Micromanipulatie van genexpressie in de Adult zebravis hersenen met behulp Cerebroventricular Micro-injectie van Morfolino Oligonucleotides

Het algemene doel van deze procedure is om morpholino-oligonucleotiden in de cerebrale ventrikel van de hersenen van de volwassen zebravis te micro-injecteren en om de activiteit van genen in de radiogliaalcellen te onderdrukken. Dit wordt bereikt door de zebravis eerst te anesthetiseren. Vervolgens wordt met een gekartelde dentaalnaald een incisie gemaakt in de schedel, boven de optic tectum.

Vervolgens wordt de morpho-oplossing via de incisieplaats in de cerebrale ventrikelvloeistof geïnjecteerd. Ten slotte worden de efficiëntie en nauwkeurigheid van de injectie gecontroleerd onder de fluorescentiemicroscoop. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald door de efficiënte en wijdverspreide blokkade van eiwitproductie vanuit de genen van belang in de radiale gliacellen van de hersenen van de volwassen zebravis via morpho-gemedieerde gene knockdown, wat kan worden geanalyseerd middels histologische coupes en immunohistochemische kleuringen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals transgene benaderingen of leveringsmethoden op basis van elektroporatie, is dat CVMI minder tijdrovend is en efficiënter is in het targeten van de gehele populatie radiale gliacellen. Deze zijn aanpasbaar en meerdere genen kunnen gelijktijdig worden uitgeschakeld. Om het injectiemengsel te bereiden, begint u met het maken van een 500 Micromolar Morpho-stockoplossing.

Bereid voor 10 injecties 10 µL injectiemengsel voor door negen µL verdunde of onverdunde morpho-oplossing te combineren met één µL fluorescente trackingkleurstof, gebruikmakend van PBS. Bewaar dit bij kamertemperatuur. Gebruik een naaldtrekker om glazen injectiecapillairen voor te bereiden volgens de volgende parameters.

Schakel de drukbron in en stel de drukinstellingen in op 50 PSI of 3,5 bar. Stel de instellingen van de micro-injector als volgt in: houddruk 20 PSI, uitstootdruk 10 PSI, periode-waarde 2,5 en 100 milliseconden.

Bereik van de gating. Schakel de ringverlichting in en plaats de ring over de microscooptafel. Plaats de capillairhouder op een geschikte positie naast de microscoop.

Plaats de glazen capillair in de houder en stel de injectiehoek in op 45 graden. Gebruik een fijne pincet om de punt van de glazen capillair af te breken en calibreer de drukuitvoer vanuit de opening. Door de punt van de naald in het viswater te dompelen en een continue drukpuls toe te passen, moeten de luchtbellen een enkele rij vormen, wat duidt op een optimale druk of openinggrootte.

Vul de glazen capillair met de injectie-oplossing. Oefen druk uit om de lucht tussen de punt van de glazen capillair en de geladen injectie-oplossing te verwijderen, terwijl u luchtbellen vermijdt. Nadat een 0,1% stockoplossing van het anestheticum meab is bereid, brengt u het gewenste aantal vissen over naar een transportcontainer met viswater.

Bereid een werkoplossing van het anestheticum voor door 200 milliliters viswater te mengen met vijf milliliters MISP-stamaanmaakoplossing. Vul een Petrischaal voor de halve hoogte met het anestheticum voor gebruik bij injecties. Incubeer een vis in het anestheticum tot deze stopt met bewegen.

Gebruik vervolgens een net om de vis over te brengen naar de petrischaal met anestheticum. Om de incisie te vergemakkelijken, houdt u de vis voorzichtig vast met de pincet en oriënteert u deze zodanig dat de kop iets naar beneden is gekanteld. Maak met de punt van een 30 gauge gebarbeerde naald een kleine snee in de schedel zonder te diep door te dringen, aangezien dit schade aan het hersenweefsel kan veroorzaken.

Houd de vis vast en steek de punt van de glazen capillair ongeveer een halve millimeter door de incisieplaats. Richt de capillair naar het cephalon, waarbij contact met het hersenweefsel wordt vermeden. Injecteer de oplossing; deze moet zich onmiddellijk verspreiden. Plaats de vis vervolgens in vers aquariumwater en laat deze herstellen.

Anestheseer de vis na ongeveer 30 minuten opnieuw en controleer deze onder een fluorescentiemicroscoop om te kijken naar een wijdverspreide distributie van de vloeistof, op basis van rode fluorescentie. Plaats de vis terug in zijn aquarium en breng hem terug in het circulatiesysteem.

Tot aan het gebruik voor gedragsanalyses of voor het bereiden van weefselmonsters zoals hier getoond, leidt een nauwkeurige injectie tot verspreiding van de geïnjecteerde oplossing door de hersenen en een efficiënte targeting van de cellen nabij het ventriculaire oppervlak. Echter, bij injecties waarbij de glazen capillair het hersenweefsel doorboort, zal er een dicht fluorescent signaal aanwezig zijn op het punt van injectie. En als de geïnjecteerde hoeveelheid onvoldoende is, zal een zwak fluorescent signaal worden waargenomen.

Deze figuur demonstreert dat vivo morpho's enkele celdiameters diep in het ventriculaire oppervlak kunnen penetreren en daarom de ventriculaire cellen efficiënter kunnen targeten vergeleken met de controle-morpho. Injectie van morpho tegen PCNA knockt de genexpressie in ventriculaire cellen efficiënt down. In deze immunofluorescentiebeelden tonen BRDU- en QCD-immunokleuringen na een A-B-R-D-U pulse-chase experiment aan dat knockdown van PCNA met antisense morpho's leidt tot een significante vermindering van pasgeboren neuronen, wat suggereert dat CVMI kan worden gebruikt om endogene genen te knockdownen, wat vervolgens leidt tot functionele consequenties.

Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de neurowetenschappen om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die betrokken zijn bij de regeneratieve neurogenese-respons van de hersenen van de volwassen S-vis.