Name: Immunohistochemische analyse in het Rat centrale zenuwstelsel en van perifere lymfeknopen Tissue Secties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Leer dubbele immunokleuring in rattenweefsel voor neuroimmunologisch onderzoek. Deze methode visualiseert eiwitlokalisatie in het centrale zenuwstelsel en perifere lymfeklieren met lichtmicroscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Hans Lassmann en Jan Bauer voor hun begeleiding en ondersteuning. We danken ook Katalin Benedek voor uitstekende technische assistentie en Caroline Westerlund voor kritische en linguïstische evaluatie.
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van Biogen Idec, de Wenner-Gren Stichting, de Zweedse Onderzoeksraad, de Zweedse Vereniging van Personen met Neurologische Handicaps, de Zweedse Hersenstichting, het EU 6DE Kaderprogramma EURATools (LSHG-CT-2005-019015) en Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). De financiers hadden geen rol in de ontwerp van het onderzoek, gegevensverzameling en analyse, beslissing om te publiceren, of voorbereiding van het manuscript.

ethische verklaring Deze studie wordt uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Zweedse Nationale Raad voor proefdieren en de Europese Richtlijn Gemeenschapsraad (86/609 / EEG van de Raad) in het kader van de ethische vergunningen N338 / 09, N15 / 10 en N65 / 10, die werden goedgekeurd door de North Stockholm Animal Ethics Committee. 1. Tissue Voorbereiding <ol><li> Perfusie &amp; fixatie <ol><li> Verdoven het dier met isofluraan om transcardial perfusie uit te voeren via de linker hartkamer. Start de spoelen van vasculatuur met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aan de bloedcomponenten, gevolgd door 4% paraformaldehyde in 0,1 M PBS (PFA) verwijderen. </li><li> Fixeren ontleed hersenen, ruggenmerg en perifere LN weefsel door onder te dompelen in de PFA. Na 24 uur bij 4 ° C en breng het weefsel van PFA in PBS en bewaar bij 4 ° C tot verdere verwerking. Als alternatief voor commerciële PBS, los 9 g NaCl in 250 ml S &amp;# 246; Rensen buffer en voeg 750 ml gedemineraliseerd water (dH 2 O); voorbereiden 0,2 M Sörensen buffer (pH 7,4) los 13,8 g NaH 2 PO 4 x 1 H 2 O en 71,2 g Na 2 HPO 4 x 2H 2 O in 2,5 L dH 2 O. </li></ol></li><li> Uitdroging &amp; inbedden <ol><li> Snijd het weefsel in ongeveer 5 mm gedeelten met een scheermesje. </li><li> Start het weefsel hardingsproces (dehydratie) met de Tissue-Tek VIP Vacuum Infiltration Processor (standaardprocedure gebaseerd op onderdompeling in oplopende concentraties ethanol, gevolgd door xyleen en tenslotte paraffine (tabel 1). </li><li> Plaats het weefsel in een mal en giet de vloeibare paraffine rond het monster een &quot;paraffine blok&quot; vormen. Langdurige opslag vereist kamertemperatuur (RT). Voorafgaand aan het snijden, verdient het aanbeveling afkoelen van de blokken, bijvoorbeeld gedurende de nacht (o / n) bij 4 ° C.</li></ol></li></ol> 2. Opdeling <ol><li> Plaats het paraffineblok in een vaste houder van de slede microtoom, die heen en weer kan bewegen over het mes. Pas de optimale hoek tussen het mes en de microtoom (die afhankelijk mes geometrie, maar ook op de snijsnelheid en de techniek). </li><li> Snijd 3-5 pm dikke doorsneden van de paraffine blok. </li><li> Transfer gewoon knippen sectie in een waterreservoir en monteer deze vervolgens uit het water op het glaasje. </li><li> Druk op de gemonteerde gedeelte zorgvuldig tegen een papieren handdoek om het resterende water en potentiële luchtbellen te verwijderen. Commercieel pre-coated lijm glazen dia&#39;s zijn aan te bevelen. </li><li> Dry gemonteerde dia&#39;s voor een paar uur in een oven op 50 - 60 ° C. </li></ol> 3. deparaffinisatie (Rehydration en blokkeren van de endogene peroxidase) <ol><li> Dompel de dia&#39;s 2x in xyleen (alternatief xyleen plaatsvervangerXEM-200), telkens 15-20 &#39;. </li><li> Spoel in 99% ethanol. </li><li> De endogene peroxidase activiteit te blokkeren, incubeer de afdelingen 30 in methanoloplossing die 0,25% waterstofperoxide. </li><li> Verder rehydratatie met ethanol toenemend watergehalte (99%, 70%, eindigend in gedestilleerd water. </li><li> Vanaf dit punt tot het monteren van de dekglaasjes secties vochtig gehouden worden. </li></ol> 4. Antigen Retrieval <ol><li> Gebruik een stoomkoker voor het koken van de objectglaasjes in een antigen retrieval oplossing (in dit geval EDTA pH 8,5 buffer) gedurende 60 &#39;(EDTA buffervoorraadoplossing bevat 1,21 g Tris en 0,37 g EDTA werd opgelost in 50 ml dH 2 O, voor de werking voorbereiden Verdun 2,5 ml EDTA-voorraad-oplossing in 47,5 ml dH 2 O). </li><li> Afkoelen van de dia&#39;s op RT ca. 1 uur en spoel dan 3 - 5x met Tris gebufferde zoutoplossing (TBS, te gebruiken als alternatief PBS), bestaande uit 0,05 M Tris en 0,15 M NaCl; pH 7,5 bijgesteld with HCl. U kunt ook gebruik maken van commerciële TBS. </li></ol> 5. Het blokkeren van de aspecifieke bindingsplaatsen <ol><li> Om niet-specifieke achtergrond reacties te vermijden, incubeer de volgende secties in KT 30 in de blokkerende oplossing bevattende 10% foetaal kalfsserum (FCS) en 90% DAKO buffer. </li></ol> 6. Dubbelklik immunokleuring: Gelijktijdige incubatie met de primaire Abs <ol><li> Verdun benodigde hoeveelheid primaire antilichamen in de blokkerende oplossing en incubeer o / n bij 4 ° C. Voor de dubbele immunokleuring combineren α-eotaxine (Ccl11; 1: 300) met α-CD68 (Ed1; 1: 1000) of α-Iba1 (Aif1, 1: 1000) of α-CD8a (Ox-8; 1: 200) . </li><li> Spoel de dia&#39;s 3-5x met TBS-buffer (gebruik als alternatief 10x verdund DAKO buffer). </li><li> Verdun benodigde hoeveelheid secundaire antilichamen (gebiotinyleerde anti-geit en AP-geconjugeerd anti-muis, beide op 1: 200) in de blokkerende oplossing en incubeer 1 uur bij RT. </li><li> Spoel de slides 3 - 5x met TBS-buffer (use alternatief 10x verdund DAKO buffer). </li><li> Incubeer de glaasjes met avidine- mierikswortelperoxidase complex (HRP) verdund in blokkeeroplossing gedurende 1 uur bij RT. </li><li> Spoel de slides 3 - 5x met TBS-buffer (gebruik als alternatief 10x verdund DAKO buffer). </li></ol> 7. Visualisatie <ol><li> Visualisatie van de gebonden AP-gelabeld secundair antilichaam <ol><li> Bereid 0,1 M Tris-HCl-buffer door het oplossen van 12,1 g Tris in 1 L dH 2 O en de pH instellen op met behulp van HCl. Gebruik dezelfde Tris-HCl-buffer aan 1 M levamisool te bereiden. Bereid vers 4% NaNO 2-oplossing in dH 2 O. </li><li> Tot 50 ml van de Fast Blue (FB) substraat (volume vereist voor een standaard glas cuvet) oplossen 6,25 mg naftol-AS-MX-fosfaat in 312,5 pl DMF in de glasbuis en roer 50 ml voorverwarmd verkrijgen (37 ° C) Tris-HCl buffer. Tot 12,5 mg FB RR zout op te lossen in 312,5 ui 2 N HCl toe te voegen 312,5 ul van eerder preparrood 4% NaNO 2-oplossing en roer het mengsel in dezelfde 50 ml voorverwarmde Tris-HCl buffer. Schud zachtjes tot de gele vloeistof duidelijk wordt en tot slot voeg 77 ul van eerder bereide 1 M Levamisole oplossing. Verkregen filtraat mengsel en giet op dia&#39;s geplaatst in het glas cuvet. </li><li> Start de incubatie bij 37 ° C en controle ontwikkelproces onder de lichtmicroscoop ca. elke 15-30 minuten. Als het draaien fuzzy, vervang de FB-oplossing met de verse mengsel. </li><li> Spoel de slides 3 - 5x met TBS-buffer en de overdracht vervolgens in PBS-buffer. </li></ol></li><li> Visualisatie van het gebonden gebiotinyleerde secundaire antilichaam <ol><li> Bereid DAB / H 2 O 2 ontwikkelaaroplossing door 1 ml DAB voorraadoplossing (25 mg DAB per 1 ml PBS) in 49 ml PBS. Voeg 16,5 ul H 2 O 2 en filtraat voorafgaande gieten op secties. </li><li> Omzetting van het chromogeen DAB in het neerslaan van brown pigment kan worden onmiddellijk. De controle van de ontwikkeling van proces in het kader van de lichtmicroscoop (zelfs enkele seconden langer incubatietijd kan een hoge achtergrond te verhogen en te maskeren het specifieke signaal). </li><li> De intensiteit van de bruine pigment neerslag kan ook worden verbeterd door incubatie in de oplossing bestaande uit 2% kopersulfaat en 0,9% NaCl 5 &#39;. </li><li> Spoel de slides 3 - 5x met PBS en tenslotte met dH 2 O, gebruiken tik alternatief water. </li><li> Monteer de dia&#39;s met deksel direct glijdt uit het water met behulp van waterig GelTol montage medium. Voorkomen dat er luchtbellen. </li><li> Sta volledige droging van het fixeermiddel, bijvoorbeeld o / n bij 4 ° C. Store gedroogde dia&#39;s op RT. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1. </td><td> % Ethanol </td><td> 20 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 2. </td><td> % Ethanol </td><td> 60 &amp;# 39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 3. </td><td> % Ethanol </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 4. </td><td> % Ethanol </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 5. </td><td> % Ethanol </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 6. </td><td> % Ethanol </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 7. </td><td> % Ethanol </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 8. </td><td> % Ethanol </td><td> 120 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 9. </td><td> xylol </td><td> 30 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 10. </td><td> xylol </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 11. </td><td> Paraffine </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 12. </td><td> Paraffine </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 13. </td><td> Paraffine </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 14. </td><td> Paraffine </td><td> 120 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Tissue Verwerking door de Tissue-Tek VIP Vacuum Infiltration Processor.

<ol><li>Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).</li>
<li>Nakane, P. K., Pierce, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-labeled+antibodies%3A+preparation+and+application+for+the+localization+of+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).</li>
<li>Avrameas, S., Uriel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+antigen+and+antibody+labelling+with+enzymes+and+its+immunodiffusion+application%5BTitle%5D)+AND+%22C+R+Acad+Sci+Hebd+Seances+Acad+Sci+D%22%5BJournal%5D)">Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application.</a> C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).</li>
<li>Mason, D. Y., Sammons, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+preparation+of+peroxidase%3A+anti-peroxidase+complexes+for+immunocytochemical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use.</a> Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).</li>
<li>Faulk, W. P., Taylor, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunocolloid+method+for+the+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">An immunocolloid method for the electron microscope.</a> Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).</li>
<li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+antigen+in+tissue+cells%3B+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).</li>
<li>Polak, J. M., Van Noorden, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPolak%2C+JM+%22Introduction+to+immunocytochemistry%22">Introduction to immunocytochemistry</a>. , Bios Scientific Publishers Ltd. Oxford, UK. (2003).</li>
<li>Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+detection+efficiency+of+the+peroxidase+antiperoxidase+%28PAP%29%2C+avidin-biotin+peroxidase+complex+%28ABC%29%2C+and+peroxidase-labeled+avidin-biotin+%28LAB%29+methods%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+clinical+pathology%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods.</a> American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+aspects+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Technical aspects of immunohistochemistry.</a> Vet Pathol. 42, 405-426 (2005).</li>
<li>Adzemovic, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Ccl11+associates+with+immune+response+modulation+and+protection+against+neuroinflammation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats.</a> PloS one. 7, 39794(2012).</li>
<li>Bauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+stress+in+PLP-overexpressing+transgenic+rats%3A+gray+matter+oligodendrocytes+are+more+vulnerable+than+white+matter+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuropathology+and+experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes.</a> Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).</li>
<li>Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+contribution+of+CD4+and+CD8+T+lymphocytes+to+T-cell+infiltration+of+the+intact+and+the+degenerative+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord.</a> The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).</li>
<li>Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+populations+of+microglia%2Fmacrophages+in+the+retina+and+their+activation+after+retinal+ischemia+and+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury.</a> Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).</li>
<li>Hirasawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+microglia+in+living+tissues+using+Iba1-EGFP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice.</a> Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).</li>
<li>Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+adhesion+mediated+by+CD8+and+MHC+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules.</a> Nature. 336, 79-81 (1988).</li>
<li>Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+formaldehyde+fixation+irreversibly+reduces+immunoreactivity+of+Bcl-2+in+the+nuclear+compartment+of+breast+cancer+cells%2C+but+not+in+the+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+immunohistochemistry+%26+molecular+morphology+%3A+AIMM+%2F+official+publication+of+the+Society+for+Applied+Immunohistochemistry%22%5BJournal%5D)">Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm.</a> Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).</li>
<li>Hayat, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHayat%2C+M+%22Microscopy%2C+Immunohistochemistry+and+antigen+retrieval+methods+for+light+and+electron+microscopy%22">Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy</a>. , Kluwer Academic. New York. (2002).</li>
<li>Boenisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formalin-fixed+and+heat-retrieved+tissue+antigens%3A+a+comparison+of+their+immunoreactivity+in+experimental+antibody+diluents%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+immunohistochemistry+%26+molecular+morphology+%3A+AIMM+%2F+official+publication+of+the+Society+for+Applied+Immunohistochemistry%22%5BJournal%5D)">Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents.</a> Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).</li>
<li>Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%3A+an+enhancement+method+for+immunohistochemical+staining+based+on+microwave+oven+heating+of+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).</li>
<li>Huang, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+demonstration+of+hepatitis+B+core+and+surface+antigens+in+paraffin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+investigation%3B+a+journal+of+technical+methods+and+pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).</li>
<li>Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+immunohistochemistry%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).</li>
<li>Taylor, C. R., Shi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval%3A+call+for+a+return+to+first+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+immunohistochemistry+%26+molecular+morphology+%3A+AIMM+%2F+official+publication+of+the+Society+for+Applied+Immunohistochemistry%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval: call for a return to first principles.</a> Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).</li>
<li>Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formic+acid+pretreatment+enhances+immunostaining+of+cerebral+and+systemic+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+investigation%3B+a+journal+of+technical+methods+and+pathology%22%5BJournal%5D)">Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).</li>
<li>Nelson, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+pathology+%3A+MP%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies.</a> Molecular pathology : MP. 53, 111-117 (2000).</li>
<li>Van der Loos, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+der+Loos%2C+C+%22Immunoenzyme+multiple+staining+methods%22">Immunoenzyme multiple staining methods</a>. , Bios Scientifc publishers Ltd. New York. (1999).</li>
<li>Elias, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElias%2C+J+%22Immunohistopathology.+A+practical+approach+to+diagnosis%22">Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis</a>. , ASCP Press. Chicago. (2003).</li>
<li>Straus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Letter%3A+Cleavage+of+heme+from+horseradish+peroxidase+by+methanol+with+inhibition+of+enzymic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).</li>
<li>Streefkerk, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+erythrocyte+pseudoperoxidase+activity+by+treatment+with+hydrogen+peroxide+following+methanol%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).</li>
<li>Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+endogenous+tissue+alkaline+phosphatase+with+the+use+of+alkaline+phosphatase+conjugates+in+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).</li>
<li>Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+biotin+on+phosphorylation%2C+acetylation%2C+methylation+of+rat+liver+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+reports%22%5BJournal%5D)">Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones.</a> Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).</li>
<li>Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+endogenous+biotin-containing+proteins+in+mouse+Bergmann+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Histochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells.</a> The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).</li>
<li>Van Hecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+Immunohistochemical+Staining+Today%3A+Choices+to+Make%2C+Challenges+to+Take%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take.</a> Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

IHC standaard procedures vereisen vaak specifieke aanpassingen van een optimaal resultaat, dat gewoonlijk inhoudt ruime ervaring maar ook &quot;trial and error&quot; benadering te verkrijgen. Uit weefsel preparaat tot doel visualisatie kan bijna elke stap in het protocol onderworpen individueel ontwerp modificaties om het uiteindelijke resultaat te verbeteren. Dubbele kleuring protocol hier gepresenteerde voorbeeld IHC-eiwitten richt bijzonder aangepast voor het beoordelen onderlinge relaties tussen de eiwitten van het ...

Ondanks het gebruik van geavanceerde high-throughput analyses uitgevoerd op de methyloom, transcriptoom- of zelfs proteoom niveau, immunokleuring blijft de gouden standaard voor eiwit detectie direct in het weefselmonster, celkweek of een cel uitstrijkje. Door de onthulling van de lokalisatie / distributie patroon, kan immunohistochemie (IHC) relatieve verhoudingen en topografische onderlinge relaties van de doeleiwitten te beoordelen, en zelfs geven hun biologische activiteiten. Daarom wordt IHC wijd gebruikt voor klinische en onderzoeksdoeleinden, bijvoorbeeld voor diagnose, behandeling evaluaties studie ziektemechanismen, functionele en fenotypische veranderingen in diermodellen, etc. Die voornamelijk histologie, pathologie, biochemie en immunologie, heeft IHC aanzienlijke vooruitgang geboekt sinds 1941, toen fluorescent gemerkte antilichamen werden voor het eerst Pneumokokken-antigenen herkennen in het geïnfecteerde weefsel 1. Visualization van cellulaire producten en componenten door IHC is gebaseerd op binding van antilichamen (Ab) niet specifieke antigen (Ag). Naast het gebruik van fluorofoor gelabeld antilichamen kunnen immuunreacties worden gevisualiseerd met behulp van enzymen zoals peroxidase of alkalische fosfatase 2,3 4. Verder colloïdaal goud-tag antilichamen 5 worden gebruikt voor het detecteren van antigeen-antilichaam interactie van licht en elektronenmicroscopie, terwijl radioactieve labels worden gevisualiseerd door autoradiografie. De Ag-Ab immuunreactie kunnen worden opgespoord via directe en indirecte methoden. De directe werkwijze is in wezen sneller en eenvoudiger, aangezien het direct gebruikt gelabelde primaire Abs 6. Vanwege significant gebrek aan gevoeligheid, indirecte methoden met de directe degenen. Tweestaps indirect detectiemethoden vereisen ongelabeld primaire Abs, als de eerste en gekenmerkt tweede Abs gericht tegen de primaire Abs, de tweede laag 7.Signaalversterking kan gebeuren door met, enzym-gekoppelde tertiaire Ab (drietraps indirecte methode) dat bindt aan de secundaire Ab. Veelgebruikte indirecte detectiewerkwijzen zijn avidine-biotine-peroxidase en antipe- (PAP). Als alternatief kan alkalische fosfatase-antialcalinos fosfatase (APAAP) complex worden gebruikt in plaats van de PAP methode. Met name, alkalische fosfatase (AP) methoden lijken nog gevoeliger dan immunoperoxidase methode 4 zijn. Avidine- biotine complex (ABC) methode gebruikt gebiotinyleerd secundair Ab in combinatie met gemerkte avidine-biotine complex (LAB) of gemerkt streptavidine-biotine complex (SLAB). Detectiegevoeligheid kan verder worden vergroot door met avidine gemerkt met peroxidase of alkalische fosfatase 8. Andere opsporingsmethoden in gebruik zijn polymere etikettering, tyramine versterking en immuno-rolling circle 9. Met name kunnen verschillende detectiemethoden worden gecombineerd voor meerdere Ag detectie in hetzelfde weefselmonster, die in 1978 4. Simultaan dubbele immunokleuring hier gepresenteerd voor het eerst werd gemeld werd uitgevoerd in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde rat CNS en LN weefselcoupes met behulp van peroxidase-gebonden en AP-geconjugeerde secundaire antilichamen, respectievelijk. De signalen werden zichtbaar gemaakt met 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) chromogeen en de Fast Blue (FB) APAAP complex, respectievelijk.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagens</td></tr><tr><td>Isofluraan (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluomethyl ether) 2-Chloor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethaan (C3H2ClF5O)</td><td>Baxter</td><td>1001936060</td><td>Oogbeschieting. Beïnvloedt waarschijnlijk vruchtbaarheid en beschadigt baby in de baarmoeder. Alleen toedienen in een goed uitgeruste anesthesiegeometrie.</td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>Merck</td><td>1.0604</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatbufferzoutoplossing (PBS), tablet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% in 1x PBS</td><td>Apl pharma</td><td>34 24 28</td><td>Gevaar voor de gezondheid. Corrosief. Ontvlambaar. Acute toxiciteit.</td></tr><tr><td>Ethanol &#8805;99,5%, absoluut (CH3CH2OH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844-1L</td><td>Ontvlambaar.</td></tr><tr><td>XYleen (XYleens, histologisch graad; C6H4(CH3)2 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>Ontvlambaar. Acute toxiciteit.</td></tr><tr><td>Histo-Comp paraffine wax</td><td>Tissue-Tek</td><td>V0-5-1001</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive Microscope Slides</td><td>Starfrost</td><td>MIC-1040-W</td><td></td></tr><tr><td>Xylol vervanger XEM-200 </td><td>Vogel GmbH</td><td>ND-HS-200</td><td>Ademhalingssensitisatie. Kankerverwekkendheid.</td></tr><tr><td>&alpha;-CD8 (Ox-8) muis anti-rat, primaire antistof</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA48G</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Iba1 (AIF1) muis anti-rat, primaire antistof</td><td>Millipore</td><td>MABN92</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-CD68 (ED1) muis anti-rat, primaire antistof</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA341R</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-eotaxin C-19 (CCL11) geit anti-rat, primaire antistof</td><td>Santa Cruz BT</td><td>SC-6181</td><td></td></tr><tr><td>Alkaline fosfatase (AP)-geconjugeerde secundaire antistof</td><td>Dakopatts, Denemarken</td><td>D0314</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyleerde secundaire antistof</td><td>Amersham Biotech</td><td>RPN1025</td><td></td></tr><tr><td>Avidine-paardenraden peroxidase complex (HRP) </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3151</td><td></td></tr><tr><td>Naftol AS-MX fosfaat (C19H18NO5P)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4875-1G</td><td>Acute toxiciteit.</td></tr><tr><td>Fast Blue RR Zout, Azoic Diazo Nr. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FBS25</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31742</td><td>Acute toxiciteit.</td></tr><tr><td>3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen)</td><td>DAKO</td><td>S3000</td><td>Zeer ontvlambaar. Toxisch.</td></tr><tr><td>Kopersulfaat (CuSO4)</td><td>Merck</td><td>1.02791</td><td>Acute toxiciteit. Milieugevaar.</td></tr><tr><td>GelTol Aqueous Montage Medium</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>230100</td><td></td></tr><tr><td>Waterstofperoxide, 30% (H2O2)</td><td>Merck</td><td>107210</td><td>Acute toxiciteit.</td></tr><tr><td>Methanol (CH3OH)</td><td>Fluka</td><td>65543</td><td>Acute toxiciteit. Ademhalingssensitisatie. Kankerverwekkendheid. Ontvlambaar.</td></tr><tr><td>Tris (hydroxymethyl) aminomethaan, TRIS-base (C4H11NO3 )</td><td>AppliChem</td><td>A1379</td><td>Huid- en oogirritatie.</td></tr><tr><td>Tris-gebufferde zoutwateroplossing (TBS), tablet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5030</td><td></td></tr><tr><td>Di- Natriumwaterstoffosfaatdihydraat (Na2HPO4 x 2H2O)</td><td>Merck</td><td>1.0658</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdiwaterstoffosfaatmonohydraat (NaH2PO4 x 1H2O) </td><td>Merck</td><td>1.06346</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runder serum (FCS) </td><td>Cambrex BioScience</td><td>DE-14-802F</td><td></td></tr><tr><td>DAKO cytomation wasbuffer 10x </td><td>DAKO</td><td>S3006</td><td>Moet worden bewaard bij 2-8 &deg;C om bacteriegroei te remmen. Schuimvorming vermijden.</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide; DMF (C3H7NO)</td><td>Fluka</td><td>40250</td><td>Ontvlambaar. Acute toxiciteit.</td></tr><tr><td>Glas coverslip 24 x 36 mm </td><td>Menzel-Gl&#228;ser</td><td>BB024036A1</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur, geconcentreerd (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721</td><td>Corrosief, irriterend, doordringend. Longsensitisator (als zuurmist). Toxisch.</td></tr><tr><td>Zoutzuuroplossing volumetrisch, 2 M HCl (2 N)</td><td>Fluka</td><td>71826</td><td>Corrosief, irriterend, doordringend. Longsensitisator (als zuurmist). Toxisch.</td></tr><tr><td>Natriumnitriet, ReagentPlus, &#8805;99,0% (NaNO2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2252</td><td>Oxidant. Toxisch. Gevaarlijk voor het milieu.</td></tr><tr><td>Ethyleendinitrilotetraazijnzuur dinatriumzout dihydraat (EDTA; C10H14N2Na

immunohistochemische analyse in het rat centrale zenuwstelsel en van perifere lymfeknopen tissue secties

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemie (IHC) levert zeer specifiek, betrouwbaar en aantrekkelijk eiwit visualisatie. Correcte uitvoering en interpretatie van een IHC-gebaseerde multicolor etikettering uitdagend, vooral wanneer gebruikt voor het beoordelen van verbanden tussen doeleiwitten in het weefsel met een hoog vetgehalte, zoals het centrale zenuwstelsel (CNS). Ons protocol is een verfijning van deze techniek immunokleuring bijzonder aangepast voor het detecteren van zowel structurele als oplosbare eiwitten in het rat CNS en perifere lymfeknopen (LN) waarop inflammatoire processen. Niettemin, met of zonder verdere aanpassingen ons protocol kan waarschijnlijk worden gebruikt voor de detectie van gerelateerde targets, zelfs in andere organen en soorten dan hier gepresenteerd.

Dubbele immunokleuring (co-kleuringen) werden in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde rat CNS en LN secties. 3-5 micrometer dikke weefsel plakjes werden gesneden met behulp van een slee microtoom, gemonteerd vervolgens op pre-coated lijm glasplaatjes en behandeld zoals eerder beschreven 10,11,12. Kort na deparaffiniseren, weefsel rehydratie en endogene peroxidase inactivering werden secties onderworpen aan het antigeen ophaalproves, gevolgd door een blokkerende stap as...

Wij presenteren hier een geoptimaliseerd, gedetailleerd protocol voor dubbele immunokleuring in formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties van het centrale zenuwstelsel (CZS) en perifere lymfeklieren (LK) van ratten.

Immunohistochemische analyse in het Rat centrale zenuwstelsel en van perifere lymfeknopen Tissue Secties

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Het algemene doel van deze procedure is om een specifiek eiwit in rattenweefsel aan te tonen. Dit wordt bereikt door het weefsel eerst te isoleren, te fixeren en in paraffine in te bedden, gevolgd door het maken van weefselcoupes en het monteren hiervan op objectglazen. De tweede stap bestaat uit het deparaffineren en rehydrateren van de in paraffine ingebedde weefselcoupes, om vervolgens de endogene peroxidase te blokkeren.Vervolgens worden de epitopen blootgelegd door middel van antigeenherstel. Daarna wordt er geblokkeerd om aspecifieke binding te verminderen vóór de toevoeging van de antilichamen. De laatste stap is het detecteren van het specifieke epitoop door immunolabeling met primaire en secundaire antilichamen, en het ontwikkelen van het signaal van het gelabelde secundaire antilichaam.Uiteindelijk wordt het signaal gevisualiseerd met lichtmicroscopie om het lokalisatiepatroon van het eiwit in de weefselcoupes aan te tonen. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de lokalisatie- en expressiepatronen van eiwitten in het centrale zenuwstelsel en de perifere lymfeklieren van de rat, kan deze ook worden toegepast op andere organen en soorten. De procedure zal worden gedemon

immunohistochemical-analysis-rat-central-nervous-system-peripheral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the immunohistochemical staining of cholinergic fibers in the nucleus basalis of the Meynert region of mouse brain sections. Sections are blocked and treated with primary against choline acetyltransferase, followed by biotinylated secondary antibodies. Avidin-biotin-peroxidase complexes are added, which bind to secondary antibodies, followed by the chromogenic substrate. Sections are then dehydrated and mounted before visualizing under the microscope.

Immunohistochemical Staining of Nerve Fibers in the Nucleus Basalis of Meyner of the Mouse Brain

Source: Evilsizor, M. N., et. al., Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates a step-by-step immunohistochemistry staining procedure on cryosectioned rat brain tissue to visualize the spatial arrangement of microglia and neurons.

Immunohistochemical Staining of Rat Coronal Tissue Cryosections for Microglia and Neurons

Dit protocol op inleidend niveau beschrijft de reagentia, apparatuur en technieken die nodig zijn om immunohistochemische kleuring van knaagdierhersenen te voltooien, gebruikmakend van markeringen voor microglia en neuronale elementen als voorbeeld.

Primer voor Immunohistochemie op Cryosectioned Rat Brain Tissue: Voorbeeld kleuring voor Microglia en Neuronen

Hier beschrijven we een eenvoudige en goedkope methode die het mogelijk maakt de kwantificering van lijmtumorcellen naar lymfeklier (LN) cryosecties. LN-aanhangende tumorcellen worden gemakkelijk geïdentificeerd door lichtmicroscopie en bevestigd door een fluorescentiegebaseerde methode, waardoor een adhesie-index wordt gegeven die de tumorcelbindende affiniteit met LN-parenchyma onthult.

Kwantificering van tumorcelhechting in cryosecties lymfeklieren

De belangrijkste bekken ganglia bevatten parasympathische en sympathische neuronen die bekkenorganen innervate. Hier beschrijven we een dissectie methode en bieden schema's voor de identificatie van deze ganglia en hun bijbehorende zenuwen. Deze methoden kunnen worden toegepast op experimentele manipulatie van deze ganglia in vivo of verwijdering post-mortem voor verder onderzoek.

Dissectie van Bekken Autonome Ganglia en bijbehorende zenuwen in mannelijke en vrouwelijke ratten

Dit manuscript presenteert een protocol om actieve experimentele auto-immuunenceomyelitis (EAE) bij muizen te induceren. Een methode voor de isolatie en karakterisering van de geïnfiltreerde lymfocyten in het centrale zenuwstelsel (CNS) wordt ook gepresenteerd om te laten zien hoe lymfocyten betrokken zijn bij de ontwikkeling van cns auto-immuunziekte.

Flow Cytometrische Analyse van lymfocyten infiltratie in het centrale zenuwstelsel tijdens experimentele auto-immuunenceomyelitis

Dit artikel presenteert twee geoptimaliseerde protocollen voor het onderzoeken van residente en perifeer afgeleide immuuncellen in het centrale zenuwstelsel, waaronder de hersenen, het ruggenmerg en de hersenvliezen. Elk van deze protocollen helpt bij het vaststellen van de functie en samenstelling van de cellen die deze compartimenten bezetten onder steady state en ontstekingsomstandigheden.

Isoleren van weefsels van het centrale zenuwstelsel en bijbehorende hersenvliezen voor de downstream-analyse van immuuncellen

De vrij zwevende techniek stelt onderzoekers in staat om histologische kleuringen uit te voeren, waaronder immunohistochemie op vaste weefselsecties om biologische structuren, celtype en eiwitexpressie en lokalisatie te visualiseren. Dit is een efficiënte en betrouwbare histochemische techniek die nuttig kan zijn voor het onderzoeken van een groot aantal weefsels, zoals hersenen, hart en lever.

Histologische kleuringen met behulp van vrij zwevende weefselsecties

Een handige zwaartekracht-gevoede perfusiemethode voor histologische analyse van het centrale zenuwstelsel van de muis wordt gepresenteerd. Immunofluorescentie detectie van gefosforyleerd α-synucleïne wordt aangetoond in een muismodel van de ziekte van Parkinson. Dit werk beschrijft ook uitgebreid de transcardiale perfusie, dissectie, weefselbevriezing / inbedding en bevroren sectiestappen.

Een zwaartekracht-gevoede transcardiale perfusiemethode voor histologische analyse van het centrale zenuwstelsel van de muis

Dit protocol beschrijft een meerkleurige immunofluorescentietechniek voor het evalueren van het rattenmodel van allergische rhinitis.

Immunofluorescerende etikettering in neusslijmvliesweefselsecties van allergische rhinitis-ratten via veelkleurige immunoassay

Leer dubbele immunokleuring in rattenweefsel voor neuroimmunologisch onderzoek. Deze methode visualiseert eiwitlokalisatie in het centrale zenuwstelsel en perifere lymfeklieren met lichtmicroscopie.

Immunohistochemische analyse in het Rat centrale zenuwstelsel en van perifere lymfeknopen Tissue Secties

Meer video's verkennen