Name: Gekoppeld Testen voor Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 52 s
Description: Leer een methode om eiwitrefolding in vivo te monitoren in Saccharomyces cerevisiae met behulp van fluorescentiemicroscopie en enzymatische assays. Deze aanpak helpt onderzoekers bij het begrijpen van proteostase-netwerken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de National Institutes of Health (NIGMS-074696) om KAM en een American Society of Microbiology Robert D. Watkins Graduate Student Research Fellowship aan JLA We danken ook John Glover aan de Universiteit van Toronto voor het verstrekken van de FFL source-GFP plasmide.

1. Bouw van stammen die FFL-GFP plasmide Voor deze studie werd Saccharomyces cerevisiae stam BY4741 (MAT a, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) gebruikt samen met een Hsp104 deletie stam van de gist knockout collectie (Open Biosystems / Thermo Scientific). De deletie werd bevestigd met een Hsp104-specifiek antilichaam voor Western blot analyse. FFL-GFP werd uitgedrukt van p426MET25-FFL-GFP, opgebouwd uit een LEU2-based bron plasmide verkregen uit de Glover laboratorium aan de Universiteit van Toronto 17 en verkrijgbaar op verzoek aan de auteurs. Expressie van de FFL-GFP plasmide fusieproteïne wordt gecontroleerd door de MET25 methionine te onderdrukken promoter. Het plasmide werd getransformeerd in elke stam met behulp van een protocol werd aangepast van Gietz et. al, 1995: <ol><li> Centrifugeer 25 ml o<html> f logfase cellen in een 50 ml conische buis bij 4.400 rpm gedurende 2 minuten, wassen met 500 ul van dubbel gedestilleerd H 2 0 (DDH 2 O), en gooi supernate. </li><li> Resuspendeer cellen in 250 pl TE / LiAc (Tris-HCl 10 mM, pH = 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 M lithium acetaat). Incubeer bij 30 ° C zonder mengen gedurende 20 minuten. </li><li> Breng 50 pl competente cellen naar een nieuwe buis met 5 ml (50 ug) drager DNA en 5 ui (0.1-5 ug) van plasmide DNA. Voeg 300 ul van PEG / TE / LiAc (gelijk TE / LiAc plus 40% polyethyleenglycol) aan dit mengsel, en incubeer cellen bij 30 ° C nog 30 minuten. </li><li> Voeg 1/10 volume (v / v) DMSO (36 pi) aan dit mengsel en hitteschok bij 42 ° C gedurende 6 minuten. </li><li> Centrifugeer mengsel bij 6000 rpm gedurende 30 seconden en verwijder supernatant. Resuspendeer cellen in 100 pi van steriele DDH 2 0 en plaat cellen op synthetische complete media dat uracil (SC-URA). </li></ol> 2. Inductie van FFL-GFP nt &#39;&gt; FFL-GFP wordt geïnduceerd wanneer cellen in log-fase, zodat de meerderheid van het proteïne voorafgaand aan warmte-shock is onlangs aan eiwitten die terminaal zijn geaggregeerd tijd door ouderdom verbonden cellulaire gebreken voorkomen. <ol><li> Dag 1: Incubeer cellen in 5 ml SC-URA bij 30 ° C roterende O / N. </li><li> Dag 2: Meet OD 600 en enten verse culturen in 5 ml SC-URA OD 600 ~ 0.2. </li><li> Incubeer kweken met rotatie bij 30 ° C totdat zij logfase OD 600 ~ 0.8-1.0. </li><li> Centrifugeer cellen in 15 ml conische buizen bij 4.400 rpm gedurende 3 minuten, giet supernatant en resuspendeer celpellet in 500 pl DDH 2 0; transferoplossing een microcentrifugebuis. </li><li> Centrifugeer bij 6000 rpm en gooi supernatant. </li><li> Resuspendeer cellen in 5 ml SC-URA-MET. De cellen worden geïncubeerd in dit medium draaien gedurende 1 uur bij 30 ° C. </li><li> Centrifuge cellen en herhaal wassen in DDH 2 0 en gooi supernatant. </li><li> Resuspend cellen in 5 ml SC-URA medium met 100 ug / ml cycloheximide om eiwitexpressie te remmen en gaat direct naar stap 3. </li></ol> 3. Enzymatische FFL-GFP Recovery Assay Deze test is een kwantitatieve benadering van de concentratie actieve enzym bepaald in een populatie. <ol><li> Voorbereiding voor deze test: <ol class="lroman"><li> Meet OD 600 voor elk monster. </li><li> Bereid benodigde hoeveelheid D-luciferine nodig is gebaseerd op het aantal monsters en het gewenste aantal herhalingen plus ongeveer 1200 ul van de buis. Eindconcentratie van D-luciferine is ~ 23 ug per 100 ui cellen. Aanvankelijk wordt opgelost in water bij een voorraadoplossing concentratie van 7,5 mg / ml en verdund tot 455 ug / ml in SC voor experiment. In figuur 2 zijn drie herhalingen voor elk monster werd geanalyseerd wat resulteerde in een totaal van 2,4 ml van D-luciferine gebruikt. </li><li> Programma-afleesapparaat voor flash luminescence assay (aangepast van BioTek Gen5 &quot;Luminescence Flash Assay met Injection&quot;, voor andere instrumenten instructies van de fabrikant te volgen) <ol class="lalpha"><li> Stel de temperatuur tot 30 ° C </li><li> Stel plaataflezer aan D-luciferine toevoegen, schudden, en lees elke well afzonderlijk. </li><li> Lees luminescentie (eindpunt lezen, 5 sec integratie tijd, 180 gevoeligheid niveau) </li><li> Voor herstel assay tussen elke lezing schudden gedurende 5 minuten, vertraging 20 min, en schud nog eens 5 minuten. </li><li> Doseer 50 pl D-luciferine van een injector. </li></ol></li></ol></li><li> Verwarm-shock luminescentie wordt direct gemeten na cellen worden toegevoegd aan media met cycloheximide om eiwitsynthese te stoppen. <ol class="lroman"><li> Breng 100 ul van cellen voor elk monster met gewenste aantal herhalingen in een stevige witte plaat met 96 putjes. </li><li> Controles moeten onder andere een water leeg en cellen met een lege vector. </li><li> Start het lezen met de specifications hierboven vermeld. </li></ol></li><li> Om de rest van FFL FFL-GFP denatureren, incubeer de 5 ml kweek in een glascultuur buis bij 42 ° C schudden gedurende 25 minuten. </li><li> Recovery test luminescentie metingen onmiddellijk na cellen uit de incubator, die tijdstip nul worden verwijderd. Maatregel luminescentie hetzelfde als hierboven beschreven voor het eerste tijdstip en elke 30 minuten gedurende 90 minuten. </li><li> Normaliseren monsters te verwarmen-shock luminescentie waarden die zijn aangepast op basis van de OD 600 (verdeel de verwarm-shock waarden door OD 600). </li></ol> 4. Fluorescence Microscopy Deze test is een semi-kwantitatieve methode om de oplosbaarheid van aggregaten in de tijd in een populatie van cellen te bepalen. <ol><li> Inductie is dezelfde als beschreven in hoofdstuk 2, Stappen 1-8 van protocollen. </li><li> Dezelfde tijdstippen genomen zoals hierboven beschreven (hoofdstuk 3, stap 4), maar voor microscopy verzamelen 1 ml cellen bij voorverwarming-shock en elke hersteltijd punt, en incubeer monsters draaien bij 30 C in kweekbuis °. </li><li> Visualisatie: <ol class="lroman"><li> Centrifugeer 1 ml cellen bij 6000 rpm gedurende 30 seconden en verwijder supernatant. </li><li> Resuspendeer celpellet in 2 pl DDH 2 O. </li><li> Mix 2 pi van cellen plus 2 pi van 2% laag smeltpunt agarose op de dia en voeg een dekglas. Om een ​​enkel vlak van cellen te verkrijgen drukt u licht op de vinger in het midden van het deksel slip en draaien tot het dekglas is moeilijk om te bewegen. </li><li> Cellen worden gevisualiseerd met behulp van 100x olie doelstelling op fluorescentiemicroscoop; gebruik DIC om cellen en de FITC filter visualiseren om GFP-fluorescentie te visualiseren. </li><li> Neem meerdere foto&#39;s voor elke stam op elk tijdstip voor de kwantificering. Velden voor foto&#39;s moeten ~ 15-30 cellen bevatten voor kwantitatieve post-experimentele analyse. </li><li> Om percentage cellen met aggregaten te berekenen, telt 50-100 Cellen totaal en verdeel het aantal cellen met aggregaten. </li></ol></li></ol> 5. Single Cell Microscopy Deze methode wordt gebruikt om de oplosbaarheid van de afzonderlijke aggregaten in een cel in de tijd te volgen. <ol><li> Induceren FFL-GFP-expressie zoals beschreven in paragraaf 2, Stappen 1-8. </li><li> Na hitte-shock, centrifuge cellen in 15 ml conische buis bij 4.400 rpm gedurende 2 minuten. </li><li> Was de cellen met 500 pi van water en resuspendeer in 20 ul van DDH 2 O. </li><li> Voor elke stam, knip een 5x5 mm sectie van een SC-URA agar plaat en het gebruik van de oppervlakte die in contact stond met de petrischaal, pipet 4 ul van cellen en verspreid over het oppervlak van de agar met pipet tip. Laat staan ​​voor ~ 1 minuut. </li><li> Gebruik een pincet om agar kubus sectie plaatsen naar beneden op een ~ 55 mm glazen bodem schaal nr. 0 en druk lichtjes. </li><li> Visualisatie: <ol class="lroman"><li> Zie i-iii in Section 4. </li><li> Reeks coördineert voor 2-4 focal points voor elke stam afhankelijk van de dichtheid van de cultuur. </li><li> Stel de camera om foto&#39;s te maken met een Z-stack met de juiste range (- / + 15 micrometer met een 0,5-1,0 micrometer slice dikte) om de 5 min voor een periode van 90 min.. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adapting+proteostasis+for+disease+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adapting proteostasis for disease intervention.</a> Science. 319, 916-919 (2008).</li>
<li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).</li>
<li>Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. P., Brick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+diffraction+studies+of+firefly+luciferase+from+Photinus+pyralis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 52, 876-878 (1996).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc%2FSS-DNA%2FPEG+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11, 355-360 (1995).</li>
<li>Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp104%2C+Hsp70%2C+and+Hsp40%3A+a+novel+chaperone+system+that+rescues+previously+aggregated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins.</a> Cell. 94, 73-82 (1998).</li>
<li>Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein folding.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 70-82 (2001).</li>
<li>Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+in+vivo+of+a+newly+translated+yeast+cytosolic+enzyme+is+mediated+by+the+SSA+class+of+cytosolic+yeast+Hsp70+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12860-12865 (1998).</li>
<li>Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+and+protein+binding+in+the+axial+channel+of+Hsp104.+Insights+into+the+mechanism+of+protein+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding.</a> J. Biol. Chem. 283, 30139-30150 (2008).</li>
<li>Marques, S. M., Esteves da Silva, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+bioluminescence%3A+a+mechanistic+approach+of+luciferase+catalyzed+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions.</a> IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).</li>
<li>Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMorimoto%2C+RI+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol%22">Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol</a>. 76, 91-99 (2011).</li>
<li>Nakatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+spectral+difference+in+luciferase+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence.</a> Nature. 440, 372-376 (2006).</li>
<li>Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+functions+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+Hsp90+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).</li>
<li>Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+disaggregation+mediated+by+heat-shock+protein+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104.</a> Nature. 372, 475-478 (1994).</li>
<li>Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+stability+of+recombinant+green+fluorescent+protein+%28GFPuv%29+at+various+pH+values%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).</li>
<li>Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Spectral+Distribution+of+Firefly+Light%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Spectral Distribution of Firefly Light.</a> J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).</li>
<li>Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+disaggregase+machinery%3A+Hsp110+synergizes+with+Hsp70+and+Hsp40+to+catalyze+protein+disaggregation+and+reactivation+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system.</a> PLoS One. 6, e26319(2011).</li>
<li>Tkach, J. M., Glover, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocytoplasmic+trafficking+of+the+molecular+chaperone+Hsp104+in+unstressed+and+heat-shocked+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells.</a> Traffic. 9, 39-56 (2008).</li>
<li>Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Hsp70+subfamily%2C+Ssa%2C+in+protein+folding+in+yeast+cells%2C+seen+in+luciferase-transformed+ssa+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Pharm.+Bull%22%5BJournal%5D)">Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants.</a> Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).</li>
<li>Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+heat+shock+response+and+protein+chaperones%3A+budding+yeast+%28Saccharomyces+cerevisiae%29+as+a+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In dit artikel wordt het model eiwit FFL-GFP werd aangetoond dat de gist disaggregase, Hsp104 bij aan eiwit opnieuw oplossen en reparatie. De enzymatische assays en microscopie differentieel ondervraagd de status van hetzelfde substraat proteïne hervouwing efficiëntie en opbrengst te bepalen. Resultaten van de enzymatische assays recovery voor dat niet alleen de maximale herstel van de hsp104D mutante stam inefficiënt, maar de aanvankelijke omvang van het ontvouwen spanning hoger was in de mutant (figuu...

Bij mensen neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer, Parkinson en Huntington ziekten zijn verbonden met eiwit misfolding en aggregatie 10. Cellen in dienst moleculaire chaperonnes in kinetische vangst van cellulaire eiwitten in misgevouwen inactieve structuren 6 voorkomen. Chaperones deelnemen ingewikkelde wisselwerking netwerken binnen de cel, maar is niet volledig duidelijk hoe de som van deze interacties bijdraagt ​​tot organismale proteostasis. Een van de belangrijkste chaperonnes verantwoordelijk voor de meerderheid van de cytosolische eiwitten vouwen is het 70 kD heat shock protein (hsp70) family 19. Er is aangetoond dat in gist verlies van Hsp70 daalt de mogelijkheid ontluikende heteroloog tot expressie FFL vouwen en het endogene eiwit, ornithine transcarbamoylase, hervouwen in vivo 18, 7. Het vermogen om te vouwen analyseren met bijna realtime resolutie zal het wederzijds begrip hoe de extra cellulaire factoren contribute deze Hsp70-afhankelijk proces. Bovendien vouwen / hervouwing reacties kunnen niet volledig afhankelijk van deze eiwitten dragen, zodat assays zijn gevoelig genoeg om zowel grote als kleine veranderingen detecteren in kinetiek en efficiency. De gistcel disaggregase, Hsp104, speelt een belangrijke rol bij het herstel geaggregeerde verkeerd gevouwen eiwitten. Hoewel Hsp104 homologen geïdentificeerd in schimmels en planten, lijkt dit gezin afwezig in metazoans. Er is voorgesteld dat andere chaperones zoals die van de familie Hsp110 voeren wat de bekende Hsp104 activiteiten bij zoogdieren 16. Hsp104 is een AAA +, hexamere eiwitcomplex dat functies in gist te verbouwen eiwitcomplexen, die bijdragen tot het opnieuw vouwen en reparatie 13. Hsp104, samen met de gist Hsp70, SSA1 en de gist Hsp40, Ydj1, vereist voor het herstel van gedenatureerd FFL in gistcellen 5, 8. The small heat shock eiwit Hsp26, is ook aangetoond dat requirood voor Hsp104-gemedieerde uitsplitsing van FFL 2. FFL is een twee-domein eiwit dat het substraat luciferine in de actieve plaats en na een conformationele verandering die ATP en zuurstof, decarboxyleert vereist bindt het substraat los oxyluciferine, koolstofdioxide (CO 2), adenosine monofosfaat (AMP), en lichte 11, 9, 3. De commercieel beschikbare FFL substraat D-luciferine resulteert in lichtemissie tussen 550-570 nm die kunnen worden gedetecteerd met behulp van een lichtmeter 15. FFL is uiterst gevoelig voor denaturatie van chemische of thermische behandelingen en aggregaten snel na ontvouwen. Bij blootstelling aan temperaturen tussen 39-45 ° C FFL is reversibel ontvouwen en geïnactiveerd 12. In tegenstelling, GFP en derivaten daarvan zijn zeer resistent tegen eiwitten ontvouwen spanningen 14. Daarom fusie van deze twee eiwitten kunnen FFL gefunctioneerd als experimenteel labiele groep die zich richten functionele GFP aan deposito&#39;s die kunnen worden gevisualiseerd met behulp van fluorescentie microscopie op zowel de bevolking en single cell niveau intracellulaire. Toepassing van de enzymatische assay in een semi-automatische multimode plaatlezer combinatie met geautomatiseerde microscopie kunnen ongekende gelijktijdige beoordeling kinetiek en opbrengst van hervouwing reacties. Bovendien, de gemakkelijke moleculaire genetica van het model Saccharomyces cerevisiae kunnen zowel nauwkeurige manipulatie van het eiwit kwaliteitscontrole netwerk en de mogelijkheid voor ontdekking benaderingen om nieuwe spelers dragen tot cellulaire stressrespons en proteostasis identificeren. In deze studie, wild-type (WT) en Hsp104 deletiestammen uiten FFL-GFP zijn onderhevig aan eiwitten denatureren heat shock. FFL-GFP refolding wordt bewaakt door middel van zowel een enzymatische assay en microscopie als een proxy uitlezing voor reparatie van het proteoom geuit over een hersteltijd cursus. In vergelijking met WT cellen, tonen we the Hsp104 deletiestam is ~ 60% minder efficiënt bij refolding FFL-GFP, het ondersteunen eerdere bevindingen tot vaststelling van een rol voor Hsp104 bij reactivering van gedenatureerde FFL 2.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Synergy MX Microplate Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope</td><td>Olympus, Tokyo Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lumitrac 200 white 96-well plates</td><td>USA Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SlideBook 5.0 digital microscopy software</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>(LiAc) Lithium Acetate</td><td>Sigma</td><td>L6883</td><td></td></tr><tr><td>PEG (polyethelene glycol)</td><td>Fisher</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Malinckrodt</td><td>4948</td><td></td></tr><tr><td>SC</td><td>Sunrise</td><td>1300-030</td><td></td></tr><tr><td>SC-URA</td><td>Sunrise</td><td>1306-030</td><td></td></tr><tr><td>cycloheximide</td><td>Acros Organics</td><td>357420050</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin</td><td>Sigma</td><td>L9504</td><td></td></tr><tr><td>low melt agarose</td><td>NuSieve</td><td>50082</td><td></td></tr><tr><td>immersion oil</td><td>Cargille</td><td>16484</td><td></td></tr></tbody></table>

gekoppeld testen voor monitoring protein refolding in<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, gedefinieerd als de gecombineerde processen van het vouwen van eiwitten / biogenese, heropvouw / reparatie, en degradatie, is een delicate cellulaire evenwicht dat moet worden gehandhaafd om schadelijke gevolgen te vermijden 1. Externe of interne factoren die dit evenwicht verstoren kan leiden tot aggregatie van eiwitten, toxiciteit en celdood. Bij mensen is dit een belangrijke factor voor de symptomen van neurodegeneratieve aandoeningen zoals Huntington, Parkinson en Alzheimer ziekten 10. Het is daarom essentieel dat de bij het onderhoud van proteostasis eiwitten om behandelingen voor deze slopende ziekten ontwikkelen geïdentificeerd. Dit artikel beschrijft technieken voor het toezicht op in-vivo vouwen van eiwitten in bijna realtime resolutie met behulp van het model eiwit vuurvliegluciferase gefuseerd met groen fluorescerend eiwit (FFL-GFP). FFL-GFP is een uniek model chimeer eiwit als FFL groep zeer gevoelig voor stress-geïnduceerde misfolding en aggregatie, die het enzym 12 inactiveert. Luciferase activiteit wordt bewaakt door middel van een enzymatisch assay, en de GFP-groep een werkwijze van het visualiseren van oplosbare of geaggregeerd FFL middels geautomatiseerde microscopie. Deze combinatie methoden rekening gehouden twee parallelle en technisch onafhankelijke benaderingen van zowel heropvouwing en functionele reactivering van een enzym na spanning te analyseren. Activiteit herstel kan direct worden gecorreleerd met de kinetiek van disaggregatie en opnieuw oplossen om beter te begrijpen hoe eiwitten kwaliteitscontrole factoren zoals eiwitten chaperonnes samenwerken om deze functies uit te voeren. Bovendien kan gendeleties of mutaties worden inbreng van specifieke eiwitten of subeenheden om dit proces te testen. In dit artikel onderzoeken we de bijdrage van het eiwit disaggregase Hsp104 13, bekend om samen met de Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding systeem 5, aan eiwit opnieuw vouwen om deze aanpak te valideren.

Gist is afhankelijk disaggregase, Hsp104 efficiënt warmte-gedenatureerde eiwitten te hervouwen. De activiteit van FFL-GFP werd gevolgd na 25 min hitteschok, met een luminescentie flash assay Figuur 1. De resultaten van deze geautomatiseerde assay weergegeven in figuur 2 onthulde een stapsgewijze toename van de activiteit in 90 min. die uiteindelijk tot een herstel&gt; 80% in WT-cellen. De hsp104Δ stam herstelde 19% van de oorspronkelijke activiteit over hetzelfde tijdsbestek. B...

Dit artikel beschrijft het gebruik van een vuurvlieg luciferase-GFP-fusie-eiwit te onderzoeken<em&gt; In vivo</em&gt; Eiwitvouwing in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Met behulp van dit reagens, hervouwing van een model warmte-gedenatureerde proteïne kan gelijktijdig monitoren van fluorescentie microscopie en een enzymatische assay om de rol van proteostasis netwerkcomponenten eiwit kwaliteitscontrole sonde.

Gekoppeld Testen voor Monitoring Protein Refolding in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Het algemene doel van deze procedure is om de resolubilisatie en refolding van eiwitten in vivo in bijna real-time te monitoren via fluorescentiemicroscopie en enzymatische assays. Dit wordt bereikt door cellen eerst te transformeren met een plasmide dat vuurvlieg-luciferase bevat, gefuseerd aan groen fluorescent eiwit of F-F-L-G-F-P. De tweede stap is het induceren van de expressie van het F-F-L-G-F-P-eiwit, gevolgd door een behandeling met cycloheximide om de productie van het eiwit te stoppen.Meet vervolgens de luciferase-activiteit vóór en gedurende een bepaalde periode na thermische denaturatie. De laatste stap is het visualiseren van de cellen om de oplosbaarheid van het F-F-L-G-F-P-eiwit te bepalen. Uiteindelijk worden fluorescentiemicroscopie en enzymatische assays gebruikt om de efficiëntie van de reactivering van een model van een ontvouwen enzym in meerdere stammen te kwantificeren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals eindpuntsanalyse, is dat u de activiteit van het eiwit kunt correleren met de aggregatiestatus in de loop van de tijd. Om de relatie tussen deze twee fenomenen te bepalen, kan deze methode helpen bij het be

coupled-assays-for-monitoring-protein-refolding-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een nieuwe kwantitatieve proteomics-techniek voor het identificeren van eiwitcomplexen in Saccharomyces cerevisiae. In deze studie hebben we gebruik gemaakt van de SILAC methode, samen met affiniteit zuivering, gevolgd door tandem massaspectrometrie te identificeren met een hoge specificiteit van de binding partners van een ER-eiwit, Scs2p.

Identificatie van eiwit-complexen met kwantitatieve proteomics in S. cerevisiae

In dit protocol een methode om intracellulair eiwit hervouwing te meten na de heat shock wordt beschreven. Deze methode kan gebruikt worden om foldases zoals moleculaire chaperonnes en hun co-factoren of verbindingen in staat om hun activiteiten van invloed te bestuderen. Vuurvlieg luciferase activiteit wordt gebruikt als reporter voor chaperonne hervouwing activiteit te meten.

Intracellulaire hervouwing Assay

This video describes a degradation assay for misfolded proteins using cycloheximide treatment along with detergent fractionation. This method aids in studying the dynamics of misfolded proteins and uncovering the in-depth mechanisms of protein turnover.

Misfolding-Prone Protein Degradation Assay: A Technique to Monitor Misfolded Protein Degradation Using Cycloheximide Treatment and Detergent Fractionation

Om de relatie tussen eiwithomeostase, stress en veroudering te bestuderen, hebben we veranderingen in eiwitvouwing gemonitord door eiwitdisfunctie, eiwitlocalisatie in de cel en eiwitstabiliteit op organismisch, cellulair en eiwitniveau te volgen, met behulp van de genetisch hanteerbare metazoa Caenorhabditis elegans als modelsysteem.

Gebruik Caenorhabditis elegans Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

Dit artikel beschrijft een op groei gebaseerde gisttest voor de bepaling van genetische vereisten voor eiwitafbraak. Het demonstreert ook een methode voor snelle extractie van gisteiwitten, geschikt voor western blotting om biochemisch de afbraakvereisten te bevestigen. Deze technieken kunnen worden aangepast om de afbraak van een verscheidenheid aan eiwitten te monitoren.

-Groei op basis Vaststelling en Biochemische Bevestiging van Genetische Eisen voor de afbraak van eiwitten in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

We presenteren een gedetailleerd protocol om mutantenbibliotheken te construeren en te screenen voor gerichte evolutiecampagnes in Saccharomyces cerevisiae.

Geregisseerd Evolution Method in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliotheek Creatie en Screening

Eiwit interacties vormen de kern van de functie van een cel. Calorimetrische en spectroscopische technieken worden gewoonlijk gebruikt om ze te karakteriseren. Hier beschrijven we fluorescentie anisotropie als middel om de interactie tussen het eiwit gemuteerd in de Shwachman-Diamond Syndroom (SBDS) en elongatiefactor-1 achtige GTPase (EFL1) te bestuderen.

Fluorescentie anisotropie als een instrument om eiwit-eiwit interacties te bestuderen

Dit artikel beschrijft een FRET-based flow cytometrie protocol voor het kwantificeren van eiwit zelf montage in zowel S. cerevisiae en HEK293T cellen.

Opsporen en karakteriseren van zelf-assemblage van eiwitten in vivo door flow Cytometrie

Hier introduceren we een protocol voor het gebruik van substraten met gistoppervlak voor enzymatische modificatietests. Het platform werd gedemonstreerd met behulp van de analyse van de defosforyleringsactiviteit van tyrosinefosfatase SHP-2 tegen een van zijn substraten als een representatieve enzymatische modificatietest.

Enzymatische modificatie en beoordeling van flowcytometrie van door het gistoppervlak weergegeven eiwitten

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de in vitro reassociatie van gezuiverde, zoutgewassen eukaryote ribosomale subeenheden voor de analyse van 80S-deeltjesvorming. Deze methode wordt geïllustreerd door het analyseren van ribosomale subunits die zijn geïsoleerd uit een wildtypestam van Saccharomyces cerevisiae en een mutante stam die een tekort heeft aan het ribosomale eiwit eL24.

In vitro Reassociatie-assay om de vorming van ribosomale deeltjes uit de jaren 80 te meten met zoutgewassen ribosomale subeenheden

Leer een methode om eiwitrefolding in vivo te monitoren in Saccharomyces cerevisiae met behulp van fluorescentiemicroscopie en enzymatische assays. Deze aanpak helpt onderzoekers bij het begrijpen van proteostase-netwerken.

Gekoppeld Testen voor Monitoring Protein Refolding in

Meer video's verkennen