Immunohistochemische analyse in het Rat centrale zenuwstelsel en van perifere lymfeknopen Tissue Secties

Het algemene doel van deze procedure is om een specifiek eiwit in het rattenweefsel aan te pakken. Dit wordt bereikt door eerst het weefsel te isoleren, te fixeren en in paraffine in te bedden, gevolgd door het snijden van het weefsel en het monteren op glazen platen. De tweede stap is het deparaffiniseren en rehydreren van de paraffine-ingebedde weefselsecties, en vervolgens het blokkeren van de endogene peroxidase.

Vervolgens worden de epitopen ontdekt door antigeenretrieval. Daarna wordt het blokkeren uitgevoerd om onspecifieke binding te verminderen voordat de antilichamen worden geïntroduceerd. De laatste stap is het detecteren van het specifieke epitoop door immunolabeling met primaire en secundaire antilichamen, en het ontwikkelen van het signaal van het gelabelde secundaire antilichaam.

Uiteindelijk wordt het signaal gevisualiseerd met behulp van lichtmicroscopie om het eiwitlokalisatiepatroon in de weefselsecties te tonen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de eiwitlokalisatie en expressiepatronen in het centrale zenuwstelsel van de rat en in de perifere lymfeklieren, kan deze ook worden toegepast op andere organen en soorten. Voor het demonstreren zal een technicus de procedure uitvoeren.

Haar naam is Katalin Benedek, van de kernfaciliteit van het microbiologie tumor en celbiologie centrum aan het Karolinska Institutet. Om te beginnen met de weefselvoorbereiding, dompelt u het gedissekteerde hersenen, ruggenmerg en perifere lymfeklierweefsel in vier procent paraformaldehyde en plaatst u het 24 uur op vier graden Celsius. Nadat de weefsels zijn gefixeerd, brengt u het weefsel over in P-B-S en bewaart u het op vier graden Celsius tot verdere verwerking.

Om te beginnen met het verwerken van het weefsel, gebruikt u een scheermes om het weefsel in ongeveer vijf millimeter grote porties te snijden. Begin vervolgens het weefselverhardingsproces met een vacuüminfiltratieprocessor. De standaardprocedure is gebaseerd op onderdompeling in stijgende concentraties ethanol, gevolgd door xylol en ten slotte paraffine.

Plaats vervolgens het weefsel in een mal. Giet de vloeibare paraffine rond het monster om een paraffineblok te vormen en bewaar het op kamertemperatuur. Voordat het weefsel wordt gesneden, koelt u het paraffineblok een nacht lang af op de koude plaat of in de koelkast.

Nadat het paraffineblok is afgekoeld, plaatst u het blok in de vaste houder van een slede microtoom die voor- en achteruit kan bewegen over een mes. Pas vervolgens het blok en het microtoom-mes aan op de optimale hoek, die afhankelijk is van de mesgeometrie en de snijsnelheid en -techniek. Snijd drie vijf-micron dikke dwarssecties uit het paraffineblok.

Breng vervolgens de gesneden secties over in een waterbak en monteer de secties vanuit het water op een commercieel voorgecoate glasplaat met kleefmiddel. Druk vervolgens de gemonteerde sectie voorzichtig tegen een papieren handdoek om resterend water en potentiële luchtbellen te verwijderen. Laat de gemonteerde platen een paar uur drogen in een oven ingesteld op 50 tot 60 graden Celsius.

Zodra de platen droog zijn, dompelt u de platen twee keer gedurende 15 tot 20 minuten in xylol. Spoel vervolgens elke plaat af in 99 procent ethanol. Om de endogene peroxidaseactiviteit te blokkeren, incubeert u de secties gedurende 30 minuten in een methanoloplossing met 0,25 procent waterstofperoxide.

Ga vervolgens door met het rehydreren van de weefselsecties door te spoelen met ethanoloplossingen met toenemend watergehalte. Voer de laatste rehydratatie stap uit in gedestilleerd water. Zorg ervoor dat de secties vochtig blijven totdat de dekglasjes worden gemonteerd.

Om het antigeen te herstellen, verwarmt u de platen met een huishoudelijke stoomer en EDTA-buffer bij pH 8,5 gedurende 60 minuten. Koel vervolgens de platen af op kamertemperatuur gedurende ongeveer een uur. Zodra de platen zijn afgekoeld, spoelt u elke plaat drie tot vijf keer af met Tris-gebufferd zout, of T-B-S.

Bewerk vervolgens de weefselsecties gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een blokkeeroplossing die 10 procent foetaal runderserum en 90 procent wasbuffer bevat om niet-specifieke achtergrondreacties te blokkeren. Nadat de weefselsecties zijn geblokkeerd, verdunt u de vereiste hoeveelheid primaire antilichamen in de blokkeeroplossing en incubeert u de platen in deze primaire antilichaam-oplossing gedurende een nacht bij vier graden Celsius. De volgende dag spoelt u de platen drie tot vijf keer af met T-B-S-buffer.

Vervolgens incubeert u de platen met secundaire antilichamen verdund in de blokkeeroplossing gedurende een uur bij kamertemperatuur. Spoel daarna de platen opnieuw drie tot vijf keer af met T-B-S-buffer. Incubeer vervolgens de platen met avidine-paardenradenperoxidase-complex, verdund één op honderd in de blokkeeroplossing, gedurende een uur bij kamertemperatuur.

Zodra de een uur durende incubatie is voltooid, spoelt u de platen drie tot vijf keer af met T-B-S-buffer. Nadat u de fast blue-oplossing hebt bereid zoals beschreven in het tekstprotocol, schudt u de schaal lichtjes en filtert u het verkregen mengsel. Giet de oplossing in de glazen cuvet op de platen.

Begin de incubatie bij 37 graden Celsius en observeer het ontwikkelingsproces elke 15 tot 30 minuten onder de lichtmicroscoop. Zodra de incubatie is voltooid, spoelt u de platen drie tot vijf keer af met T-B-S-buffer en brengt u de platen vervolgens over in P-B-S-buffer. Om de D-A-B-waterstofperoxide-ontwikkelingsoplossing te maken, verdunt u eerst één milliliter van een D-A-B-stockoplossing in 49 milliliter P-B-S.

Voeg 16,5 microliter waterstofperoxide toe en filter vervolgens de oplossing. Giet de oplossing op de platen en zorg ervoor dat u het ontwikkelingsproces onder de lichtmicroscoop controleert om een hoge