Een Caenorhabditis elegans Model Systeem voor Amylopathy Study
17 mei 2013
Beschrijven we methoden om aspecten van amylopathies in de worm te bestuderen C. elegans. We laten zien hoe je wormen die humaan Aß construeren 42 In neuronen en hoe ze hun functie in de gedrags-assays te testen. We tonen verder hoe primaire neuronale kweken die worden gebruikt voor farmacologische proeven verkrijgen.
Het algemene doel van deze procedure is om de effecten van amyloïde bètatoxiciteit op neuronale functie en overleving te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst transgene C elegant wormen te construeren die een amyloïde bèta-peptide met een GFP-reporter in SE-sensorische neuronen tot expressie brengen. Vervolgens wordt de gedragsgevolg van het tot expressie brengen van amyloïde bèta in SE-neuronen beoordeeld door middel van een chemotaxis-assay.
De derde stap is het verkrijgen van primaire culturen van SE-neuronen en vervolgens gecultiveerde neuronen te behandelen met farmacologische middelen zoals Q-V-D-O-P-H om het toxische effect van amyloïde bèta te onderdrukken. Uiteindelijk kunnen resultaten de effecten van amyloïde bètatoxiciteit op de functie en overleving van SE-neuronen laten zien door middel van gedrags- en farmacologische assays. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over neurodegeneratie, zoals het verduidelijken van specifieke cellulaire en moleculaire mechanismen.
Onderliggende neurotoxische effecten van amyloïde bèta-oligomeren. Het demonstreren van de procedures zal worden gedaan door Dr. Zing Dwan, een postdoc uit mijn laboratorium. Voor de transformatie zijn 2% agros injectiepads nodig. Plaats een druppel hete aros opgelost in water op een glasdeksel en plaats snel een tweede deksel op de druppel en tik er lichtjes op.
Wanneer je de injectiemix maakt, zorg er dan voor dat je centrifugeert en de bovenste vijf microliters, vrij van puin en andere verontreinigingen, overbrengt naar een verse buis voor injectiebelasting, injectiemix en leg lege plasmiden in een injectiepijp door middel van capillaire actie. Half een microliter is meestal voldoende om 100 wormen te injecteren om de opening van de injectiepijp te verbreden, wrijf de punt erover tegen de rand van een deksel gemonteerd op een glasplaat in Halo carbon 700 olie. De kwaliteit van de opening is cruciaal.
Het wordt beoordeeld door de puntvorm, en het belangrijkste, door de stroomsnelheid, beoordeeld door de stroom en door de grootte van de bubbels die zich vormen aan de punt van de pijp als reactie op injectiedruk. Plaats nu een druppel van 700 holle koolstofoliën op een injectiepad en breng verschillende wormen over naar het pad. Gebruik een wormpick om de wormen naar beneden op het pad te duwen totdat ze aan de aros hechten.
De wormen moeten in rijen worden geordend met hun ventrale kanten uitgelijnd. Raak hun hoofden niet aan. Als de wormen na meerdere pogingen niet aan de pad hechten, probeer dan een nieuwe pad of verhoog de dikte of concentratie van de pad.
Breng nu de pijp in de worm in. Beweeg eerst de stage om de worm onder de pijp te positioneren. Positioneer de pijp vervolgens naast de centrale kern van de gonade. Omdat het cytoplasma wordt gedeeld door veel kiemcelkernen, verhoogt dit de kans dat het geïnjecteerde DNA aan het nageslacht wordt doorgegeven. De pijp moet bijna parallel aan de worm liggen. Beweeg vervolgens de punt verticaal naar het lichaam totdat de huid is verzonken.
Tik ten slotte zachtjes op de manipulator om de invoeging van de punt te induceren. Injecteer nu de DNA-oplossing. Oefen druk uit op de pijp totdat de gonade zwelt.
Stop vervolgens de stroom en trek de worm van de pijp af. Test de naaldstroom en injecteer vervolgens de andere gonades voordat u naar de volgende worm gaat. Voeg na de injecties ongeveer 10 microliters herstelbuffer toe aan de wormen en wacht tot ze beginnen te zwemmen.
Eenmaal zwemmend, voeg een gelijk volume M negen buffer toe. Wanneer de wormen weer beginnen te zwemmen, blijf M negen toevoegen totdat de oplossing meestal M negen is. Breng nu elke worm over naar een zittende plaat.
Verzamel GR wormen in één milliliter M negen buffer in een 50 milliliter falconbuis. Was vervolgens de wormen met behulp van M negen buffer door herhaalde centrifugatie en oplossingsvervanging tot de M negen helder is na de wasbeurt. Voeg vervolgens 10 volumes basis hypochlorietoplossing toe aan luizen.
De gepelletiseerde wormen incuberen de wormen bij kamertemperatuur tot ongeveer vier vijfde ervan gebroken is, wat meestal 10 minuten duurt. Volg de reactie door aliquoten te nemen om met een microscoop te bekijken. Stop de reactie door een gelijk volume steriele eierbuffer toe te voegen.
Verzamel vervolgens de eieren en karkassen door centrifugatie bij 450 G gedurende vijf minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant. Voeg een gelijk volume eierbuffer terug en centrifugeer de buis opnieuw bij 450 G gedurende vijf minuten.
Herhaal de procedure totdat de buffer helder is. Incubeer de eieren vervolgens een nacht in M negen buffer en zaai ze de volgende dag op standaard NGM-platen. Bereid verschillende blokjes agar voor, ongeveer een halve centimeter per zijde.
Week de agarblokken in een oplossing met het gewenste aantrekmiddel gedurende twee uur. Deponeer een agarblok in een 10 centimeter testplaat waarin de locatie van de testplek en een controleplek zijn gemarkeerd. Bereid vijf van dergelijke platen per experiment voor.
Laat de platen een chemische gradiënt vormen door ze een nacht bij 20 graden Celsius te laten staan. Voeg voorafgaand aan het experiment 10 microliters van 20 millimolair natriumazid toe aan elke plek op de platen. Dit werkt als een verdovingsmiddel.
Start het experiment door 20 leeftijdsgesynchroniseerde wormen in het midden van de plaat te plaatsen en vervolgens de plaat een uur in een incubator van 20 graden Celsius te plaatsen. Tel na een uur de dieren op de test over controleplek en bereken de CI-index. Na het lysen van GR wormen en het schoonmaken van de eieren en karkassen zoals eerder beschreven, schors ze opnieuw op in twee milliliter steriele eierbuffer en voeg twee milliliter steriele 60% sucrose in eierbuffer toe.
Meng vervolgens de buis met de hand of met vortex totdat de eieren volledig zijn opgehangen. Centrifugeer de opgeschorte eieren bij 450 keer G gedurende 15 minuten. Verzamel vervolgens voorzichtig het eiervulle supernatant en gooi de schaal weg om de resterende sucrose
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft methoden om de toxiciteit van amyloïd bèta in C. elegans te bestuderen, met de nadruk op neuronale functie en overleving. Het beschrijft in detail de constructie van transgene wormen die humane Aβ 42 tot expressie brengen en de beoordeling van hun gedrag via chemotaxis-assays.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Neurodegeneratie
- Transgene modellen
Achtergrond
- Amyloïde beta is betrokken bij neurodegeneratieve ziekten.
- C. elegans dient als modelorganisme voor het bestuderen van de neuronale functie.
- Inzicht in de effecten van amyloïde beta kan leiden tot nieuwe inzichten in neurodegeneratie.
- Gedragsassays kunnen de impact van toxische peptiden op de neuronale gezondheid onthullen.
Doel van de studie
- Om de effecten van amyloïd bèta op de neuronale functie en overleving te beoordelen.
- Om de cellulaire en moleculaire mechanismen van neurodegeneratie te verduidelijken.
- Om farmacologische middelen te evalueren die de toxiciteit van amyloïd bèta kunnen verminderen.
Gebruikte methoden
- Constructie van transgene C. elegans die amyloïd bèta tot expressie brengen met een GFP-reporter.
- Beoordeling van de gedragsmatige gevolgen met behulp van chemotaxis-assays.
- Isolatie van primaire culturen van SE-neuronen.
- Behandeling van gecultiveerde neuronen met farmacologische middelen om beschermende effecten te evalueren.
Belangrijkste Resultaten
- Gedragsmatige assays geven de impact van amyloïd bèta op de neuronale functie aan.
- Farmacologische behandelingen tonen potentieel om de toxiciteit van amyloïd bèta te onderdrukken.
- De resultaten dragen bij aan het begrip van de mechanismen van neurodegeneratie.
- De bevindingen kunnen toekomstige therapeutische strategieën voor neurodegeneratieve ziekten informeren.
Conclusies
- De studie biedt een kader voor het onderzoeken van amyloid beta-toxiciteit in neuronen.
- Transgene C. elegans kunnen een waardevol instrument zijn voor onderzoek naar neurodegeneratie.
- Gedragsmatige en farmacologische assays zijn effectief bij het beoordelen van de neuronale gezondheid.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Transgene Caenorhabditis elegans-modellen die menselijk amyloïd beta tot expressie brengen, maken een snelle, mechanistisch onderbouwde analyse mogelijk van neurodegeneratieve paden die relevant zijn voor amylopathieën. Dit systeem ondersteunt het voorspellend vertrouwen bij vroege validatie van targets en het beperken van risico's bij neurotoxiciteitshypotheses, wat direct bijdraagt aan de portfolio-triage voor programma's tegen neurodegeneratie. Deze aanpak slaat een brug tussen de elucidatie van moleculaire mechanismen en schaalbare, reproduceerbare gedragsmatige en cellulaire read-outs voor enterprise R&D.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt functionele validatie van amyloid bèta-neurotoxiciteit mogelijk in een genetisch hanteerbaar organisme.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door transgene expressie te koppelen aan kwantificeerbare neuronale dysfunctie.
- Faciliteert hypothese-gestuurd onderzoek naar neurodegeneratieve pathways met behulp van gedragsmatige en cellulaire assays.
- Biedt een platform voor snelle iteratie en triage van neurodegeneratie-targets.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert gestandaardiseerde chemotaxis-assays voor kwantitatieve beoordeling van de neuronale functie.
- Maakt reproduceerbare gedragsfenotypering mogelijk ter voorbereiding op screening van verbindingen.
- Ondersteunt de ontwikkeling van assays met primaire neuronale culturen voor farmacologische evaluatie.
- Maakt schaalbare, onderling vergelijkbare resultaten mogelijk over verschillende experimentele condities.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Koppelt ziekterelateerde amyloid beta-toxiciteit aan meetbare fenotypen in de context van het volledige organisme.
- Zorgt voor continuïteit van het moleculaire mechanisme naar de functionele uitkomst, wat translationele biomarkerstrategieën ondersteunt.
- Maakt risico-gecorrigeerde voortgang van neuroprotectieve kandidaten mogelijk op basis van in vivo- en in vitro-gegevens.
- Ondersteunt voorspellende risicoreductie voor preklinische pipelines voor neurodegeneratie.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit modelsysteem integreert het proces vanaf de vroege ontdekking tot en met de identificatie van leadverbindingen, ter ondersteuning van zowel hypothesetoetsing als verbindingsevaluatie in neurodegeneratieonderzoek.
- Discovery Biology: Faciliteert het toetsen van de nulhypothese met betrekking tot amyloid beta-geïnduceerde neurotoxiciteit en de verduidelijking van signaalpaden.
- Screening: Biedt gevalideerde, reproduceerbare chemotaxis- en neuronale overlevingsassays voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Genereert kwantitatieve gedragsindices en read-outs van de cellulaire levensvatbaarheid voor een robuuste statistische vergelijking.
- Translationeel onderzoek: Verbindt moleculaire en functionele eindpunten, wat bijdraagt aan de afstemming van biomarkers en translationele continuïteit.
- Enterprise hergebruik: Biedt een herbruikbaar, schaalbaar platform voor de doorlopende evaluatie van targets en verbindingen bij neurodegeneratie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van targets voor neurodegeneratie.
- Operationele waarde: Standardiseert gedragsmatige en cellulaire assays voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid tussen teams.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënte voortgang van neuroprotectieve strategieën mogelijk.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en cross-programma vergelijkbaarheid in pipelines voor neurodegeneratie.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in transgene manipulatie en gedragsfenotypering van C. elegans.
- Vereist toegang tot infrastructuur voor micro-injectie, fluorescentiemicroscopie en celkweek.
- Noodzaakt standaardisatie van chemotaxis- en neuronenkweekprotocollen tussen verschillende teams.
- Aanpassing aan andere neurodegeneratieve targets kan optimalisatie van constructen en assays vereisen.
- Gedragsmatige en cellulaire resultaten moeten worden geïnterpreteerd binnen de context van de complexiteit van het organisme en de beperkingen van het model.
