Technieken voor verwerking Ogen geïmplanteerd met een Retina Prothese voor Gelokaliseerde histopathologisch Analysis

Het algemene doel van deze procedure is om de evaluatie van de veiligheid van retinale prothesen te verbeteren. Dit wordt bereikt door eerst het oppervlak van een optimaal gefixeerd geënucleeerd oog te labelen met weefseldyes om de positie van een geïmplanteerde elektrode aan te geven. In de tweede stap wordt het elektrodenarray verwijderd en wordt het oogweefsel in stroken gesneden.

Vervolgens worden de stroken gestabiliseerd in agar en vervolgens in paraffine ingebed. In de laatste stap worden de gemarkeerde gebieden van belang gesneden en verzameld op dia's voor kleuring. Uiteindelijk kan de gezondheid van de geïmplanteerde gebieden naast elke elektrode worden geëvalueerd door lichtveld- en immunofluorescentiemicroscopie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat artefacten gerelateerd aan fixatie en delaminatie kunnen worden geminimaliseerd, terwijl weefselgebieden naast de elektroden nauwkeurig kunnen worden gevolgd in grote monsters. Het kan ook worden gebruikt bij het evalueren van de veiligheid van nieuwe implantaten voor andere oogziekten. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode het een uitdaging vinden omdat een retina vatbaar is voor delaminatie en een hoge mate van handigheid vereist is voor het hanteren van de monsters.

Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk omdat markeren en hanteren van het kwetsbare weefsel moeilijk te leren is. Voorafgaand aan deze studie werden de ogen na implantatie met een suprachoroïde elektrodenarray eerder verwerkt met behulp van een niet-optimale techniek, zoals aangegeven door de ster. Deze eerste afbeelding toont een representatieve orthogonale sectie door de elektrodenarrayholte.

Merk op dat de retina los is van het buitenste oogweefsel. Dit is bijzonder duidelijk onder het geïmplanteerde gebied, zoals aangegeven door de pijlpunt. Merk ook op dat het niet mogelijk is om te bepalen welk deel van de retina naast elke individuele elektrode van de array lag.

Bij hogere vergroting zijn er verschillende regelmatige vrijlatingsgebaseerde artefacten in de retinale lagen, zoals aangegeven door de pijlpunten, evenals een grote loslating van de torpedolaag, de reflecterende laag in het kattenoog. Bij verdere vergroting kan worden waargenomen dat de buitenste segmenten van de fotoreceptoren, evenals het gepigmenteerde epitheel, intact blijven, wat suggereert dat eerder waargenomen loslatingen of artefactuele neveneffecten van de verwerking in plaats van het resultaat van in vivo-trauma of pathologie waren. Daarom werd de volgende techniek geïmplementeerd om deze fixatiegerelateerde artefacten en delaminatie te minimaliseren.

Na het nucleeren en fixeren van de ogen begint men met het verwijderen van een geïmplanteerde oogbol uit ethanol en het zorgvuldig wegsnijden van overtollig weefsel, inclusief het bindvlies en de peescapsule. Snijd de oogzenuw tot een lengte van twee tot drie millimeter. Het elektrodenarray is zichtbaar door de semi-transparante sclera.

Gebruik vervolgens een fijne penseeltip om voorzichtig histologische kleurstoffen aan te brengen op het weefsel om de elektroden te labelen met een vooraf gedefinieerde kleurcode. Zorg ervoor dat de kleurstof niet waait. Extra kleurstofmarkeringen kunnen worden gemaakt om punten van belang te definiëren of om secties te helpen uitlijnen.

Hier zijn de maximaal gestimuleerde elektroden gelabeld met groen. De andere actieve elektroden zijn gelabeld met rood. De return-elektroden met een groter diameter zijn geel gekleurd en eventuele extra leidingen of anatomische markeringen zijn gelabeld met blauwe kleurstof.

Na vijf minuten luchtdrogen, brengt u de oogbol terug naar de 70% ethanol om de kleurstof uit te drogen. Vervolgens, na het wegsnijden van overtollig weefsel van de ongeplante controle-oogbol zoals zojuist is gedemonstreerd, gebruikt u de acht nylonnaden die tijdens de nucleatie- en fixatiestap zijn bevestigd om de controle- en geïmplanteerde ogen als een gespiegeld paar uit te lijnen. Plaats vervolgens een siliconensjabloon met dezelfde afmetingen als het elektrodenarray op een gespiegelde locatie op de controle I die overeenkomt met de locatie van het array in het geïmplanteerde oog.

Label vervolgens de controle-oogbol zoals zojuist is gedemonstreerd, zodat elke geïmplanteerde elektrodelocatie een controlepaar heeft op een anatomisch vergelijkbare locatie. Vervolgens verwijdert u het implantaatarray uit het oog en vervolgens het voorste deel van het oog, inclusief het hoornvlies, de iris en de lens. Vervolgens verwijdert u de glasvocht uit de resterende oogbeker.

Snijd nu het geïmplanteerde oog in meerdere stroken van twee millimeter dik. Elk bevat een subset van de gekleurde gemarkeerde regio's. De oriëntatie van de stroken moet worden geselecteerd om te helpen bij de beoordeling van verschillende aspecten van de weefselrespons op het implantaat, documenteer zorgvuldig de positie van de kleurstofmarkeringen op de monsters voor toekomstig gebruik.

Plaats vervolgens de strook met de kant die als eerste wordt gesneden naar beneden in een ondiepe pool van vloeibare agar. Zodra de agar is gestold, snijdt u rond het monster en plaatst u het in een weefselcassette ondersteund door schuiminserts. Na het dissekeren en inbedden van het controleoog, plaatst u de cassettes in neutraal gebufferde formine en verwerkt u ze 's nachts via een standaard geautomatiseerde 12 uur durende paraffine verwerkingstechniek.

De volgende dag, begraaft u het verwerkte weefsel in paraffine met de kant die als eerste wordt gesneden naar beneden. Snijd nu de paraffineblokjes in vijf micronsecties. Monteer vervolgens de secties van elk van de gekleurde regio's op dia's.

Om het DY-gebied regelmatig te lokaliseren, controleert u de dia's onder een microscoop. De regio's die direct naast elke gekleurde plek van de sclera liggen, zijn die welke in de naaste nabijheid waren van de overeenkomstige elektrode uit het array. Vervolgens worden de secties naar wens gekleurd.

Hoge dynamische waaier. Macrofoto's van een geënucleeerd kattenoog met een suprachoroïde elektrodenarray in situ worden getoond na fixatie met davidson's fixatief en voorafgaand aan het verwijderen van de array. De transparante