Name: Genetische Manipulatie van de muis Ontwikkelen Hypothalamus via In utero Elektroporatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Leer in utero elektroporatie in de muis hypothalamus voor genetische manipulatie tijdens de embryonale ontwikkeling. Deze methode maakt gerichte DNA-transfectie en genfunctie-analyse in vivo mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de Duitse Research Foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft).

1. Voorbereiding van DNA en Glas Micropipetten voor injectie <ol><li> Goede kwaliteit glas micropipetten zijn essentieel om initiële hoge abortuscijfer wijten aan het verlies van vruchtwater verminderen. De procedure voor het glas micropipetten trekken is goed gedocumenteerd 13,18,25. Gebruik 1,2 mm diameter haarvaten getrokken in een conventionele Sutter P-97 toestel met de instellingen P = 500; Heat = 300; Trek = 40; Velocity = 50; Tijd = 50. Monteer de trekker met 3 mm &quot;dal&quot; filamenten (Sutter Instrument FT330B). De 2 mm formaat filamenten hebben opgeleverd voor ons minder bevredigende resultaten. Aan de andere kant, afschuinen van de micropipet tips lijkt geen resultaten voor ons te verbeteren. </li><li> Los gezuiverd endotoxine-vrij plasmide DNA in PBS (Cell Culture Grade) dat 0,1% Fast Green tot een uiteindelijke concentratie van 1-2 ug / ul. De Fast Green zal de geïnjecteerde oplossing zichtbaar in de embryonale hersenen ventrikel maken. </li><li> Plaats 10 gl van de DNA-oplossing in de glazen micropipet. </li&gt; <li> Sluit het glas micropipet aan het inspuitsysteem (Pico pomp) of mond pipet. </li></ol> 2. Anesthesie Bereid de chirurgische tafel met een verwarmingselement en de chirurgische instrumenten. Zet de koude lichtbronnen tot visualisatie van de embryo&#39;s te vergemakkelijken. Ontsmet de chirurgische instrumenten met behulp van bijvoorbeeld een glazen kraal sterilisator. Drie verschillende anesthesie procedures mogelijk zijn voor dit protocol (zie discussie). Hier zullen we de ene beschouwen we de beste, met behulp van isofluraan inhalatie voor anesthesie-inductie (debiet 0,5 l / min) alsook het onderhoud (debiet 1 L / min) te beschrijven. <ol><li> Introduceer de zwangere muis in een klein doorzichtig (dus de muis zichtbaar blijft) container door een korte lengte van de slang aangesloten op de Komesaroff Mark 5 verdoving apparaat. </li><li> Vul de verdamper met isofluraan, opent u vervolgens de zuurstoffles verbonden aan het apparaat. Blaas een of twee pulsen van isoflUrane / zuurstof (0.5 L / min) in de container met de muis en het horloge voor narcose te stellen inch </li><li> Neem de muis uit, bedekken haar ogen met zalf om te voorkomen dat ze uitdrogen en past de doorstroming narcose masker op zijn hoofd onmiddellijk. </li></ol> 3. Laparotomie <ol><li> Plaats de muis buik tot aan de verwarming pad (anders zal haar lichaamstemperatuur zal dalen zeer snel gaan, het verminderen van de kans op herstel) en zijn lichaam veilig op zijn plaats door de vaststelling van haar vier poten aan de zijkanten met tape. Beoordelen van de diepte van de anesthesie door te controleren op verlies van respons op reflex stimulatie (bijvoorbeeld teen of staart knijpen met een stevige druk). </li><li> Scheer de buik oppervlak en desinfecteer deze met de iodophorpovidone-jodium (Braunoderm). </li><li> Maak een longitudinale incisie (1 tot 1,5 cm lang) op de buikhuid. Knip dan het buikvlies. Plaats een gaasje rond de incisie. Maak een baarmoedertak zichtbaar en trek het er voorzichtig met stompe tang op de PBS-gespoelde gauze. Spoel de baarmoeder met PBS vaak verband houden altijd bevochtigd (Figuren 2A en 2B). Tijdens de gehele procedure kan worden getrokken de mesometrium of uterus strakke, aangezien een hoge druk in de baarmoeder zendt de embryo vergroten van de kans op verlies van vocht bij injectie resulteert in abortus. </li></ol> 4. DNA Injectie in de hersenen ventrikel <ol><li> Houd de baarmoeder zodanig dat de hersenenventrikels kunnen worden gevisualiseerd. Hoeft niet uitgebreid te herpositioneren een embryo dat ligt in een ongunstige positie - dit alleen verhoogt de kans op abortus. </li><li> Kijkend naar het hoofd van de embryo&#39;s van boven, lokaliseren visueel de opening of spleet tussen de linker en rechter corticale hemisferen. De hersenhelften duidelijk te onderscheiden en de laterale ventrikels erin (niet gericht) kunnen meestal als iets donkerder vormen worden waargenomen. Als een embryo wordt gevonden perfect georiënteerd te zijn voor DNA-injectie (Figures 2C en 2D), is het mogelijk te doorboren de baarmoederwand en voer de derde ventrikel tegelijk. Houd het glas micropipet bij 45 ° baarmoederwand en punctie bij de rostrale einde van de spleet tussen corticale hersenhelften doordringen ongeveer 1 mm. Op deze wijze het uiteinde van de glazen micropipet wordt de derde ventrikel van de hersenen (niet de laterale ventrikel) (Figuren 2C en 2D) invoeren. In embryo minder gunstig georiënteerde is het nuttig om eerst doorboren van de baarmoederwand (altijd 45 °) in de nabijheid van de embryonale hoofd plaatst de micropipet tip in de juiste positie tussen de corticale hemisferen en pas daarna perforeren hersenen. Injecteer ongeveer 1 pl DNA-oplossing in de derde ventrikel (een goede injectie vult het ventrikel met groene vloeistof). Herhaal dezelfde procedure met alle embryo&#39;s van een baarmoeder hoorn. Dit maakt het mogelijk enige tijd voor de DNA-oplossing gelijkmatig mengen met de ventriculaire vloeistof en bereiken de entire neuroepithelium. </li></ol> 5. Gericht op de Hypothalamus voor Elektroporatie <ol><li> Schakel de electroporator over en de instellingen aanpassen aan de embryonale leeftijd (voor E12.5 we gebruiken 5 blokvormige pulsen, 50 V, 50 msec ON/950 msec OFF). Gebruik als positieve pool van de roestvrij stalen naald elektrode (CUY550-10) en als negatieve pool van een ronde platte elektrode (CUY700P4L). (Het is belangrijk dat de elektroden kleiner dan de embryo, anders loopt de stroom net om de embryo maar niet doorheen.) </li><li> Kies voor elektroporatie die embryo&#39;s waarvan dorsale zijde is up (dus gedraaid naar de experimentator) (zoals de meeste van hen zijn), en gooi die waarvan de oriëntatie is niet gunstig. Het is nu veilig om de baarmoeder te raken met ethanol-gedesinfecteerd vingers of met handschoenen. Houd de baarmoeder met een tang, maar zou interfereren met de stroom tijdens elektroporatie. </li><li> Doorboren de baarmoederwand door het hoofd van de embryo&#39;s tussen de amniotic sac en de placenta door stoten beneden door het met de punt van de naald elektrode. Gebruik de wijsvinger van de andere hand als stuwkracht blok. Ongeveer 5 mm van de elektrode moet nu tussen de vruchtzak en de baarmoederwand, op ongeveer het niveau van de middenhersenen (figuren 2E en 2F). Herinner dat dit de &quot;targeting elektrode&quot;, zodat de positie bepalen welk deel van de hypothalamus neuroepithelium is het meest waarschijnlijk te getransfecteerd. De embryo moet zeer voorzichtig &quot;gecomprimeerde&quot; tussen de elektroden. </li><li> Met de andere hand, de positie van de ronde platte elektrode buiten de baarmoeder muur aan de andere kant van het hoofd van de embryo&#39;s (figuren 2E en 2G). </li><li> Gebruik de pedaal schakelaar om de spanning toe te passen (50 V, 50 msec ON, 950 msec OFF, 5 blokvormige pulsen). </li><li> Trek de naald elektrode uit de baarmoeder tijdje terug die de baarmoeder met de wijsvinger van de andere hand - als amniotic vloeistof verloren gaat door de lekke wand, meestal het embryo zal abortus te ondergaan. Herhaal de procedure met alle embryo&#39;s. </li><li> Terug de baarmoeder hoorn in de buik en herhaal de injectie en elektroporatie in het overblijfsel hoorn. </li></ol> 6. Afwerking van de Chirurgie <ol><li> Na injectie en elektroporatie van alle embryo&#39;s, plaatst de baarmoeder terug in de buik zeer zorgvuldig, gepositioneerd precies zoals ze vóór en vochtig de buikholte met een zoutoplossing voor het sluiten van het ware. </li><li> Hechten het buikvlies met catgut (Vicryl polyglactine 910, 5-0, Ethicon V4914). Voor de sluiting van de huid gebruik &quot;onderbrak stitch&quot; methodwith een meer resistente hechtdraad (Supramid Nylon, 6-0, Serag Wiessner TO 07171L). </li><li> Desinfecteren de buik oppervlak met povidon-jood (Braunoderm) en injecteer een niet-steroïde anti-inflammatoire subcutaan (bijv. 100 ui van een 1:10 oplossing van Rimadyl in 0,9% NaCl) of, nog beter, een opioïde zoals buprenorphine (Temgesic, 0,05-0,1 mg / kg lichaamsgewicht in 0,9% NaCl) om pijn te verlichten. </li><li> Verwijder de moeder uit de narcose machine en plaats hem in een kooi die wordt verwarmd door een verwarmingselement. Toezien op de muis voortdurend tot deze volledig is hersteld van de narcose. Later, check de dagelijkse om te verzekeren dat ze zich herstellen van de procedure zonder enig teken van infectie of pijn dieren. </li></ol> 7. Het analyseren van de resultaten <ol><li> Oogst de embryo&#39;s (of postnatals) volgens de gewenste dag van de analyse. Postnatale muizen (1 tot 2 dagen oud) worden gedood door onthoofding. </li><li> Scheid elk embryo volgens de voorgaande elektroporatie annotatie. Ontleden van de hersenen onder een stereomicroscoop en kijk onder de microscoop voor groen fluorescerend signaal (van de GFP reporter) in de juiste regio. </li><li> De geselecteerde hersenen kunnen worden geanalyseerd &quot;vers&quot;: fix het weefsel voor een korte tijd in 4% paraformaldehyde en inbedding in agarose 4% of gelatine-albumin, dan sectie op een vibratome-apparaat type (figuur 3). Voor meer gedetailleerde immunohistochemische analyse (figuur 4), cryo-bescherming van de hersenen 30% saccharose-oplossing, insluiten in oktober fixeermiddel (Tissue Tek) knip 20 urn secties in een cryostaat. </li></ol>

<ol><li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shocking%27+developments+in+chick+embryology%3A+electroporation+and+in+ovo+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).</li>
<li>Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foreign+gene+expression+in+an+organotypic+culture+of+cortical+anlage+after+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation.</a> Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294, 1071-1074 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+tend+to+stop+migration+and+differentiate+along+the+cortical+internal+plexiform+zones+in+the+Reelin+signal-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice.</a> J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).</li>
<li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emx2+patterns+the+neocortex+by+regulating+FGF+positional+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling.</a> Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).</li>
<li>Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+signaling+centers+expressing+BMP%2C+WNT+and+FGF+proteins+interact+to+pattern+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex.</a> Development. 131, 5639-5647 (2004).</li>
<li>Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+8+regulates+neocortical+guidance+of+area-specific+thalamic+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation.</a> J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li>
<li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Gene+Delivery+into+Multiple+CNS+Territories+Using+In+Utero+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2957(2011).</li>
<li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+Electroporation+followed+by+Primary+Neuronal+Culture+for+Studying+Gene+Function+in+Subset+of+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons.</a> J. Vis. Exp. (44), e2103(2010).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E15+Mouse+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e239(2007).</li>
<li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E16+Rat+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e236(2007).</li>
<li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).</li>
<li>Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+thalamic+differentiation%3A+gli-dependent+pattern+and+gli-independent+prepattern%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern.</a> Front Neurosci. 6, 27(2012).</li>
<li>Kataoka, A., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+controls+regional+identity+in+the+developing+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus.</a> Development. 135, 2873-2881 (2008).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+Utero+Electroporation%3A+Controlled+Spatiotemporal+Gene+Transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), e3024(2011).</li>
<li>Vue, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+signaling+controls+thalamic+progenitor+identity+and+nuclei+specification+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice.</a> J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+the+hypocretin%2Forexin+gene+by+NR6A1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).</li>
<li>Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+axonal+projections+from+mammillary+bodies+in+Pax6+mutant+mice%3A+possible+roles+of+Netrin-1+and+Slit+2+in+mammillary+projections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections.</a> J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).</li>
<li>Canteras, N. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCanteras%2C+NS+%22The+Mouse+Nervous+System%22">The Mouse Nervous System</a>. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. , Academic Press. 539-562 (2011).</li>
<li>Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+for+trouble%3A+a+search+for+developmental+defects+of+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Res%22%5BJournal%5D)">Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus.</a> Horm. Res. 64, 222-230 (2005).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+Electroporation+for+Gene+Expression+in+Mouse+Retinal+Ganglion+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells.</a> J. Vis. Exp. (31), e1333(2009).</li>
<li>Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mouse+Model+of+in+Utero+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Mouse Model of in Utero Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (47), e2303(2011).</li>
<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Development+of+the+Rat+Hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Anat.+Embryol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Development of the Rat Hypothalamus.</a> Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).</li>
<li>Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+developmental+time+across+mammalian+species%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Translating developmental time across mammalian species.</a> Neuroscience. 105, 7-17 (2001).</li>
<li>Clancy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+method+for+translating+neurodevelopment+from+laboratory+species+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans.</a> Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).</li>
<li>Ishii, Y., Bouret, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+birthdate+of+hypothalamic+leptin-activated+neurons+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice.</a> Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).</li>
<li>Karim, M. A., Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histogenesis+of+the+supraoptic+and+paraventricular+neurosecretory+cells+of+the+mouse+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus.</a> J. Anat. 130, 341-347 (1980).</li>
<li>Shimada, M., Nakamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+of+neuron+origin+in+mouse+hypothalamic+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei.</a> Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).</li>
<li>Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+lineage+in+the+mouse+hypothalamus%3A+from+progenitor+domains+to+hypothalamic+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Dev%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions.</a> Neural. Dev. 7, 4(2012).</li>
<li>Vann, S. D., Aggleton, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammillary+bodies%3A+two+memory+systems+in+one%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mammillary bodies: two memory systems in one.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).</li>
<li>Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O'Shea, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+inhibition+of+BMP-4+gene+expression+in+postimplantation+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos.</a> Genesis. 37, 12-17 (2003).</li>
<li>Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+silencing+of+Sry+gene+with+RNA+interference+in+developing+mouse+embryos+resulted+in+feminization+of+XY+gonad%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891(2012).</li>
<li>Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+mechanism+of+gene+transfer+into+early+to+mid-gestational+mouse+fetuses+by+tail+vein+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection.</a> Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).</li>
<li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).</li>
<li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+targeting+mechanism+of+Angiopep-conjugated+poly%28ethylene+glycol%29-co-poly%28epsilon-caprolactone%29+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles.</a> Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+for+stable+expression+of+foreign+genes+in+mammalian+cells+by+use+of+the+untranslated+leader+sequence+from+EMC+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus.</a> Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+promoters+for+driving+efficient+transgene+expression+in+neonatal+porcine+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets.</a> Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Over de anesthesie: Aangezien in utero elektroporatie in de hypothalamus technisch lastig en vereisen een langere tijd narcose we bij voorkeur inductie en handhaven van verdoving door toediening van een mengsel van zuurstof en isofluraan. In onze ervaring, kunnen dieren goed verdoofd blijven op deze manier voor een periode van maximaal een uur op zijn minst, het herstel van de moeder is erg snel, en de overleving van embryo&#39;s verbeterd. Andere benaderingen van anesthesie zijn ook beschikbaar. De meest eenvo...

Genetische manipulatie van de embryonale hersenen van muizen is een geprefereerde aanpak te leren over ontwikkelingsregulatie. De generatie van mutante muizenlijnen echter traag en duur. Een methode wel specifieke genetische veranderingen in ontwikkeling neuronen van de hersenen van zoogdieren introduceren in utero elektroporatie. In wezen de techniek bestaat het transfecteren DNA in de embryonale hersenen neuroepithelium door middel van elektrische pulsen, waarna men het embryo te overleven gedurende een bepaalde tijd, het verzamelen van de hersenen en onderzoek ze mogelijke nieuwe, informatief fenotypes. Hierdoor kan de experimentator vrijwel direct testen hypotheses zonder lange wachttijden voor het samenstellen van muismutanten. Transfectie van DNA in ontwikkelende embryo&#39;s begonnen met in-ovo elektroporatie op kippenembryo&#39;s 1. De essentiële proof-of-concept voor de muis werd uitgevoerd in de cultuur <sup&gt; 2. Dit werd al snel gevolgd door de eerste beschrijvingen van de techniek op de muis in de baarmoeder 3,4. Het belangrijkste probleem is de hersenen van embryo ontwikkeling in utero transfecteren zonder hen of moeder doden. Leren om de noodzakelijke operatie uit te voeren (laparotomie, injectie, elektroporatie) vereist een lange trainingsperiode. Zodra de operatie is de knie tot het punt waar de embryo overleving verhouding aanvaardbaar is, de volgende belangrijke vraag is: welke hersenstructuren toegankelijk zijn? Niet verrassend, de eerste gepubliceerde artikelen tonen de resultaten verkregen met in utero elektroporatie gericht op de corticale ontwikkeling 5-9. Dit is nog steeds geldt voor de meeste publicaties met deze techniek, omdat het gebied van de ontwikkeling van muizenhersenen meest toegankelijke chirurgische procedures is de cortex (Figuur 1). De procedure in utero elektroporatie in de cortex is beschrevenin print 10 en in video 11-14. Een modificatie van de techniek kan worden gebruikt om een ventrale deel van de grote hersenen, de basale ganglia 15 richten. Voorbij de grote hersenen, het diencephalon (klassiek verdeeld thalamus en hypothalamus) is een gebied van de voorhersenen moeilijker bereikbaar. Een klein aantal papers meldingen targeting van haar rug en meest toegankelijke deel, de thalamus 16-19. De hypothalamus is het ventrale deel van de voorhersenen, daarom een gelokaliseerde diepste van het dorsale oppervlak (cortex) (figuur 1). Deze regio blijft een moeilijke uitdaging voor onderzoekers verbonden aan genetisch manipuleren van de hersenen van muizen in de baarmoeder. Voor zover wij weten, melden slechts zeer weinig artikelen over de resultaten van de in utero transfectie in de muis hypothalamus 20,21. De functionele betekenis van de hypothalamus cannot worden overdreven, omdat het reguleert gedrag zoals eten en drinken, paring, fokken en opvoeden 22. Bovendien, veranderingen in hypothalamus ontwikkeling helpen de latere leeftijd aandoeningen zoals zwaarlijvigheid, hypertensie, diabetes en voortijdige puberteit 23 ontstaan. In staat zijn om genetisch veranderen de hypothalamus tijdens de ontwikkeling zou zorgen voor een zeer krachtig instrument om het te begrijpen. De basis chirurgische protocol voor laparotomie zwangere muizen die we hier gebruikt is vergelijkbaar met die in andere protocollen 11,13,14,24. We zullen ze hier kort beschrijven op volledigheid. Sleutel tot onze procedure, anderzijds, zijn de vorm van anesthesie, de plaats van toediening, de aard van de elektroden en de insertie en de positie van de positieve elektrode ten opzichte van het hoofd van de embryo&#39;s. We verkiezen voor inductie en handhaven verdoving door inhalatie gas via eenvoudige intraperitoneale anesthesie, aangezien de eerste maakt deiets langere narcose vereist een moeilijke operatie. Isofluraan inhalatie resulteert in sneller herstel van anesthesie, aangezien meestal de moeder toont normaal gedrag heeft minuten na de operatie. De eenvoudigste injectiepunt van de DNA-oplossing met de glazen micropipet is de laterale ventrikel, die echter volledig ongeschikt voor hypothalamus elektroporatie. Injectie rechtstreeks in het derde ventrikel is inderdaad cruciaal voor diepe diencephalic structuren te richten. Het is mogelijk om de hypothalamus transfecteren van E12.0 en E12.5 met standaard, off-the-shelf elektroden. We hebben een aantal van de elektroden vervaardigd door Nepa Gene (Chiba, Japan) bijzonder geschikt voor dit doel gevonden. Met onze procedure transfectie van de gehele hypothalamus neuro-epitheel of gedeeltelijke, regionale transfectie afhankelijk elektrode oriëntatie krijgen we. Hier laten we de techniek door transfecteren van de mammillary lichaam, misschien welde diepste en meest verzonken van alle hypothalame kernen. Daarnaast tonen we gedetailleerde histologische analyse van de getransfecteerde cellen naar het cellulaire niveau van de resolutie. Een vergelijking van de in utero elektroporatie met andere benaderingen transfecteren van de muis ontwikkelende hersenen in utero te vinden in de sectie discussie.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>REAGENTS</td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Sanofi GmbH</td><td></td><td>anestheticum</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>HDG9623</td><td>anestheticum</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Pharma GmbH</td><td></td><td>anestheticum</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Fluka</td><td>44715</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rimadyl</td><td>Pfizer</td><td></td><td>non-steroïdale anti-inflammatoire</td></tr><tr><td>Braunoderm</td><td>Braun</td><td>3887138</td><td>povidon-jodium</td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Temgesic (buprenorfine)</td><td>Essex Pharma</td><td></td><td>opioïde analgeticum</td></tr><tr><td>Eye Ointment</td><td>Pan-Ophtal</td><td>7136926</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5</td><td>Medical Developments Australia</td><td>ACN 004 903 682</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Capillary puller P-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Compresstome</td><td>Precisionary Instr.</td><td>VF-300</td><td>Vibratome-type device</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Nepa Gene Co. Ltd.</td><td>CUY21EDIT</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Electrode 1</td><td>Nepa Gene Co. Ltd.</td><td>CUY550-10</td><td>Roestvrijstalen naaldelektrode, 10 mm-tip, 0. 5 mm diam.</td></tr><tr><td>Electrode 2</td><td>Nepa Gene Co. Ltd.</td><td>CUY700P4L</td><td>Plaatje van ronde platina 4 mm diameter</td></tr><tr><td>Fiberoptic cold light source</td><td>Leica</td><td>KL2500 LCD</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC120T-15</td><td>1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D.</td></tr><tr><td>Glass bead sterilizer</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST250</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Harvard Apparatus</td><td>py872-5272</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Injection device</td><td>World Precision Instruments</td><td>Pneumatic Pico Pump PV820</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Suture Thread Coated Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>V4914</td><td>Peritoneal Suture</td></tr><tr><td>Suture Thr. Supramid</td><td>Serag Wiessner</td><td>TO07171L</td><td>Huidnaad</td></tr></tbody></table>

genetische manipulatie van de muis ontwikkelen hypothalamus via<em&gt; in utero</em&gt; elektroporatie

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetische modificatie van specifieke gebieden van de ontwikkelende hersenen van zoogdieren is een zeer krachtige experimentele benadering. Echter, het genereren van nieuwe muismutanten is vaak frustrerend traag. Er is aangetoond dat de toegang tot de hersenen van muizen ontwikkelen in utero met redelijke post-operatory overleving mogelijk. Toch resultaten met deze procedure zijn bijna uitsluitend gerapporteerd voor de meest oppervlakkige en gemakkelijk toegankelijk deel van de ontwikkeling van de hersenen, dat wil zeggen de cortex. De thalamus, een smaller en middengebied is moeilijker doel gebleken. Transfectie in diepere kernen, met name die van de hypothalamus, is misschien wel de meest uitdagende en dus zeer weinig resultaten zijn gemeld. Hier laten we een procedure om de gehele hypothalamus neuroepithelium of deel daarvan (hypothalamische regio) voor transfectie door elektroporatie richten. De sleutels van onze aanpak zijn langer narcose keer, injectie in de third ventrikel en passende vorm en plaatsing van de elektroden. Daarnaast tonen we de resultaten van targeting en daaropvolgende histologische analyse van de meest verzonken hypothalamus nucleus, het mammillary lichaam.

De meeste hypothalamus neuronen zijn geboren tussen E11.5 tot E15.2, volgens geboorte-dating-analyse bij de rat 26 vertaald in de wat kortere muis ontwikkeling 27,28. De piek van de hypothalamus neurogenese wordt bereikt bij E12.5 29-31. Dienovereenkomstig, op de leeftijd transfectie gekozen voor deze studie (E12.5), een groot deel van neuronen van de hypothalamus codeerbaar op elk rostro-caudale niveau. Analyse op E18.5 op dikke vibratome-gedeelten die <stro...

Ondanks de functionele en medische belang van de hypothalamus,<em&gt; In de baarmoeder</em&gt; Genetische manipulatie van zijn ontwikkeling is zelden geprobeerd. We tonen een gedetailleerde procedure voor<em&gt; In de baarmoeder</em&gt; Elektroporatie in de muis hypothalamus en tonen representatieve resultaten van de gedeeltelijke of volledige (regionale) hypothalamus transfectie.

Genetische Manipulatie van de muis Ontwikkelen Hypothalamus via<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Het algemene doel van deze procedure is om plasmide-DNA te transfecteren in de hypothalamus van muisembryo's die in utero zich ontwikkelen, om zo de functie van een specifiek gen van belang te activeren of te onderdrukken. Dit wordt bereikt door eerst de drachtige muis te anesthetiseren en de uterus bloot te leggen via een laparotomie. De tweede stap bestaat uit het injecteren van de DNA-oplossing in het derde ventrikel van de embryonale hersenen.Vervolgens wordt de positieve elektrode in de baarmoeder geplaatst tussen de placenta en de embryonale kop. De negatieve elektrode wordt op het buitenste oppervlak van de baarmoeder geplaatst en er worden elektrische pulsen toegediend. De laatste stap is het verwijderen van de getransfecteerde embryonale hersenen zes dagen later.Uiteindelijk wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om de fenotypische veranderingen van de getransfecteerde cellen te analyseren, zoals aantal, vorm, positie, markerexpressie, enzovoort. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals virale transfectie zijn enerzijds dat er geen speciale voorzorgsmaatregelen nodig zijn en geen twee aparte faciliteiten, en anderzijds dat tar

genetic-manipulation-mouse-developing-hypothalamus-through-utero

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In Utero Intraventriculaire injectie en elektroporatie van de E15 muizenembryo&#39;s

In utero elektroporatie zorgt voor een snelle genafgifte in een ruimtelijk-temporeel en gecontroleerde wijze in de zich ontwikkelende centrale zenuwstelsel (CZS). Hier beschrijven we een groot aanpassingsvermogen in utero electroporatie protocol dat gebruikt kan worden om expressie constructen te leveren in meerdere embryonale CNS domeinen, waaronder de telencephalon, diencephalon en netvlies.

Efficiënte gen delivery in meerdere CNS Gebieden Het gebruik van In Utero Elektroporatie

Een genoverdracht methode in de zich ontwikkelende hersenen van muizen wordt beschreven door middel van een unieke chirurgische methode en de speciale vorm van de elektroden. Deze unieke techniek maakt het mogelijk transfectie van plasmide DNA tijdelijk en ruimtelijk, die veel neurowetenschappers zullen helpen bij het bestuderen van ontwikkeling van de hersenen.

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

Deze studie beschrijft de ontwikkeling van...

In vitro Elektroporatie van de Tweede Rhombic Lip van Midgestation muizenembryo&#39;s

Dit artikel beschrijft in detail een protocol bij electroporate in utero de cerebrale cortex en de hippocampus bij E14.5 bij muizen. We tonen ook aan dat dit een waardevolle methode om dendrieten en stekels te bestuderen in deze twee cerebrale regio's.

Visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de muis Cerebral cortex en de hippocampus met behulp van<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

Hier presenteren we een protocol dat een hulpmiddel biedt om regulerende mechanismen van specifieke genen tijdens de ontwikkeling van de hippocampus te onderzoeken. Het gebruik van ex utero elektroporatie en organotypische plakcultuur maakt de op- en neerregulatie van de expressie van genen van belang in enkele cellen mogelijk en volgt hun lot tijdens de ontwikkeling.

Ex Utero Electroporatie en Organotypische Slice Cultuur van de muis hippocampus Tissue

Dit protocol beschrijft in detail hoe specifiek te transfecteren verschillende regio's in het centrale zenuwstelsel van C57BL/6 via in utero elektroporatie. Inbegrepen in dit protocol zijn gedetailleerde instructies voor transfecties van regio's die zich ontwikkelen tot de cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, laterale septumkern en striatum.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Laterale Septal Nucleus- en Striatum-specifieke<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie in de C57BL / 6 muis

Nodulair heterotopia van de Periventricular (PNH) is de meest voorkomende vorm van misvorming van corticale ontwikkeling (MCD) in volwassenheid maar haar genetische basis blijft onbekend in meest sporadische gevallen. Onlangs hebben we een strategie nieuwe kandidaat om genen te identificeren voor MCDs en direct bevestigen hun oorzakelijke rol in vivo.

Een nieuwe strategie combinatie matrix-CGH, geheel-exome Sequencing en In Utero Electroporation bij knaagdieren ter identificatie van de oorzakelijke genen voor hersenen misvormingen

De rol van recent ontdekte ziekte-geassocieerde genen in de pathogenese van neuropsychiatrische aandoeningen blijft onduidelijk. Een gemodificeerde bilaterale in utero elektroporatie techniek maakt de genoverdracht in grote populaties neuronen en onderzoek van de veroorzakers van genexpressie veranderingen op sociaal gedrag mogelijk.

Een pijpleiding die bilaterale in Utero-elektroporatie gebruikt om genetische invloeden op knaagdiergedrag te ondervragen

In dit protocol beschrijven we hoe de vruchtwaterholte van de muis op E7.5 kan worden geïnjecteerd met lentivirus, wat leidt tot uniforme transductie van de gehele neurale plaat, met minimale schadelijke effecten op overleving of embryonale ontwikkeling.

Murine Neural Plate Targeting door In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) op Embryonale Dag 7.5

Leer in utero elektroporatie in de muis hypothalamus voor genetische manipulatie tijdens de embryonale ontwikkeling. Deze methode maakt gerichte DNA-transfectie en genfunctie-analyse in vivo mogelijk.

Genetische Manipulatie van de muis Ontwikkelen Hypothalamus via

Meer video's verkennen