Name: Imaging en 3D Reconstructie van cerebrovasculair Structuren in embryonale zebravis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-22T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Leer cerebrovasculaire structuren in embryonale zebravis evalueren met confocale microscopie en 3D-reconstructie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar angiogenese en vasculaire biologie in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken verleden en huidige leden van onze laboratoria die heeft geholpen deze technieken te ontwikkelen. Gedeeltelijke financiering door een subsidie ​​van het California Institute for Regenerative Medicine / CIRM (RN1-00538) naar DE verstrekt.

1. Zebravis Veehouderij, Embryo Generation, en behandeling <ol><li> Voeren de volgende zebravis protocollen onder de begeleiding van een institutionele Animal Care en gebruik Comite (IACUC) en binnen dierverzorging richtlijnen van de NIH of andere regelgevende instanties / richtlijnen. </li><li> Zebravis stammen die fluorescerende eiwitten tot expressie in specifieke weefsels, cellen of organen zijn verkrijgbaar bij de zebravis International Resource Center (Zirc). Bijvoorbeeld, Tg (KDR: EGPF) s843 EGFP expressie in vasculaire endotheelcellen 6, die kan worden gebruikt om volledige 3D vasculaire structuren te produceren zoals in dit protocol. Andere lijnen van transgene zebravis zijn verkrijgbaar bij Zirc. </li><li> Huis volwassen zebravissen in een geschikt aquacultuur systeem dat pH, zoutgehalte, temperatuur, opgeloste zuurstof, licht, en andere omgevingsfactoren 7 bewaakt. De hier getoonde zebravis werden gehuisvest in een Aquaneering Inc systeem (San Diego, CA) en 28.5 ° C met een 14 uur light/10 uur donker cyclus. Feed volwassen zebravissen een uitgebalanceerd dieet van pekel garnalen en NRD 4/6 Visvoer (Brine Shrimp Direct, Ogden, Utah). </li><li> Volwassen mannelijke en vrouwelijke zebravis van vruchtbare leeftijd dienen afzonderlijk te worden gehuisvest aan de paring succesvol te verhogen. </li><li> Stimuleer de eileg en bemesting door het plaatsen van vrouwen (2-4) en mannen (4-6) samen in een paring container die een mesh bodem met gaten groot genoeg voor de eieren te vallen door heeft, maar te klein voor de zebravis volwassenen te passeren . Opzetten van paringen de avond voor; eieren worden gelegd in de buurt van de dageraad, meestal terwijl het overdag licht cyclus langzaam in intensiteit toeneemt (dageraad). Controleer eieren op de bodem van de houder koppelen elke 15-30 minuten. </li><li> Verzamel eieren met behulp van een zeef en schoon met E3 buffer (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4). Breng de eieren tot 100 mm cultuur platen gevuld met E3 buffer en op te slaan in een 28 ° C incubator. </li><li> Chemische stoffen die cer veranderen studerenebrovascular vertakking voegen gewenste chemische concentraties. Bijvoorbeeld neovascularisatie vertakking kan worden geïnduceerd met γ-secretase inhibitor (GSI IX/DAPT/N- [N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butylester) opgelost in DMSO 4, beginnend 24 uur na de bevruchting (HPF). Op dat moment-point embryo&#39;s nog steeds binnen het chorion, en vele chemicaliën doorheen kan 8. Als een behandelingsconditie heeft neurale of motorische effecten die het vermogen van embryo zonder de chorion breken kan beïnvloeden, dan embryo&#39;s worden de-chorionated tussen 24 en 48 HPF, die kan worden gedaan met ofwel tang pronase 2. Embryo&#39;s getoond in de beelden geleverd werden dechorionated door voorzichtig grijpen de chorion met twee geslepen pincet en scheurt hem open. </li><li> Indien nodig / gewenst pigmentvorming kan worden geremd door toevoeging van 0,003% N-fenylthioureum (PTU) het E3 buffer 24 HPF. </li></ol> 2. Confocale beeldvorming van Cerebrovascular Structgelen in Vaste zebravis embryo&#39;s <ol><li> Offer embryo in 250 mg / L tricaïne methaansulfonaat, en vervolgens lossen door onderdompeling in 2 - 4% paraformaldehyde gedurende de nacht bij 4 ° C. Containers met fluorescerende embryo&#39;s moet worden verpakt in folie. Eenmaal vastgesteld, moet embryo&#39;s worden opgeslagen in PBS bij 4 ° C totdat afgebeeld - EGFP fluorescentie-intensiteit minder opgelost na ongeveer een week, maar morfologie (zoals gezien in helderveld) is veel langer bewaard. </li><li> Bereid je voor om het embryo te monteren door eerst een oog met behulp van een scherpe wolfraam naald. Snij het weefsel verbinden het oog het eerst knip dan de spieren, en uiteindelijk snijd de oogzenuw aan het oog te verdringen. (Opmerking: als beeldvorming beide kanten gewenst verwijderen beide ogen.) </li><li> Zodra het oog wordt verwijderd, monteer het embryo op een dekglaasje met behulp van een daling van 3% methylcellulose. Richt het embryo, zodat de kant met het verwijderde oog wordt geconfronteerd met de dekglaasje en is zo dicht mogelijk bij het glas mogelijk. Bedek de hele embryo met methyllcellulose uitdroging tijdens de beeldvorming te voorkomen. </li><li> Afbeelding gemonteerde embryo onmiddellijk met een omgekeerde confocale microscoop met een hoge kwaliteit 20x Plan Apo objectief (numerieke lensopening = 0,75 of beter). Deze configuratie verdient de voorkeur om een ​​niet-geïnverteerde microscoop die zou vereisen daartussen het embryo tussen twee glazen vlakken, en op de embryo tegen de bovenkant glas. </li><li> Verzamel optische schijfjes in 1 micrometer stappen van het gebruik van een middelgroot of groot diafragma. Grotere stappen van 2,5 urn kan worden gebruikt, maar het kan moeilijk zijn om de ruimtelijke organisatie van kleinere objecten bepalen. Kleine openingen scherpere details, maar langere scans vereiste bleken EGFP en beperken ook de diepte van de beeldvorming in het embryo kan worden bereikt. Een confocale microscoop maakt beeldvorming ongeveer halverwege een embryo. </li><li> Als beeldvorming van de hele vis wordt gewenst, verwijder beide ogen in het begin (zie opmerking in stap 3.2), draait het embryo na imaging ene kant en herhaal de stappen 2,3-2,5 voor de andere kant. </li></ol> 3. 3D Reconstructie van embryonale zebravis Cerebrovasculature <ol><li> Gebruik de Fiji distributie 3 van open source ImageJ (http://fiji.sc), die is geoptimaliseerd voor 3D renderings, kosteloos, en compatibel met PC, Mac en Linux-computers. </li><li> Import confocale stapels naar Fiji door te gaan naar Plugins&gt; LOCI&gt; BioFormats importeur 9 selecteer vervolgens de confocale bestand, bijvoorbeeld name.ids voor Nikon stacks (Figuur 2A). Selecteer Bekijk stack met HyperStack, Kleur-modus: grijswaarden, check autoscale, check split kanalen. </li><li> Deze selecties zullen vier apart kanaal panelen te openen; enige voor EGFP nodig zal zijn, meestal de derde naar beneden. Sluit de andere drie panelen (rood, blauw en alpha) beeld 16-bits waardoor een lange naam gevolgd door C = 1 (Figuur 2A). </li><li> Pas de drempel door het scannen hoewel het beeld met behulp van de scroll-tab langs de onderkant om een stukje dat de regio of de structuur van belang is te vinden, ga dan naar Afbeelding&gt; Aanpassingen&gt; Drempel (figuur 2C). </li><li> In het panel dat omhoog komt, schuif de bovenste balk (zwartniveau) naar links zodat de structuur heel goed te zien is op de achtergrond, en laat de onderste schuif (wit-niveau) waar het is (figuur 2D). Selecteer B &amp; W, selecteert Donkere achtergrond. Heeft berekenen Drempel voor elk beeld niet selecteren, tenzij anders aanpassingen nodig zijn voor elk segment, selecteert Zwarte achtergrond. Dit proces creëert nieuwe afbeelding een 8-bit. </li><li> WAARSCHUWING: Threshold kan niet ongedaan worden gemaakt of opgeslagen in ImageJ, zodat de confocale stack zal elke keer een verandering nodig is om te worden herladen. Noteer de nummers en probeer verschillende instellingen totdat het gewenste resultaat is bereikt. </li><li> Ga naar Plugins&gt; 3D Viewer&gt; Drempel 0, Resampling factor 1 (beste) of 2 (goed), schakelt u de rode en blauwe kleur dozen aan een groene 3D output maken - anders will produceren een witte rendering - selecteer Apply (niet automatisch) (figuur 2E). </li><li> Roteren, draaien en zoomen het 3D-beeld met behulp van de muis en het toetsenbord controles (figuur 2F). </li><li> Opslaan van stilstaande beelden op elk punt met de optie capture in het menu. De grootte van het beeld doos op het scherm dicteert pixelafmetingen van de afbeelding geproduceerd dus als een hoge resolutie gewenst make het vak groter door het slepen van de rechter benedenhoek. </li><li> Maak een draaiende 3D-film via Beeld&gt; Record 360 graden rotatie (figuur 2G). Rotatie standaard 2 graden per stap, maar het kan worden veranderd tot 5 graden bijvoorbeeld, die veel kleinere bestanden zal leiden, maar kan schokkerige toe te voegen aan de animatie. </li><li> Sla het bestand op in een van de verschillende beschikbare formaten om later te bekijken met mediaspelers, uploaden naar het internet, of het gebruik in PowerPoint-presentaties. De open source mediaspeler VLC ( <a href="http://www.videolan.org/vlc/index.html">ht</a>tp :/ / www.videolan.org / vlc / index.html), is gratis en behandelt deze video&#39;s heel goed. </li></ol>

<ol><li>Staudt, D., Stainier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+the+molecular+and+cellular+mechanisms+of+heart+development+using+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish.</a> Annu Rev Genet. 46, 397-418 (2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Cameron, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s-related+peptide+amyloid-%CE%B2+plays+a+conserved+role+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's-related peptide amyloid-β plays a conserved role in angiogenesis.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Cunvong, K., Huffmire, D., Ethell, D. W., Cameron, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-%CE%B2+increases+capillary+bed+density+in+the+adult+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Amyloid-β increases capillary bed density in the adult zebrafish retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, 1516-1521 (2013).</li>
<li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li>
<li>Lawrence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+husbandry+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review.</a> Aquaculture. 269, 1-20 (2007).</li>
<li>Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+major+permeability+barrier+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Characterization of a major permeability barrier in the zebrafish embryo.</a> Biol Reprod. 59, 1240-1250 (1998).</li>
<li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274(2010).</li>
<li>Opitz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+zebrafish+illuminate+the+dynamics+of+thyroid+morphogenesis+and+its+relationship+to+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenic zebrafish illuminate the dynamics of thyroid morphogenesis and its relationship to cardiovascular development.</a> Dev Biol. 372, 203-216 (2012).</li>
<li>Gleave, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroanatomical+phenotyping+of+the+mouse+brain+with+three-dimensional+autofluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Neuroanatomical phenotyping of the mouse brain with three-dimensional autofluorescence imaging.</a> Physiol Genomics. 44, 778-785 (2012).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Markaki, Y., Smeets, D., Cremer, M., Schermelleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+applications+for+super-resolution+3D+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization applications for super-resolution 3D structured illumination microscopy.</a> Methods Mol Biol. 950, 43-64 (2013).</li>
<li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. 68, e4272(2012).</li>
</ol>

Er is niets te onthullen.

De hier beschreven methoden leveren een basis voor visueel onderzoek van het vaatstelsel in het ontwikkelen van de zebravis. Levende exemplaren kunnen worden gebruikt om fysiologische parameters, zoals hartslag en slagvolume beoordelen, terwijl gefixeerde monsters kunnen worden gebruikt voor hoge-resolutie confocale beeldvorming. Drosophila en C. elegans zorgen voor het gehele lichaam, maar zebravis zijn vertebraten en een nuttig model voor gewervelde weefsels, met inbegrip van een endotheelcel beklede bloedvaten. Deze studies kunnen belangrijke transgene lijnen en genomische hulpbronnen te nemen vanuit de zebravis onderzoeksgemeenschap. 3D reconstructie en weergave van confocale beelden van embryonale zebravis, zoals hier beschreven, zorgen voor een systeembiologie aanpak van vasculaire vertakking en bloedvat dichtheid die niet mogelijk is met grotere diermodellen zoals ratten en muizen. Verder, zoals amniotes zebravis ontwikkelen in een veranderbare omgeving (E3 buffer), waar men kan gemakkelijk c toevoegenhemicals die specifieke enzymen of andere processen die vasculaire ontwikkeling beïnvloeden remmen. De concentratie en de timing van chemische levering kan worden gewijzigd, zodat de onderzoeker te fine-tunen van de behandeling. 1. Wijzigingen en het oplossen van problemen Wijzigingen in dit systeem transgene lijnen zebravis die EGFP of andere fluorescerende eiwitten tot expressie in een verscheidenheid van weefsel, orgaan of regiospecifieke patronen 10 opgenomen. Verdere analyse van neovasculaire ontwikkeling van de zebravis netvlies is onlangs gepubliceerd 5. Problemen met de pigmentatie in oudere embryo&#39;s en volwassen zebravissen kan worden gecompenseerd door kruising met transgene lijnen die niet produceren schaal pigmenten of retinale pigment. Problemen met verminderde fluorescentie meestal het gevolg zijn van een onjuiste fixatie voorwaarden. Paraformaldehyde (4%) gedurende 1 dag optimaal, maar sterker fixatieven, zoals glutaaraldehyde, osmiumtetroxide of alcohol, kanvernietigen EGFP fluorescentie. Na fixatie moet embryo in PBS bewaard bij 4 ° C en altijd beschermd tegen direct zonlicht. 2. Beperkingen van deze techniek De kwaliteit en de resolutie 3D renderings geproduceerd met dit protocol afhankelijk van de kwaliteit van de beelden gegenereerd. Lichtinval door middel van deze embryo&#39;s is beperkt tot het sagittale middenvlak met een standaard confocale microscoop. Dit aspect van de beeldvorming beperkt de diepte van de beeldvorming bij oudere embryo&#39;s en volwassenen, maar meer geavanceerde multi-foton microscopie systemen maken het mogelijk voor de beeldvorming op grotere diepte. 3. Belang met betrekking tot bestaande methoden Dit protocol stelt een aanpak voor de analyse van netwerken bloedvat op een systeem dat zorgt voor een hele dier kan nemen. Eerdere voorstellingen van deze gegevens vaak ingeroepen reeks samen aangelegd beelden, maar 3D-weergave zorgt voor een betere resolutie van de ruimtelijke relatietionships betrokken. 4. Toekomstige toepassingen Nieuwe ontwikkelingen in de beeldvorming en weefselverwerking zullen veel nieuwe toepassingen voor deze methoden die kunnen bestaan ​​uit het maken van oudere embryo&#39;s of volwassenen transparant 11-14 bieden. Meer transparantie zal sterk toenemen weefselpenetratie door confocale en multi-foton-lasers. Verder, aangezien de snelheid van camera en fotomultiplicatorbuizen verhogen binnenkort mogelijk om 3D weergaven van de vissen in realtime, die een 4e dimensie analyse. 5. Kritische stappen Een cruciale stap in dit protocol is de voorbereiding voor de beeldvorming, die een goede fixatie omvat. Imaging moet zo snel mogelijk na fixatie met een hoge kwaliteit doelstellingen die de beste numerieke openingen beschikbaar hebben. Afhankelijk van de gebruikte beeldvormingssysteem gebruikt zodat hoogwaardige systemen algemeen beter. Het genereren van 3D-renderings vergt veel geheugenvoor zo nieuwere, high-end computers met een grote hoeveelheid geheugen en goede grafische processors worden aanbevolen. De visuele biologie systeem beschreven is geoptimaliseerd voor transgene zebravis die EGFP expressie in vasculaire endotheelcellen, maar deze werkwijzen kunnen worden aangepast om transgene embryo&#39;s die GFP of andere fluorescerende eiwitten tot expressie, in populaties van neuronen, spieren, klieren of een aantal andere cellen. Het grote voordeel van het werken met dit systeem is de mogelijkheid om te onderzoeken wat er in het gehele embryo op enig moment gedurende deze ontwikkelingsfase in vaste en / of levende dieren.

Zebravis een krachtig systeem om ontwikkelingsbiologie te bestuderen, en de relatieve transparantie van hun embryo vatbaar is voor-imaging gebaseerde studies 1. De zebravis is nu gebruikt als een model voor de ontwikkeling van vertebraten decennia. Teleosten, met inbegrip van de zebravis, een vereenvoudigde gewervelde vasculaire systeem dat geen redelijk homoloog in ongewervelde dieren heeft. Bloed wordt door kieuwen, waar het zuurstof uit de voorste kamer van een twee-chambered hart gepompt. Bloed uit de kieuwen convergeert op de dorsale aorta en loopt door slagaders die tak in kleinere en kleinere schepen, en bereikte uiteindelijk haarvaten in orgaanweefsels. Binnen haarvaten zuurstof vrijkomt en kooldioxide wordt geabsorbeerd. Aan de aderlijke kant van capillairen bloed stroomt in steeds grotere aders en uiteindelijk getrokken in de achterste kamer van het hart, waarbij de cyclus herhaalt. Een volwassen zebravissen kunnen 200 of meer eieren te leggen in een tijd, en ONCe bevrucht, ontwikkelen ze snel 2. Binnen een dag het lichaam as is goed ontwikkeld, met inbegrip van spieren die overeenkomst en het embryo verplaatsen binnen het chorion membraan. Vanaf 2-7 dagen na de bevruchting (DPF) de meeste systemen van het lichaam te ontwikkelen, met inbegrip van ogen en een centrale zenuwstelsel die kan coördineren zwemmen ten opzichte van voedsel of uit de buurt van fel licht. Tot 7 dpf embryo&#39;s zijn klein genoeg om voor visualisatie met microscopie. Transgene lijnen die fluorescerende eiwitten tot expressie kunnen worden afgebeeld met confocale of fluorescentie microscopie. Confocale beeldvorming kan worden gecombineerd met open-source software 3 naar 3D renderings van complete vasculaire structuren te creëren in de zebravis embryo&#39;s die een systeembiologie perspectief van vasculaire ontwikkeling. Bezig met veranderingen in de vasculaire en cerebrovasculaire complexiteit studies zullen profiteren van dit protocol omdat het zorgt voor een systeemniveau analyse van vasculaire netwerken 4,5. Een compilatie van methoden en middelen te verstrekkend om gemakkelijk te kunnen aannemen en van deze technieken voor studies die beeldvorming van vasculaire structuren in embryonale zebravis vereisen. De kostenefficiëntie van de zebravis als diermodel is het combineren met opkomende imaging technologieën om nieuwe platforms waarmee angiogene effecten van moleculaire pathways in gewervelde ontwikkeling en homeostase beoordelen.

<table><tbody><tr><td>N &ndash; Phenylthiourea&nbsp;</td><td>Alfa Aesar, catalog #41972</td><td></td><td>0,2 M in E3 buffer, bewaard bij 4 &#176;C</td></tr><tr><td>E3 buffer</td><td>Sigma</td><td></td><td>5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4</td></tr><tr><td>Confocal microscope&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>D-EclipseC1 op een Nikon TE-2000U</td></tr><tr><td>Glazen bodem schalen</td><td>Mat-Tek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSI IX/DAPT</td><td></td><td></td><td>N-[N-(3,5-Difluorofenacetyl-L-alanyl)]-S-fenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences</td></tr><tr><td>24 wel platen&nbsp;</td><td>Becton-Dickinson, cat# 351147</td><td></td><td>BD Falcon</td></tr><tr><td>Transfer pipetten&nbsp;</td><td>VWR, cat #414004-001</td><td></td><td>VWR wegwerp transfer pipetten</td></tr><tr><td>Methyl-cellulose&nbsp;</td><td>Alfa Aesar, cat#43146</td><td></td><td>3% in E3 buffer</td></tr><tr><td>NRD 4/6 Visvoer&nbsp;</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td></td><td>Gedroogd</td></tr><tr><td>Brineeuwtjes</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td></td><td>Levend</td></tr><tr><td>Wolfraamdraad&nbsp;</td><td>Small Parts # TW-016-60</td><td></td><td>0,016&rdquo; OD</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>VWR # 101107-950</td><td></td><td>Tricaine methaansulfonaat 250 mg/L in E3 buffer</td></tr></tbody></table>

imaging en 3d reconstructie van cerebrovasculair structuren in embryonale zebravis

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebravis is een krachtig hulpmiddel om de ontwikkelingsbiologie en pathologie te bestuderen in vivo. Het kleine formaat en de relatieve transparantie van de zebravis embryo&#39;s maken ze bijzonder nuttig voor het visuele onderzoek van de processen, zoals hart-en vasculaire ontwikkeling. In verschillende recente studies transgene zebravis die EGFP expressie in vasculaire endotheelcellen werden gebruikt om beelden en complexe vasculaire netwerken te analyseren in de hersenen en het netvlies, met confocale microscopie. Beschrijvingen zijn gegeven voor te bereiden, te behandelen en imago zebravis embryo&#39;s die versterkt groen fluorescerend eiwit (EGFP) te uiten, en dan het genereren van uitgebreide 3D renderings van het cerebrovasculaire systeem. Protocollen omvatten de behandeling van embryo, confocale beeldvorming en fixatie protocollen die EGFP fluorescentie behouden. Verder, nuttige tips over het verkrijgen van beelden van hoge kwaliteit van cerebrovasculaire structuren, zoals het verwijderen van de ogen zonder schadelijke nabijgelegen zenuwweefsel zijn aanwezig. Mogelijke valkuilenmet confocale beelden worden besproken, samen met de stappen die nodig zijn om 3D-reconstructies van confocale beeld stapels met behulp van vrij beschikbare open source software te genereren.

3D-reconstructie van vasculaire structuren biedt een uitgebreide en visueel interessant perspectief van ontwikkeling van de zebravis. Figuren 1 en 2 tonen methoden zoals ze meestal gedaan. Figuur 3 toont verschillende invalshoeken van vasculaire structuren in een 6 DPF zebravis embryo dat EGFP tot expressie in endotheelcellen. Met een solide groene of witte kleur kan het moeilijk zijn om het signaal intensiteit te waarderen; pseudo-kleuren bieden afbeelding intensiteit van een look-up-tafel en zorgt voor een betere diepte zien wanneer structuren overlappen. Een voorbeeld van een pseudo-gekleurde 3D ​​beeld van de vasculatuur in een 6 dpf zebravis wordt verschaft in Figuur 4. Fluorescentie beeldvorming van levende embryo&#39;s kunnen worden gebruikt om fysiologische kenmerken ogen en lichaamsbeweging omvatten bestuderen en hartactiviteit. Figuren 3 en 4 tonen representatieve resultaten verkregen met deze methoden, met behulp van de transgene zebravis lijn<html> beschreven. Imaging resolutie is afhankelijk van microscoop kenmerken, maar de helderheid van het EGFP signaal is voldoende voor een goede beeldkwaliteit met de meeste commerciële systemen. Wederopbouw en weergave van 3D-voorstellingen is consistent en opties binnen deze open-source software bieden consistent goede resultaten. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig1highres.jpg" width="600" /> Figuur 1. Verwijderen Eye. A) Een vast 3 dpf embryo met een wolfraam behoefte gepositioneerd naast het oog. Weefsel wordt gesneden rond het oog van deze positie. B) Het oog is valt uit en de onderliggende oogspieren en oogzenuw worden gesneden. De lege oogkas is aangegeven met gestreepte cirkel. C) Dezelfde embryo wordt omgekeerd en gemonteerd met methyl-cellulose, met de intacte oog naar boven.<html> hres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig2highres.jpg" width="600" /> Figuur 2. Stap-voor-stap 3D reconstructie van een confocale afbeelding stapel. A) Open bestand (4104.1.ids) geladen binnen Fiji gebruik Plugins&gt; LOCI&gt; Bioformat aan. B) te selecteren Na het vinden van een schijfje met de regio van belang, drempel aanpassing heeft gekozen, zoals. C) De drempel wordt ingesteld op 214 met behulp van de top schuif en toepassen is geselecteerd. D) 3D-viewer wordt genoemd als afgebeeld. E) De 3D-reconstructie getoond van een zebravis met het oog intact, voor oriëntatie. F) Het beeld is ingezoomd en gedraaid. G) Een 360 graden rotatie film gemaakt zijn.<html> res.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg" width="600" /> Figuur 3. Perspectieven van 3D reconstructie. A) Medial perspectief van 6 DPF embryo afgebeeld met 10x objectief, mond is aan de rechterkant, niet kieuwen in de mond. B) Laterale van hetzelfde embryo, nota vin is een lus in het midden. C) Zelfde embryo afgebeeld met 20x objectief, mediale perspectief, nota kieuw resolutie. D) Laterale perspectief van 20x objectieve beeldvorming. De vin is aan de rechter rand van het paneel. E) Antero-mediaal aanzicht van 20x objectieve beeldvorming, nota kieuwen in de mond. F) Buik van hetzelfde embryo afgebeeld met een 20x doelstelling, het hoofd naar rechts. Opmerking vaatstelsel op de dooierzak in de rechterbenedenhoek.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" width="600" /> Figuur 4. Intensiteit verschillen in 6 dpf embryo. Afbeelding van een 6 DPF reconstrueren aan de hand van een pseudokleur look-up-table voor de intensiteit van het signaal. Mond, hersenen, kieuwen en dooierzak zijn gelabeld voor oriëntatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still.jpg" width="500" /> Figuur 5. Filmpje van gereconstrueerde vasculaire systeem in een 4 DPF zebravis. De vis werd in beeld gebracht op 2,5 micrometer. De beelden warenbeeldvorming van de helft van de embryo. Vergelijk vasculaire structuren structuren in een GSI behandelde zebravis verschaft in Figuur 6. Noteer de lagere dichtheid van bloedvaten in het hoofd en grotere kieuwen. (Zie de &quot;Zfish_spin.avi&quot; aanvullend bestand onder Downloads) <img alt="Figuur 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still1.jpg" width="500" /> Figuur 6. 3D-film van vasculaire systeem in een GSI-behandelde embryo in 4 dpf. De vis werd in beeld gebracht op 2,5 micrometer door van lateraal naar middellijn. Vergelijk vasculaire structuren met de besturing 4 dpf figuur 5 vissen. De gebogen rug en een kleiner formaat zijn typisch in embryo&#39;s die met deze chemische stof. (Zie de &quot;GSI-treated_4dpf_fish.avi&quot; aanvullend bestand onder Downloads)

Beeldvorming van cerebrovasculaire ontwikkeling in larvale zebravis wordt beschreven. Technieken om 3D-beeldvorming te vergemakkelijken en het gebruik van chemische behandelingen cerebrovasculaire ontwikkeling passen zijn ook aanwezig.

Imaging en 3D Reconstructie van cerebrovasculair Structuren in embryonale zebravis

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Het algemene doel van deze procedure is om cerebrovasculaire structuren in embryonale zebravisjes te evalueren. Dit wordt bereikt door eerst bevruchte zebravis-eieren te verzamelen en de behandelingscondities in te stellen. Na een groeiperiode van drie dagen worden de zebravisjes geofferd en gefixeerd, waarna een oog zorgvuldig wordt verwijderd voordat het preparaat op een dekglas wordt gemonteerd.Vervolgens wordt de cerebrovasculatuur in beeld gebracht met confocale microscopie. Tot slot worden er met behulp van opensourcesoftware 3D-reconstructies van de vasculatuur gegenereerd. Uiteindelijk wordt de analyse van deze reconstructies gebruikt om de effecten van de behandelcondities op de vertakking en densiteit van de bloedvaten te bepalen.In de hersenen van de ontwikkelende zebravis. Deze techniek evalueert het volledige vasculaire systeem van embryonale zebravisjes. Dit heeft ons in staat gesteld om de biologie van amyloïde bèta op het niveau van orgaansystemen te bestuderen.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de dissectie en beeldanalyse technisch uitdagend zijn en moeilijk aan te leren zijn. Begin met het opkweken van een transgene zebravisstam die enhanced green fluorescent protein tot expressie brengt in de gewenste weefsels bij 28.5 °C met een cyclus van 14 uur licht en 10 uur donker. In dit voorbeeld worden transgene vissen die EGFP tot expressie brengen in vasculaire endotheelcellen opgekweekt; zet de avond voor de eierverzameling mannetjes en vrouwtjes in paartanks met mazenbodems. Verwijder de volgende ochtend de scheidingswand en laat de vissen paren, waarbij elke 15 minuten op eieren wordt gecontroleerd.Gebruik een zeef om de eitjes en E three medium op te vangen en ze te wassen, gebruik vervolgens E three om de eitjes over te brengen naar 100 millimeter cultuurschalen en incubeer deze bij 28 degrees Celsius om de cerebrovasculaire vertakking te beïnvloeden. Voeg vanaf 24 uur na de bevruchting een chemische stof toe, zoals een gamma-secretaseremmer opgelost in DMSO. Indien gewenst kan 0.03% PTU worden toegevoegd om pigmentvorming te remmen.Nadat de embryo's in oplossing zijn overgebracht naar de putjes van een 12-wellplaat, worden deze geïncubeerd bij 28,5 °C tot de embryo's het gewenste ontwikkelingsstadium hebben bereikt. Daarna worden de embryo's in trica gesacificeerd en gedurende één nacht bij 4 °C gefixeerd met aldehyde. Bewaar de embryo's in PBS in het donker bij 4 °C.Om het oog uit het embryo te verwijderen, gebruikt u een aangeslepen wolfraamnaald en snijdt u rondom het weefsel dat één oog verbindt. Snijd vervolgens de spieren en tot slot de oogzenuw door om het oog te verwijderen. Zodra het oog is verwijderd, draait u het embryo om op een dekglas, waarbij de lege oogkas naar beneden wijst en het dekglas raakt.Voeg een druppel 3% Methylcellulose toe om het embryo op zijn plaats te houden en het volledige embryo te bedekken om uitdroging te voorkomen. Maak onmiddellijk beelden van het embryo met een geïnverteerde confocale microscoop met een 20 x plan APO objectief; veel beeldsystemen zullen vasculaire structuren slechts tot halverwege dit specimen kunnen resolveren. Als dit het geval is, resus, suspendeer het embryo in PBS en monteer het opnieuw aan de contralaterale zijde voor verdere beeldvorming om een 3D-reconstructie van cerebrovasculaire beelden uit te voeren met ImageJ, dat is geoptimaliseerd voor 3D-renderings.Importeer confocale stacks door naar plugins, loci, bio formats importer te gaan en vervolgens het confocale bestand voor Nikon stacks te selecteren; kies voor view stack with hyper stack en stel de kleurmodus in op gray scale. Vink vervolgens auto scale en split channels aan. Deze selecties zullen vier afzonderlijke kanaalpanelen openen.Sluit alle afbeeldingen behalve de 16-bit afbeelding met de bestandsnaam gevolgd door c=1. Pas de drempelwaarde aan door de schuifregelaar onderaan te gebruiken om door de plakjes te scannen en een plakje te vinden dat het gebied of de structuur van belang bevat. Ga vervolgens naar image adjust threshold.Schuif in het venster dat verschijnt de bovenste balk naar links, zodat de structuur duidelijk zichtbaar is tegen de achtergrond, en laat de onderste schuifregelaar ongewijzigd om een nieuwe 8-bit afbeelding te maken. Selecteer b and w. Kies vervolgens voor een donkere achtergrond.Selecteer niet 'calculate threshold' voor elke afbeelding, tenzij er voor elke coupe verschillende aanpassingen nodig zijn. Ga vervolgens naar plugins 3D viewer threshold zero resampling factor one or two, en deselecteer de rode en blauwe kleurvakken om een groene 3D-output te genereren. Anders wordt er een witte weergave geproduceerd.Selecteer vervolgens toepassen. Gebruik de muis- en toetsenbordbediening om het 3D-beeld te roteren, te draaien en in te zoomen om op elk gewenst moment stilstaande beelden op te slaan. Gebruik hiervoor de optie vastleggen in het menu.De grootte van het afbeeldingskader op het scherm bepaalt de pixelafmetingen van de geproduceerde afbeelding; als een afbeelding met een hoge resolutie gewenst is, maak het kader dan groter door de rechterbenedenhoek te verslepen. Maak een roterende 3D-film door de optie 'view record 360 degree rotation' te selecteren. Sla het bestand ten slotte op in een van de beschikbare formaten en gebruik de gratis open-source mediaspeler VLC voor het bekijken van 3D.De reconstructie van vasculaire structuren biedt een uitgebreid en visueel interessant perspectief op de ontwikkeling van zebravis. Hier worden verschillende hoeken van vasculaire structuren getoond in een zebravissenbryo zes dagen na bevruchting, waarin EGFP werd tot expressie gebracht in endotheelcellen met monochrome groene of witte kleuren. Het kan moeilijk zijn om de signaalintensiteit te beoordelen, maar pseudokleuring biedt beeldintensiteit via een opzoektabel, wat zorgt voor een betere diepteperceptie van overlappende structuren.Bijvoorbeeld, deze figuur toont een pseudogekleurde 3D-afbeelding van de vasculatuur in een zebravis zes dagen na de bevruchting na diens ontwikkeling. Deze techniek stelde ons in staat om de vasculaire effecten van amyloïde bèta in een gewervelde hersenen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de vasculaire netwerken in embryonale zebravissen kunt visualiseren, wat een economisch en toegankelijk systeem biedt om angiogenese te bestuderen.

imaging-3d-reconstruction-cerebrovascular-structures-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video, demonstreren we een methode om de ontwikkeling van gewervelde hersenen te analyseren in levende zebravis embryo's bij enkele cel resolutie door confocale microscopie. Dit omvat de methode waarmee we injecteren van de single-cell zebravis embryo en vervolgens monteren en het imago van de zich ontwikkelende hersenen.

Live-Imaging van de zebravis embryonale Brain door confocale microscopie

Na de vorming van neurale buis, de neuroepithelium vernauwt en plooien, terwijl de buis gevuld met embryonale cerebrospinale vloeistof (eCSF) om de embryonale hersenen ventrikels vormen. We hebben deze ventrikel injectie techniek om beter te visualiseren van de vloeistof gevulde ruimte in tegenstelling tot de neuro-vorm in een live-embryo.

Zebravis hersenventrikel Injection

Time-lapse confocale beeldvorming is een techniek nuttig voor het karakteriseren van embryonale ontwikkeling. Hier beschrijven we de methode karakteriseren craniofaciale morfogenese in wildtype en PDGFRA, Smad5 en SMO mutant embryo's.

Het analyseren Craniofacial Morphogenesis in zebravis behulp 4D confocale microscopie

Het in beeld brengen van het dynamisch gedrag van organellen en andere subcellulaire structuren in vivo kan licht werpen op hun functie in fysiologische en ziektecondities. Hier presenteren we methoden voor het genetisch markeren van twee organellen, centrosomen en mitochondriën, en het in beeld brengen van hun dynamiek in levende zebravis-embryo's met behulp van breedveld- en confocale microscopie.

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

Hier presenteren we een veelzijdige montagemethode die langetermijn tijds-gelaps beeldvorming mogelijk maakt van de ontwikkeling van het achterste lichaam van levende zebravisembryo's zonder de normale ontwikkeling te verstoren.

Een veelzijdige Montage Methode voor de lange termijn beeldvorming van ontwikkeling van de zebravis

In vivo imaging is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van het zenuwstelsel te onderzoeken. Hier beschrijven we een techniek voor het gebruik van time-lapse confocale microscopie om grote aantallen multicolor Brainbow-gelabelde cellen in real time te visualiseren binnen het zich ontwikkelende zebraviszenuwstelsel.

Visualiseren van de zich ontwikkelende hersenen in levende zebravissen met behulp van Brainbow en Time-lapse Confocalimaging

Dit protocol beschrijft een benadering voor in toto labeling en multidimensionale beeldvorming van zebravissen vroege oogontwikkeling. We beschrijven labeling, embedding en vierdimensionale (4D) beeldvorming met behulp van laserscannen confocale microscopie, en overwegingen voor het optimaliseren van de verwerving van datasets voor het ontleden van mechanismen van optische cupmorfogenese.

4-dimensionale beeldvorming van zebravis optic cup morfogenese

Hier presenteren we een methode om de zebravis embryonale hersenen in vivo tot larvale en juveniele stadia in beeld te brengen. Deze microinvasieve procedure, aangepast aan elektrofysiologische benaderingen, biedt toegang tot cellulaire en subcellulaire details van volwassen neuronen en kan worden gecombineerd met optogenetica en neurofarmacologische studies voor het karakteriseren van hersenfunctie en medicamenteuze interventie.

In vivo beeldvorming van volledig actief hersenweefsel in wakkere zebravislarven en juvenielen door schedel- en huidverwijdering

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor in vivo beeldvorming van de hele hersenen van larvale zebravissen met behulp van driedimensionale fluorescentiemicroscopie. De experimentele procedure omvat monstervoorbereiding, beeldacquisitie en visualisatie.

In Vivo Beeldvorming van de hele hersenen van zebravislarven met behulp van driedimensionale fluorescentiemicroscopie

Dit protocol beschrijft een goedkope lichtmicroscopiemethode om de cardiale morfologie en functie in zebravisembryo's te beoordelen, waardoor een reproduceerbare evaluatie van ontwikkelingscardiotoxiciteit mogelijk is zonder dat er geavanceerde beeldvormingssystemen nodig zijn.

Functionele cardiale beeldvorming in zebravisembryo's met behulp van standaardmicroscopie en videoanalyse: toepassingen in milieu- en biomedisch onderzoek

Leer cerebrovasculaire structuren in embryonale zebravis evalueren met confocale microscopie en 3D-reconstructie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar angiogenese en vasculaire biologie in vivo.

Imaging en 3D Reconstructie van cerebrovasculair Structuren in embryonale zebravis

Meer video's verkennen