Generatie van Human Cardiomyocytes: Een Differentiatie Protocol van Feeder-vrije Human geïnduceerde pluripotente stamcellen
28 juni 2013
Pluripotente stamcellen, hetzij embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen vormen een waardevolle bron van menselijke gedifferentieerde cellen, zoals cardiomyocyten. Hier zullen we ons richten op de cardiale inductie van iPS cellen, laten zien hoe ze te gebruiken om functionele menselijke hartspiercellen te verkrijgen via een embryoid lichamen-gebaseerd protocol.
Het algemene doel van deze procedure is om humane cardiomyocyten te differentiëren van humane IPS-cellen gekweekt in feeder-vrije omstandigheden. Dit wordt bereikt door IPS-cellen eerst in ultra lage hechtingsplaten te plateren om embryolichamen te vormen. De tweede stap van de procedure is om de gevormde embryolichamen over te brengen naar gelatine gecoate schalen.
Wanneer er samentrekkende gebieden verschijnen, worden deze handmatig gedissecteerd onder de stereomicroscoop en geplateerd op fibronectine gecoate schalen. Voor verdere differentiatie is de laatste stap het verkrijgen van enkele cardiomyocyten door enzymatische vertering van samentrekkende clusters. Uiteindelijk kunnen de resultaten differentiatie laten zien van cardiomyocyte-achtige cellen die typische structurele markers vertonen, bijvoorbeeld hart troponine via immunofluorescentiemicroscopie.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van een sleutelvraag in het veld van de cardiovasculaire biologie, zoals welke mechanismen cardio differentiatie en disfunctie aansturen tijdens de ontwikkeling en ziekten van het hart op het niveau van de humane cardiomyocyte. Dit is een zeer interessante techniek omdat het de generatie van cardiomyocyten in vitro van humane patiënten en menselijke individuen mogelijk maakt. En in de tweede plaats, het maakt het mogelijk om de ziekte in de testbuis te recapitulationeren, zodat nieuwe medicijnen kunnen worden geëxperimenteerd in vitro voordat ze in vivo worden gebruikt.
Experimenten beginnen met confluente IPS-cellenculturen gekweekt op 35 millimeter matrigel gecoate platen. Vervang het groeimedium met één milliliter PBS dat een milligram diss bevat. Onderzoek de cellen met gepolleerde glazen pipetten.
Verwijder regio's met gedifferentieerde cellen zoals krater-achtige of cystische structuren in het midden van koloniën. Verwijder ook gebieden waar de cellen gescheiden, vervlakt en lijken te migreren naar buiten. Incubeer nu de resterende cellen bij 37 graden Celsius onder een kweekkap totdat de koloniegrenzen helderder worden en beginnen los te maken.
Dit duurt meestal tussen de vijf en zeven minuten. Op dit punt verwijdert u de dispa-oplossing en wast u de cellen met één milliliter HESM. Gooi vervolgens de wasoplossing weg.
In een verse milliliter HESM, gebruik een cellifter om de koloniën te verzamelen. Verzamel de koloniën in een 15 milliliter buis. Spoel vervolgens de cellen met nog een milliliter HESM en centrifugeer ze 1000 keer G gedurende vier minuten.
Ga vervolgens verder met het plateren van de cellen op matrigel en verander dagelijks het medium tijdens het kweken. Begin met het verzamelen van ongedifferentieerde IPS-koloniën zoals beschreven in de vorige sectie. Zodra de ongedifferentieerde populaties zijn geïsoleerd, schors ze voorzichtig op in één milliliter EBM 20.
Gebruik een tweeduizend milliliter pipette, breek de celkluiten niet te veel. Beperk het pipetteren tot twee of drie slagen. Controleer de grootte van de koloniën onder de stereoscoop tussen de slagen.
Wanneer de koloniën allemaal ongeveer dezelfde grootte hebben, hoeven ze niet verder te worden gemengd. Plateer nu de cellen op ultra lage hechtingsplaten en vul één zes-welplate per plaat van gekochte cellen. Vergeet niet om de buis te spoelen met één milliliter EBM 20 en de spoeling te verdelen over de plaat.
Na de derde dag van incubatie, verander het medium met behulp van een microscoop om verwijdering van embryolichamen te voorkomen. Houd de pipette dicht bij de rand van de plaat. Op de zevende dag, verplaats de embryolichamen naar platen gecoat met 0,1% Gelatine verwarmd op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.
Voeg 35 tot 40 embryolichamen toe aan elk 35 millimeter schaal in twee milliliter medium. Tijdens het kweken. Verander het medium twee keer per week regelmatig.
Controleer de embryolichamen op kloppende gebieden en markeer waar de kloppende gebieden zich bevinden. Op de bovenkant van de schaal moeten kloppende, samentrekkende gebieden verschijnen na ongeveer 10 tot 20 dagen. Wanneer er gebieden met spontane samentrekking verschijnen, verander hun medium naar EBM twee Na het verschijnen van de samentrekkende gebieden, blijf kweken en controleer andere gebieden op de plaat gedurende maximaal een maand.
In totaal. In EBM twee Deficiëntie van het differentiatieproces is sterk afhankelijk van verschillende factoren, waarvan de meest cruciale zijn de specifieke cellijnen en de batch serum die wordt gebruikt om cardio differentiatie te induceren. Om de hoogste efficiëntie te verkrijgen, test verschillende lijnen op cardiogeen potentieel en verschillende batches serum Begin met het coaten van 12.
Well platen met vijf microgram per vierkante centimeter fibronectine in PBS. 300 microliters per well moet volledig het oppervlak van elke well bedekken. Laat de platen onbedekt drogen in een celkweekkap. Om het kloppende gebied van de celcultuur te verwijderen, gebruik een getrokken glazen pipette en scalpel.
Gebruik vervolgens een milliliter pipette om vier tot vijf klemmen over te brengen naar elke well van een fibronectine gecoate plaat. Zodra alle collecties zijn gemaakt, voegt u één milliliter EBM twee toe aan de geladen wells op de collectieplaat en markeert u gebieden waar cellen zijn verwijderd. Verander vervolgens het medium en breng de plaat terug naar de kweekkap.
Als kleinere kloppende klontjes onder een stereomicroscoop vereist zijn, passeer dan de explantate gebieden door een pipette. Dit produceert kleine clusters met een paar kloppende cellen. In cultuur.
Verwissel het medium twee keer per week totdat ze klaar zijn voor analyse. Bereid eerst vier centimeter vierkante tweekamer slides voor door ze te coaten met 20 microgram fibronectine verdund in voldoende PBS om het oppervlak te bedekken. Als een glazen ondersteuning wordt gebruikt, voeg dan een extra 20 microgram laminine toe.
Isoleer het bead-cultuurgebied zoals eerder beschreven. Gebruik een milliliter pipette om de cellen over te brengen naar een 15 milliliter buis met 500 microliters collageenase buis. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten en schud de buis eenmaal tijdens de incubatie.
Na 15 minuten, verplaats de cellen door een 200 microliter pipette om klontjes
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel bespreekt de differentiatie van menselijke cardiomyocyten uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS-cellen) met behulp van een op embryoïde lichamen gebaseerd protocol. De procedure omvat het kweken van iPS-cellen in feeder-vrije omstandigheden en het manipuleren van embryoïde lichamen om functionele cardiomyocyten te verkrijgen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Stamcellenbiologie
- Cardiovasculair onderzoek
- Celdifferentiatie
Achtergrond
- Pluripotente stamcellen kunnen zich differentiëren in verschillende celtypen.
- Menselijke iPS-cellen zijn een veelbelovende bron voor het genereren van cardiomyocyten.
- Embryoïde lichamen dienen als een tussenstap in celdifferentiatie.
- Functionele cardiomyocyten zijn essentieel voor hartonderzoek en therapie.
Doel van het onderzoek
- Om een protocol te ontwikkelen voor het differentiëren van iPS-cellen in cardiomyocyten.
- Om de bruikbaarheid van embryoïde lichamen in cardiale inductie aan te tonen.
- Om een methode te bieden voor het verkrijgen van functionele menselijke cardiomyocyten.
Gebruikte methoden
- iPS-cellen worden geplaatst in ultra-lage hechtingsplaten om embryoïde lichamen te vormen.
- Embryoïde lichamen worden overgebracht naar gelatine-gecoate schalen voor verdere ontwikkeling.
- Contracterende gebieden worden verwijderd en geplaatst op fibronectine-gecoate schalen.
- Enkelvoudige cardiomyocyten worden verkregen door enzymatische vertering van clusters.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle differentiatie van cardiomyocyte-achtige cellen uit iPS-cellen.
- Expressie van cardiale troponine bevestigd door immunofluorescentie microscopie.
- Functionele kenmerken van cardiomyocyten waargenomen in cultuur.
- Protocol biedt een reproduceerbare methode voor de generatie van hartcellen.
Conclusies
- Het beschreven protocol genereert effectief functionele cardiomyocyten uit iPS-cellen.
- Deze methode kan worden gebruikt voor hartonderzoek en potentiële therapieën.
- Verdere studies kunnen de efficiëntie en functionaliteit van afgeleide cardiomyocyten verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Generating functional human cardiomyocytes from induced pluripotent stem cells enables preclinical validation of cardiac drug candidates in a human-relevant system. This approach supports target de-risking by modeling human myocardial physiology and pathophysiology in vitro. It enhances predictive confidence in lead optimization by bridging species gaps in cardiovascular safety and efficacy assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of human-specific mechanisms driving cardiomyocyte differentiation and dysfunction.
- Operational Value: Provides a renewable source of human cardiomyocytes for pathway elucidation and target engagement studies.
- Predictive Value: Supports biological de-risking through expression of cardiac structural and ion channel markers in differentiated cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates contracting cardiomyocyte clusters suitable for functional assay development.
- Operational Value: Yields quantifiable outputs such as beating area percentage (20–35%) for assay standardization.
- Scalability Value: Enables production of single cardiomyocytes via enzymatic digestion for downstream analytical workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease modeling by recapitulating patient-specific cardiac phenotypes in vitro.
- Operational Value: Supports preclinical drug experimentation in human cells prior to in vivo studies.
- Translational Continuity: Expresses human cardiac troponin, connexin 43, and ion channels relevant to clinical translation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a human cardiomyocyte source for target validation and assay development, enabling progression to preclinical screening and lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on human cardiac differentiation pathways and disease mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible cardiomyocyte populations with measurable contractile activity for compound evaluation.
- Analytics: Enables immunofluorescence and RT-PCR readouts for cardiac troponin, ion channels, and structural proteins.
- Translational Research: Models human myocardial disease and drug response using patient-derived iPS cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, feeder-free cardiomyocyte production platform applicable across multiple iPS lines and serum batches.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in cardiac target validation through human cell-based phenotyping.
- Operational Value: Standardizes cardiomyocyte generation via defined steps: embryoid body formation, gelatin transfer, fibronectin plating, and enzymatic dissociation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling preclinical efficacy and toxicity testing in human cardiomyocytes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cardiac drug candidates based on human-relevant functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, embryoid body handling, and microscopic identification of contracting areas.
- Depends on low-attachment plates, gelatin and fibronectin coatings, and enzymatic dissociation tools (collagenase, trypsin).
- Necessitates standardization across iPS cell lines and serum batches to ensure consistent differentiation efficiency.
- Involves manual dissection of beating zones under stereo microscope, limiting throughput without automation.
- Relies on serum-dependent cardiogenic induction, requiring batch testing for optimal performance.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:15
Feeder-free Maintenance and Passaging of Human iPS Cell Lines
3:54
Embryoid Bodies Aggregation and Cardiac Induction
6:25
Beating Areas Isolation and Culture
7:48
Single Beating Cells Isolation and Analysis
10:06
Characterizing Contracting Cardiomyocytes Derived from iPS Cells
12:36
Conclusion
