Generatie van Human Cardiomyocytes: Een Differentiatie Protocol van Feeder-vrije Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

Het algemene doel van deze procedure is om menselijke cardiomyocyten te differentiëren uit menselijke IPS-cellen die zijn gekweekt in feeder-vrije condities. Dit wordt bereikt door IPS-cellen eerst uit te platen in platen met een ultra-lage hechting om embryo-bodies te vormen. De tweede stap van de procedure is het overbrengen van de gevormde embryo-bodies naar met gelatine gecoate schaaltjes.

Wanneer er samentrekkende gebieden verschijnen, worden deze handmatig gedissecteerd onder de stereomicroscoop en geplaatst op met fibronectine gecoate schaaltjes. Voor verdere differentiatie is de laatste stap het verkrijgen van enkelvoudige cardiomyocyten door enzymatische digestie van samentrekkende clusters. Uiteindelijk kunnen de resultaten differentiatie tonen van cardiomyocyte-achtige cellen die typische structurele markers tot expressie brengen, zoals cardiaal troponine, via immunofluorescentiemicroscopie.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van een kernvraag binnen het veld van de cardiovasculaire biologie, zoals welke mechanismen de cardiale differentiatie en dysfunctie aansturen tijdens de cardiale ontwikkeling en bij ziekten op het niveau van de menselijke cardiomyocyt. Dit is een zeer interessante techniek omdat het de in vitro generatie van cardiomyocyten mogelijk maakt vanuit menselijke patiënten en individuen. Daarnaast maakt het de recapitulatie van de ziekte in de reageerbuis mogelijk, zodat nieuwe geneesmiddelen in vitro kunnen worden getest voordat ze in vivo worden toegepast.

Experimentatie Begin met convergente IPS-celculturen gekweekt op 35 millimeter met matrigel gecoate platen. Vervang het groeimedium door één milliliter PBS met een milligram diss. Onderzoek de cellen met behulp van gepolijste glaspipetten.

Verwijder regio's met gedifferentieerde cellen, zoals kraterachtige of cysteuze structuren in het centrum van de kolonies. Verwijder daarnaast alle gebieden waar de cellen zijn gescheiden, afgeplat en naar buiten lijken te migreren. Incubeer de resterende cellen vervolgens bij 37 °C in een zuurkast tot de randen van de kolonie helderder worden en beginnen los te laten.

Dit duurt gewoonlijk vijf tot zeven minuten. Verwijder op dit punt de dispa-oplossing en was de cellen met één milliliter HESM. Gooi vervolgens de wasoplossing weg.

Gebruik in een verse milliliter HESM een cellifter om de kolonies te oogsten. Verzamel de kolonies in een 15 milliliter buis. Spoel de cellen vervolgens met nog een milliliter HESM en centrifugeer deze bij 1000 ×g gedurende vier minuten.

Ga vervolgens over tot het uitplaten van de cellen op matrigel en ververs het medium dagelijks tijdens de cultivatie. Begin met het oogsten van ongedifferentieerde IPS-kolonies zoals beschreven in de vorige sectie. Zodra de ongedifferentieerde populaties zijn geïsoleerd, worden deze voorzichtig geresuspendeerd in 1 mL EBM 20.

Gebruik een pipette van twee milliliter en zorg dat de celklonten niet te veel worden opgebroken. Beperk het pipetteren tot twee of drie bewegingen. Controleer tussen de bewegingen door de grootte van de kolonies onder het stereomeeskoop.

Wanneer de kolonies ongeveer dezelfde grootte hebben, is verder mengen niet meer nodig. Zaai de cellen nu uit op ultra-low attachment platen, waarbij één six-well plaat wordt gevuld per geoogste plaat cellen. Vergeet niet de buis te spoelen met 1 mL EBM 20 en het spoelmiddel over de plaat te verdelen.

Vervang na de derde incubatiedag het medium onder een microscoop om te voorkomen dat embryolichamen worden verwijderd. Houd de pipet dicht bij de rand van de plaat. Verplaats de embryolichamen op de zevende dag naar platen die zijn gecoat met 0,1% gelatine en 30 minuten lang zijn voorverwarmd op 37 °C.

Voeg 35 tot 40 embryo-lichamen toe aan elk schaaltje van 35 millimeter in twee milliliters medium. Tijdens de cultivering dient het medium regelmatig twee keer per week te worden ververst.

Controleer de embryo-lichamen op kloppende gebieden en markeer waar deze kloppende gebieden zich bevinden. Op de bovenkant van de schaaldeksel zouden kloppende contractiegebieden na ongeveer 10 tot 20 dagen moeten verschijnen. Wanneer gebieden met spontane contractie verschijnen, dient het medium te worden gewisseld naar EBM two. Nadat de contractiegebieden zijn verschenen, kan de kweek worden voortgezet en kunnen andere gebieden op de plaat tot een maand lang worden gemonitord.

In totaal. In EBM is een tekort aan het differentiatieproces sterk afhankelijk van verschillende factoren, waarvan de meest kritische de specifieke cellijnen en de batch serum zijn die worden gebruikt om cardio-differentiatie te induceren. Om de hoogste efficiëntie te bereiken, moeten verschillende lijnen op hun cardiogene potentieel en diverse batches serum worden getest. Begin met het coaten van 12.

Wellplaten met vijf microgram per vierkante centimeter fibronectine in PBS 300 microliters per well moeten het oppervlak van elke well volledig bedekken. Laat de platen onbedekt drogen in een celcultuurkap. Gebruik een getrokken glaspipet en een scalpel om het beading-gebied van de celcultuur te verwijderen.

Gebruik vervolgens een pipet van één milliliter om vier tot vijf clumps over te brengen naar elke put van een met fibronectine gecoate plaat. Zodra alle collecties zijn voltooid, voegt u één milliliter EBM 2 toe aan de gevulde putten op de collectieplaat en markeert u de gebieden waar cellen zijn verwijderd. Vervang daarna het medium en plaats de plaat terug in de cultuurkap.

Indien er onder een stereomicroscoop kleinere kloppende klontjes nodig zijn, breng de geëxplante gebieden dan over via een pipet. Dit produceert kleine clusters die enkele kloppende cellen bevatten. In kweek.

Vervang het medium tweemaal per week tot ze klaar zijn voor analyse. Bereid eerst vierkante tweekamer-objectglazen van vier centimeter voor door ze te coaten met 20 µg fibronectine, verdund in voldoende PBS om het oppervlak te bedekken. Indien er een glazen drager wordt gebruikt, voeg dan een extra 20 µg laminine toe.

Isoleer het kweekgebied van de beads zoals eerder beschreven. Breng de cellen met een pipette van 1 milliliter over naar een buis van 15 milliliter die 500 µL collagenase bevat. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten en schud de buis één keer tijdens de incubatie.

Na 15 minuten worden de cellen door een 200 microliter pipette gehaald om eventuele resterende klonten te verwijderen. Wanneer er geen grote klonten meer over zijn, worden de cellen overgebracht naar verse collagenase twee en wordt de incubatie herhaald. Beëindig de digestie door drie milliliters EBM twee zonder ascorbinezuur toe te voegen, zodra deze zijn voorbereid.

Bewaar de buisjes in een verwarmd rek onder de zuigkast en centrifugeer ze vervolgens 4 minuten bij 1000 ×g op kamertemperatuur. Maak na het centrifugeren een suspensie van de celfracties van hetzelfde initiële monster in één milliliter 0,25% trypsine EDTA in PBS. Incubeer de suspensie vervolgens vijf minuten in het verwarmde blok en inactiveer de trypsine met vier milliliter EBM-2 zonder ascorbinezuur.

Haal de cellen vervolgens tot zeven keer door een naald van 18 gauge op een spuit van 2,5 milliliter, totdat er onder de microscoop geen grote klonten meer zichtbaar zijn. Centrifugeer de cellen daarna bij 1000 ×g gedurende vier minuten. Resuspendeer het celpellet nu in E BM twee en zaai deze uit op chamber slides met twee putjes.

De cellen zijn na twee tot drie dagen incubatie klaar voor analyses. CMS werden gegenereerd uit verschillende IPS-cellijnen. Deze lijnen werden aanvankelijk gegenereerd op een meth-feederlaag en direct op matrigel geplaatst met gebruik van een gedefinieerd medium.

De cellen vertoonden een morfologie die leek op die van menselijke ESC's, met fase-heldere randen en prominente kernen. Immunofluorescentieanalyse toonde aan dat de iPS-cellen de transcriptiefactor T4 correct tot expressie brachten en het TRA-1-60 oppervlakteantigeen tot expressie brachten. Cytofluorimetrische analyse bevestigde de expressie van typische oppervlakte-pluripotentie-antigenen, SSEA-4 en TRA-1-60.

De gating-strategie wordt weergegeven in de linker scatterplot. Er werd ook een karyotype-analyse uitgevoerd van de IP FS-cellen die op matrixgel waren gekweekt. Inductie naar de cardiale lijn werd gestimuleerd door de aggregatie van de IPS-cellen tot ebs, samen met kweek in de aanwezigheid van een specifiek type serum.

Aangezien de door sorbinezuur samentrekkende gebieden 20 tot 35% van de totale cultuur vertegenwoordigden, afhankelijk van de gebruikte cellijn, werden samentrekkende CMS uit deze regio's geïsoleerd via enzymatische digestie en geanalyseerd op eiwitexpressie. R-T-P-C-R wees op de expressie van hartspecifieke ionkanalen in de uit IPS afgeleide kloppende cellen, maar niet in de niet-kloppende cellen.

Deze kanalen omvatten een alfa 1, een subunit van een spanningsafhankelijk calciumkanaal, een alfa-subunit van een type 5 spanningsgestuurd natriumkanaal, een kalium spanningsgestuurd kanaal van de KQT-achtige subfamilie en beide vormen van myosine. Immunofluorescentieanalyse van de zware keten onthulde dat individuele IPS-afgeleide cardiomyocyten de structurele eiwitten alfa-sarcomere actine, cardiaal troponine I en de hartspecifieke junction-connexine 43 tot expressie brachten. Uiteindelijk heeft deze techniek echt de weg vrijgemaakt voor de in vitro modellering van myocardziekten en maakt zij het mogelijk om medicijnen in een menselijke setting te testen zonder het medicijn in menselijke lichamen te injecteren.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u IPS-cellen in feeder-vrije condities in stand houdt en hoe u deze differentieert tot cardiomyocyten via een methode gebaseerd op de aggregatie van embryoïden.