RNAi-gemedieerde Dubbele Gene Knockdown en Smaak Perception Meting in Honingbijen (

Dit videoprotocol demonstreert nieuwe technieken om gelijktijdig twee genen uit te schakelen (knockdown) bij volwassen honingbijen en vervolgens een proboscis-extensierespons- of PER-assay uit te voeren om het effect van deze dubbele gen-knockdown op de smaakperceptie van honingbijen te meten. Dit wordt bereikt door eerst dubbelstrengs RNA's te synthetiseren die gericht zijn op de genen voor drie eiwitten, vitelli, genin, ultras, spherical, en het groen fluorescent eiwit.

Aangezien het gen dat codeert voor GFP niet in het genoom van de honingbij voorkomt, dient het dubbelstrengs RNA van GFP als negatieve controle. De tweede stap is het injecteren van dubbelstrengs RNA in honingbijen met behulp van vier behandelingsstrategieën: injectie met enkel dubbelstrengs RNA van GFP, een enkele injectie met een mengsel van dubbelstrengs RNA van VG en USP, injectie met dubbelstrengs RNA van vg op de eerste dag gevolgd door injectie met dubbelstrengs RNA van USP op de tweede dag, en injectie met dubbelstrengs RNA van USP op de eerste dag gevolgd door injectie met dubbelstrengs RNA van VG op de tweede dag. Na de injecties werden de bijen gemarkeerd met kleurgecodeerde verfstippen die overeenkomen met de behandelingen en vervolgens teruggeplaatst in een bijenkast.

Zes dagen later wordt de knockdown van de VG- en USP-genen in de behandelde bijen gevalideerd via real-time PCR en wordt het effect van de dubbele VG- en USP-knockdown op de gustatoire perceptie bepaald met de PER-assay. Uiteindelijk blijkt dat bijen met een dubbele knockdown significante reducties vertonen in de expressie van de VG- en USP-genen en significante toenames in de gustatoire perceptie van sucrose. Onze interferentie is een krachtig instrument dat we kunnen gebruiken om genfuncties te ontsluieren.

Het wordt doorgaans gebruikt om zich op een enkel gen te richten. Genen maken echter deel uit van een complex regulatoir netwerk. Een manier om biologische processen beter te begrijpen, is door te leren hoe genen interageren met het gennetwerk.

Om dit te bereiken, moeten we meerdere genen tegelijkertijd manipuleren. Tot nu toe waren we slechts in staat om één gen tegelijk te beïnvloeden in insecten; hier willen we voor het eerst laten zien hoe we twee genen in honingbijen kunnen uitschakelen in plaats van één. De proboscis extensiereflex (PER) is een zeer nuttige techniek om de gustatoire perceptie te meten, wat een gedragsmatige voorspeller is voor het sociale gedrag van honingbijen.

Bijvoorbeeld: nestbijen met een hoge gustatoire perceptie rijpen gedragsmatig snel, verzamelen vroeg in hun leven voedsel en geven de voorkeur aan het verzamelen van pollen. Om deze procedure te starten, ontwerpt u primers voor dubbelstrengs RNA's die gericht zijn op de genen voor knockdown met behulp van de gratis software primer.Three. In dit experiment zijn de twee genen die gericht zijn op knockdown vitelli, genin, of VG en ultraspherical of USP.

Naast het ontwerp voor VG en USP werden primers gebruikt voor dubbelstrengs RNA gericht op een controlegen dat codeert voor groen fluorescent proteïne, of GFP, dat niet in het genoom van de honingbij voorkomt. Vervolgens werd de synthese van dubbelstrengs RNA voor VG, USP en GFP uitgevoerd via in vitro transcriptie met behulp van het rib max T seven RNA-productiesysteem van Promega.

Nadat de dubbelstrengs RNA's met standaardprocedures zijn gezuiverd, wordt elk dubbelstrengs RNA-pellet opgelost in nucleasevrij water; om de effectiviteit van de gen-downregulatie te waarborgen, moet de concentratie van het dubbelstrengs RNA ongeveer 9 tot 10 µg/µL bedragen. Om de bijen voor injectie voor te bereiden, worden pas uitgekomen bijen gedurende één tot twee minuten gekoeld in een koelkast van 4 °C. Zodra de bijen zijn geïmmobiliseerd, worden drie tot vier bijen parallel op Petrischalen gevuld met vaste was gemonteerd, waarbij insectenspelden kruislings tussen hun abdomen en thorax worden geplaatst.

Koel de bijen opnieuw af in een koelkast van 4 °C gedurende ongeveer één tot twee minuten. Zorg ervoor dat de bijen volledig immobil zijn. De bijen moeten er ontspannen uitzien, niet opgekruld of verkrampt.

Volledige immobilisatie is belangrijk, aangezien elke beweging de grootte van de wond en de mortaliteit kan verhogen. Bijen die gekruld of vervormd zijn, zijn te lang gekoeld en mogen niet worden gebruikt vanwege de hoge mortaliteit. Plaats een wegwerplaag naald van 30 gauge op een Hamilton-microspuit.

Vul de spuit met 3 µL dubbelstrengs RNA en zorg ervoor dat er geen luchtbel in de spuit zit. Als er gebruik wordt gemaakt van een strategie met één injectie, wordt de spuit gevuld met een mengsel van de dubbelstrengs RNA's van de twee genen. Als er gebruik wordt gemaakt van een injectiestrategie over twee dagen, wordt de spuit gevuld met één van de twee dubbelstrengs RNA's.

Steek de naald in de zijkant van de buikholte. Druk de zuiger van de spuit langzaam in om beschadiging van interne organen te voorkomen en het dubbelstrengs RNA te laten absorberen. Omdat dubbelstrengs RNA zeer stroperig is, duurt het twee tot drie seconden voordat het volledig uit de spuit is geperst.

Nadat de zuiger volledig is ingedrukt, laat u de naald vier tot vijf seconden in de wond zitten. Observeer de bijen gedurende drie tot vijf seconden na de injecties. Als er een druppel hemolymfe uit de wond lekt, dient de bij te worden weggegooid; markeer het thorax van de bijen met verschillende kleuren die overeenkomen met de verschillende behandelingen.

Op dit punt, indien de strategie met een enkele injectie wordt gebruikt, observeer de bijen gedurende één uur in een container met honing, en plaats ze daarna terug in een kolonie. Indien echter de tweedaagse injectiestrategie wordt gebruikt en alleen het eerste dubbelstrengs RNA is geïnjecteerd, plaats de bijen dan in een cilindervormige gaaskooi met honing aan de zijkant. Houd de bijen gedurende de nacht en de volgende dag in een incubator bij 34 °C en 80% vochtigheid.

Inject dezelfde bijen met het tweede dubbelstrengs RNA, met gebruik van dezelfde procedure als voor het eerste dubbelstrengs RNA. Laat de bijen één uur lang herstellen bij kamertemperatuur in een container waarin honing is voorzien, en breng ze vervolgens over naar een kolonie. Verzamel zes dagen na de injecties de behandelde bijen uit de kolonie zonder een rookblazer te gebruiken om de kast te openen.

Rook wordt niet gebruikt omdat dit de smaakperceptie van de bijen zou kunnen beïnvloeden, wat in deze procedure wordt getest. Verzamel de bijen in kooien van metaalgaas met behulp van zachte pincetten, met maximaal drie bijen per kooi om de bijen te plaatsen voor de PER-assay.

Koel de bijen af bij vier graden Celsius tot ze volledig geïmmobiliseerd zijn. Monteer elke bij verticaal in een plastic buisje dat speciaal is ontworpen voor PER. Gebruik plakband om het abdomen in het buisje te houden en zorg dat de kop uit het buisje steekt.

Plaats de buisjes in een rek met twee rijen kleine plastic kolommen. Eén rij is genummerd zodat de gemonteerde bijen een ID-nummer kunnen worden toegewezen. Plaats de rekken met de behandelde bijen gedurende twee uur in een incubator bij 34 °C en 80% luchtvochtigheid terwijl de bijen incuberen.

Bereid een reeks sucrose-wateroplossingen. Vul de oplossingen in spuiten met naalden van 15 tot 20 gauge voor de PER-assay.

De bijen worden in groepen getest. Raak eerst de antenne van elke bij aan met een druppel van een 0%-oplossing, wat water is, en test daarna met 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% en 30% sucrose-wateroplossingen. Houd een interval van ten minste twee minuten aan tussen elke oplossing.

Het testen van 20 bijen met één sucroseconcentratie duurt gewoonlijk ongeveer twee minuten. Daarom moeten er altijd meer dan 20 bijen in elke groep aanwezig zijn. Als een bij haar proboscis volledig uitstrekt, wordt dit geteld als een positieve respons.Real-time.

PCR-analyse bevestigde dat zowel de strategie met een enkele injectie als de strategie met injecties over twee dagen de transcriptieniveaus van Fiji en USP in honingbijen significant verlaagden. Zes dagen nadat het dubbelstrengs RNA was geïnjecteerd, geven in deze grafieken de RQ het relatieve quantificatieniveau van de targetgen-transcripten aan en duiden de verschillende letters boven de balken op significante verschillen tussen de behandelingsgroepen. Post-hoc analyse wees uit dat de onderdrukking van USP-transcripten door het gebruik van de enkele injectie met een mengsel van dubbelstrengs RNA en de injecties over twee dagen waarbij eerst VG en daarna USP werd toegediend, significant lager was dan bij de injecties over twee dagen waarbij eerst USP en daarna VG werd toegediend.

Dit geeft aan dat VG mogelijk een primaire regulator is in de regulatiecyclus van VG en juveniel hormoon. De GUA-respons-scores of GRS voor de behandelde bijen werden berekend op basis van de resultaten van de proboscis-extensierespons of PER-assay, zoals hier wordt getoond. De GRS bij de bijen die waren geïnjecteerd met een mengsel van dubbelstrengs RNA van VG en USP was significant hoger dan de GRS bij de GFP-controlebijen, wat aangeeft dat de bijen met de dubbele knockdown gevoeliger waren voor sucrose.

De verschillende letters boven de balken geven significante verschillen tussen de behandelingsgroepen aan. Hier wordt een mogelijk regulerend netwerk tussen vi genin ultras, sferische en juveniel hormoon getoond, onthuld door gelijktijdige onderdrukking van VG- en USP-genen. Hoewel een enkelvoudige knockdown van USP geen verandering in juveniel hormoon induceert, veroorzaakt een dubbele knockdown van VG en USP een grotere toename van juveniel hormoon dan een enkelvoudige knockdown van VG.

Dit suggereert dat vitelli niet alleen de productie van juveniel hormoon remt, maar ook een feedbackrespons van juveniel hormoon op USP-knockdown remt. Bij dubbele knockdowns is de dramatische toename van de productie van juveniel hormoon het gevolg van een verminderde remming door VI-genine veroorzaakt door VG-knockdown en een compensatoire respons op een verminderde transduktie van juveniel hormoon veroorzaakt door USP-knockdown. Een meer gedetailleerde bespreking van dit regulatoire netwerk is te vinden in de bijbehorende protocoltekst.

Door gebruik te maken van een dubbele gene knockdown-benadering hebben we een gedetailleerde relatie onthuld tussen vital genic, ultras, spherical en juveniel hormoon, wat we niet hadden ontdekt door slechts één gen te onderdrukken. Met deze techniek kunnen onderzoekers nu de onderlinge relaties tussen genen binnen regulatoire netwerken verkennen. PR is een standaardmethode die wordt gebruikt om gustatoire perceptie te meten. Bij honingbijen is dit echter zeer gevoelig voor hantering, waardoor men zeer zorgvuldig moet zijn om consistentie te behouden in de omgeving en de hantering van de dieren.

Bovendien is het, indien de assay over meerdere dagen wordt uitgevoerd, raadzaam om een kort tijdschema bij te houden en erop toe te zien dat het weer en de omgeving niet veranderen.