Name: Reconstructie van een Kv kanaal in Lipid Membranen voor structurele en functionele studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Leer de reconstitutie van voltage-afhankelijke kaliumkanalen in lipide membranen voor functionele en structurele studies. Deze methode maakt elektrofysiologische metingen en elektronencrystallografie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De studies over KvAP in de Jiang lab hebben aanzienlijke hulp verkregen van het laboratorium van Dr Roderick MacKinnon&#39;s aan de Rockefeller University. Speciale dank gaat uit naar Dr Kathlynn Brown en Michael McQuire voor hun advies en hulp op onze faag-scherm experimenten. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH (GM088745 en GM093271 naar Q-XJ) en AHA (12IRG9400019 naar Q-XJ).

<ol><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22">Molecular Biology of the Cell</a>. , 5th edition, Galand Science. New York. (2007).</li>
<li>Lee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+lipids+and+proteins+interact+in+a+membrane%3A+a+molecular+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach.</a> Mol. Biosyst. 1, 203(2005).</li>
<li>Lee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+lipids+affect+the+activities+of+integral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">How lipids affect the activities of integral membrane proteins.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1666, 62(2004).</li>
<li>Anderson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+caveolae+membrane+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The caveolae membrane system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 199(1998).</li>
<li>Simons, K., Vaz, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems%2C+lipid+rafts%2C+and+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Model systems, lipid rafts, and cell membranes.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 269(2004).</li>
<li>Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+lipid+rafts%3A+from+model+membranes+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">The state of lipid rafts: from model membranes to cells.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 257(2003).</li>
<li>Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Artificial+Bilayers+for+Electrophysiology+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments.</a> J. Vis. Exp. (20), e1033(2008).</li>
<li>Zheng, H., Liu, W., Anderson, L. Y., Jiang, Q. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-dependent+gating+of+a+voltage-gated+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipid-dependent gating of a voltage-gated potassium channel.</a> Nat. Commun. 2, 250(2011).</li>
<li>Schmidt, D., Jiang, Q. X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipids+and+the+origin+of+cationic+gating+charges+in+voltage+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors.</a> Nature. 444, 775(2006).</li>
<li>Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+an+archaebacterial+voltage-dependent+K%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel.</a> Nature. 422, 180(2003).</li>
<li>Jiang, Q. X., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+lipids+on+voltage-gated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The influence of lipids on voltage-gated ion channels.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. , 3408884(2012).</li>
<li>Artimo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExPASy%3A+SIB+bioinformatics+resource+portal%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">ExPASy: SIB bioinformatics resource portal.</a> Nucleic Acids Res. 40, W597(2012).</li>
<li>Cladera, J., Rigaud, J. L., Villaverde, J., Dunach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+solubilization+and+membrane+protein+reconstitution+using+Chaps+and+Chapso%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Liposome solubilization and membrane protein reconstitution using Chaps and Chapso.</a> Eur. J. Biochem. 243, 798(1997).</li>
<li>Levy, D., Bluzat, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+study+of+liposome+and+proteoliposome+reconstitution+involving+Bio-Bead-mediated+Triton+X-100+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">A systematic study of liposome and proteoliposome reconstitution involving Bio-Bead-mediated Triton X-100 removal.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1025, 179(1990).</li>
<li>Young, H. S., Rigaud, J. L., Lacapere, J. J., Reddy, L. G., Stokes, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+tubular+crystals+by+reconstitution+of+detergent-solubilized+Ca2%28%2B%29-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">How to make tubular crystals by reconstitution of detergent-solubilized Ca2(+)-ATPase.</a> Biophys. J. 72, 2545(1997).</li>
<li>Levy, D., Gulik, A., Bluzat, A., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+sarcoplasmic+reticulum+Ca%282%2B%29-ATPase%3A+mechanisms+of+membrane+protein+insertion+into+liposomes+during+reconstitution+procedures+involving+the+use+of+detergents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase: mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1107, 283(1992).</li>
<li>Cohen, F. S., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+phospholipid+vesicles+with+planar+phospholipid+bilayer+membranes.+II.+Incorporation+of+a+vesicular+membrane+marker+into+the+planar+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fusion of phospholipid vesicles with planar phospholipid bilayer membranes. II. Incorporation of a vesicular membrane marker into the planar membrane.</a> The Journal of General Physiology. 75, 251(1980).</li>
<li>Fuks, B., Homble, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+and+electrical+properties+of+planar+lipid+membranes+from+thylakoid+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids.</a> Biophysical Journal. 66, 1404(1994).</li>
<li>Hanke, W., Schlue, W. -R. Planar Lipid Bilayers. Methods and Applications. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHanke%2C+W+%22Biological+Techniques%22">Biological Techniques</a>. Sattelle, D. B. , Academic Press, Inc. San Diego. 133(1993).</li>
<li>Tien, H. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTien%2C+HT+%22Bilayer+lipid+membranes+%28BLM%29.+Theory+and+Practice%22">Bilayer lipid membranes (BLM). Theory and Practice</a>. , Marcel Dekker, Inc. New York. 655-65 (1974).</li>
<li>Pagano, R. E., Ruysschaert, J. M., Miller, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+composition+of+some+lipid+bilayer+membranes+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">The molecular composition of some lipid bilayer membranes in aqueous solution.</a> The Journal of Membrane Biology. 10, 11(1972).</li>
<li>Henn, F. A., Thompson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+lipid+bilayer+membranes+separating+two+aqueous+phases%3A+composition+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Properties of lipid bilayer membranes separating two aqueous phases: composition studies.</a> Journal of Molecular Biology. 31, 227(1968).</li>
<li>Tao, X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+Kv1.2+and+paddle+chimera+Kv+channels+in+planar+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of Kv1.2 and paddle chimera Kv channels in planar lipid bilayers.</a> J. Mol. Biol. 382, 24(2008).</li>
<li>Cohen, F. S., Akabas, M. H., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+affecting+the+fusion+of+unilamellar+phospholipid+vesicles+with+planar+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Parameters affecting the fusion of unilamellar phospholipid vesicles with planar bilayer membranes.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1054(1984).</li>
<li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+Display%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Phage Display.</a> Chem. Rev. 97, 391-39 (1997).</li>
<li>McGuire, M. J., Li, S., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopanning+of+phage+displayed+peptide+libraries+for+the+isolation+of+cell-specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biopanning of phage displayed peptide libraries for the isolation of cell-specific ligands.</a> Methods Mol. Biol. 504, 291(2009).</li>
<li>Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%3A+functional+and+structural+studies+using+reconstituted+proteoliposomes+and+2-D+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Braz.+J.+Med.+Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals.</a> Braz. J. Med. Biol. Res. 35, 753(2002).</li>
<li>Chami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+octyl+beta-thioglucopyranoside+in+two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of octyl beta-thioglucopyranoside in two-dimensional crystallization of membrane proteins.</a> J. Struct. Biol. 133, 64(2001).</li>
<li>Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization of membrane proteins.</a> Q. Rev. Biophys. 25, 1(1992).</li>
<li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65(2003).</li>
<li>Walz, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Crystallography+of+Two-Dimensional+Crystals+of+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins.</a> J. Struct. Biol. 121 (2), 142(1998).</li>
<li>Signorell, G. A., Kaufmann, T. C., Kukulski, W., Engel, A., Remigy, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+2D+crystallization+of+membrane+proteins+using+methyl-beta-cyclodextrin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlled 2D crystallization of membrane proteins using methyl-beta-cyclodextrin.</a> J. Struct. Biol. 157, 321(2007).</li>
<li>Vink, M., Derr, K., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J. Struct. Biol. 160, 295(2007).</li>
<li>Iacovache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2DX+robot%3A+a+membrane+protein+2D+crystallization+Swiss+Army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The 2DX robot: a membrane protein 2D crystallization Swiss Army knife.</a> J. Struct. Biol. 169, 370(2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De reconstitutie van de KvAP kanalen in verschillende membranen is gebruikt in verscheidene studies 8-10. Na het idee voor de distributie van lipiden tussen detergens / lipide micellen en de eiwit / reinigende / lipide micellen, kunnen wij nagenoeg volledig oplossen van de KvAP bereiken in membranen gemaakt van zeer verschillende lipiden. Elke tetrameric KvAP kanaal moet ~ 100 vetmoleculen om volledig te dekken zijn transmembraan domein. De belangrijkste voorwaarde is om genoeg vetmoleculen te smelten in de e...

Cellen wisselen materiaal en informatie met hun omgeving door de functies van specifieke membraaneiwitten 1. Membraaneiwitten in celmembranen functioneren als pompen, kanalen, receptoren, intramembranair enzymen, linkers en structurele supporters over membranen. Mutaties die de membraaneiwitten invloed zijn gerelateerd aan vele menselijke ziekten. In feite, hebben veel membraaneiwitten de primaire drug targets, omdat ze belangrijk zijn en gemakkelijk toegankelijk zijn in celmembranen. Het is daarom erg belangrijk om de structuur en functie van diverse membraaneiwitten in membranen begrijpen, en maken het mogelijk om nieuwe methoden te ontwikkelen om de nadelige gevolgen van de mutante eiwitten in menselijke ziekten te verlichten. Lipiden surround alle membraaneiwitten geïntegreerd in dubbellagen 2, 3. In eukaryote membranen, worden de verschillende typen lipiden bekende georganiseerd in microdomains 4, 5.Veel membraaneiwitten werden verspreid worden bij deze microdomains en de omvangrijke fase van membranen 3, 6 vloeistof. Het mechanisme dat de organisatie van de microdomeinen en de levering van membraaneiwitten in hen en de fysiologische betekenis van dergelijke uitkeringen zijn uiteraard belangrijk, maar nog slecht begrepen. Een grote technische moeilijkheden bij het ​​bestuderen van de effecten op de lipiden membraaneiwitten is de betrouwbare reconstructie van biochemisch gezuiverde membraaneiwitten in membranen van goed gecontroleerde lipidesamenstelling zodat bijna alle gereconstitueerd eiwitten functioneel zijn 7. In de afgelopen jaren, hebben we het prototype voltage-gated kalium kanaal van A. ontwikkelde methoden te reconstrueren Pernix (KvAP) in verschillende membraan systemen voor structurele en functionele studies 8-10. De gegevens van anderen en ons samen gebleken dat de lipiden waarschijnlijk een determinant in conformationele veranderingen van de spanning-sensingdomeinen van een voltage-gated ionkanalen en kan de vorm van de structuur van sommige van deze kanalen 11. In het volgende zullen we een gedetailleerde beschrijving van onze methoden leveren en biedt kritische technische tips die waarschijnlijk zullen zorgen voor de succesvolle reproductie van onze resultaten, alsook de uitbreiding van onze methoden om de studies van andere membraaneiwitten.

<table><tbody><tr><td>Tryptone</td><td>RPI Corp.</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>RPI Corp.</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>RPI Corp.</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&#946;-D-Maltoside</td><td>Affymetrix</td><td>D322S</td><td>Sol-grade</td></tr><tr><td>n-Octyl-&#946;-D-Glucoside </td><td>Affymetrix</td><td>O311</td><td>Ana-grade</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>RPI Corp.</td><td>A20550-0.05</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>RPI Corp.</td><td>L22035-0.025</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>RPI Corp.</td><td>P30100-0.025</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>13407000</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Bead SM-2</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>RPI Corp.</td><td>H75030</td><td></td></tr><tr><td>POPE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td>DOGS</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870314C</td><td></td></tr><tr><td>DMPC </td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-DOPE </td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870282C</td><td></td></tr><tr><td>DOTAP</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>890890C</td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin agarose beads </td><td>Piercenet</td><td>29200</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis Tubing</td><td>Spectrum Laboratories, Inc</td><td>132-570</td><td></td></tr><tr><td>Pentane</td><td>Fisher</td><td>R399-1</td><td></td></tr><tr><td>Decane</td><td>TCI America</td><td>D0011</td><td></td></tr><tr><td>MTS-PEG5000</td><td>Toronto Research Cemicals</td><td>M266501</td><td></td></tr></tbody></table>

reconstructie van een kv kanaal in lipid membranen voor structurele en functionele studies

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

Om de lipide-eiwit interacties in een reductionistische manier bestuderen, is het noodzakelijk om de membraaneiwitten nemen in membranen van goed gedefinieerde lipidensamenstelling. We bestuderen de lipide-afhankelijke gating effecten in een prototype voltage-gated kalium (Kv) kanaal, en de gedetailleerde procedures voor het oplossen van de kanalen zijn uitgewerkt in verschillende membraan systemen. De reconstitutie die rekening houden beide detergent-geïnduceerde fusie van vesicles en het fusie-eiwit / detergens micellen van het lipide / detergens micellen en het van belang is om een ​​evenwichtsverdeling van lipiden bij de eiwit / reinigende / lipiden en detergens / lipide micellen. Onze data suggereerde dat het inbrengen van de kanalen in het lipide vesicles relatief willekeurig oriëntaties en de reconstitutie efficiëntie zo hoog dat er geen detecteerbare eiwitcomplexen werden bij fractionering experimenten. We hebben het reconstrueren benutd kanalen conformationele toestanden van de kanalen te bepalen in verschillende lipiden, opnemen elektrische activiteiten van een klein aantal kanalen opgenomen in vlakke lipide dubbellagen scherm conformatie-specifieke liganden van een faagweergegeven peptidebibliotheek en de groei van kristallen 2D van de kanalen in membranen. De reconstitutie hier beschreven kan worden aangepast voor het bestuderen van andere membraaneiwitten in lipide bilagen, met name voor het onderzoek van de effecten op de lipiden eukaryote voltage-gated ionenkanalen.

De algemene stroom van de experimenten voor het zuiveren van de KvAP kanaal in biochemische homogeniteit wordt beschreven in figuur 1A. Typische monsters tijdens de expressie en zuivering van het eiwit wordt getoond in de SDS-PAGE gel in Figuur 1B. Het eiwit na de IMAC zuivering relatief zuiver. De opbrengst van de KvAP kanaal ongeveer 1,0 mg / liter kweek. Oplosbaarheid van lipide blaasjes met reinigingsmiddelen dient te worden uitgewerkt voor elk paar van ...

Procedures voor volledige reconstructie van een prototype voltage-gated kalium kanaal in lipide membranen beschreven. De gereconstitueerde kanalen zijn geschikt voor biochemische assays, elektrische opnamen ligand screening en elektronenmicroscopie kristallografische studies. Deze methoden kunnen hebben algemene toepassingen om de structurele en functionele studies van andere membraaneiwitten.

Reconstructie van een Kv kanaal in Lipid Membranen voor structurele en functionele studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Het algemene doel van deze procedure is om een gedetailleerde beschrijving te geven van technieken voor de functionele en structurele studie van het effect van lipiden op membraaneiwitten. Dit wordt bereikt door eerst een spanningsafhankelijk kaliumkanaal tot expressie te brengen en te zuiveren. De tweede stap is de reconstitutie van het ionkanaal.Vervolgens wordt de elektrische registratie van de ionkanalen in lipide dubbellagen uitgevoerd voor de functionele studie van de ionkanalen. De laatste stap is de kristallisatie van de ionkanalen in het membraan voor structuurbepaling. Uiteindelijk worden biochemische assays, de elektrofysiologische methode en elektronkristallografisch onderzoek gebruikt om de effecten van lipiden op de beweging van de spanningssensor van ionkanalen te bestuderen.Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de vele technische details bij de reconstitutie van eiwitten en biologische opnames. Hopelijk zal deze film en het proces u helpen om de volledige procedure te doorlopen en succesvol af te ronden. De demonstratie van de gehele procedure zal worden uitgevoerd door Dr. Hui Jim uit mijn laboratorium.Voor de lipideb

reconstitution-kv-channel-into-lipid-membranes-for-structural

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Reconstructie van functionele membraaneiwitten in gigantische liposomen van gedefinieerde samenstelling is een krachtige aanpak in combinatie met patch-clamp elektrofysiologie. Echter, kunnen conventionele reus liposoom productie onverenigbaar met eiwitstabiliteit. We beschrijven protocollen voor het produceren gigantische liposomen uit pure lipiden of kleine liposomen die ionkanalen.

Giant liposoombereiding for Imaging en patch-clamp elektrofysiologie

De reconstitutie van het transmembraan eiwit, KvAP, in grote unilamellaire vesicles (GUVs) is aangetoond voor twee dehydratatie-rehydratatie methode - electroformation en gel ondersteunde zwelling. In beide werkwijzen worden kleine unilamellaire blaasjes die het eiwit gefuseerd aan GUVs die vervolgens kan worden onderzocht door fluorescentie microscopie en patch-clamp elektrofysiologie vormen.

Reconstructie van een transmembraaneiwit, de Voltage-gated ionkanalen, KvAP, in Giant Unilamellaire Blaasjes voor Microscopie en Patch Clamp Studies

Hier beschreven is een snelle en efficiënte procedure voor de functionele reconstitutie van gezuiverde wildtype en mutante CFTR-eiwit dat activiteit behoudt deze chloride kanaal, die defect in Cystic Fibrosis. Jodide efflux uit opgelost proteoliposomen gemedieerd door CFTR maakt studies van het kanaal en de effecten van kleine moleculen.

Functionele Het oplossen en Channel activiteit Metingen van gezuiverde wildtype en mutante CFTR eiwit

Dit artikel wordt beschreven specifieke methoden voor biochemische hoeveelheid wasmiddel-ontbindend TRPV1 spectroscopische p.a.. De gecombineerde protocollen bieden biochemische en biofysische hulpmiddelen die kunnen worden aangepast om de structurele en functionele studies voor zoogdieren ionenkanalen in een membraan-gecontroleerde omgeving.

Zuivering en reconstructie van TRPV1 spectroscopische p.a.

Dit protocol beschrijft technieken gebruikt om te bepalen van ion kanaal structuren door cryo-elektronenmicroscopie, met inbegrip van een systeem van de baculovirus gebruikt om genen in zoogdiercellen met minimale inspanning en toxiciteit, eiwit winning, zuivering, efficiënt en kwaliteit controleren, Raster monstervoorbereiding en screening, evenals gegevensverzameling en verwerking.

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

In dit manuscript demonstreren we de experimentele technieken om het F-actinecytoskelet in te kapselen in gigantische unilamellaire lipideblaasjes (ook wel liposomen genoemd), en de methode om een cortex-biomimicking F-actinelaag te vormen aan de binnenste folder van het liposoommembraan.

In vitro Reconstitutie van het Actin Cytoskelet Inside Giant Unilamellar Vesicles

Celvrije reconstitutie is een belangrijk hulpmiddel geweest om de cytoskeletassemblage te begrijpen, en het werk in het afgelopen decennium heeft benaderingen vastgesteld om septinedynamica in minimale systemen te bestuderen. Hier worden drie complementaire methoden gepresenteerd om septineassemblage in verschillende membraancontexten te observeren: vlakke bilayers, sferische steunen en staafsteunen.

Reconstitutie van septineassemblage bij membranen om biofysische eigenschappen en functies te bestuderen

Hierin wordt beschreven de procedure geïmplementeerd in de Caffrey Membrane Structurele en Functionele Biologie Groep handmatig in te stellen tot kristallisatie onderzoeken van membraaneiwitten in lipide mesofasen.

Kristalliseren membraaneiwitten voor structuurbepaling met behulp van lipide mesofasen

Evaluatie van twee-dimensionale (2D) kristallisatie onderzoeken voor de vorming van de bestelde membraaneiwit arrays is een zeer kritische en moeilijke taak in elektron kristallografie. Hier beschrijven we onze aanpak in het screenen en identificeren van 2D-kristallen van overwegend kleine membraaneiwitten in de range van 15 - 90kDa.

Het beoordelen van twee-dimensionale Kristallisatie Trials van kleine membraaneiwitten voor Structurele Biologie Studies van Electron Kristallografie

We zullen zien hoe het effect van een enkele puntmutatie op de functie van een ionkanaal studie.

Mutagenese en Functionele analyse van ionenkanalen heteroloog Uitgedrukt in zoogdiercellen

Leer de reconstitutie van voltage-afhankelijke kaliumkanalen in lipide membranen voor functionele en structurele studies. Deze methode maakt elektrofysiologische metingen en elektronencrystallografie mogelijk.

Reconstructie van een Kv kanaal in Lipid Membranen voor structurele en functionele studies

Meer video's verkennen