Genetische Manipulatie van de muis Ontwikkelen Hypothalamus via In utero Elektroporatie
24 juli 2013
Ondanks de functionele en medische belang van de hypothalamus, In de baarmoeder Genetische manipulatie van zijn ontwikkeling is zelden geprobeerd. We tonen een gedetailleerde procedure voor In de baarmoeder Elektroporatie in de muis hypothalamus en tonen representatieve resultaten van de gedeeltelijke of volledige (regionale) hypothalamus transfectie.
Het algemene doel van deze procedure is om plasma-DNA te transfecteren in de hypothalamus van muisembryo's die zich in utero ontwikkelen om de functie van een gen van belang te activeren of onderdrukken. Dit wordt bereikt door eerst de zwangere muis te anesthetiseren en de baarmoeder bloot te leggen door middel van een laparotomie. De tweede stap is om de DNA-oplossing in de derde ventrikel van de embryonale hersenen te injecteren.
Vervolgens wordt de positieve elektrode geplaatst binnen de baarmoeder tussen de placenta en het embryonale hoofd. De negatieve elektrode wordt op het uiterlijke baarmoederslijmvlies geplaatst en er worden elektrische pulsen toegepast. De laatste stap is om de getransfecteerde embryonale hersenen zes dagen later te verwijderen.
Uiteindelijk wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om de fenotypische veranderingen van de getransfecteerde cellen, aantal, vorm, positie, markerexpressie, enzovoort te analyseren. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals virale transfectie zijn ten eerste dat er geen speciale voorzorgsmaatregelen nodig zijn, en ten tweede dat targeting van een specifiek gebied mogelijk is. En ten derde, met Ute elektroporering is het screenen van kandidaatgenen sneller.
Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat het injecteren van de DNA-oplossing in de derde ventrikel en het correct positioneren van de naaldelektrode geavanceerde handmatige vaardigheid en enige ervaring vereisen. Deze methode kan helpen om vragen te beantwoorden op het gebied van hypothalamusontwikkeling, met name die relevant zijn voor celmigratie, evenals hoe individuele regio's en nucle genetisch gespecificeerd zijn. Begin deze procedure door enkele glazen micropijpen van goede kwaliteit te trekken, omdat ze essentieel zijn om de aanvankelijke hoge abortussnelheid te verminderen als gevolg van verlies van vruchtwater.
Om DNA voor te bereiden, lost u het gezuiverde endotoxinevrije plasma-DNA op in PBS met 0,1% fast green tot een eindconcentratie van een tot twee microgram per microliter. De fast green maakt de geïnjecteerde oplossing zichtbaar in de ventrikel van de embryonale hersenen. Laad vervolgens 10 microliter van de DNA-oplossing in de glazen micropijp.
Verbind vervolgens de glazen micropijp met het injectiesysteem of een mondpijp. In deze stap bereidt u de operatietafel voor met een verwarmingskussen en de chirurgische instrumenten. Zet de koude lichtbronnen aan om de visualisatie van de embryo's te vergemakkelijken. Desinfecteer vervolgens de chirurgische gereedschappen met behulp van een glazenkraalsterilisator.
Vervolgens verdooft u een zwangere muis met isofluorine. Nadat de muis verdoofd is, brengt u zalf aan op haar ogen om uitdroging te voorkomen. Breng vervolgens de masker op haar gezicht aan om de anesthesie continu te handhaven.
Plaats nu de muis op een verwarmingskussen met haar buik omhoog. Bevestig haar lichaam op zijn plaats door haar vier ledematen met tape te fixeren. Zorg ervoor dat de muis volledig verdoofd is door in haar staart te knijpen om reflux te veroorzaken.
Scheer vervolgens het buikoppervlak en desinfecteer het met jodiumoplossing. Maak een longitudinale incisie van ongeveer een tot anderhalve centimeter lang op de buikhuid. Snijd daarna het buikvlies door.
Plaats vervolgens katoengaas rond de incisie. Spoel het gaas af met PBS. Leg een baarmoederhoorn bloot door het voorzichtig met stompe pincetten eruit te trekken.
Vermijd het strak trekken van het myometrium of de baarmoeder. Hoge druk in de baarmoeder verhoogt de kans op embryovloeistofverlies bij injectie, wat kan resulteren in abortus. Plaats vervolgens de baarmoederhoorn op een met PBS gespoeld gaas en spoel het om de paar minuten met PBS om het vochtig te houden.
Houd nu, onder de microscoop, de baarmoeder zo vast dat de hersenventrikels zichtbaar zijn. Herpositioneer het embryo dat in een ongunstige positie ligt niet uitgebreid. Dit verhoogt alleen de kans op abortus.
Kijk van bovenaf naar het hoofd van het embryo om de opening te lokaliseren waar de kloof tussen de linker en rechter corticale hemisphären is. De hemisphären zijn gemakkelijk te onderscheiden, en de laterale ventrikels erin kunnen meestal worden waargenomen als iets donkerdere vormen. Als een embryo perfect georiënteerd wordt gevonden voor DNA-injectie, is het mogelijk om de baarmoederwand te doorboren en direct de derde ventrikel binnen te gaan.
Houd de glazen micropijp met het eerder voorbereide DNA onder een hoek van 45 graden tegen de baarmoederwand en prik het op het rostrale uiteinde van de interhemisferische kloof, tot een diepte van ongeveer een millimeter doordringend. Op deze manier zal de punt van de glazen micropijp de derde ventrikel van de hersenen binnengaan en niet de laterale ventrikel. Injecteer vervolgens ongeveer een microliter DNA-oplossing in de derde ventrikel, groene vloeistof zal de ventrikel vullen bij een goede injectie, herhaal dezelfde procedure met alle embryo's van dezelfde baarmoederhoorn.
Dit geeft wat tijd om de DNA-oplossing gelijkmatig te mengen met het ventrikelvocht en het hele neuro-epitheel te bereiken. Schakel nu de elektro perter in en pas de instellingen aan volgens de embryonale leeftijd. Gebruik de roestvrijstalen naaldeletrode als positieve pool en de ronde platte elektrode als negatieve pool, selecteer de embryo's met de dorsale kant omhoog voor elektroporering.
Prikt vervolgens de baarmoederwand naast het hoofd van het embryo door de punt van de naaldeletrode er doorheen te steken en naar beneden te duwen tussen de vruchtzak en de placenta. Gebruik vervolgens de wijsvinger van de andere hand als duwblokken. Ongeveer vijf millimeter van de punt van de elektrode moet zich tussen de vruchtzak en de baarmoederwand op ongeveer het niveau van de middenhersenen bevinden.
Aangezien dit de targeting-elektrode is, zal de positie ervan bepalen welk deel van het hypothalamus neuro-epitheel het meest waarschijnlijk wordt getransfecteerd. Positioneer vervolgens de ronde platte elektrode buiten de baarmoederwand aan de andere kant van het hoofd van het embryo met de andere hand. Knijp vervolgens voorzichtig het embryo tussen de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerde procedure voor in utero elektroporatie in de hypothalamus van muizen. De methode beoogt plasma-DNA te transfecteren in de hypothalamus van muizenembryo's om genfunctie te manipuleren.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Genetische manipulatie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- De hypothalamus speelt een cruciale rol in verschillende fysiologische processen.
- Genetische manipulatie in utero is nog onvoldoende onderzocht op dit gebied.
- Elektroporatie is een techniek die wordt gebruikt om DNA in cellen te introduceren.
- Deze studie beoogt de kennis over de ontwikkeling van de hypothalamus te verbeteren.
Doel van het onderzoek
- DNA transfecteren in de hypothalamus van muizenembryo's.
- Specifieke genfuncties activeren of onderdrukken.
- Een gedetailleerde methodologie voor toekomstig onderzoek verschaffen.
Gebruikte methoden
- Verdoving van de zwangere muis en uitvoeren van een laparotomie.
- Injecteren van DNA-oplossing in de derde ventrikel van de embryonale hersenen.
- Positionering van elektroden voor elektroporatie.
- Verwijderen van getransfecteerde embryonale hersenen na zes dagen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle transfectie van de hypothalamus werd bereikt.
- Zowel totale als gedeeltelijke (regionale) transfecties van de hypothalamus werden aangetoond.
- De procedure kan worden gerepliceerd voor verder onderzoek.
- Resultaten geven aan dat er potentieel is voor manipulatie van genfunctie in vivo.
Conclusies
- De studie biedt een nieuwe aanpak voor onderzoek naar de hypothalamus.
- In utero elektroporatie is een haalbare methode voor genetische manipulatie.
- Toekomstige studies kunnen op deze methodologie voor verschillende toepassingen voortbouwen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Targeted genetic manipulation of the developing hypothalamus enables mechanistic interrogation of neurodevelopmental pathways relevant to metabolic and behavioral disorders. This approach supports target validation by allowing precise spatiotemporal gene modulation in a physiologically intact embryonic system. It enhances predictive confidence in early discovery by linking genetic perturbation to phenotypic outcomes in a disease-relevant brain region.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of candidate genes in hypothalamic neuroepithelium to clarify role in developmental pathways.
- Operational Value: Provides a reproducible method for regional transfection without requiring germline mutant generation.
- Therapeutic Value: Supports target de-risking by linking gene function to cellular phenotypes such as migration and marker expression in situ.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates rapid screening of candidate genes via fluorescent reporter expression in transfected hypothalamic nuclei.
- Operational Value: Uses standardized electroporation parameters and histological readouts for consistent transfection assessment.
- Therapeutic Value: Enables quantitative analysis of transfected cell number, position, and morphology for phenotype-based hit evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models developmental gene regulation in a mammalian system with relevance to human hypothalamic disorders.
- Operational Value: Allows postnatal analysis of electroporated embryos to assess long-term cellular consequences of embryonic gene modulation.
- Therapeutic Value: Supports biomarker alignment by enabling co-labeling of transfected cells with lineage or migration markers.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven gene screening in a physiologically contextualized embryonic brain model prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation through region-specific gene manipulation in the developing hypothalamus.
- Screening: Enables assay-ready transfection with fluorescent reporters for automated or manual phenotypic scoring.
- Analytics: Generates quantitative readouts on transfected cell distribution, morphology, and marker expression for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects embryonic genetic manipulation to postnatal phenotypic analysis, supporting developmental-to-adult disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative gene screening across multiple targets in the same embryonic system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by enabling direct observation of gene function in hypothalamic cell migration and specification.
- Operational Value: Standardizes surgical and electroporation steps to improve reproducibility and reduce embryo loss across users.
- Strategic Value: Accelerates target evaluation timelines by bypassing lengthy mutant generation pipelines.
- Portfolio Impact: Informs go/no-go decisions through early phenotypic screening of genetic targets in a disease-relevant neural substrate.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, embryonic handling, and precise electrode placement for successful transfection.
- Dependent on specialized instrumentation including glass micro pipettes, electroporator, stereo microscope, and histological processing tools.
- Necessitates standardized protocols for DNA preparation, injection volume, and electrical pulse parameters to ensure consistency.
- Must account for variability in embryonic orientation and uterine horn handling to maintain transfection efficiency and survival rates.
- Limited to embryonic stages where hypothalamic neuroepithelium is accessible via third ventricle injection, restricting postnatal application.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:06
Preparation of DNA and Glass Micropipettes for Injection
2:57
Laparotomy
4:33
DNA Injection into the Brain Ventricle
5:59
Targeting the Hypothalamus for Electroporation
7:17
Finishing the Surgery
8:28
Analyzing the Results
9:18
Results: Hypothalamus Transfection by In utero Electroporation
10:54
Conclusion
