Name: Whole Cell Patch Clamp voor Onderzoek naar de mechanismen van Infrarood Neural Stimulatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Leer de patch clamp-methode in whole cell configuratie voor onderzoek naar infrarood neurale stimulatie van auditieve neuronen. Deze techniek helpt wetenschappers elektrische responsen op laserbelichting meten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Australische Raad voor Onderzoek onder Linkage Project subsidie ​​LP120100264.

1. Cultuur van Spiral ganglionneuronen <ol><li> Steriliseren kleine ronde (bv. 10 mm diameter) dekglaasjes en gebogen pincet in een autoclaaf. Breng de gesteriliseerde dekglaasjes in afzonderlijke putjes van een steriele 4-ring 35 mm petrischaaltje of 4-well plaat, met behulp van de gesteriliseerde tang. Breng 150 pi van poly-L-ornithine (500 ug / ml) en muis laminine (0,01 mg / ml) op het bovenoppervlak van het dekglaasje en in een incubator (37 ° C) gedurende 48 uur. Zorg ervoor dat de dekglaasjes niet wegdrijven van de bodem van de put. </li><li> Bereid 50 ml steriel Neurobasal media (NBM) voor elke neurale cultuur: 47,5 ml Neurobasal A, 0,5 ml N2 supplement, 1 ml B27 supplement, 0,5 ml L-glutamine, en 0,5 ml penicilline-streptomycine. Opmerking: Supplementen worden ingevroren, opgeslagen bij -20 ° C en toegevoegd aan de media op de dag vereist. </li><li> Distantiëren spiraal ganglion neuronen van postnatale dag 4-7 rattenpups zoals eerder beschreven 20,21, onsIng zowel enzymatische (0,025% trypsine en 0,001% DNase I) en mechanische technieken. Zie Whitlon et al.. 22 en Vieira et al. 23. voor gedetailleerde procedures van spiraal ganglion neuron cultuur, of Parker et al.. 24 voor een demonstratie van modiolus isolement. </li><li> Aspireren resterende poly-L-ornithine/laminin oplossing uit de dekglaasjes en kort wassen met NBM. </li><li> Voeg 150-200 ul van de gedissocieerde ganglion spirale neuron suspensie de dekglaasjes en het in een incubator (37 ° C, 10% CO2). Opmerking: tot 20 dekglaasjes kunnen worden bereid uit een gemiddelde nest van 8 ratten. </li><li> Vier uur na het uitplaten neuronen, zuigen de oplossing celresten te verwijderen en te vervangen door 150-200 ul voorverwarmde verse NBM. Opmerking: media kunnen de dagelijkse aanvulling nodig om uitdroging te voorkomen. </li><li> Terug dekglaasjes naar de couveuse tot het moment van elektrofysiologische opnames. Opmerking: los spiraalganglion neuron culturen uur na dissociatie en tot twee dagen daarna gebruikt voor elektrofysiologische experimenten. Tijd in vitro moeten tijdens de analyse van de resultaten rekening worden gehouden. Vullen NBM elke 24-48 uur. </li></ol> 2. Voorbereiding voor Patch Clamp Recordings <ol><li> Bereid oplossingen <ol><li> Intracellulaire (micropipet) oplossing: 115 mM K-gluconaat, 7 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,05 mM EGTA, 2 mM Na 2 ATP, 2 mM MgATP, 0,5 mM Na2 GTP (op pH 7,3 met KOH, aanpassen 295 mOsmol / kg met sucrose). Laat de oplossing door een steriel filter (0,2 pm) en verdelen in 200 pi fracties bij -20 ° C tot de dag van de opname worden opgeslagen. </li><li> Extracellulaire (bad) oplossing: 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucose (op pH 7,4 met NaOH; aanpassen 300-310 mOsmol / kg met sucrose) . Deze oplossing wordt op de dag van opname. </li></ol></li><li> Bereid opname micropipetten met een weerstand van 2-6 MQ. We maken gebruik van een CO 2 laser puller (P-2000; Sutter Instruments) en borosilicaatglas (1,0 mm buitendiameter; 0,58 mm binnendiameter; 75 mm lengte). </li><li> Bereid de laser. Dit protocol is bedoeld voor gebruik met een vezel-gekoppelde laser, zoals 1870 nm infrarood zenuwstimulator van Optotech P / L. De optische vezel gebruikt voor lichte levering in onze experimenten is een 200/220 um kern / mantel diameter silica vezel met een numerieke opening van 0,22 en FC-PC connectors aan beide uiteinden (AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C -0.22). De patch koorden gehalveerd tot twee vezels vlechten (ie voorzien van een connector aan een einde en gesplitst op de andere) produceren. De effecten van vezels kerndiameter en numerieke opening op laser-geïnduceerde veranderingen in temperatuur zijn uitvoerig besproken door Thompson et al.. 25 <ol><li> Splijt het uiteinde van het licht levering vezel met behulp van standaard techniekenen ervoor zorgen dat de resulterende tip is van hoge kwaliteit door observatie met een optische microscoop (dwz de tip moet loodrecht op de vezel-as en lijken plat na visuele inspectie). Sluit het licht levering fiber to the fiber-gekoppelde uitgang van de stimulatie laser met behulp van een geschikte via connector (bijv. Thorlabs ADAFC2). </li><li> Meet de uitgang laservermogen van het gesplitste uiteinde van het licht levering vezel met behulp van een geschikt instrument (bv. Coherent FieldMate met LM-3 melderkop). Het wordt aanbevolen om het laservermogen iedere keer het licht aflevering vezel wordt gesplitst of een belangrijke aanpassing wordt gedaan om de laser (bv vervoer van het ene laboratorium naar het andere) te controleren. </li><li> Breng licht levering vezel in een vezel klauwplaat of vergelijkbare voorziening en brengen zij de boorkop naar de juiste micropositioner. Het is belangrijk om de hoek θ die de optische vezel maakt het dekglaasje nauwkeurig bepalen. Dit angle kan worden gemeten door een foto van de experimentele opstelling en met beeldverwerkingssoftware (bijvoorbeeld ImageJ) om de stand te verkrijgen. De hoek θ (of bereik van mogelijke hoeken) wordt voornamelijk beperkt door ruimtelijke beperkingen van de proefopstelling - vooral de microscoop. Typische waarden van θ in onze experimenten (gebaseerd op een rechtopstaande microscoop) zijn ongeveer 36 °, maar de optimale hoek aanzienlijk verschillen alternatieve opstellingen (bijvoorbeeld die met behulp van een omgekeerde microscoop). </li><li> Verbanden tussen de laser en de patch clamp meetsysteem (bijv. Digidata 1440A, Molecular Devices) zoals getoond in figuur 2. De digitale uitgang van de patch clamp meetsysteem moet worden aangesloten op de laser via een externe functie generator, waardoor het mogelijk laserpuls parameters onafhankelijk van het meetsysteem te geven. Alternatief deze uitgang kan direct worden aangesloten opde laser driver (waarbij de puls lengte en de herhalingsfrequentie van de data-acquisitie software in te stellen). In beide gevallen dient het signaal gebruikt om de laser activeren terug verbonden met een ingang van het meetsysteem dat de timing en lengte van de laserpulsen gelijktijdig kunnen worden opgenomen met de elektrofysiologische signaal. </li></ol></li></ol> 3. Patch Clamp Recordings voor Onderzoek van INS <ol><li> Vul het juiste container van de perfusie-systeem met extracellulaire oplossing en pas het debiet aan perfusie van het bad te leveren tegen een snelheid van 1-2 ml / min. We gebruiken een zwaartekracht gevoed systeem (aanzuigfles, afknijpventiel, en PE slang) met een in-line heater snel verwarmen van de oplossing en een peristaltische pomp verbruikte oplossing te verwijderen door afzuigen mogelijk. </li><li> Plaats een dekglaasje met gekweekte cellen in de opname kamer (bad) van een rechtopstaande microscoop. Met behulp van een hoge vergroting water-immersie objectief (e. G. 40x) en fase-contrast (bijv. differentieel interferentie contrast of Dodt gradiënt contrast), visueel lokaliseren de spiraal ganglion neuronen binnen de cultuur. Een typische ganglion spirale neuron fase-helder, rond en ongeveer 15 micrometer in diameter met een prominente kern, zoals getoond in figuur 1a. </li><li> Zodra een neuron is gevestigd, over te schakelen naar een kleinere vergroting doelstelling (bv. 10X) en zoek de doelgroep neuron binnen het gezichtsveld. </li><li> Verplaats het licht levering optische vezel in positie met behulp van de volgende procedure (of gelijkwaardig): <ol><li> Gebruik micropositioner de uitgangsvezel bewegen totdat de punt dicht bij het doel neuron in zowel de horizontale en verticale vlak. De verticale positie van de vezel tip kan worden geverifieerd door de doelstelling op en neer bewegen (het scannen van de focus). </li><li> Ga terug naar de hoge objectiefvergroting en plaats het uiteinde van de optische vezel in de bedoelde positie naast tHij neuron (zie figuur 2 inzet). Het instellen van de verticale positie van de vezel, is het belangrijk dat de onderrand van de vezel rust op (dus slechts raken) het dekglaasje worden onzekerheid over de locatie van de vezel te minimaliseren. Optimale positionering in het horizontale vlak zal afhangen van de hoek θ die de vezel maakt het dekglaasje en de straal van de vezel r. Om de vezels te positioneren zodat het midden van het doelwit neuron ligt langs de vezelas, dient de horizontale afstand tussen de bovenkant van de vezel en de doelcel Δ target = r (cosec θ - 2 sin θ), Indien negatieve waarden zouden aangeven dat de optische vezel hangt de cel. Bij het ​​instellen van de vezel, kan een afstand Δ doel tussen de bovenrand van de vezel en het centrum van de neuron benadering worden bereikt door visuele inspectie. Echter Δ doel is ontworpendienen enkel als ruwe richtlijn. Plaatsing van de vezel zodanig dat de feitelijke afstand Δ tussen de bovenrand van de vezel en het centrum van de neuron meetbaar verschilt van Δ doel (zoals in figuur 1) kan inzicht verschaffen in het effect van zowel radiale verplaatsing (dat wil zeggen van het centrum van de beam) en axiale verplaatsing (bijvoorbeeld langs de vezelas) van de bundel ten opzichte van het doelwit neuron. Bijvoorbeeld, het instellen Δ ≈ 0 zou naar verwachting de lokale temperatuur te verhogen in de nabijheid van de cel - dat wil zeggen sinds de bundel profiel voor typische multimode vezels is goed benaderd door een hoge hoed verdeling 26, de daling van lokaal geabsorbeerde energie (temperatuur) door verplaatsing van het centrum van de bundel minimaal in vergelijking met de toename van de geabsorbeerde energie uit dichter bij de cel beweegt het vezeleindvlak. Terwijl zorg moeten worden genomen om de vezels zo nauwkeurig en herhaalbaar als po positionerenssible behulp van visuele aanwijzingen, nauwkeurige meting van de vezel locatie ten opzichte van het doel neuron (bv. Δ) is van groter belang dan het plaatsen van een vooraf bepaalde afstand. Δ kan worden vastgesteld (met een geschatte maximale onzekerheid van ± 3 micrometer) door beeldanalyse zoals beschreven in stap 3.8.2 van het protocol. In sommige experimenten 5,8 hebben witlichtbronnen aangekoppeld door de vezel om de gewenste cel te richten. Deze aanpak bleek effectief te zijn in de rechtopstaande microscoop setup, zoals de intensiteit van het licht verstrooid uit het doelgebied was relatief laag in deze ondiepe hoeken (θ). </li><li> Zodra de vezel is in staat, zet het uit door een bekende hoeveelheid tot een eenvoudige positionering van de micropipet mogelijk. De vezel kan dan worden teruggebracht naar de oorspronkelijke positie wanneer een neuraal opname wordt bereikt. </li></ol></li><li> Vul het micropipet met intracellulaire oplossing en veilig te passen in plaats van de koppentage van de versterker (bv. Multiclamp 700B, Molecular Devices). Middels slang aan de zijkant van de micro-elektrode houder, een kleine hoeveelheid positieve druk verstopping van de micropipet te voorkomen. </li><li> Met behulp van een micromanipulator, verplaatsen de micropipet in positie net boven de doelstelling neuron. </li><li> Protocol voor het gehele cel opnames: <ol><li> Breng een 10 msec, 10 mV rechthoekimpuls (bv. Seal Test) in voltage-clamp-modus van de versterker en de micropipet potentiële (pipet offset) van de basislijn signaal naar 0 nA passen. De dichtheidstest moet worden bepaald of de weerstand van de micro-elektrode binnen het gewenste bereik (bijv. 2-6 MQ). </li><li> Terwijl het toezicht op de weerstand, gebruik fijne aanpassingen van de micromanipulator om voorzichtig te positioneren de micropipet op het oppervlak van het doel neuron. Wanneer de micropipet in contact met de neuron, zal de weerstand te verhogen (van ~ 0,5 tot 1 MQ). Ikmmediately na de weerstand te verhogen, verwijder de positieve druk vloeistof en breng een kleine negatieve druk. Zodra weerstand is geslaagd 10 - 20 MQ, fix het membraan potentieel om een holding niveau (bijvoorbeeld rond -60 mV). </li><li> De elektrode weerstand moet blijven stijgen tot het hoger is dan 1 GQ, betekent dat een effectieve afdichting (zogenaamde &#39;gigaseal&#39;) is gevormd tussen het celmembraan en de micropipet. Op dit punt, verwijder alle vloeistofdruk van de micropipet. </li><li> Zodra de gigaseal is gevormd, gebruik korte stroompulsen (25 tot 100 psec, 1 V) of korte pulsen van negatieve fluïdumdruk scheuren de celmembraan en het bereiken van volledige celconfiguratie. </li><li> Noteer de membraancapaciteit, serie weerstand en input weerstand zoals bepaald uit de exponentiële curve gemonteerd op de huidige tijdens de dichtheidsbeproeving pols. Het minimaliseren van de capacitieve transiënten door het aanpassen van de CpFast en CpSlow controles op de versterker, dan switch de versterker in de gehele cel modus, en compenseren capaciteit en weerstand tot een vlakke stroom wordt waargenomen tijdens de dichtheidsbeproeving. Solliciteer serieweerstand compensatie (~ 70% correctie; 70% predictie), het aanpassen van capaciteit en weerstand controles om een ​​vlakke keurmerk respons te handhaven. </li><li> Schakel over naar de huidige-clamp-modus in de versterker. Kennis te nemen van de rust membraanpotentiaal (in afwezigheid van de huidige injectie). Stel een holding stroom naar de membraanpotentiaal stabiliseren op het gewenste niveau (bijv. -60 mV). Neutraliseren de pipet capaciteit en stel de brug saldo aan het spanningsverlies evenwicht. </li><li> Controleer het afvuren eigenschappen van het neuron door het stimuleren met depolariserende stroom (10-200 pA in 10 pA stappen; 300 msec duur). </li></ol></li><li><ol><li> Verplaats de optische vezel terug op zijn plaats naast het neuron. Gebruik imaging software gekoppeld aan een CCD camera beelden van de positie van de vezel vast te leggen ten opzichte van het doel neuron, gericht op het vlak van de neuron aanvankelijk, en vervolgens de bovenste rand van de optische vezel (zie figuur 1). </li><li> Bij verdere analyse van de beelden (bijvoorbeeld figuren 1b en 1c) ​​is het mogelijk om precies te bepalen Δ (de positie van de bovenrand van de optische vezel ten opzichte van het midden van het doelwit neuron). Zodra Δ bekend is, kunnen parameters zoals de afstand tussen het vezeleindvlak het doelwit neuron (langs de vezelas) z en de radiale verplaatsing van het neuron van het centrum van de bundel δ r worden berekend met behulp van eenvoudige trigonometrische relaties: z = r sin 2θ + Δ cos θ δ r = ((r cos 2θ - Δ sin θ) 2 + Ay 2) 1/2, wanneer Ay de afstand tussen de vezel-as en het midden van het neuron van boven gezien (bijv. see Figure 1). Analyse moet rekening worden gehouden met positionele varianten van cel naar cel, zoals nauwkeurige kennis van deze locatie parameters kan worden verplicht om mogelijke verschillen tussen stimulatie processen 25 te lossen. </li></ol></li></ol> 4. INS Experimenten <ol><li> Tijdens het opnemen van elektrofysiologische gegevens in beide stroomtang of voltage clamp configuraties, draaien de stimulatie laser op de gewenste parameters (bv. vermogen, pulslengte, herhalingsfrequentie etc.). Met onze laser, wordt het optische vermogen aangestuurd via een directe ingang naar de laser driver en wordt handmatig bepaald vóór elke opname. Impulsen en herhalingssnelheid kan worden gecontroleerd door ofwel een externe generator of het data acquisitie software (zoals beschreven in stap 2.3.4). Ervoor te zorgen dat de gegevens worden geregistreerd vanaf zowel de patch clamp-kanaal en de laser triggerkanaal. </li></ol> Laserpulsen met lengtes variërendvan ongeveer 500 msec naar 15 msec en energieën van ~ 0,25-5 mJ per impuls levert doorgaans meetbaar elektrisch reacties. Instellen herhalingssnelheid van laserpulsen 1 Hz of minder zijn nuttig kan zijn eerste experimenten, omdat de effecten van deze parameter zal minimaliseren. Typische resultaten tonen de verandering in de opgenomen signaal worden gepresenteerd in de volgende paragraaf.

<ol><li>Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+infrared+light+for+in+vivo+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Application of infrared light for in vivo neural stimulation.</a> Journal of Biomedical Optics. 10, 064003(2005).</li>
<li>Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stimulation+with+optical+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Laser+%26+Photonics+Reviews%22%5BJournal%5D)">Neural stimulation with optical radiation.</a> Laser & Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).</li>
<li>Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+photochemical+tools+for+controlling+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">New photochemical tools for controlling neuronal activity.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Albert, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trpv4+channels+mediate+the+infrared+laser-evoked+response+in+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).</li>
<li>Wells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+mechanisms+of+transient+optical+stimulation+of+peripheral+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve.</a> Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).</li>
<li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 3, 736(2012).</li>
<li>Bec, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+laser+stimulation+by+near+infrared+pulses+of+retinal+and+vestibular+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).</li>
<li>Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+transients+evoked+by+pulsed+infrared+radiation+in+neonatal+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes.</a> Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).</li>
<li>Izzo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+stimulation+of+auditory+neurons%3A+Effect+of+shorter+pulse+duration+and+penetration+depth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth.</a> Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).</li>
<li>Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+laser+versus+electrical+energy+for+peripheral+nerve+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).</li>
<li>Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+stimulation+of+the+facial+nerve%3A+A+new+monitoring+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique.</a> Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).</li>
<li>Jenkins, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+pacing+of+the+embryonic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Optical pacing of the embryonic heart.</a> Nature Photonics. 4, 623-626 (2010).</li>
<li>Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+stimulation+of+the+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Laser stimulation of the auditory nerve.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 38, 745-753 (2006).</li>
<li>Izzo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectivity+of+neural+stimulation+in+the+auditory+system%3A+A+comparison+of+optic+and+electric+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli.</a> J. Biomed. Opt. 12, 021008(2007).</li>
<li>Richter, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+stimulation+of+auditory+neurons%3A+Effects+of+acute+and+chronic+deafening%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening.</a> Hearing Research. 242, 42-51 (2008).</li>
<li>Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+stimulation+of+single+auditory+nerve+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Laser stimulation of single auditory nerve fibers.</a> Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).</li>
<li>Izzo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+parameter+variability+in+laser+nerve+stimulation%3A+A+study+of+pulse+duration%2C+repetition+rate%2C+and+wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable-membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes.</a> Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+application+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+and+its+impact+on+spiral+ganglion+neuron+firing+properties+and+hyperpolarization-activated+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents.</a> Hearing Research. 291, 1-14 (2012).</li>
<li>Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+hair+cell+explant+co-cultures+promote+the+differentiation+of+stem+cells+into+bipolar+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons.</a> Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).</li>
<li>Whitlon, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+morphology+of+auditory+neurons+in+dissociated+cultures+of+newborn+mouse+spiral+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion.</a> Neuroscience. 138, 653-662 (1016).</li>
<li>Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+stimulation+of+neurite+outgrowth+in+a+serum-free+culture+of+spiral+ganglion+neurons+from+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice.</a> Hearing Research. 230, 17-23 (2007).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+corti%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti.</a> J. Vis. Exp. (36), e1685(2010).</li>
<li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+light+absorption+in+tissue+during+infrared+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation.</a> Journal of Biomedical Optics. 17, 075002(2012).</li>
<li>Snyder, A. W., Love, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSnyder%2C+AW+%22Optical+Waveguide+Theory%22">Optical Waveguide Theory</a>. , Chapman and Hall. (1983).</li>
<li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+the+temporal+effects+of+heating+during+infrared+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation.</a> J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).</li>
<li>Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+temperature+jump+by+infrared+diode+laser+irradiation+for+patch-clamp+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies.</a> Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Met behulp van de in deze paper protocollen is het mogelijk om uit te pakken en cultuur spiraal ganglion neuronen en laser-opgewekte elektrische activiteit te onderzoeken door hele cellen patch clamp experimenten uitvoeren. Bij gebruik in vitro, de patch clamp techniek geeft een mate van controle over de experimentele parameters die niet haalbaar in vivo. Laserstimulatie parameters zoals golflengte, pulsenergie, pulslengte, pulsvorm, en pulsherhalingsfrequentie sequenties kunnen worden onderzocht in ee...

De velden van de neurofysiologie en de medische bionica sterk afhankelijk van technieken die regelbare stimulatie van elektrische reacties in zenuwweefsel kunnen. Terwijl elektrische stimulatie blijft de gouden standaard zenuwopwekplaatsen, lijdt aan een aantal nadelen, zoals de aanwezigheid van stimulatie artefacten bij het ​​opnemen neurale respons, en een gebrek aan stimulatie specificiteit door de verspreiding van stroom in omringende weefsel 1. De laatste twee decennia hebben de ontwikkeling van optisch gemedieerde stimulatie technieken 2 gezien. Een aantal van deze technieken vereisen aanpassing van het doelweefsel, via de toevoeging van een bepaald molecuul (bijv. gekooide moleculen) 3 of enige vorm van genetische manipulatie (bijv. optogenetics) 4, die geen van beide gemakkelijk buiten onderzoeksverband te passen. Van bijzonder belang is dan ook infrarood neurale stimulatie (INS), whereby zenuwweefsel wordt opgewekt door gepulseerd infrarood laserlicht. INS heeft de potentie om veel van de tekortkomingen van elektrische stimulatie overwinnen doordat zeer specifieke, contactloze stimulatie van zenuwweefsel 2. Hoewel INS met succes aangetoond in diverse instellingen in vivo, het precieze mechanisme van excitatie blijft onzeker. Enkele recente publicaties hebben aangetoond vooruitgang naar het blootleggen van het mechanisme achter INS 5-7. Snelle verwarming als gevolg van absorptie van het laserlicht door het water lijkt een belangrijke rol te spelen. Daarnaast echter een consensus nog worden bewerkstelligd. Shapiro et al.. 7 stellen een zeer algemeen mechanisme waarmee snel verwarmen veroorzaakt een verstoring in de verdeling van geladen deeltjes naast de celmembraan, wat leidt tot een verandering in de capaciteit van de celmembraan en daaropvolgende depolarisatie. Bovendien Albert et al.. 5 beweren dat laser geïnduceerde verwarming activeert een specifieke klasse van temperatuurgevoelige ionkanalen (transient receptor potential vanilloid kanalen), waardoor ionen om door het celmembraan. In dit stadium is het onduidelijk hoe deze mechanismen te combineren, of zelfs of er andere factoren die nog moeten worden geïdentificeerd. Hoewel een klein aantal publicaties (referenties 5,7-9) INS hebben in vitro onderzocht, heeft de overgrote meerderheid van het werk gepubliceerd op dit gebied is uitgevoerd in vivo (bv. referenties 1,6,10-18). Infrarode stimulatie van de auditieve neuronen is een gebied van bijzonder belang, gezien de potentiële toepassingen in cochleaire implantaten 10,14-18. Terwijl in vivo experimenten zijn belangrijk voor de effectiviteit van de techniek in verschillende instellingen, over de toegenomen geboden door in vitro studies controle naar verwachting leiden tot een meer gedetailleerd begrip van de mech controlerennisme verantwoordelijk voor de INS. Dit rapport beschrijft de bereiding van gekweekte ganglion spirale neuronen voor patch clamp onderzoeken, omdat deze kunnen worden gebruikt om fundamentele mechanismen bestuderen tegelijkertijd verbinden met de grote hoeveelheid bestaande gegevens uit het gehoorsysteem. De patch clamp techniek is een uitstekend hulpmiddel voor het onderzoeken van elektrofysiologische fenomenen, een middel van het opnemen van elektrische activiteit in enkele cellen en het bestuderen van de bijdrage van de individuele onderliggende stromingen 19. Wanneer deze techniek wordt toegepast op een stabiele in vitro bereiding van primaire neuronen, zoals gekweekte ganglion spirale neuronen, biedt de mogelijkheid te bestuderen in de mechanismen waardoor neurale activiteit wordt gecontroleerd en gemanipuleerd diepte. De in dit werk schema onderzoeken van het effect van laserstimulatie op de elektrische eigenschappen van de ganglion spirale neuronen door patch clamp protocollenopnames. De benadering is gebaseerd op een vezel-gekoppelde laser in plaats van een vrije ruimte laser, waardoor veiliger werken en gemakkelijker en herhaalbare uitlijning zonder de standaard microscoop configuratie te wijzigen. Op grond van deze protocollen, moet het mogelijk zijn een groot aantal experimenten om meer duidelijk het mechanisme of mechanismen achter INS.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Celcultuurmaterialen en apparatuur </td></tr><tr><td>Glascoverslips</td><td>Lomb Scientific</td><td>CSC 10 1 GP</td><td></td></tr><tr><td>4-ring celcultuurschaal </td><td>VWR International</td><td>82050-542</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Gebogen pincetten</td><td>WPI</td><td>14101</td><td>Dumont #5 pincetten (45&deg; hoektip)</td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>ThermoScientific</td><td>Heracell 150i</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabel 1. Celcultuurmaterialen en apparatuur.</td></tr><tr><td colspan="4">Neurobasal media</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>N-2 supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 serum-vrij supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Intracellulaire oplossing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Kalium D-gluconaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>NaGTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxide</td><td>LabServ</td><td>BSPPL738.500</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Extracellulaire oplossing </td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>310166</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>383147</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>LabServ</td><td>BSPSL740.500</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabel 2. Oplossingen voor celcultuur en patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellulaire oplossing. c) Extracellulaire oplossing.</td></tr><tr><td>Staande microscoop</td><td>Zeiss</td><td>AxioExaminerD1</td><td>Uitgerust met Dodt contrast </td></tr><tr><td>Water-immersie objectief</td><td>Zeiss</td><td>W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75</td><td></td></tr><tr><td>Platform en X-Y trap </td><td>ThorLabs</td><td>Burleigh Gibraltar</td><td></td></tr><tr><td>Opnamekamer</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td></td></tr><tr><td>Vibratie-isolatie tafel</td><td>TMC</td><td>Micro-g 63-532</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Diagnostic Instruments</td><td>RT1200</td><td></td></tr><tr><td>Camera software</td><td>Diagnostic Instruments</td><td>SPOT Basic</td><td></td></tr><tr><td>Inline oplossingsverwarmer</td><td>Warner</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Temperatuurregelaar</td><td>Warner</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp versterker</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp data acquisitie systeem</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-325</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet glas</td><td>Sutter Instruments</td><td>GBF100-58-15</td><td>Borosilicaatglas met filament</td></tr><tr><td>Micropipet Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>Opname Software</td><td>AxoGraph</td><td></td><td>Lab pack en elektrofysiologie tools</td></tr><tr><td>Aspiratiefles</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS12201L</td><td>1 L Pyrex aspiratiefles, met uitlaat voor slang</td></tr><tr><td>PE Slang</td><td>Harvard</td><td>PolyE #340</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex peristaltiek pomp</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-07554-85</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabel 3.Patch clamp apparatuur.</td></tr><tr><td>1,870 nm laserdiode</td><td>Optotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200/220 μm diameter multimode optische glasvezel patch kabel (FC/PC)</td><td>AFW Technologies</td><td>MM1-FC2-200/220-5-C-0.22</td><td>Lichtaflevering optische glasvezel, silica kern en coating, 0.22 NA</td></tr><tr><td>Optische glasvezel door connector (FC/PC)</td><td>Thorlabs</td><td>ADAFC2</td><td></td></tr><tr><td>Optische glasvezel splijtgereedschap</td><td>EREM</td><td>FO1</td><td></td></tr><tr><td>Optische glasvezel strip gereedschap (0.25 - 0.6 mm) </td><td>Siemens</td><td></td><td>Voor het verwijderen van de optische glasvezelmantel</td></tr><tr><td>Optische glasvezel strip gereedschap (0.6 - 1.0 mm)</td><td>Siemens</td><td></td><td>Voor het verwijderen van de buitenste coating van de patch kabel</td></tr><tr><td>Signaalgenerator</td><td></td><td></td><td>Elke signaalgenerator die de nodige pulsvormen kan produceren en in staat is om extern te worden getriggerd</td></tr><tr><td>Optische glasvezel positioner</td><td></td><td></td><td>Op maat gemaakte positioner. Kan worden vervangen door standaard micropositioner gebruikt voor patch clamp experimenten</td></tr><tr><td>Optische glasvezel klemvinger</td><td>Newport</td><td>FPH-DJ</td><td></td></tr><tr><td>Laser vermogensmeter en detectorkop</td><td>Coherent</td><td>FieldMate (vermogensmeter) met LM-3 (detectorkop)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabel 4. Laserapparatuur.</td></tr></tbody></table>

whole cell patch clamp voor onderzoek naar de mechanismen van infrarood neural stimulatie

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Aangetoond is de laatste jaren dat gepulste, infrarood laserlicht kan worden gebruikt om elektrische reacties uitlokken in neuraal weefsel, onafhankelijk van de verdere modificatie van het doelweefsel. Infrarood zenuwstimulatie gerapporteerd in een verscheidenheid van perifere sensorische en neuraal weefsel in vivo, met weergegeven in stimulatie van neuronen in de gehoorzenuw bijzonder belang. Echter, terwijl de INS is aangetoond dat het werken in deze instellingen, het mechanisme (of mechanismen) waardoor infrarood licht veroorzaakt neurale excitatie is op dit moment niet goed begrepen. Het protocol hier gepresenteerde beschrijft een hele cel patch clamp methode ontwikkeld om het onderzoek van de infrarode neurale stimulatie in gekweekte primaire auditieve neuronen vergemakkelijken. Door grondig karakteriseren van de respons van deze cellen infrarode laser belichting in vitro onder gecontroleerde omstandigheden, kan het mogelijk zijn om een beter begrip van de fundamentele Physica krijgenl en biochemische processen die ten grondslag liggen infrarode neurale stimulatie.

Ganglion spirale neuronen reageren op laser belichting met herhaalbare golfvormen in het voltage-clamp en stroom-clamp opname configuraties. Figuur 3a toont typische veranderingen in stroom over een celmembraan in respons op een 2,5 msec, 0,8 mJ laserpuls (gemiddelde reactietijd van 6 laserpulsen herhaald met intervallen van 1 seconde) met de membraanpotentiaal gehouden op -70 mV, -60 mV en -50 mV. Net naar binnen stromen worden consequent opgeroepen als reactie op laserpulsen, terug te keren naar de in...

Infrarood zenuwstimulatie is voorgesteld als een alternatief voor elektrische stimulatie in een reeks zenuw types, waaronder die gepaard gaan met het gehoorsysteem. Dit protocol beschrijft een patch clamp methode voor het bestuderen van het mechanisme van infrarood zenuwstimulatie in een kweek van primaire auditieve neuronen.

Whole Cell Patch Clamp voor Onderzoek naar de mechanismen van Infrarood Neural Stimulatie

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om een modelsysteem te produceren om de effecten van infrarood laserbestraling op auditieve neuronen in vitro te bestuderen. Dit wordt bereikt door patchclamping van gekweekte auditieve neuronen in de whole-cell configuratie om hun elektrische eigenschappen te onderzoeken. Vervolgens kan blootstelling van de neuronen aan laserbestraling elektrische responsen in de blootgestelde cel uitlokken, die kunnen worden gemeten met een patchclamp-opstelling.Verlichtingsparameters en omgevingsvariabelen kunnen vervolgens worden gevarieerd om hun effecten op door laser geïnduceerde elektrische reacties te observeren. De auditieve neuronen die aan het laserlicht worden blootgesteld, zullen herhaalbare elektrische activiteit vertonen als reactie op elke laserpuls voor latere analyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de mechanismen die ten grondslag liggen aan infraroodstimulatie van spiraalganglionneuronen.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de infrarode stimulatie specifiek van spiraalganglioncellen, kan deze ook worden uitgebreid naar andere celtypen of vereenvoudigde modellen zoals lipide dubbellagen om de betrokken fysische processen verder te verduidelijken. Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk om een nauwkeurige positionering van de optische vezel voor lichttoediening te garanderen, aangezien de resulterende stralingsblootstelling een kritische parameter is. Bereid registratie-micropipetten voor met een weerstand van twee tot zes mega ohm. Deze kunnen worden getrokken uit borosilicaatglas met een CO2-laserpuller.Bereid de vezelgekoppelde laser voor. Een breed scala aan optische vezels is hiervoor geschikt. Door een vezel in een patchkoordconfiguratie met FCPC-connectoren door te snijden, ontstaan twee vezelverbindingen met aan het ene uiteinde een connector en aan het andere uiteinde een blootliggende vezel.Dit zijn de pigtails. Bereid het blootgestelde uiteinde van één pigtail voor door de mantel van de vezel te verwijderen, te reinigen met ethanol en te klieven met een geschikt instrument onder een microscoop. Controleer of het uiteinde loodrecht op de vezelas staat en er vlak uitziet.Verbind het andere uiteinde van de fiber pigtail met de uitgang van de stimulatielaser, indien nodig met behulp van een passende doorvoerconnector. Zorg er op dit punt altijd voor dat de uitgangslaiserpower vanuit de vezel wordt gemeten. Doe dit ook na eventuele verdere manipulaties van de tip.Plaats nu de vezel in een klem en bevestig de klem aan de juiste micropositioneerder. Bepaal vervolgens de hoek die de optische vezel maakt met het dekglas. Maak een foto van de opstelling en bereken de hoek met ImageJ. Bevestig nu de verbindingen die de laser synchroniseren met het data-acquisitiesysteem van de patchclamp.De digitale output van het patch-clamp data-acquisitiesysteem moet via een externe functiegenerator met de laser worden verbonden, zodat laserpuls-parameters onafhankelijk van het data-acquisitiesysteem kunnen worden gespecificeerd; het signaal dat wordt gebruikt om de laser te triggeren, moet worden teruggekoppeld naar een ingang van het data-acquisitiesysteem om ervoor te zorgen dat de timing en duur van de laserpulsen gelijktijdig met het elektrofysiologische signaal kunnen worden geregistreerd. Stel de stroomsnelheid van het perfusiesysteem in op tussen 1 en 2 ml per minuut. Een door zwaartekracht gevoed systeem met een inline-verwarmer voor snelle opwarming van de oplossing en een peristaltische pomp om verbruikte oplossing via zuiging te verwijderen, is hiervoor geschikt. Plaats een dekglas met gecultiveerde cellen in de registratiekamer van een rechtopstaande microscoop met gebruik van een waterimmersie-objectief met hoge vergroting en fasecontrast, en lokaliseer een neuron van het spiraalganglion.Een typisch neuron van het spiraalganglion is helder rond, ongeveer 15 micron in diameter en heeft een prominente nucleus. Zodra een geschikt neuron is gelokaliseerd, schakelt u over naar een objectief met een lagere vergroting en lokaliseert u het doelneuron. Gebruik vervolgens de micro-positioneer om de optische vezel te verplaatsen totdat de punt zich in zowel het horizontale als het verticale vlak dicht bij het doelneuron bevindt.Schakel terug naar het objectief met hoge vergroting en positioneer de punt van de optische vezel op de beoogde positie naast het neuron. Bij het aanpassen van de verticale positie van de vezel is het belangrijk dat de onderrand van de vezel op de rand van het dekglas rust. Om onzekerheid over de locatie van de vezel te minimaliseren, kan het contactpunt worden geïdentificeerd aan de hand van visuele aanwijzingen in het microscoopbeeld.Zodra de vezel in positie is, verschuift u deze over een bekende afstand langs de longitudinale as, zodat de positionering van de micropipet niet wordt beïnvloed. De micropipet moet zijn gevuld met intracellulaire oplossing en stevig zijn bevestigd aan de headstage van de versterker. Pas via de aan de zijkant van de micro-elektrodehouder bevestigde slang een kleine hoeveelheid positieve druk toe om verstopping van de micropipet te voorkomen.Beweeg de micropipet met een micromanipulator naar de positie net boven het doelneuron en ga over tot het vormen van een giga-ohm seal. Noteer de membraancapaciteit, de serieweerstand en de inputweerstand zoals bepaald uit de exponentiële curve die op de stroom is gefit tijdens de seal-testpuls.Minimaliseer de capaciteitstransient door de CP fast- en CP slow-regelaars op de versterker aan te passen. Schakel de versterker vervolgens over naar de whole cell-modus en pas de capaciteits- en weerstandscompensatie aan totdat er een vlakke stroom wordt waargenomen tijdens de SEAL-test. Pas daarna serieweerstandscompensatie toe met ongeveer 70% correctie en 70% predictie, waarbij de regelaars voor capaciteits- en weerstandscompensatie worden bijgesteld om een vlakke test seal-respons te behouden.Schakel vervolgens de versterker over naar de current clamp-modus. Noteer het rustmembraanpotentiaal in afwezigheid van stroominjectie. Stel nu een holdingstroom in om het membraanpotentiaal op het gewenste niveau te stabiliseren.Neutraliseer de pipetcapaciteit en stel de brugbalans in om het spanningsverlies te balanceren. Controleer de vuureigenschappen van het neuron door te stimuleren met een depolariserende stroom. Verplaats op dit punt de optische vezel met behulp van imaging-software gekoppeld aan een CCD-camera terug naar de positie naast het neuron; maak beelden die aanvankelijk zijn gefocust op het vlak van het neuron en vervolgens op de bovenrand van de optische vezel.Analyseer de afbeeldingen om de delta-waarde te bepalen, wat de positie is van de bovenrand van de optische vezel ten opzichte van het centrum van het doelnuron. Het is zeer belangrijk om de positie van de optische vezel nauwkeurig te kennen. Dit komt omdat de energie per eenheid oppervlak, of de bestraling (radiance exposure) die aan de doelcel wordt geleverd, een kritische parameter is voor infrarode neurale stimulatie, en dit aanzienlijk kan worden beïnvloed door de positie van de vezel ten opzichte van de cel.Het optische vermogen van deze laser wordt computergestuurd via een directe ingang naar de laser en kan handmatig worden gespecificeerd vóór elke opname. De pulslengte en herhalingssnelheid kunnen worden geregeld via de functiegenerator zoals eerder beschreven; zorg ervoor dat de gegevens zowel van het patchclamp-kanaal als van het laser-triggerkanaal worden geregistreerd. Laserpulsen van 0,5 tot 15 milliseconde bij 0,25 tot 5 millijoule leveren doorgaans meetbare elektrische responsen op. Aanvankelijk.Het kan nuttig zijn om de herhalingssnelheid van de laserpulsen in te stellen op 1 Hz of minder om ongewenste effecten te minimaliseren. Zodra alle laserparameters zijn ingesteld, kan worden overgegaan tot de gegevensverzameling.Sipiraalganglionneuronen reageren op laserbestraling met reproduceerbare golfvormen in zowel voltage-clamp- als current-clamp-registratieconfiguraties in reactie op laserpulsen van 2,5 milliseconde en 0,8 millijoule. Een typische cel produceert een netto binnenwaartse stroom bij verschillende holdingpotentialen. Current-clamp-registraties tonen een gestage membraandepolarisatie gedurende deze laserpulsen, gevolgd door een bijna exponentiële afname richting de rustmembraanpotentiaal na de puls.In sommige gevallen is er na de laserpuls ook sprake van een kleine aanvullende membraandepolarisatie. Belichting met een overmatige hoeveelheid energie of blootstelling aan grote temperatuurstijgingen kan leiden tot celbeschadiging, wat waarneembaar is door een verslechtering van de elektrische eigenschappen van de cel of onmiddellijke celdood. Door deze procedure te volgen, kunnen diverse omgevingsparameters, zoals de temperatuur van de oplossing of chemische factoren, worden gevarieerd om het effect hiervan op de door laser geïnduceerde elektrische activiteit te testen.Vergeet niet dat werken met lasers gevaarlijk kan zijn en dat standaard veiligheidsmaatregelen moeten worden genomen. Deze omvatten het gebruik van een laserbril, waarschuwingsborden en het waarborgen dat de straal niet onbedoeld in contact komt met sterk reflecterende oppervlakken.

whole-cell-patch-clamp-for-investigating-mechanisms-infrared-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol beschrijft een techniek genaamd whole-cell patch clamp electrophysiology, een methode om elektrische eigenschappen van Mauthner neuronen en andere reticulospinale cellen in zebravisembryo's te bestuderen.

Whole-Cell Patch Clamp Electrophysiology: een methode om elektrische eigenschappen van neuronen te bestuderen

The video demonstrates a protocol to study synaptic interactions and neuronal responses in a transfected mouse hippocampal brain slice. It involves illuminating long-range sensory neurons to trigger action potentials and recording the resulting excitatory post-synaptic potentials in the recorded neuron using the whole-cell patch-clamp technique.

Photostimulation and Whole-Cell Patch Clamp Recordings of Neurons in Mouse Hippocampal Slices

This video demonstrates the patch-clamp technique for measuring ionic currents in inner ear sensory neuron cell bodies. It details the preparation and use of a polished patch-clamp pipette filled with an internal solution containing amphotericin B, which perforates the membrane to allow ion movement while preserving intracellular conditions. Voltage pulses are applied to trigger and record ion channel activity, providing insights into their properties and behavior.

Perforated Patch-Clamp Recordings of Inner Ear Sensory Neuron Cell Bodies

This video demonstrates the examination of sensory neuron excitability in the dorsal root ganglia using the patch clamp technique to measure the rheobase and membrane potential, analyzing the neurons' responses to incremental current injections.

Whole-Cell Patch Clamp Recordings on Intact Rat Dorsal Root Ganglia

Hier beschreven is een procedure voor het verkrijgen van lange stukken huidige opname van een ionkanaal met de cel-bijgevoegde patch-clamp techniek. Deze methode maakt het mogelijk voor het observeren, in real time, het patroon van open-close kanaal conformaties dat de biologische signaal ten grondslag liggen. Deze gegevens informeren over kanaal woningen in ongestoord biologische membranen.

Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

Corticale netwerken worden gecontroleerd door een kleine, maar gevarieerde set van remmende interneuronen. Functioneel onderzoek van interneuronen vereist daarom gerichte opname en strenge identificatie. Hier beschreven is een gecombineerde aanpak met whole-cell opnames van enkele of synaptically gekoppelde paren van neuronen met intracellulaire etikettering, post-hoc-morfologische en immunocytochemische analyse.

Whole-cell patch-clamp opnamen van Morphologically- en neurochemisch-geïdentificeerde hippocampus Interneurons

Dit protocol beschrijft elementaire procedurele stappen voor het uitvoeren van whole-cell patch-clamp opnames. Deze techniek maakt het onderzoek mogelijk van het elektrisch gedrag van neuronen, en wanneer uitgevoerd in hersencoupes, kan worden nagegaan of verschillende neuronale functies van neuronen die nog geïntegreerd in goed behouden hersenen circuits.

Whole-cell patch-clamp opnamen in Brain Slices

Dit protocol laat zien hoe whole-cell patch clamp opname uit te voeren op het netvlies neuronen uit een flat-mount voorbereiding.

Patch Clamp Registratie van Starburst amacrine Cellen in een flat-mount voorbereiding van Deafferentated Mouse Retina

Het segment patch-clamp techniek is een effectieve methode voor het analyseren van leren-geïnduceerde veranderingen in de intrinsieke eigenschappen en de plasticiteit van excitatory of inhiberende synapsen.

Segment Patch-Clamp techniek voor het analyseren van leren-Induced Plasticity

Dit protocol beschrijft hoe u automatische beeldgeleide patch-clamp experimenten kunt uitvoeren met behulp van een systeem dat onlangs is ontwikkeld voor standaard in vitro elektrofysiologie apparatuur.

Toepassing van geautomatiseerde beeldgeleide patchclamp voor de studie van neuronen in hersenschijven

Leer de patch clamp-methode in whole cell configuratie voor onderzoek naar infrarood neurale stimulatie van auditieve neuronen. Deze techniek helpt wetenschappers elektrische responsen op laserbelichting meten.

Whole Cell Patch Clamp voor Onderzoek naar de mechanismen van Infrarood Neural Stimulatie

Meer video's verkennen