Imaging en 3D Reconstructie van cerebrovasculair Structuren in embryonale zebravis
22 april 2014
Beeldvorming van cerebrovasculaire ontwikkeling in larvale zebravis wordt beschreven. Technieken om 3D-beeldvorming te vergemakkelijken en het gebruik van chemische behandelingen cerebrovasculaire ontwikkeling passen zijn ook aanwezig.
Het algemene doel van deze procedure is om cerebrovasculaire structuren in embryonale zebravissen te evalueren. Dit wordt bereikt door eerst bevruchte zebraviseieren te verzamelen en behandelingsomstandigheden in te stellen. Na een groeiperiode van drie dagen worden de zebravissen gedood, gefixeerd en wordt een oog voorzichtig verwijderd voordat het specimen op glasplaatje wordt gemonteerd.
Vervolgens wordt de cerebro vasculaire structuur gevisualiseerd door confocale microscopie. Ten slotte worden 3D-renderingen van het vaatstelsel gegenereerd met behulp van open source software. Uiteindelijk wordt de analyse van de reconstructies gebruikt om de effecten van de behandelingsomstandigheden op de vertakking en dichtheid van bloedvaten te bepalen.
In de zich ontwikkelende zebravisbrein. Deze techniek evalueert het gehele vaatstelsel van embryonale zebravissen. Het heeft ons toegestaan de biologie van amyloid beta op orgaansysteemniveau te bestuderen.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de dissectie en beeldanalyse moeilijk te leren zijn omdat ze technisch uitdagend zijn. Om te beginnen, kweek een transgene zebravisstam die versterkt groen fluorescent eiwit uitdrukt in de gewenste weefsels bij 28,5 graden Celsius met een cyclus van 14 uur licht, 10 uur donker. In dit voorbeeld worden transgene vissen die EGFP uitdrukken in vasculaire endotheelcellen gekweekt de nacht voor de eierverzameling. Zet mannetjes en vrouwtjes in kweektanks met gaasbodems. De volgende ochtend verwijdert u de scheidingswand en laat u de vissen paren terwijl u elke 15 minuten op eieren controleert.
Nadat u een gaasfilter hebt gebruikt om de eieren te verzamelen en ze met E drie medium hebt gewassen, gebruikt u E drie om de eieren over te brengen naar 100 millimeter kweekschalen en incubeert u ze bij 28 graden Celsius om de cerebrovasculaire vertakking te veranderen. Begin bij 24 uur na bevruchting met het toevoegen van een chemische stof zoals een gamma secretase remmer opgelost in DMSO. Indien gewenst, voegt u 0,03% PTU toe om pigmentvorming te remmen.
Nadat de embryo's in oplossing zijn overgebracht naar de putjes van een 12-putsplaat, incubeert u bij 28,5 graden Celsius tot de embryo's het gewenste ontwikkelingsstadium bereiken. Na het doden van de embryo's in trica en het fixeren ervan met aldehyde gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Bewaar de embryo's in PBS in het donker bij vier graden Celsius.
Om het oog van het embryo te verwijderen, gebruikt u een geslepen wolfraamnaald en snijdt u rond het weefsel dat één oog verbindt. Snijd vervolgens de spieren en tenslotte de oogzenuw om het oog te verwijderen. Zodra het oog is verwijderd, draait u het embryo om op een glasplaatje met de lege oogkas naar beneden en raakt het glasplaatje aan.
Voeg een druppel 3% Methylcellulose toe om het embryo op zijn plaats te houden en om het hele embryo te bedekken om uitdroging te voorkomen. Tijdens het beeldvormen met behulp van een omgekeerde confocale microscoop met een 20 x plan APO objectief, beeldt u het embryo onmiddellijk af, veel beeldvormingssystemen kunnen alleen vasculaire structuren halverwege dit specimen oplossen. Als dit het geval is, resuspendeer, schors het embryo in PBS en monteer het opnieuw aan de andere kant voor verdere beeldvorming om 3D-reconstructie van cerebrovasculaire beelden uit te voeren met behulp van Image J, die is geoptimaliseerd voor 3D-renderingen.
Importeer confocale stapels door naar plugins, loci, bio-formats importer te gaan en selecteer vervolgens het confocale bestand voor Nikon-stacks selecteer stackweergave met hyperstack en stel de kleurmodus in op grijsschaal. Controleer vervolgens automatisch schalen en kanalen splitsen. Deze selecties openen vier afzonderlijke kanaalpanelen.
Sluit alle behalve het 16-bits beeld met de bestandsnaam gevolgd door c gelijk aan één. Pas de drempelwaarde aan door de scrollbalk aan de onderkant te gebruiken om door te scannen om een schijf te vinden met het gebied of de structuur van belang. Ga vervolgens naar beeld drempelwaarde aanpassen.
In het paneel dat verschijnt, schuift u de bovenste balk naar links zodat de structuur goed zichtbaar is boven de achtergrond en laat u de onderste schuif waar hij is om een nieuwe acht-bits afbeelding te maken. Selecteer zwart-wit. Vervolgens donkere achtergrond.
Selecteer niet de drempelwaarde berekenen voor elke afbeelding, tenzij er voor elke schijf verschillende aanpassingen nodig zijn. Ga vervolgens naar plugins 3D-viewer drempelwaarde nul herbemonsteringsfactor een of twee en deselecteer de rode en blauwe kleurvakken om een groene 3D-uitvoer te maken. Anders zal het een witte rendering produceren.
Selecteer vervolgens toepassen. Gebruik de muis- en toetsenbordbediening om de 3D-afbeelding te draaien, draaien en in te zoomen om op elk moment stilstaande beelden op te slaan. Gebruik de optie voor opname in het menu.
De grootte van het afbeeldingsvak op het scherm bepaalt de pixelafmetingen van de geproduceerde afbeelding, dus als een afbeelding met hoge resolutie gewenst is, maakt u het vak groter door de rechter onderhoek te slepen. Maak een draaiende 3D-film door 'weergave opnemen 360 graden rotatie' te selecteren. Bewaar ten slotte het bestand in een van de beschikbare formaten en gebruik de gratis open source mediaspeler VLC voor het bekijken van 3D.
Reconstructie van vasculaire structuren biedt een uitgebreid en visueel interessant perspectief van de ontwikkeling van zebravissen. Hier zijn verschillende hoeken van vasculaire structuren te zien in een zebravisembryo van zes dagen na bevruchting die EGFP in endotheelcellen uitdrukte met monochroom groene of witte kleuren. Het kan moeilijk zijn om de signaalintensiteit te waarderen, maar pseudokleuring biedt afbeeldingsintensiteit vanuit een lookup tabel, wat zorgt voor een betere diepteperceptie van overlappende structuren.
Deze figuur toont bijvoorbeeld een pseudogekleurde 3D-afbeelding van het vaatstelsel in een zebravis van zes dagen na bevruchting. Deze techniek stelde ons in staat om de
Overzicht
Dit artikel beschrijft beeldvormingstechnieken voor het evalueren van de cerebrovasculaire ontwikkeling bij zebravissenlarven. Het schetst methoden voor 3D-beeldvorming en het gebruik van chemische behandelingen om cerebrovasculaire structuren te modificeren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Beeldbewerkings- en beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Cerebrovasculaire structuren zijn cruciaal voor het begrijpen van de hersenontwikkeling.
- Zebravissenlarven dienen als modelorganisme voor het bestuderen van vasculaire systemen.
- Beeldvormingstechnieken kunnen inzicht bieden in vasculaire veranderingen als gevolg van behandelingen.
- Transgene zebravissen die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen, verbeteren de visualisatie.
Doel van de studie
- Om cerebrovasculaire structuren in embryonale zebravis te evalueren.
- Om de effecten van chemische behandelingen op de vasculaire ontwikkeling te beoordelen.
- Om beeldvormingstechnieken voor het bestuderen van vasculaire biologie te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Verzameling en incubatie van bevruchte zebravisseitjes.
- Toepassing van chemische behandelingen om vasculaire vertakking te beïnvloeden.
- Confocale microscopie voor beeldvorming van cerebrovasculaire structuren.
- 3D-reconstructie van beelden met behulp van opensource-software.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van cerebrovasculaire structuren bij zebravisen.
- 3D-renderings boden inzicht in de vertakking en dichtheid van bloedvaten.
- Aantoonde impact van amyloïd bèta op de vasculaire ontwikkeling.
- Visuele technieken verbeterden het begrip van vasculaire netwerken.
Conclusies
- De studie biedt een methode voor het visualiseren van vasculaire netwerken in zebravissen.
- Deze benadering is waardevol voor het onderzoeken van angiogenese en vasculaire biologie.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze technieken om andere biologische vragen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Deze methode maakt hoogresolutie 3D-visualisatie van cerebrovasculaire netwerken in een genetisch hanteerbaar gewervde model mogelijk, wat bijdraagt aan mechanistische risicovermindering van angiogene targets. Het levert kwantitatieve vasculaire metrieken die het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase vergroten door chemische perturbaties te koppelen aan structurele fenotypes. De aanpak biedt een schaalbaar, reproduceerbaar platform voor het evalueren van de vasculaire effecten van neuroactieve verbindingen in een ziekterelevant systeem.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen over vasculaire vertakking en dichtheid in een levend gewervde system mogelijk.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe visualisatie van de effecten van target-interactie op de cerebrovasculaire architectuur.
- Voorspellende waarde: Genereert structurele resultaten die bijdragen aan de betrouwbaarheid van het target en de prioritering van de portfolio op basis van angiogene activiteit.
Screening en assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Produceert gestandaardiseerde, op fluorescentie gebaseerde vasculaire readouts die compatibel zijn met confocal imaging-pipelines.
- Kwantitatieve output: Maakt meting van vertakkingspatronen en dichtheid van vaten mogelijk voor compound screening-campagnes.
- Schaalbaarheid van het platform: Maakt gebruik van openbaar beschikbare software voor 3D-reconstructie, wat de reproduceerbaarheid tussen laboratoria en de overdracht van assays vergemakkelijkt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Modelleert de menselijke cerebrovasculaire pathofysiologie in een gewerveld systeem met geconserveerde angiogene routes.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en in vivo vasculaire fenotypes, ter ondersteuning van de preklinische validatie van angiogene modulatoren.
- Risicogebaseerde besluitvorming: Levert morfologische gegevens om go/no-go-beslissingen te onderbouwen op basis van signalen voor vasculaire veiligheid of werkzaamheid.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadoptimalisatie, waarbij vasculaire fenotypes bijdragen aan het mechanistische begrip en de structuur-activiteitsrelaties.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van angiogene routes door genetische of chemische perturbaties te koppelen aan de 3D vasculaire morfologie.
- Screening: Levert reproduceerbare, op imaging gebaseerde eindpunten voor het beoordelen van de effecten van verbindingen op de vorming van vasculaire netwerken.
- Analytics: Genereert 3D-reconstructies en morfometrische gegevens die comparatieve analyse tussen verschillende behandelcondities mogelijk maken.
- Translational Research: Verbindt vroege vasculaire bevindingen met preklinische modellen via geconserveerde mechanismen van de ontwikkeling van de bloed-hersenbarrière en angiogenese.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar imagingplatform voor vasculaire fenotypering over meerdere projecten en therapeutische gebieden.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in angiogene signalering te verminderen.
- Operationele waarde: Standardiseert workflows voor vasculaire beeldvorming en analyse, waardoor de reproduceerbaarheid tussen teams en locaties wordt verbeterd.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroegtijdige detectie van vasculaire tekortkomingen of therapeutische mogelijkheden mogelijk te maken.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang door middel van objectieve, op beeldvorming gebaseerde vasculaire fenotypering.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de husbanderie van zebravis, het omgaan met transgene modellen en confocale microscopie.
- Afhankelijk van toegang tot confocale microscopen met geschikte objectieven en fluorescentiefiltersets voor EGFP-detectie.
- Vereist gestandaardiseerde fixatie- en montageprotocollen om de fluorescentie en weefselintegriteit voor 3D-reconstructie te behouden.
- Omvat training in 3D-beeldanalyse met behulp van open-source tools zoals ImageJ om een consistente vasculaire kwantificering te waarborgen.
- Beperkt door de grootte van het embryo en de optische penetratie, wat de beelddiepte in latere ontwikkelingsstadia kan beperken zonder clearing of sectie-imaging.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:23
Zebrafish Husbandry, Embryo Generation, and Treatment
2:50
Confocal Imaging of Cerebrovascular Structures in Fixed Zebrafish Embryos
4:07
3D Reconstruction of Embryonic Zebrafish Cerebrovasculature
6:34
Results: 3D Reconstruction of Embryonic Zebrafish Cerebrovasculature
7:26
Conclusion
