten tijdens gliose en is zichtbaar langs de zenuwvezellaag, waarbij Müller-cellen dunne uitlopers vormen van de binnenste naar de buitenste retinalagen. Tegenkleuring met DPI in blauw maakt visualisatie van de retinalagen mogelijk.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een monster-workflow in drie dimensies te visualiseren en de oriëntatie van de monsters gedurende de gehele procedure regelmatig in overweging te nemen. Na het volgen van deze procedure kunnen alle histologische methoden worden gebruikt om aanvullende veiligheidsvraagstukken na de ontwikkeling te beantwoorden. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in de ontwikkeling van bionische ogen om de veilige stimulatieniveaus op de lange termijn voor blinde patiënten te beoordelen.

Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht gekregen in hoe de veiligheid van een bionisch oogimplantaat kan worden geëvalueerd.