Name: Technieken voor verwerking Ogen geïmplanteerd met een Retina Prothese voor Gelokaliseerde histopathologisch Analysis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Leer een verbeterde techniek voor de verwerking van ogen met een retina-prothese om fixatie-artefacten te minimaliseren en weefselgezondheid naast elektroden nauwkeurig te evalueren met helderveld- en immunofluorescentiemicroscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen bedanken: mevrouw Alexia Saunders en mevrouw Michelle McPhedran voor experimentele bijstand; mevrouw Helen Feng voor elektrode fabricage; Dr Penny Allen en dr. Jonathan Yeoh voor chirurgische bijstand; personeel van de Royal Victorian Eye en Ear Hospital&#39;s Biological Onderzoekscentrum voor de verzorging van dieren; prof. Rob Shepherd voor algemene begeleiding en Dr Bryony Nayagam en de heer Ronald Leung voor kritische opmerkingen over een ontwerp-vorm van het manuscript. Dit werk werd uitgevoerd bij het Bionics Institute en St Vincent&#39;s Hospital, Melbourne. De financiering werd verstrekt door de Ian Potter Foundation, de John T Reid Charitable Trusts, en de Australische Raad voor Onderzoek door middel van haar speciale Research Initiative in Bionic Visie Wetenschap en Technologie subsidie ​​om Bionic Vision Australia (BVA). De Bionics Instituut erkent de steun die zij ontvangt van de Victoriaanse regering via haar operationele Infrastructure Support Program.

1. Enucleatie en Post-Fixation Dit protocol gaat ervan uit dat het onderwerp is eenzijdig geïmplanteerd met een suprachoroïdale elektrode-array. <ol><li> Bereid postfix oplossingen in glazen Schott flessen. <ol class="lalpha"><li> Davidson&#39;s fixatief oplossing, 2x 100 ml <ul><li> 2 ml formaline (37% formaldehyde) </li><li> 10 ml ijsazijn (99,7%) </li><li> 35 ml ethanol (98%) </li><li> 53 ml gedestilleerd water </li></ul></li><li> 50% ethanol, 2x 100 ml </li><li> 70% ethanol, 2x 100 ml </li></ol></li><li> Transcardiaal perfuseren onderwerp met warme (37 ° C) gehepariniseerde zoutoplossing gevolgd door koud (4 ° C) neutraal gebufferde formaline (10%). </li><li> Bind hechtingen aan de superieure limbus (of een locatie die op afstand van de suprachoroïdale array) van beide ogen - in lijn met een rectusspier, om te dienen als een mijlpaal. </li><li> Ophelderen ogen, behoud van alle externe kabels uit de geïmplanteerde oog. </li><li> Plaats each oog in 100 ml Davidson&#39;s fixatief oplossing en laat op een post-fix bij kamertemperatuur. </li><li> Na 18-36 uur in Davidson&#39;s fixatief, over te dragen aan 50% ethanol (kamertemperatuur) voor 6 - 8 uur, dan uiteindelijk tot 70% ethanol (kamertemperatuur). </li><li> Koel monsters bij 4 ° C en bewaar tot dissectie. </li></ol> Intact en druk oog globes zijn opgeslagen op deze manier voor maximaal 3 maanden zonder schadelijke gevolgen voor de resulterende histologie. 2. Identificatie en Tissue Mapping Bovenstaande fixatie protocol (stap 1) heeft de sclera doorzichtig gemaakt en de array nu zichtbaar - inclusief de individuele elektroden plaatsen (Figuur 3). <ol><li> Verwijder de geïmplanteerde wereld uit ethanol en zorgvuldig weggesneden overtollige weefsel, waaronder bindvlies en oogkapsel. Trim oogzenuw naar een 2 - 3 mm lengte (Figuur 3A). </li><li> Met behulp van een histologische kleurstof marking regeling, etiket de elektroden met een vooraf gedefinieerde kleurcode, zorg ervoor dat u de kleurstof vlekken. </li></ol><ul><li> We kozen voor een in de handel verkrijgbaar suite van gespecialiseerde histologische kleurstof (zie bijlage). Kleine hoeveelheden van de kleurstof werden zorgvuldig aangebracht met een fijne tip penseel (Roymac maat 00) aan het weefsel en aan de lucht gedroogd tot 5 minuten. </li><li> Voor ons doel, hebben we gekozen: groen voor de actieve elektrode (s) die was (waren) gestimuleerd maximaal, op bovendrempelige niveaus, voor de duur van de studie, rood voor andere actieve elektroden, geel voor de grotere diameter terugkeer elektroden, en blauw voor extra gidsen en / of markeringen anatomische afstand (Figuren 3B en 3C). </li><li> Wat trial and error kan worden verplicht om een ​​kleurstof die stabiel is gedurende de daarop volgende stappen vinden. Bijvoorbeeld, in figuur 4, kan worden gezien dat de groene kleurstof is veerkrachtiger dan de rode kleurstof. Verdunnen van de kleurstof in 70% ethanol verbetert lipide penetrantsoen en weefsel coating. </li><li> Het is nuttig om te schetsen of fotograferen de geverfde wereld voor toekomstige referentie. </li></ul><ol start="3"><li> Keer terug naar 70% ethanol om de kleurstof te dehydrateren. </li><li> Herhaal stap 2.1 voor de niet-geïmplanteerde controle aardbol. </li><li> Met behulp van de hechtingen uit stap 1.3, lijn de controle oog en de geïmplanteerde oog als een gespiegeld paar. </li><li> Plaats een siliconen mal (met dezelfde afmetingen als de elektrode-reeks) in de gespiegelde locatie op de controle oog als het implantaat zich in geïmplanteerde oog (NB de doorschijnende sclera en de kleurstof noteringen van stap 2.2 kan direct visualisatie van de geïmplanteerde matrix positie ). </li><li> De stappen 2.2 en 2.3 het controle-oog, zodat elke geïmplanteerde elektrode heeft een controle-paar op een anatomisch vergelijkbaar (dwz mirror equivalent met) locatie. </li></ol> 3. Dissectie en Embedding <ol><li> Verwijder het implantaat matrix van het oog en verwijder de voorkant van het oog(Met inbegrip van de cornea, iris en lens). Verwijder het glasvocht vloeistof uit de resterende oogschelp (achterste kamer). </li><li> Ontleden het oog geïmplanteerd in meerdere representatieve stroken (~ 2 mm dikte) die elk een deel van de kleurstof gemarkeerde gebieden (figuur 3D). Merk op dat de oriëntatie van de stroken worden gekozen om te helpen bij de beoordeling verschillende aspecten van de weefselreactie op het implantaat 7. </li></ol> Het is nuttig, voor toekomstig gebruik, tot een record van die kleurstof regio&#39;s aanwezig op elke strip en hun relatieve locaties (en kleuren) zijn te maken. <ol start="3"><li> Plaats de strip aan de zijkant in een ondiepe plas vloeibaar agar (4%; 80 - 90 ° C) met de zijkant te snijden eerst naar beneden (figuur 3E). </li><li> Zodra de agar heeft ingesteld, snijd rond het monster en plaats in een weefsel cassette ondersteund door foam inserts (figuur 3F). </li><li> Herhaal stappen 3.1-3.3 ter bestrijding eye - taking zorg aan spiegel-geëvenaard strips ontleden. </li><li> Verwerk alle cassettes via standaard (geautomatiseerde overnight) paraffine verwerkingstechniek. </li><li> Insluiten verwerkt weefsel in paraffine met de zijkant te snijden eerst naar beneden. </li></ol> 4. Snijden en kleuring <ol><li> Snijd paraffine blokken in 5 micrometer secties regelmatig verwijzen naar de toelichting van de stappen 2 en 3. </li><li> Verzamel gedeelten van elk van de gekleurde gebieden en monteren op objectglaasjes. </li></ol> Het gebied direct naast elkaar geverfd plek van sclera kan nu worden beoordeeld met vertrouwen dat het dichtst in de nabijheid van de overeenkomstige elektrode in de array (figuur 4). <ol start="3"><li> Beits of presteren immunofluorescentie zoals gewenst. Voorbeeld vlekken en immunohistochemie weergegeven in figuur 5 zijn: H &amp;E; Luxol snel blauw (LFB); cresylviolet; Masson trichroom blauw; perjoodzuur Schiff (PAS); Perls &#39;Pruisisch blauw stain, anti-glutamine synthetase (GS), anti-neurofilament proteïne (NF), anti-glia fibrillair zuur eiwit (GFAP) en 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). </li><li> Standaard en speciale vlekken waren zo gedetailleerd uitgevoerd: <ol><li> H &amp; E kleuring werd uitgevoerd volgens het protocol geleverd door Leica Multistainer bad scala ST5020 (Leica Biosystems). </li><li> LFB en cresylviolet (gewijzigd vanaf 11): <ol><li> Dewax in 3 veranderingen van xyleen (3x 2 min) en 2 wijzigingen van ethanol (100%, 100%) (2 x 1 min) en spoelen met leidingwater (45 sec). </li><li> Hydrateren secties tot 95% ethanol. </li><li> Plaats in LFB oplossing 11 bij 37-42 ° C (&#39;s nachts). </li><li> Afspoelen overtollige vlek met 70% ethanol. </li><li> Spoelen in gedestilleerd water. </li><li> In verdunde lithiumcarbonaat (8%) (enkele seconden). </li><li> Onderscheid in 70% ethanol (enkele seconden). </li><li> Spoelen in gedestilleerd water. </li><li> Herhaal de stappen 4.4.2.6 tot 4.4.2.8, indien nodig, tot background is kleurloos. </li><li> In cresylviolet acetaat werkoplossing bij 37 ° C (10 min). </li><li> Niet wassen in water. </li><li> Uitdrogen in 3 veranderingen van absolute alcohol (1x 30 sec, 2x 20 sec) en 3 veranderingen van xyleen (1x 1 min 30 sec, 2x 1 min.). </li><li> Mount en dekglaasje met DPX. </li></ol></li><li> Masson trichroom blauw (gewijzigd vanaf 11): <ol><li> Dewax volgens 4.4.2.1. </li><li> Breng secties om water (2 min). </li><li> Vlekken op de kernen met Weigert&#39;s ijzer hematoxyline (2 min). </li><li> Spoelen met kraanwater afspoelen in gedestilleerd water. </li><li> Vlek in Biebrich scharlaken-zuur fuchsine oplossing (5 min). </li><li> Spoelen in gedestilleerd water. </li><li> Differentiëren in fosfomolybdeenzuur-fosfowolfraamzuur tot collageen is lichtroze (6 min). </li><li> Spoelen in gedestilleerd water. </li><li> Achtergrondkleuring in aniline blauw (1 min). </li><li> Goed wassen in 1% azijnzuur (1 min). </li><li> Uitdrogen, mount en dekglaasje als pER 4.4.2.12 en 4.4.2.13. </li></ol></li><li> PAS (gewijzigd van 11): <ol><li> Dewax volgens 4.4.2.1. </li><li> Oxideren in 1% perjoodzuur (15 min). </li><li> Wassen onder stromend water vervolgens gedestilleerd water. </li><li> Vlek in Schiff&#39;s reagens (15 min). </li><li> Wassen in water (5 min). </li><li> Tegenkleuring met Harris hematoxyline (1 min). </li><li> Kort in kraantjeswater. </li><li> Differentiëren in 0,5% zuur alcohol (1 duik). </li><li> Goed wassen in leidingwater. </li><li> Blauw in Scott&#39;s kraanwater (1 min). </li><li> Goed met water wassen. </li><li> Uitdrogen, mount en dekglaasje als per 4.4.2.12 en 4.4.2.13. </li></ol></li><li> Perls &#39;Pruisisch blauwe vlek, zoals beschreven in 11. </li></ol></li><li> Immunofluorescentie kleuring werd uitgevoerd zoals gedetailleerd: <ol><li> Dewax volgens 4.4.2.1. </li><li> Spoelen in gedestilleerd water (2x 5 min.). </li><li> Voer antigenen met 0,01% citraatbuffer, pH 6 bij 75-80 ° C (20 min) eend laat afkoelen in 0,01% citraat bufferoplossing (20 min). </li><li> Wassen secties in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (2x 5 min). </li><li> Permeabel de celmembraan wasbuffer oplossing (10 min). </li><li> Incubeer in serum blokkeeroplossing (2 uur). </li><li> Incubeer secties in een primair antilichaam verdund in antilichaamverdunner (10% normaal geit serum/0.1% Triton X-100/PBS) (&#39;s nachts in de koelkast). De titer van elke primaire antilichaam dat wordt weergegeven in tabel 1. </li><li> Na overnacht incubatie, wassen secties in wasbuffer oplossing (5x 3 min). Vanaf dit punt, houden secties in het donker. </li><li> Incubeer secties in de corresponderende tweede antilichaam bij een titer van 1:500 voor een bepaalde duur (zie tabel 1 voor details). </li><li> Wassen secties in wasbuffer oplossing (3 x 5 min). </li><li> Incubeer secties in DAPI (1:25.000 / PBS) (30 min). </li><li> Wassen secties in wasbuffer oplossing (3 x 5 min). </li><li> Mount en dekglaasje met fluorescerennt montage media. </li></ol></li></ol> Proefmonsters en controlemonsters zijn klaar voor paarsgewijze vergelijking.

<ol><li>Santos, A., Humayun, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+the+inner+retina+in+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa.</a> Arch. Ophthalmol. 115, 511-515 (1997).</li>
<li>Humayun, M. S., Weiland, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+perception+in+a+blind+subject+with+a+chronic+microelectronic+retinal+prosthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Visual perception in a blind subject with a chronic microelectronic retinal prosthesis.</a> Vision Res. 43, 2573-2581 (2003).</li>
<li>Roessler, G., Laube, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiographic+findings+folowing+tack+fixation+of+a+wireless+epiretinal+retina+implant+device+in+blind+RP+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes.+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Angiographic findings folowing tack fixation of a wireless epiretinal retina implant device in blind RP patients.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 1281-1286 (2011).</li>
<li>Chow, A. Y., Chow, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+artificial+silicon+retina+microchip+for+the+treatment+of+vision+loss+from+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The artificial silicon retina microchip for the treatment of vision loss from retinitis pigmentosa.</a> Arch. Ophthalmol. 122, 460-469 (2004).</li>
<li>Zrenner, E., Bartz-Schmidt, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+electronic+chips+allow+blind+patients+to+read+letters+and+combine+them+to+words%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words.</a> Proc. R. Soc. B. 278, 1489-1497 (2011).</li>
<li>Fujikado, T., Kamei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+of+semichronically+implanted+retinal+prosthesis+by+suprachoroidal-transretinal+stimulation+in+patients+with+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Testing of semichronically implanted retinal prosthesis by suprachoroidal-transretinal stimulation in patients with retinitis pigmentosa.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 4726-4733 (2011).</li>
<li>Villalobos, J., Allen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+surgical+approach+for+a+wide-view+suprachoroidal+retinal+prosthesis%3A+evaluation+of+implantation+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes.+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Development of a surgical approach for a wide-view suprachoroidal retinal prosthesis: evaluation of implantation trauma.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 250, 399-407 (2012).</li>
<li>Latendresse, J. R., Warbittion, A. R., Jonassen, H., Creasy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+of+testes+and+eyes+using+a+modified+Davidson%27s+fluid%3A+comparison+with+Bouin%27s+fluid+and+conventional+Davidson%27s+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Fixation of testes and eyes using a modified Davidson's fluid: comparison with Bouin's fluid and conventional Davidson's fluid.</a> Toxicol. Pathol. 30, 524-533 (2002).</li>
<li>Agrawal, R. N., He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+models+of+proliferative+vitreoretinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo models of proliferative vitreoretinopathy.</a> Nat. Protoc. 2, 67-77 (2007).</li>
<li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+of+whole+eyes%3A+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes.+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 233, 366-370 (1995).</li>
<li>Bancroft, J. D., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBancroft%2C+JD+%22Theory+and+practice+of+histological+techniques%22">Theory and practice of histological techniques</a>. , 6, Churchill Livingstone. (2008).</li>
<li>Horobin, R. W., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHorobin%2C+RW+%22Troubleshooting+histology+stains%22">Troubleshooting histology stains</a>. , Churchill Livingstone. (1998).</li>
<li>Pow, D. V., Robinson, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamante+in+some+retinal+neurons+is+derived+solely+from+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glutamante in some retinal neurons is derived solely from glia.</a> Neuroscience. 60, 355-366 (1994).</li>
<li>Lewis, S. E., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+phosphorylated+variants+of+the+high+molecular+mass+subunit+of+neurofilaments+in+axons+of+retinal+cell+neurons%3A+characterization+and+evidence+for+their+differential+association+with+stationary+and+moving+neurofilaments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple phosphorylated variants of the high molecular mass subunit of neurofilaments in axons of retinal cell neurons: characterization and evidence for their differential association with stationary and moving neurofilaments.</a> J. Cell Biol. 107, 2689-2701 (1988).</li>
<li>Ruiz-Ederra, J., García, M., Hicks, D., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+the+three+neurofilament+subunits+within+pig+and+human+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Comparative study of the three neurofilament subunits within pig and human retinal ganglion cells.</a> Mol. Vis. 10, 83-92 (2004).</li>
<li>Bringmann, A., Pannicke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Müller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog. Retin. Eye Res. 25, 397-424 (2006).</li>
<li>Seo, J. M., Kim, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+of+polyimide+microelectrode+array+for+retinal+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Sci.+Eng.+C%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility of polyimide microelectrode array for retinal stimulation.</a> Mater. Sci. Eng. C. 24, 185-189 (2004).</li>
<li>Gerding, H., Benner, F. P., Taneri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+implantation+of+epiretinal+retina+implants+%28EPI-RET%29+with+an+IOL-type+receiver+unit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Experimental implantation of epiretinal retina implants (EPI-RET) with an IOL-type receiver unit.</a> J. Neural Eng. 4, S38-S49 (2007).</li>
<li>Majji, A. B., Humayun, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+histological+and+electrophysiological+results+of+an+inactive+epiretinal+electrode+array+implantation+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Long-term histological and electrophysiological results of an inactive epiretinal electrode array implantation in dogs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 2073-2081 (1999).</li>
<li>Walter, P., Szurman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+long-term+implantation+of+electrically+inactive+epiretinal+microelectrode+arrays+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Successful long-term implantation of electrically inactive epiretinal microelectrode arrays in rabbits.</a> Retina. 19, 546-552 (1999).</li>
<li>Pardue, M. T., Stubbs, E. B. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+studies+of+the+retina+following+long-term+implantation+with+subretinal+microphotodiode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical studies of the retina following long-term implantation with subretinal microphotodiode arrays.</a> Exp. Eye Res. 73, 333-343 (2001).</li>
<li>Gekeler, F., Szurman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compound+subretinal+prostheses+with+extra-ocular+parts+designed+for+human+trials%3A+successful+long-term+implantation+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes.+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Compound subretinal prostheses with extra-ocular parts designed for human trials: successful long-term implantation in pigs.</a> Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 245, 230-241 (2007).</li>
<li>Montezuma, S. R., Loewenstein, J. I., Scholz, C., Rizzo, J. F. III <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+of+materials+implanted+into+the+subretinal+space+of+Yucatan+minipigs%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility of materials implanted into the subretinal space of Yucatan minipigs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).</li>
<li>Montezuma, S. R., Loewenstein, J. I., Scholz, C., Rizzo, J. F. III <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+of+materials+implanted+into+the+subretinal+space+of+Yucatan+minipigs%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility of materials implanted into the subretinal space of Yucatan minipigs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).</li>
<li>Ray, A., Colodetti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+analysis+of+retinal+neurons+under+electrical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical analysis of retinal neurons under electrical stimulation.</a> Brain Res. 1255, 89-97 (2009).</li>
<li>Nakauchi, K., Fujikado, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold+suprachoroidal-transretinal+stimulation+current+resulting+in+retinal+damage+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Eng%22%5BJournal%5D)">Threshold suprachoroidal-transretinal stimulation current resulting in retinal damage in rabbits.</a> J. Neural. Eng. 4, S50-S57 (2007).</li>
<li>Shepherd, R. K., Murray, M. T., Houghton, M. E., Clark, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy+of+chronically+stimulated+platinum+intracochlear+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy of chronically stimulated platinum intracochlear electrodes.</a> Biomaterials. 6, 237-242 (1985).</li>
<li>Villalobos Villa, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Safety+of+a+Wide-Field+Suprachoroidal+Retinal+Pros%22">Safety of a Wide-Field Suprachoroidal Retinal Prosthesis</a>. , The University of Melbourne. (2012).</li>
<li>Nayagam, D. A. X., Allen, P. J., et al. A Pre-Clinical Model for Chronic Electrical Stimulation of the Retina via Suprachoroidal Electrodes. Association for Research in Vision and Ophthalmology Annual Meeting, Fort Lauderdale, Florida, USA, , (2012).</li>
<li>Nayagam, D. A. X., Villalobos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Suprachoroidal+Retinal+Prosthesis+is+Safe+in+a+Chronic+Implantation+Model%5BTitle%5D)+AND+%22in+Vision+and+Ophthalmology+Annual+Meeting.%2C+Vol.+4928%2FA327%22%5BJournal%5D)">A Suprachoroidal Retinal Prosthesis is Safe in a Chronic Implantation Model.</a> in Vision and Ophthalmology Annual Meeting., Vol. 4928/A327. Association for Research in Vision and Ophthalmology Annual Meeting, Fort Lauderdale, Florida, USA, , (2011).</li>
<li>Cicione, R., Shivdasani, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+cortex+responses+to+suprachoroidal+electrical+stimulation+of+the+retina%3A+effects+of+electrode+return+configuration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Visual cortex responses to suprachoroidal electrical stimulation of the retina: effects of electrode return configuration.</a> J. Neural Eng. 9, 036009(2012).</li>
<li>Schuettler, M., Stiess, S., King, B. V., Suaning, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+implantable+microelectrode+arrays+by+laser+cutting+of+silicone+rubber+and+platinum+foil%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Fabrication of implantable microelectrode arrays by laser cutting of silicone rubber and platinum foil.</a> J. Neural Eng. 2, S121-S128 (2005).</li>
<li>Morimoto, T., Kamei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+implantation+of+newly+developed+suprachoroidal-transretinal+stimulation+prosthesis+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Chronic implantation of newly developed suprachoroidal-transretinal stimulation prosthesis in dogs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6785-6792 (2011).</li>
<li>Bron, A. J., Tripathi, R. C., Tripathi, B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBron%2C+AJ+%22Wolff%27s+anatomy+of+the+eye+and+orbit%22">Wolff's anatomy of the eye and orbit</a>. , Arnold. (2001).</li>
<li>Stein, J. J., Johnson, S. A., Berson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+coverage+of+beta+cells+in+the+cat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distribution and coverage of beta cells in the cat retina.</a> J. Comp. Neurol. 372, 597-617 (1996).</li>
<li>Dagnelie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychophysical+evaluation+for+visual+prosthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Psychophysical evaluation for visual prosthesis.</a> Annu. Rev. Biomed Eng. 10, 339-368 (2008).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

Beoordeling van de veiligheid van het implantaat is een primaire overweging voor preklinische studies. Voordat een netvliesprothese kan worden geïmplanteerd bij mensen is het essentieel om te verifiëren dat het geen schade toebrengen. Dit vereist een beoordeling van zowel het implantaat biocompatibiliteit 17-23 alsmede eventuele schade die kan worden veroorzaakt door chronische elektrische stimulatie 24-26. Ervaring met soortgelijke neurale prothesen, zoals het cochleair implantaat, geeft inzicht in de brede waaier van de stimulatie, en fysische, parameters die niet weefselschade 27 veroorzaken. Echter, het netvlies heeft verschillende kenmerken naar andere implantatieplaatsen en dus nauwkeuriger veiligheidsfactor grenzen (zoals de maximale ladingsdichtheid) kan niet worden uitgegaan van eerdere studies in andere systemen. Ladingsdichtheden zijn het hoogst bij de actieve elektrode plaatsen en dit komt overeen met het grootste potentieel voor de schade. Derhalve een werkwijze voor het lokaliseren van het weefsel direct naastde afzonderlijke actieve elektroden zou verhogen de bruikbaarheid van deze studies. Het weefsel grenzend aan specifieke gebieden van het implantaat kan ook worden uitgelicht nadere inspectie. Deze doelgerichte aanpak het mogelijk om minder secties te analyseren, met behoud van het vertrouwen dat het &quot;worst case scenario&quot; werd onderzocht. De sclerale kleurstof lokalisatie hier beschreven methode is uitgebreid getest met de hand gevormd en gegoten siliconen / Pt-elektrode arrays 28-30. Het is gebruikt bij dunne-film polyamide 7,31 arrays ook dunne-film silicone / Pt arrays 32. Sommige retinale prothese studies tewerkgesteld &quot;kogelvormige&quot; elektroden met intrasclerale implantaties 33. De huidige techniek moet effectief zijn voor de beoordeling van dit type elektrode arrays zijn. Feline ogen met dunne sclera (dikte bij achterpool 90-200 urn) toegestaan ​​visualisatie van afzonderlijke elektroden in een matrix. Echter, zelfs als individuele electrodes niet zichtbaar waren, hun posities gemakkelijk kunnen worden afgeleid met behulp van een siliconen mal als het kader van de array kan worden gezien (vergelijkbaar met die in stap 2.6). De kleurstof mapping beperkt de noodzaak om niet-relevante weefselsecties verkrijgen over gedeelten met kleurstofheden verkregen. De mogelijkheid om elektrode positie nauwkeurig afleiden laat niet alleen relevant histopathologische analyse en een groter statistisch onderscheidingsvermogen, maar heeft een grote impact op tijd en kosten beheer door het verminderen van de hoeveelheid dia&#39;s en bladen evenals gebruikt als de kosten van arbeid. Het gebruik van de kleurstof die is aanhangend en kan weefselverwerking weerstaan ​​terwijl ook zichtbaar in ongekleurde coupes is een belangrijke eerste overweging. Kennis van de locatie van de kleurstof en de oriëntatie van het weefsel wordt bij de ontleding en tijdens inbedden ondersteunt het snijproces. Dit omvat correct oriënteren het blok naar een gedeelte dat niet schuin is afgesneden te bereiken en geeft een volledige vertegenwooreen van het weefsel. Het is daarom belangrijk dat de persoon die de snij die ten tijde van kleurstof aanvraag dissectie en inbedding. De totale protocol is robuust om minder belangrijke wijzigingen, met name fixatie timings. Echter, het oog dissectie en kleurstof markering stappen zijn complexe handelingen die profiteren van een goede handvaardigheid om beschadiging van het monster te voorkomen. Terwijl Davidson fixatief is effectief voor het verminderen van artefacten loslating van het netvlies bij een implantaat bleek, is het niet tijdens dissectie effectief directe mechanische beschadiging. Davidson&#39;s fixatief was moeilijk te verenigen met een aantal speciale histologische en immunohistochemische procedures. Daarom was er behoefte aan deze stappen te wijzigen / optimaliseren zoals hierboven beschreven. Incrementele veranderingen in kleuring tijden en concentraties werden gemaakt tot het optimale resultaat werd bereikt - voor meer details, zie de aanvullende materialen. Kwantificering van retinalehistologie blijft problematisch. Het netvlies is niet homogeen en zowel de dikte en de celdichtheid veranderen met toenemende afstand van de lokale centralis 34,35. Daarom kan naburige weefsel in het oog geïmplanteerde niet worden gebruikt voor vergelijkingen en controleoog plaats daarvan toegepast. Paarsgewijs matching van elke sectie met de controle-oog geeft ons een meer krachtige statistische vergelijking van de pathologische veranderingen; werkzaamheid en veiligheid resultaten met retinale prothesen worden beter beoordeeld bij het ​​vergelijken van de collega-ogen in een subject 36. Speciale zorg moet worden genomen om schuin snijden te minimaliseren, omdat dit zou kwantificering beïnvloeden. Kortom, de hierboven beschreven werkwijzen aanzienlijk verbeterd onze histopathologische analyse, die op zijn beurt geleid tot een efficiëntere preklinische workflow. De resultaten van preklinische studies met behulp van deze methoden direct geleid tot een klinische proef waarbij 3 RP patiënten zijn veilig geïmplanteerd met suprachoroidal retinale prothesen. Deze methoden zijn relevant zowel retinale stimulatoren en andere oculaire implantaten waarbij de pathologische respons op lange termijn implantatie moeten worden onderworpen. Deze methode verstrekt waardevolle voordelen voor het behoud van de cytoarchitecture en registratie van de pathologie aan de regio&#39;s van de rente op het implantaat. Hoewel niet specifiek onderzocht kan een modificatie van deze procedures worden gebruikt in andere soorten en andere anatomische locaties, met name wanneer een array oppervlakkig wordt geïmplanteerd.

Retinale prothesen kan binnenkort nuttige klinische interventies voor de behandeling van verschillende vormen van ernstige gezichtsverlies. Bepaalde omstandigheden, zoals retinitis pigmentosa (RP), resulteren in wijdverspreide degeneratie van fotoreceptoren in het oog, dit zijn de cellen die verantwoordelijk zijn voor het transduceren van licht in neurale signalen. Sommige cellen in andere lagen van de retina blijven en zijn potentiële doelwitten voor elektrische stimulatie met een netvliesprothese 1. De eerste resultaten van klinische proeven zijn veelbelovend voor elektrodenseries geïmplanteerd in de epiretinale 2,3, subretinal 4,5 en intrasclerale 6 locaties. Deze apparaten zijn gemaakt van verschillende materialen met verschillende vormen, maar ze gebruiken elektrische pulsen om de resterende levensvatbare neuronen van de retina om visuele waarnemingen maken activeren. Onze bredere groep (Bionic Vision Australia) heeft een retinale implantaat dat progressie heeft ontwikkeldsed om een klinische pilotstudie met 3 RP patiënten geïmplanteerd met suprachoroïdale elektrode arrays (Clinical Trial Number: NCT01603576). Figuur 1A toont dit suprachoroïdale prototype retinale prothese. Veiligheid van de patiënt staat voorop in klinische studies en dus, alvorens met menselijke proeven, uitgevoerd we uitgebreide acute en chronische testen in preklinische modellen (Figuur 1B). Histopathologische beoordeling noodzakelijk waren om de chirurgische procedures te verfijnen, doorloopt elektrodeontwerp en uiteindelijk vaststellen van de veiligheid van het implantaat. Om een ​​efficiënte workflow afgestemd met standaard klinische pathologie praktijken te handhaven, werd een paraffine inbedding toegepaste techniek. Het is eveneens wenselijk kleuringen vergelijkbaar met klinische normen, zoals hematoxyline en eosine (H &amp; E), die gemakkelijk door pathologen worden geïnterpreteerd gebruiken. We wilden een techniek die kan worden aangepast voor immunohistochemische analyse, inOm verdere cellulaire evaluatie van de weefsels te vergemakkelijken. De biocompatibiliteit van het implantaat materialen, en de veiligheid van chronische elektrische stimulatie, moeten zorgvuldig worden geëvalueerd. Het is belangrijk om de histopathologie van het oogweefsel nabij de afzonderlijke stimulatie-elektroden in de array te onderzoeken. De arrays moest worden verwijderd vóór behandelen van monsters zodat ze kunnen worden getest, en omdat hun metaalcomponenten kon gemakkelijk doorgesneden. Bijgevolg heeft onze gevestigde weefselbereiding niet toe lokalisatie en kartering van weefsel ten opzichte van de geïmplanteerde elektroden 7. Naast het ontbreken van een weefsellokalisatie methode, de standaard formaldehyde gebaseerde fixatie en verwerkingstechnieken geleid tot grootschalige artefacten en loslating van het netvlies als gevolg van de differentiële krimp van de verschillende lagen van het oog (figuur 2). Vanwege de niet-homogeniteit van tHij retina, het moeilijk zinvolle vergelijkingen met controleweefsel, met name voor kwantitatieve metingen. De combinatie van deze beperkingen gecompliceerd nauwkeurige evaluaties van de potentiële schade veroorzaakt door onze geïmplanteerde arrays. Hier presenteren we nieuwe technieken voor het overwinnen van deze beperkingen. Wij hebben gespecialiseerde oogfixatie en verwerkingstechnieken aangepast 8-10 om de compatibiliteit met paraffine-gebaseerde histologie behouden. We hebben standaard histologische en immunohistochemische vlekken aangepast om vergelijkbare resultaten te geven, gebaseerd op feedback van klinisch pathologen. Na waardoor de sclerale weefsel doorschijnend, werd een dye-gebaseerde kleur-code gebruikt om het oogweefsel grenzend aan elke afzonderlijke elektrode markeren, voordat u de array van de suprachoroïdale ruimte. Door het markeren van de elektrode-reeks en de individuele elektrodeplaatsen kan monsters nauwkeurig vanuit elektrode aangrenzende gebieden. Matched monsters kunnen worden verzameld van the controleoog om paarsgewijze vergelijkingen te vergemakkelijken.

<table><tbody><tr><td>The Davidson marking system</td><td>Bradley Products</td><td>1163-4 - rood 1163-5 - blauw 1163-2 - geel 1163-1- groen</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rabbit Polyclonal Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody</td><td>Millipore</td><td>AB5804</td><td>1:1500, overnacht incubatie</td></tr><tr><td>Mouse Monoclonal Anti-Glutamine Synthetase Antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td>1:100 overnacht incubatie</td></tr><tr><td>Monoclonal Mouse Anti-Neurofilament 200 Antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0142</td><td>1:100 overnacht incubatie</td></tr><tr><td>4',6-diamindino-2-fenylindole, dilactaat (dilactaat)</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td>1:25.000 30 min incubatie</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Superfrost 90&deg; geel</td><td>Grale Scientific</td><td>SF41299</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FLEX IHC Microscoopglazen</td><td>DAKO</td><td>K802021-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11037</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Normaal geitenserum</td><td>Life Technologies</td><td>PCN5000</td><td>10% serum/0,1% Triton X-100/PBS</td></tr><tr><td colspan="4"> Niet-standaard oplossingsvoorbereiding voor speciale vlekken 1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution <ul> <li>Cresyl violet 1 g</li> <li>Gedestilleerde water 100 ml</li> </ul> Cresyl Violet Acetaat Werkoplossing <ul> <li>1% waterige cresyl violet stockoplossing 9 ml</li> <li>Gedestilleerde water 51 ml</li> <li>10% azijnzuur 0,5 ml</li> </ul> Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution <ul> <li>1% Beihrich scarlet 90 ml</li> <li>1% acid fuchsin 10 ml</li> <li>Glacial azijnzuur 1 ml</li> </ul> Fosfomolybdenzuur-Fosfowolfraamzuur Oplossing <ul> <li>Fosfomolybdenzuur 2,5 g</li> <li>Fosfowolfraamzuur 2,5 g</li> <li>Gedestilleerde water 100 ml</li> </ul> Aniline Blauw Oplossing <ul> <li>Aniline blauw 2,5 g</li> <li>Glacial azijnzuur 2 g</li> <li>Gedestilleerde water 100 ml</li> </ul> Oplossingen voor Immunohistochemische analyse Wasbufferoplossing <ul> <li>0,1% Triton X-100 in fosfaatgebufferd zout (PBS)</li> </ul> Serum Blokkeringsoplossing <ul> <li>10% normaal geitenserum/0,1% Triton X-100 in PBS</li> </ul> AANVULLEND MATERIAAL Luxol Fast Blue Het doel van het uitvoeren van een Luxol Fast Blue (LFB) vlek was om de ganglioncellen in de ganglioncel-laag te identificeren door de tegenkleuring van cresyl violet. Terwijl LFB myeline kleurt, bindt de cresyl violet vlek aan de Nissl-stoffen in neuronen, bestaande uit ruw endoplasmatisch reticulum en ribosomen. Talrijke cellen in de retina bevatten Nissl-stof, inclusief amacrine cellen. Deze cellen bevinden zich meestal in de binnenste grenslaag van de binnenste nucleaire laag, maar verplaatste amacrine cellen kunnen worden gevonden in de ganglioncel-laag. De kleuring van Nissl-stof is nuttig bij het differentiëren van grote, zwaar gekleurde ganglioncellen van kleinere verplaatste amacrine cellen. Om de visualisatie van deze cellen te helpen, hebben we het cresyl violet werkoplossing protocol gewijzigd door het volume van de cresyl violet stockoplossing in de werkoplossing te verhogen. We verhoogden het volume met 1,0 ml incrementen van 6,0 ml tot 9,0 ml, waardoor het volume van gedestilleerde water werd verminderd. Na het beoordelen van de gemakkelijke visualisatie en identificatie van de ganglioncellen, werd optimale kleuring bereikt met 9 ml extra cresyl violet stockoplossing en 51 ml gedestilleerde water. Cresyl violet is een basische kleurstof, maar om de Nissl-stof te kleuren, moet het in een zure oplossing worden gebruikt, en daarom bleef het volume van azijnzuur onveranderd op 0,5 ml. Periodic Acid Schiff De Periodic Acid Schiff (PAS) vlek werd uitgevoerd om polysacchariden, met name glycogeen, te benadrukken, gevonden in basement membranen en schimmelcelwanden, wat duidt op een schimmelinfectie. Het proces van de PAS-kleuring is om de hydroxylgroepen in polysacchariden te oxideren met behulp van periodienzuur, waardoor aldehydegroepen worden geproduceerd. De toepassing van het Schiff-reagens bindt aan de aldehydegroepen en produceert een magenta kleur met hematoxyline tegenkleuring die paarse celkernen produceert. Onze dia's vertoonden zwakke kleuring aan de binnenste begrenzingsmembraan. Dit kan te wijten zijn aan de aanwezige polysacchariden, aangezien niet alle polysacchariden kunnen worden geoxideerd met een standaard tijdsframe, vooral die welke anionische polysacchariden bevatten. We verhoogden daarom de duur van de oxidatiestap van 10 min naar 12, 15 en 20 min. We

technieken voor verwerking ogen geïmplanteerd met een retina prothese voor gelokaliseerde histopathologisch analysis

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

Met de recente ontwikkeling van retinale prothesen, is het belangrijk betrouwbare technieken te ontwikkelen om de veiligheid van deze apparaten in preklinische studies. De standaardtechniek fixatie, bereiding en histologie geautomatiseerde procedures zijn niet ideaal. Hier beschrijven we nieuwe procedures voor het evalueren van de gezondheid van het netvlies direct naast een implantaat. Retinale prothesen voorzien elektrodenseries in contact met oogweefsel. Vorige methoden zijn niet in staat om ruimtelijk lokaliseren het oogweefsel grenzend aan de afzonderlijke elektroden binnen de reeks geweest. Bovendien, standaard histologische verwerking resulteert vaak in bruto artefacten loslating van de retina lagen bij de beoordeling geïmplanteerd ogen. Bijgevolg is het moeilijk om gelokaliseerde schade, indien aanwezig, door implantatie en stimulering van een geïmplanteerde elektrode. Daarom hebben we een werkwijze voor het identificeren en lokaliseren van het oogweefsel naast geïmplanteerde e ontwikkeldlectrodes met behulp van een (kleurgecodeerde) kleurstof markering regeling, en we een oogfixatie techniek aangepast aan artefactuele netvliesloslating te minimaliseren. Deze werkwijze ook rendered de sclera doorschijnende, waardoor lokalisatie van individuele elektroden en specifieke delen van een implantaat. Tenslotte gebruikten we een controlegroep om de kracht van de histopathologische evaluatie verhogen. Samengevat, deze methode maakt betrouwbare en efficiënte discriminatie en beoordeling van het netvlies cytoarchitecture in een geïmplanteerde oog.

Figuur 4 toont een representatieve verkregen uit het snijden van het monster getoond in figuur 3. De sectie werd afgesneden op 5 urn dik en gekleurd met H &amp; E volgens de hierboven beschreven protocollen. De bruto-vorm van het monster strip wordt geconserveerd met minimale gedifferentieerde weefsel artefacten (Figuur 4A). Kleurstof-markeringen zichtbaar waren op de sclera, hoewel de groene kleurstof is veerkrachtiger dan de rode (figuur 4B). De retinale lagen werden niet artifactually losgemaakt en het netvlies morfologie behouden blijft (Figuur 4C). De retinale weefsel naast de kleurstof markeringen, die overeenkomt met de locatie van de elektroden in de array, kan gemakkelijk worden geïdentificeerd. Figuur 5 toont representatieve speciale kleuring en immunohistochemie van weefselcoupes bereid volgens de huidige protocol. Raadpleeg 5 Captio figuurn en aanvullende materialen voor meer informatie over de specifieke vlekken en de wijzigingen in het gebruik ervan. Post-modificatie, deze vlekken en immunohistochemie waren gelijkwaardig aan vastgestelde normen - zoals geverifieerd door pathologen. <table border="1"><tbody><tr><td> Soort primaire antilichaam en titer (tussen haakjes) </td><td> GFAP (1:1500) </td><td> NF200 (1:100) </td><td> GS (1:100) </td></tr><tr><td> Type secundaire antilichaam en titer (tussen haakjes) </td><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Alexa Fluor 488 </td></tr><tr><td> Duur van de incubatie van secundair antilichaam </td><td> 1 hr </td><td> 2 hr </td><td> 45 min </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Antilichaam Type, Titre en Duur van Labeling. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig1.jpg" /> Figuur 1. Suprachoroidal Prototype Electrode Array. A) Macro foto van een klinische kwaliteit gegoten array. B) Photomicrograph van een handgemaakte preklinische array. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig2.jpg" /> Figuur 2. Voormalig Netvlies Histologie. Standaard histologische methoden werden gebruikt om deze te bereiden, H &amp; E gekleurde, secties van een oog geïmplanteerd met een suprachoroïdale elektrode-array. A) Een orthogonaal doorsnede door het elektrode-array holte (afgebeeld door een ster). Het netvlies wordt losgemaakt van het buitenste oogweefsel. Dit is vooral duidelijk onder het geïmplanteerde gebied (pijl). Het is onmogelijk te bepalen welk deel van de retina naast elke afzonderlijke elektrode van de array was. Scalebar = 1 mm. B) Een hogere vergroting van de boxed regio Panel A. Er zijn een aantal op regelmatige afstand, artefacten in de retinale Layers (pijlen), evenals grote onthechting van het tapetum laag (de reflecterende laag in kattenogen). Scalebar = 100 micrometer. C) Een hogere vergroting van de boxed regio in panel B. Pijl aangegeven buitensegmenten van de fotoreceptoren de pigmental epitheel, dat intact blijft, suggereert dat het losmaken werd een kunstmatig neveneffect van de verwerking, in tegenstelling tot zijn veroorzaakt door een in vivo trauma of pathologie. Scalebar = 20 urn. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig3.jpg" /> Figuur 3. Lokalisatie en Dissectie van elektrode-weefsel Adjacent. AD) hoog dynamisch bereik macro foto van een enucleated oog, met een suprachoroïdale elektrode array in situ. A) Wens gefixeerd met Davidson&#39;s fixatief en vóór matrix verwijderd, de doorschijnende sclera maakt visualisatie vande afzonderlijke elektroden in de array (enkel voorbeeld aangeduid met pijl). B) De elektroden zijn aangeduid met een vooraf bepaalde stof kleur. C) Dye markeringen op regelmatige afstand van anatomische oriëntatiepunten gebruikt om consistentie in experimenten. D) Na verwijdering van de array, wordt het oog ontleed met de hand in monster reepjes. Gekleurde pijlen geven twee van de elektrode aansluitende gebieden van de sclera. Gele gestippelde lijn geeft vlak van snijden. E) Macro-foto van sample strip ingebed in een agar blok. F) Macro foto van de agar-embed steekproef strook van Panel E, uitknippen en in een inbedding cassette ondersteund door schuim biopsie pads om beweging van het minimaliseren tijdens verwerking. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig4.jpg" /> Figuur 4. Nieuwe Retina Histologie. </s<html> trong&gt; Het bovenstaande voorbeeld strip (uit figuur 3D), met daarin de elektrode zak, was paraffine ingebed, coupes op 5 micrometer en gekleurd met H &amp; E. A) Groen en rood geverfde gebieden (aangegeven met pijlen, hetzelfde als figuur 3D) zijn zichtbaar in een doorsnede ter hoogte van de gele stippellijn in figuur 3D. Schaal bar = 1000 micrometer. Het netvlies is niet los, ook niet onder de array pocket noch op afstand. B) De boxed gebied van Panel A met zichtbare rode en groene kleurstof aangegeven met pijlen, en intacte retina overal. Schaal bar = 500 urn. C) De boxed gebied van paneel B, die het intacte, in bijlage, retina nabij de groene kleurstof. Schaal bar = 50 micrometer. Wetende dat de plaats van de kleurstof geeft de positie van een elektrode, kunnen we met vertrouwen beoordeelt de aangrenzende retinale weefsel voor eventuele beschadiging, veroorzaakt door elektrische stimulatie. ve_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; altijd &quot;&gt; <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig5.jpg" /> Figuur 5. Voorbeelden van gemodificeerde retinale cytohistochemistry met speciale vlekken en immunofluorescentie. Het gebruik van Davidson&#39;s fixatief, in tegenstelling tot standaard formaline fixatie technieken vereist veranderingen aan de gebruikelijke kleuringsprotocollen, zoals uiteengezet in de voornaamste protocol tekst. Pathologen hebben bevestigd dat deze wijzigingen resulteerden in gelijkwaardige kleuring. A) H &amp;E; haematoxyline vlekken celkernen paars terwijl eosine vlekken cel cytoplasma, collageen en steunweefsel verschillende tinten roze. B) LFB vlekken myeline blauw terwijl de cresylviolet tegenkleuring kan worden gebruikt om . identificeren ganglioncellen door kleuring Nissl instanties binnen het perikaryon blauwe en het benadrukken van de satelliet cellen rondom de cellen C) Masson trichroom blauw, de Biebrich scharlaken-zuur fuchsine oplossing vlekken spier fimers rood, terwijl de aniline blauwe vlekken het collageen, in casu sclera, blauw D) PAS;. glycoproteïne componenten basaalmembraan en bindweefsel componenten paars gekleurd, terwijl celkernen hematoxyline counterstains paars E) Perls Pruisisch blauw.; op de plaats van bloeding, de vorming van haemosiderine in gedegradeerde rode bloedcellen en de afgifte van ijzer complexen veroorzaakt een paarse kleur, terwijl de toevoeging van neutrale rode beits lysosomen rood F) GS;. deze neurotransmitter afbrekend enzym in Müllercellen 13 (groen ), blijkt zich in beide richtingen met Müller cellichamen in de inwendige kernlaag en Müller eindvoetjes cel die het binnenste beperkende membraan G) NF-200,. deze zware keten cytoskelet eiwit (groen) in de cel soma en processen gecrosslinkt met andere zenuwvezels de structuur van neuronen 14,15 handhaven. Ganglioncellen en hun axonen te zien in de ganglion cellaag en zenuwvezellaag, terwijl axonen van horizontale cellen die zich aan de buitenste grens van de binnenste kernlaag in de katachtige retina worden benadrukt. Tegenkleuring met DAPI (blauw) maakt visualisatie van retinale lagen H) GFAP;. Deze cytoskelet eiwit (rood) vermeerderd in Müller cellen en astrocyten in gliosis 16, zichtbaar langs de zenuwvezellaag met Müllercellen vormen dunne uitbreidingen door binnen naar buitenste retinale lagen. Tegenkleuring met DAPI (blauw) maakt visualisatie van de retinale lagen. Schaal bar = 50 micrometer in alle panelen. De binnenste retina wordt bovenaan elk beeld, de buitenste retina wordt onderin elke afbeelding, exclusief Panel E die subscleral reactie toont.

Technieken voor het visualiseren retinale cytoarchitecture direct aan individuele elektroden binnen een retinale stimulator.

Technieken voor verwerking Ogen geïmplanteerd met een Retina Prothese voor Gelokaliseerde histopathologisch Analysis

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Het algemene doel van deze procedure is het verbeteren van de evaluatie van de veiligheid van retinale prosthesisen. Dit wordt bereikt door eerst het oppervlak van een optimaal gefixeerd enucleerd oog te labelen met weefselkleurstoffen om de positie van een geïmplanteerde elektrode aan te geven. In de tweede stap wordt de elektrode-array verwijderd en wordt het oogweefsel in strips gedissecteerd.Vervolgens worden de strips gestabiliseerd in agar en daarna ingebed in paraffine. In de laatste stap worden de gemarkeerde gebieden van belang gesneden en op objectglazen verzameld voor kleuring. Uiteindelijk kan de gezondheid van de geïmplanteerde gebieden naast elke elektrode worden geëvalueerd met brightfield- en immunofluorescentiemicroscopie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat fixatiegerelateerde artefacten en delaminatie tot een minimum kunnen worden beperkt, terwijl weefselregio's grenzend aan de elektrode nauwkeurig kunnen worden gevolgd in grote monsters. Het kan ook worden gebruikt bij het evalueren van de veiligheid van nieuwe implantaten voor andere oogziekten. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode dit uitdagend vinden, omdat een retina gevoelig is voor delaminatie en een hoge mate van behendigheid vereist is bij het hanteren van de monsters.Een visuele demonstratie van deze methode is belangrijk omdat het markeren en hanteren van het fragiele weefsel moeilijk te leren is. Voorafgaand aan deze studie werden de ogen na implantatie van een suprachoroïdale elektrode-array verwerkt met een niet-optimale techniek, zoals aangegeven door de ster. Deze eerste afbeelding toont een representatieve orthogonale doorsnede door de caviteit van de elektrode-array.Let op dat het netvlies is losgekomen van het buitenste oogweefsel. Dit is bijzonder duidelijk onder het geïmplanteerde gebied, zoals aangegeven door de pijlpunt. Let er ook op dat het niet mogelijk is om vast te stellen welk deel van het netvlies grenzend was aan elke individuele elektrode van de array.Bij deze hogere vergroting zijn er verschillende regelmatige artefacten door weefselvrijgave in de retinale lagen zichtbaar, zoals aangegeven door de pijlpunten, evenals een aanzienlijke loslating van de torpedo-laag, de reflecterende laag in het oog van de kat. Bij verdere vergroting kan worden waargenomen dat de buitenste segmenten van de fotoreceptoren, evenals het gepigmenteerde epitheel, echter intact blijven, wat suggereert dat eerder waargenomen loslatingen artefactuele neveneffecten van de verwerking waren in plaats van het resultaat van in vivo trauma of pathologie. Daarom is de volgende techniek geïmplementeerd om deze fixatie-gerelateerde artefacten en delaminatie te minimaliseren.Nadat de ogen zijn gekernd en gefixeerd, begint u met het verwijderen van een geïmplanteerde oogbol uit ethanol en het zorgvuldig wegsnijden van het overtollige weefsel, inclusief het conjunctiva en de kapsel van de pees. Trim de oogzenuw tot een lengte van twee tot drie millimeter. De elektrode-array is zichtbaar door de semi-translucente sclera.Gebruik vervolgens een fijngepenseel om voorzichtig histologische kleurstoffen op het weefsel aan te brengen, zodat de elektroden met een vooraf gedefinieerde kleurcode kunnen worden gelabeld. Let er hierbij op dat de kleurstof niet wordt uitgesmeerd. Aanvullende kleurmarkeringen kunnen worden aangebracht om interessante punten te definiëren of om te helpen bij het uitlijnen van de coupes.Hier zijn de maximaal gestimuleerde elektroden groen gemarkeerd. De overige actieve elektroden zijn rood gemarkeerd. De retour-elektroden met een grotere diameter zijn geel gekleurd, en eventuele aanvullende geleiders of anatomische markeringen zijn met blauwe kleurstof gemarkeerd.Laat de oogbol vijf minuten aan de lucht drogen en plaats deze vervolgens terug in de 70% ethanol om de kleurstof te dehydrateren. Trim daarna het overtollige weefsel van de niet-geïmplanteerde controle-oogbol, zoals zojuist gedemonstreerd, en gebruik de acht nylon hechtingen die tijdens de nucleatie- en fixatiestap zijn aangebracht om de controle- en geïmplanteerde ogen als een gespiegeld paar uit te lijnen. Plaats vervolgens een siliconen mal met dezelfde afmetingen als de elektrode-array op een gespiegelde locatie op de controle-oogbol, overeenkomend met de locatie van de array in het geïmplanteerde oog.Label vervolgens de controloog zoals zojuist gedemonstreerd, zodat elke plek van de geïmplanteerde elektrode een controlepaar heeft op een anatomisch vergelijkbare locatie. Verwijder daarna de implantaatmatrix uit het oog en verwijder vervolgens de voorzijde van het oog, inclusief het hoornvlies, de iris en de lens. Verwijder daarna de glasvochtvloeistof uit de resterende oogkom.Dissekeer nu het geïmplanteerde oog in meerdere stroken van twee millimeter dik. Elke strook bevat een subset van de gemarkeerde stansgebieden. De oriëntatie van de stroken moet worden gekozen om de beoordeling van verschillende aspecten van de weefselreactie op het implantaat te vergemakkelijken; documenteer de positie van de stansmarkeringen op de monsters zorgvuldig voor toekomstig referentiegebruik.Plaats vervolgens de strip, met de zijde die eerst gesneden moet worden naar beneden gericht, in een ondiepe plas vloeibare agar. Zodra de agar is gestold, snijdt u rond het monster en plaatst u dit in een weefselcassette ondersteund door schuiminlegstukken. Na het dissekeren en inbedden van het controle-oog plaatst u de cassettes in neutraal gebufferd formine en verwerkt u deze gedurende de nacht via een standaard geautomatiseerde paraffine-verwerkingstechniek van 12 uur.Inbed de bewerkte weefsels de volgende dag in paraffine, waarbij de zijde die als eerste gesneden moet worden naar beneden is gericht. Snijd de paraffineblokken vervolgens in coupes van vijf micron. Monteer daarna de coupes van elk van de gekleurde regio's op objectglazen.Controleer de coupes regelmatig onder een microscoop om de DY-regio te lokaliseren. De gebieden die direct grenzen aan elke gekleurde plek van de sclera zijn de gebieden die zich het dichtst bij de corresponderende elektrode van de array bevonden. Kleur tot slot de coupes naar wens.Hoog dynamisch bereik. Macrofotografieën van een geënucleerd kattenoog met een suprachoroidale elektrode-array in situ worden getoond na fixatie met Davidson-fixatief en vóór het verwijderen van de array. De doorschijnende sclera maakt visualisatie van de individuele elektroden in de array mogelijk.Zoals aangegeven met de pijl, zijn de elektroden gemarkeerd met een vooraf gedefinieerd kleurenschema van kleurstoffen. Deze kleurmarkeringen, die met regelmatige tussenpozen ten opzichte van anatomische referentiepunten zijn aangebracht, worden gebruikt om consistentie tussen experimenten te waarborgen. Na verwijdering van de elektrode-array wordt het oog met de hand gedisseceerd in monsterstroken.De pijlpunten geven twee van de elektrode-nabijgelegen plaatsen op de sclera aan. De stippellijn geeft het doorsnedevlak aan in deze representatieve sectie, verkregen door het monster uit de vorige figuur te snijden; de grove vorm van de monsterstrip is behouden met minimale differentiële weefselartefacten. Beide kleuringstekeningen zijn nog steeds zichtbaar op de sclera, zoals aangegeven door de pijlpunten.Hoewel de groene kleurstof beständiger was dan de rode, geeft de locatie van de kleurstof de positie van een elektrode aan. Daarom kan het aangrenzende retinaweefsel worden beoordeeld op schade, indien aanwezig, veroorzaakt door elektrische stimulatie; zoals te zien is bij deze vergroting, waren de retinalagen grenzend aan de groene kleurstof in de vorige afbeelding feitelijk niet losgelaten en was de retinale morfologie hier behouden. Representatieve speciale kleuringen en immunohistochemie van retinaweefselcoupes, verwerkt volgens het huidige protocol, worden getoond in deze eerste afbeelding.Hematine kleurde de celkernen blauw, terwijl eosine het cytoplasma van de cellen, collageen en steunweefsel in diverse tinten roze kleurde. In deze afbeelding kleurde luxol fast blue het myeline blauw. De tegenkleuring met cresylviolet werd gebruikt om de ganglioncellen te identificeren door de Nissl-lichaampjes binnen de pericarya blauw te kleuren en de omringende satellietcellen te accentueren. In deze met Masson's trichroom blauw behandelde sectie kleurde de BRIC Scarlet acid fuchsine-oplossing de spiervezels rood, terwijl anilineblauw het collageen kleurde.In dit geval zijn voor deze sectie de sclera-blauwe kleuring met periodic acid-Schiff gebruikt, waarbij de glycoproteïnecomponenten van het basaalmembraan en de bindweefselcomponenten paars verschijnen, terwijl de celkernen door de hematoxyline-tegenkleuring blauw verschijnen. De in deze afbeelding getoonde subsclerale sectie is behandeld met Pearl's Prussian blue op de plaats van de bloeding. De vorming van hemosiderine uit afgebroken rode bloedcellen en het vrijkomen van ijzercomplexen zorgden voor een paarse kleur.De toevoeging van neutraalrood kleurde de lysosomen rood in deze afbeelding; anti-glutamine synthetase werd gekleurd. Dit neurotransmitter-afbrekende enzym, dat in het groen zichtbaar is in Müllercellen, strekt zich uit in beide richtingen, met de Müllercelkernen in de binnenste kernlaag en de voetjes van de Müllercellen die het binnenste begrensende membraan vormen. Voor de kleuring van het neurofilament-eiwit werd dit zware keten cytoskelet-eiwit groen gelabeld; het bevindt zich in het cellichaam en de uitlopers. Het neurofilament-eiwit vormt crosslinks met andere neurofilamenten om de structuur van neuronen te behouden.Ganglioncellen en hun axonen kunnen worden waargenomen in de ganglioncellaag en de zenuwvezellaag, terwijl de axonen van de horizontale cellen, die zich aan de buitenrand van de binnenste nucleaire laag in het kattenretina bevinden, groen kleuren. In deze laatste afbeelding wordt gliaal fibrillair zuur eiwit getoond; dit cytoskelet-eiwit, in rood, prolifereert in Müller-cellen en astrocyten tijdens gliose en is zichtbaar langs de zenuwvezellaag, waarbij Müller-cellen dunne uitlopers vormen van de binnenste naar de buitenste retinalagen. Tegenkleuring met DPI in blauw maakt visualisatie van de retinalagen mogelijk.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een monster-workflow in drie dimensies te visualiseren en de oriëntatie van de monsters gedurende de gehele procedure regelmatig in overweging te nemen. Na het volgen van deze procedure kunnen alle histologische methoden worden gebruikt om aanvullende veiligheidsvraagstukken na de ontwikkeling te beantwoorden. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in de ontwikkeling van bionische ogen om de veilige stimulatieniveaus op de lange termijn voor blinde patiënten te beoordelen.Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht gekregen in hoe de veiligheid van een bionisch oogimplantaat kan worden geëvalueerd.

techniques-for-processing-eyes-implanted-with-retinal-prosthesis-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

De dissectie techniek illustreert enucleatie van de muis oog voor weefsel fixatie te fenotypering presteren in high-throughput-schermen.

Mouse Eye Enucleatie voor Remote High-throughput Fenotypering

Het hier beschreven protocol is voor structurele beoordeling van een wholemount retinale preparatie. Dit omvat beschrijvingen van weefseldissecatie, montage op een hydrofiliseerde polytetrafluorethyleen (PTFE) membraaninzet, bolusbelasting met fluorescente markeringen, en een vergelijking van fixatie met carbodiimide en paraformaldehyde voor immunohistochemische analyse van cellulaire en synaptische componenten.

Geoptimaliseerd protocol voor Retina Wholemount Voorbereiding voor Imaging en Immunohistochemistry

Hier beschrijven we histologische technieken voor het visualiseren van oculaire weefsel direct naast een metalen epiretinale tack en een retinale prothese.

Technieken voor verwerking Ogen geïmplanteerd met een Retina Prothese voor gelokaliseerde Histopathologisch Analyse: Part 2 Epiretinal Implantaten met Retina Kopspijkers

Retinale pigment epitheliale cellen kunnen dienen als een cel-vervangende therapie voor de geavanceerde vorm van droge leeftijdsgebonden Macula degeneratie. Dit protocol beschrijft de generatie van een grote-eyed model van geografische atrofie en subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen cel afkomstige retinale pigment epitheliale cellen in dit model van ziekte.

Subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen afgeleid-retinale Pigment epitheliale cellen in een grote-eyed Model van geografische atrofie

Hier wordt een chirurgische techniek gepresenteerd voor het transplanteren van van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) afgeleid netvliesweefsel in de subretinale ruimte van een groot diermodel.

Subretinale transplantatie van menselijk embryonaal stamcel-afgeleid retinaal weefsel in een katachtig groot diermodel

Deze studie heeft tot doel een nieuw humaan organotypisch retinale cultuurmodel (HORC) te ontwikkelen dat voorkomt dat de retinale integriteit tijdens explantbehandeling in gevaar komt. Dit wordt bereikt door het netvlies te kweken met het bovenliggende glasvocht en het onderliggende retinale pigmentepitheel-vaatvlies (RPE-vaatvlies) en sclera.

Karakterisering van een nieuwe menselijke organotypische retinale cultuurtechniek

Modificatie van bestaande multi-elektrode array of patch clamp apparatuur maakt het ex vivo elektroretinogram breder toegankelijk. Verbeterde methoden om ex vivo lichtresponsen te registreren en te onderhouden vergemakkelijken de studie van fotoreceptor en ON-bipolaire celfunctie in het gezonde netvlies, diermodellen van oogziekten en menselijke donorvliezen.

Optimalisatie van de instellingen en voorwaarden voor ex vivo elektroretinogram om de retinafunctie in kleine en grote ogen te bestuderen

Het doel van dit protocol is het karakteriseren van een nieuw model van glaucoomneurodegeneratie op basis van 360° thermische cauterisatie van de limbale vasculaire plexus, die subacute oculaire hypertensie induceert.

Volledige cirkel Cauterisatie van limbale vasculaire plexus voor chirurgisch geïnduceerd glaucoom bij knaagdieren

We beschrijven een methode om retinaal pigmentepitheel (RPE) efficiënt te scheiden van het netvlies in menselijke ogen en hele RPE / choroïde flatmounts te genereren voor histologische en morfometrische analyses van de RPE.

Efficiënte en consistente generatie van retinale pigmentepitheel / choroïde flatmounts uit menselijke ogen voor histologische analyse

Muismodellen kunnen nuttige hulpmiddelen zijn voor het onderzoeken van de biologie van het retinale gepigmenteerde epitheel (RPE). Er is vastgesteld dat muizen een reeks RPE-pathologieën kunnen ontwikkelen. Hier beschrijven we een fenotyperingsprotocol om RPE-pathologieën bij muizen op te helderen en te kwantificeren met behulp van licht, transmissie-elektron en confocale microscopie.

Een protocol voor het evalueren en kwantificeren van retinale gepigmenteerde epitheelpathologieën in muismodellen van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie

Leer een verbeterde techniek voor de verwerking van ogen met een retina-prothese om fixatie-artefacten te minimaliseren en weefselgezondheid naast elektroden nauwkeurig te evalueren met helderveld- en immunofluorescentiemicroscopie.

Technieken voor verwerking Ogen geïmplanteerd met een Retina Prothese voor Gelokaliseerde histopathologisch Analysis

Meer video's verkennen