Reconstructie van een Kv kanaal in Lipid Membranen voor structurele en functionele studies

Het algemene doel van deze procedure is om een gedetailleerde beschrijving te geven van technieken voor de functionele en structurele studie van het effect van lipiden op membraaneiwitten. Dit wordt bereikt door eerst een spanningsafhankelijk kaliumkanaal tot expressie te brengen en te zuiveren. De tweede stap is de reconstitutie van het ionkanaal.

Vervolgens wordt de elektrische registratie van de ionkanalen in lipide dubbellagen uitgevoerd voor de functionele studie van de ionkanalen. De laatste stap is de kristallisatie van de ionkanalen in het membraan voor structuurbepaling. Uiteindelijk worden biochemische assays, de elektrofysiologische methode en elektronkristallografisch onderzoek gebruikt om de effecten van lipiden op de beweging van de spanningssensor van ionkanalen te bestuderen.

Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de vele technische details bij de reconstitutie van eiwitten en biologische opnames. Hopelijk zal deze film en het proces u helpen om de volledige procedure te doorlopen en succesvol af te ronden. De demonstratie van de gehele procedure zal worden uitgevoerd door Dr. Hui Jim uit mijn laboratorium.

Voor de lipidebereiding werden een wegwerpglazen reageerbuis van 14 milliliter, een glazen buis met schroefdop en een glazen spuit van 250 microliter met chloroform klaargezet. Breng vervolgens 10 milliliters chloroform over in de reageerbuis. Voor de bereiding van POPE- en POPG-liposomen werden 3,75 milligrams POPE en 1,25 milligrams POPG in chloroform overgebracht naar de glazen buis met schroefdop.

Droog de lipiden onder een continue stroom argongas zodra er geen zichtbaar chloroform meer aanwezig is. Droog de lipiden vervolgens gedurende één uur onder vacuüm bij kamertemperatuur. Voeg daarna 440 µL laagzoutbuffer of water toe aan de gedroogde lipiden in de vortexbuis.

De buis om de lipiden te hydrateren. De lipidsuspensie moet er witachtig en troebel uitzien. Sonicate vervolgens de lipidsuspensie in een ijskoud bad totdat de vesikeloplossing doorschijnend wordt.

Voeg vervolgens 50 µL 3 M kaliumchloride en 10 µL 0,5 M DM toe aan het mengsel, zodat de uiteindelijke lipidsuspensie 300 mM kaliumchloride en 10 mM DM bevat. Incubeer de oplossing in een rotator gedurende twee uur bij kamertemperatuur om de vorming van lipid-detergent mixed micelles mogelijk te maken. Na de incubatie moet de suspensie enigszins troebel worden door de door detergent geïnduceerde fusie van de kleine ELLA-vesikels. Wanneer het eiwit is geconcentreerd tot meer dan 2 mg/mL, voegt u de vermelde componenten en het lipid-detergent mengsel toe om een eindvolume van 1 mL te verkrijgen.

Incubeer vervolgens het mengsel van proteïne, lipiden en detergent in de glazen buis gedurende nog twee uur in een rotator. De bereiding van de KVAP in een mengsel met het detergentgesolubiliseerde DTaP of DOGS is vergelijkbaar met de lipidbereiding voor P-O-P-E-P-O-P-G-vesikels. De sonicatie van gehydrateerde lipiden tot kleine unilamellaire vesikels neemt echter meer tijd in beslag dan bij de P-O-P-E-P-O-P-G-lipiden; de DOGS-vesikels kunnen langzaam met elkaar fuseren en kleine oliedruppels vormen om de DTaP of DOGS volledig te solubiliseren.

De gesoniceerde vesicles worden gemengd met 10 millimolar DM en 40 millimolar beta og. Het lipide-detergentmengsel wordt een nacht geïncubeerd bij kamertemperatuur; het mengsel moet redelijk helder zijn en geen kleine deeltjes of druppels bevatten. Meng vervolgens het KVAP-eiwit met de in detergent gesolubiliseerde DTaP of DOGS in een eiwit-lipideverhouding die kleiner is dan of gelijk is aan één op 10.

Het mengsel van eiwit, detergent en lipiden wordt twee tot drie uur geïncubeerd bij kamertemperatuur onder voortdurende orbitale rotatie. Om de langzame verwijdering van detergenten met een relatief hoge CMC, zoals DM en Beta og, aan te tonen, wordt eerst twee liter dialysebuffer per één milliliter mengsel klaargemaakt.

Knip vervolgens een geschikte lengte dialyseslang af en spoel deze met DI-water om te controleren of de slang geen lekken vertoont. Breng daarna het mengsel van proteïne, lipide en detergent over in de dialyseslang. Klem beide uiteinden van de slang af, waarbij een minimale ruimte boven de oplossing wordt overgelaten.

Plaats de gevulde slang op een roerplaat in de dialysebuffer, zodat de slang langzaam in de oplossing roteert. Vervang de dialysebuffer eenmaal per acht uur. Bereid nu de polystyreenkralen voor voor het verwijderen van detergentia met een lage CMC door eerst 0,5 gram droge kralen af te wegen.

Plaats ze vervolgens in een Corning-buis van 50 milliliter en voeg 20 milliliter methanol toe; sonicate de oplossing in een bad. Sonicate gedurende vijf minuten om ingesloten luchtbellen te verwijderen en centrifugeer de beads bij 5.000 RPM gedurende vijf minuten. Schenk daarna de methanol volledig af en herhaal de wasstap met ethanol en milli Q-water. Bewaar de gewassen beads vervolgens in 20% ethanol bij vier graden Celsius en vervang dit door een detergentvrije buffer vóór gebruik. Schat de hoeveelheid detergenten in het te behandelen eiwit-lipide-detergentmengsel en bereken de benodigde hoeveelheid beads om de detergenten te verwijderen.

Weeg de natte beads zonder overtollig water en voeg deze direct toe aan het eiwitmengsel; wacht ten minste 15 tot 20 minuten zodat de beads volledig effectief worden. Om 8,7 milligram DDM in één milliliter oplossing te verwijderen, wordt in totaal 87 milligram polystyreen beads, zoals bio-beads SM-2, verdeeld over vijf gelijke porties. Meng het eiwit-lipide-detergensmengsel met elke fractie gedurende 20 tot 30 minuten bij constante end-over-end rotatie op kamertemperatuur.

Centrifugeer de kraaltjes en breng vervolgens het supernatant over naar de volgende fractie kraaltjes; herhaal dit tot het einde. Begin deze stap met het reinigen van een glazen reageerbuis, een amberkleurig vial met een PTFE-schroefdop en een set glazen spuiten met chloroform. Droog daarna het amberkleurige vial onder een stroom argongas.

Breng vervolgens 0,75 milligram POPE en 0,25 milligram POPG in chloroform over naar het amberkleurige vial en laat het chloroform verdampen met argongas. Voeg daarna 0,2 milliliter pentaan toe aan het vial om de gedroogde lipiden op te lossen en droog dit volledig om resterend chloroform te verwijderen. Voeg vervolgens 50 microliter decaan toe aan het vial om de gedroogde lipide op te lossen.

Schilder nu het ronde gat aan het cilindrische oppervlak van de dubbellaags cup in met de lipiden, zonder dat er lipide-oplossing in het gat terechtkomt. Wacht één tot twee minuten tot het decaan volledig is verdampt om elektrische registraties van KVAP-kanalen in lipide-dubbellagen uit te voeren. Plaats de cup in de registratiekamer, voeg de zoutbruggen toe en verbind de elektroden met de twee zijden van de registratiecup.

Voeg de cysteïne-oplossing toe aan de elektrodegaatjes en de CYS- en trans-oplossing aan de buitenste en binnenste bekers in de kamer. Stel vervolgens de potentiaaloffset tussen de twee zijden van de beker in op minder dan twee millivolt, en breng daarna lipiden aan over het gat in de dop. Wacht tot het membraan dunner wordt en relatief stabiel is.

Zodra het membraan stabiel is, wordt 0,5 tot 1 µL van het kanaal met blaasjes afgegeven door de fijne punt van een P2-pipetpunt direct boven het gat te positioneren. De blaasjes vallen door het gat naar de bodem van de cup.

Om de KVAP-kanalen in de dubbellaag te testen, wordt een korte puls van 80 millivolt toegediend vanaf het rustpotentiaal van min 80 millivolt. Vanwege de snelle inactivatie en het trage herstel na activering wordt er een lang interval van ongeveer 120 seconden tussen twee pulsen gehanteerd voor kanalen in PEPG-membranen. Zodra de stroomsterkte voldoende is, worden de ionconcentraties in de oplossingen aan beide zijden van het membraan in balans gebracht door extra ionzouten toe te voegen aan de zijde met de lage concentratie.

Hier is een afbeelding van een negatief gekleurd 2D-kristal, midden in de kristaloptimalisatie. De kristallen werden gekleurd met 6% ammoniummolybdaat, pH 6.4 plus 0,5% triose, omdat ze door de suikers soms op elkaar stapelden. Het zwarte vierkante kader hier geeft het gebied aan dat het diffractiepatroon met diffractiespots oplevert.

Met een resolutie van ongeveer 20 Å is hier een cryo-EM-beeld van een 2D-kristal van een monster dat vergelijkbaar is met het eerder getoonde monster. Het preparaat werd gemengd met 3%TLOs en bevroren door direct plungen, waarna het werd afgebeeld met een cryo-EM bij 50.000-voudige vergroting. Het is duidelijk dat er lokale defecten aanwezig waren in de kristalpakketstructuur.

Hier is een andere cryo-EM-afbeelding van een verder geoptimaliseerd kristal. Het monster was ingebed in 0,75% tannine en 10% tree hellos, en de afbeelding is genomen bij 50.000 x. De rechte lijnen in de dichte pakking suggereerden dat de kanalen in dit type kristallen goed geordend waren, terwijl de twee zwarte pijlen de vierkante vectoren markeren.

Na het bekijken van deze video hoop ik dat u een goed beeld heeft gekregen van hoe u lipiden en eiwitten correct moet behandelen, en dat deze video u helpt om de interactie tussen lipiden en eiwitten in membranen efficiënter te bestuderen.