Genetische Manipulatie van de muis Ontwikkelen Hypothalamus via

Het algemene doel van deze procedure is om plasmide-DNA te transfecteren in de hypothalamus van muisembryo's die in utero zich ontwikkelen, om zo de functie van een specifiek gen van belang te activeren of te onderdrukken. Dit wordt bereikt door eerst de drachtige muis te anesthetiseren en de uterus bloot te leggen via een laparotomie. De tweede stap bestaat uit het injecteren van de DNA-oplossing in het derde ventrikel van de embryonale hersenen.

Vervolgens wordt de positieve elektrode in de baarmoeder geplaatst tussen de placenta en de embryonale kop. De negatieve elektrode wordt op het buitenste oppervlak van de baarmoeder geplaatst en er worden elektrische pulsen toegediend. De laatste stap is het verwijderen van de getransfecteerde embryonale hersenen zes dagen later.

Uiteindelijk wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om de fenotypische veranderingen van de getransfecteerde cellen te analyseren, zoals aantal, vorm, positie, markerexpressie, enzovoort. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals virale transfectie zijn enerzijds dat er geen speciale voorzorgsmaatregelen nodig zijn en geen twee aparte faciliteiten, en anderzijds dat targeting van een specifieke regio mogelijk is. Ten slotte is de screening van kandidaatgenen met electroporatie sneller.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat het injecteren van de DNA-oplossing in de derde ventrikel en het correct positioneren van de naaldelektrode geavanceerde handvaardigheid en enige ervaring vereisen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen op het gebied van de ontwikkeling van de hypothalamus, in het bijzonder die met betrekking tot celmigratie, alsofwel hoe individuele regio's en kernen genetisch worden gespecificeerd. Begin deze procedure met het trekken van glazen micropipetten van goede kwaliteit, aangezien deze essentieel zijn om het aanvankelijk hoge percentage mislukte pogingen door verlies van vruchtwater te verminderen.

Om het DNA voor te bereiden, wordt het gezuiverde endotoxinevrije plasma-DNA opgelost in PBS met 0,1% fast green tot een eindconcentratie van één tot twee microgram per microliter. De fast green maakt de geïnjecteerde oplossing zichtbaar in het ventrikel van het embryonale brein. Laad vervolgens 10 microliters van de DNA-oplossing in de glazen micropipet.

Sluit vervolgens de glazen micropipet aan op het injectiesysteem of een mondpipet. Bereid in deze stap de operatietafel voor met een warmtemat en de chirurgische instrumenten. Zet de koude lichtbronnen aan om de visualisatie van de embryo's te vergemakkelijken. Desinfecteer vervolgens het chirurgisch instrumentarium met een glaskraalsterilisator.

Anestheseer vervolgens een drachtige muis met isofluraan. Nadat de muis is geanestheseerd, brengt u zalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen. Plaats vervolgens het masker op de snuit om de anesthesie continu in stand te houden.

Plaats de muis nu met de buik omhoog op een warmtemat. Zet het lichaam vast door de vier ledematen met tape te fixeren. Controleer of de muis volledig is geanestheseerd door in de staart te knijpen om de reflex te testen.

Scheren vervolgens het buikoppervlak en desinfecteer dit met een jodiumoplossing. Maak een longitudinale incisie van ongeveer één tot anderhalve centimeter lang in de buikhuid. Snijd daarna het peritoneum door.

Plaats vervolgens katoenen gaas rond de incisie. Spoel het gaas met PBS. Leg één uterine horn vrij door deze voorzichtig met stompe pincet naar buiten te trekken.

Voorkom dat het myometrium of de uterus strak wordt getrokken. Hoge druk in de uterus vergroot namelijk de kans op verlies van embryonale vloeistof bij injectie, wat kan leiden tot abortus. Plaats de uterushoorn vervolgens op een met PBS gespoeld gaasje en spoel deze elke paar minuten met PBS om het vochtig te houden.

Houd nu onder de microscoop de uterus zodanig vast dat de hersenventrikels gevisualiseerd kunnen worden. Verplaats het embryo dat in een ongunstige positie ligt niet uitgebreid. Dit verhoogt enkel de kans op een abortus.

Bekijk de kop van het embryo van bovenaf om de opening te lokaliseren waar de fissuur tussen de linker- en rechtercorticale hemisferen zich bevindt. De hemisferen zijn eenvoudig te onderscheiden, en de laterale ventrikels daarbinnen kunnen gewoonlijk worden waargenomen als iets donkerdere vormen. Indien een embryo perfect georiënteerd is voor DNA-injectie, is het mogelijk om de baarmoederwand te doorprikken en direct het derde ventrikel binnen te dringen.

Houd de glazen micropipet met het eerder bereide DNA in een hoek van 45 graden ten opzichte van de uteruswand en puncteer deze aan het rostrale uiteinde van de interhemisferische fissuur, waarbij een diepte van ongeveer één millimeter wordt bereikt. Op deze manier komt de punt van de glazen micropipet in het derde ventrikel van de hersenen terecht en niet in het laterale ventrikel. Injecteer vervolgens ongeveer één microliter DNA-oplossing in het derde ventrikel; bij een succesvolle injectie zal het ventrikel zich vullen met groene vloeistof. Herhaal dezelfde procedure voor alle embryo's in dezelfde uterushoorn.

Dit geeft de DNA-oplossing de tijd om gelijkmatig te mengen met de ventriculaire vloeistof en het gehele neuro-epitheel te bereiken. Zet nu de electroporator aan en pas de instellingen aan op basis van de embryonale leeftijd. Gebruik de roestvrijstalen naaldelektrode als positieve pool en de ronde platte elektrode als negatieve pool; selecteer de embryo's met de dorsale zijde naar boven voor electroporatie.

Doorboor vervolgens de baarmoederwand naast de kop van het embryo, tussen het vruchtzakje en de placenta, door de punt van de naaldelectrode naar beneden erdoorheen te duwen. Gebruik daarna de wijsvinger van de andere hand als steunpunt. Ongeveer vijf millimeter van de elektrodepunt moet zich tussen het vruchtzakje en de baarmoederwand bevinden, ter hoogte van het middenhersenen.

Aangezien dit de target-elektrode is, bepaalt de positie hiervan welk deel van het neuro-epitheel van de hypothalamus waarschijnlijk getransfecteerd zal worden. Positioneer vervolgens met de andere hand de ronde, platte elektrode buiten de baarmoederwand aan de tegenovergestelde zijde van de kop van het embryo. Knijp daarna het embryo voorzichtig tussen de elektroden.

Gebruik de voetbediening om spanning aan te leggen. Trek daarna langzaam de naaldelektrode uit de uterus, terwijl u de uterus met de wijsvinger van de andere hand tegenhoudt. Als er vruchtwater verloren gaat via de geperforeerde wand, zal het embryo gewoonlijk abortussen ondergaan.

Plaats na de injectie en electroporatie van alle embryo's de baarmoeder zeer voorzichtig terug in de buikholte van de muis en positioneer deze precies zoals ze voorheen lagen. Bevochtig vervolgens de peritoneale holte met zoutoplossing voordat u deze sluit. Hecht het peritoneum met chirurgische catgut en hecht daarna de huid met een sterker hechtmateriaal.

Desinfecteer het oppervlak van de buik met een jodiumoplossing en injecteer een niet-steroïde ontstekingsremmer subcutaan voor pijnstilling. Haal vervolgens de moeder uit het anesthesieapparaat en plaats deze in een kooi die wordt verwarmd door een warmtemat. Monitor de muis totdat deze volledig is hersteld van de anesthesie en controleer deze dagelijks om er zeker van te zijn dat het herstel van de procedure verloopt zonder tekenen van infectie of pijn.

Oogst in deze stap de embryo's of postnatale stadia op basis van de gewenste dag van analyse. Selecteer de embryo's die zijn geïnjecteerd met DNA en zijn ge-electroporeerd, en dissecteer de hersenen onder deze stereomicroscoop. Controleer vervolgens op een groen fluorescent signaal in de betreffende regio.

Om de hersenen van het geselecteerde embryo te analyseren, wordt het weefsel kort gefixeerd in 4% paraldehyde. Bedthat het weefsel vervolgens in ros 4% of in gelatinealbumine. Snijd daarna de hersenen met de vibratoom.

Deze figuren tonen de hypothalamus na in utero transfectie van plasma-DNA, dragend van fluorescerende reportergenen, GFP of CFP bij E 12.5. Dit is een sagittale doorsnede die een hypothalamus toont die is getransfecteerd van rostral naar caudal, en hier is de transversale doorsnede met de gelabelde cellen op verschillende niveaus langs de medio-laterale as. Deze sagittale doorsnede toont een specifiek getransfecteerde corpus mammillare en labelen van de kenmerkende axonale boom ervan, en aan de electro parade-zijde van deze transversale doorsnede is een gelabelde band zichtbaar die correspondeert met neuronen die zijn ontstaan op E 12.5.

Om de coupes nader te analyseren, werden horizontale coupes geprepareerd parallel aan het vlak van de radiale gliale uitlopers die uit de mammillaire recessus ontspringen. De ambi O-neuronen, voortgekomen uit neuro-epitheel dat op dag E 12.5 was getransfecteerd, werden op dag E 18.5 geïdentificeerd met behulp van antilichamen tegen GFP.

In dit voorbeeld labelde het antilichaam een beperkte groep MBO-cellen. Deze groep bevond zich tussen twee niet-gelabelde laterale en mediale MBO-gebieden die overeenkomen met MBO-neuronen, geboren vóór en na E 12.5, en de co-kleuring met een antilichaam tegen neston. In rood wordt de migratiewijze van individueel gelabelde neuronen op radiale gliale uitlopers van het neuro-epitheel getoond. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in 30 minuten worden uitgevoerd mits deze correct wordt toegepast.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u DNA in het derde ventrikel injecteert en hoe u de naald als positieve elektrode positioneert tussen het embryo, de kop en de placenta om de hypothalamus efficiënt te targeten. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals immunohistochemie of in situ hybridisatie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over het fenotype van de getransfecteerde neuronen te beantwoorden.