Name: RNAi-gemedieerde Dubbele Gene Knockdown en Smaak Perception Meting in Honingbijen ( Apis mellifera) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-25T08:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Leer RNAi-gemedieerde dubbele genen knockdown en smaakperceptiemeting bij honingbijen (Apis mellifera) met de PER-test. Deze methode onthult genetische netwerken die gedrag reguleren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag Erin Fennern bedanken voor de ondersteuning van experiment. Dit werk werd gefinancierd door de Raad onderzoek van Noorwegen (180504, 185306 en 191699), Pew Charitable Trust, en het National Institute on Aging (NIA P01 AG22500).

Deel 1: RNAi-gemedieerde dubbel gen knockdown 1. dsRNA Synthese <ol><li> Ontwerp primers van dsRNAs targeting vg, usp en een controle-gen dat codeert voor groene fluorescentie eiwit (GFP) die niet in de honingbij genoom: primers werden ontworpen met behulp van online gratis software Primer3 ( <a href="http://frodo.wi.mit.edu/" target="_blank">http://frodo.wi.mit.edu/</a> ) . </li><li> dsRNA synthese voor vg, usp en GFP: gebruik RiboMax T7 RNA productiesysteem van Promega voor in vitro transcriptie. </li><li> dsRNA zuivering <ol><li> Denaturatie en renaturatie: warmte het dsRNA tot 85 ° C gedurende 5 minuten en laat het afkoelen op kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> DNase I behandeling: voeg 1 pl DNase I in elk dsRNA reactie en meng ze door de buizen te vegen. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C. </li><li> Voeg 150 ul nuclease-vrij water en 750 pi Trizol - LS in elke reactie, en ze zachtjes mengen door inverting de buis. Incubeer de monsters gedurende 5 min bij 30 ° C. </li><li> Voeg 200 ul chloroform in elk monster. Meng krachtig gedurende 20 sec. Centrifugeer de monsters gedurende 15 min bij 12.000 xg bij 4 ° C. </li><li> Breng de bovenstaande fase aan elke nieuwe buis en voeg 500 ul isopropylalcohol in elke buis. Meng ze door het buisje. Incubeer gedurende 20 minuten bij -20 ° C werd het mengsel Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 12.000 xg bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof en gebruik 1000 ul 75% ethanol te wassen de pellet. Na het centrifugeren van de buis gedurende 5 min bij 7500 xg bij 4 ° C, de lucht drogen de dsRNA pellet, en gebruik nuclease vrij water tot ontbinding van de pellet. Om de effectiviteit van gen downregulatie waarborgen, dient de dsRNA concentratie ongeveer 9 -10 pg / pl zijn. </li></ol></li></ol> 2. dsRNA Abdominale Injectie Voor dubbel gen neerhalen, zijn er twee strategieën: 1) enkele injectie: mix dsRNA van twee genen en inject het mengsel; 2) twee-daagse injectie: injecteer de eerste dsRNA targeting een gen op de eerste dag, en injecteer het tweede dsRNA in dezelfde bijen op de tweede dag. <ol><li> Chill nieuw opgedoken bijen in een 4 ° C koelkast gedurende 1-2 minuten. Wanneer de bijen worden geïmmobiliseerd, monteren 3-4 bijen in parallel op petrischaaltjes vol met vaste was met insecten pinnen gekruist tussen hun buiken en thoraces. </li><li> Chill de bijen weer in een 4 ° C koelkast. Zorg ervoor dat de bijen zijn volledig immobiel. Het duurt ongeveer 1-2 minuten. De bijen moeten kijken los. Als de bijen worden gekruld of verwrongen, het betekent dat ze zijn te lang, die moet vermeden worden gekoeld. Chilling teveel veroorzaakt hoge mortaliteit, maar volledige immobilisatie is belangrijk als elke beweging neemt de grootte van de wond en mortaliteit. </li><li> Zet een wegwerp 30 G naald (BD) op een Hamilton micro spuit. Neem 3 pi dsRNA en zorg ervoor dat er geen luchtbel in de spuit. De naald wordt ingebracht om een ​​kant van de buik om dama te vermijdenGing interne organen. Druk langzaam op de zuiger om de dsRNA te worden geabsorbeerd. Aangezien dsRNA is zeer viskeus, duurt 2-3 seconden volledig worden verwijderd van de injectiespuit. Na het volledig naar beneden te drukken de zuiger, laat de naald in de wond voor 4-5 sec. Observeren na injecties bijen voor 3-5 sec. Als een hemolymfe druppel lekken uit de wond, gooi de bijen. </li><li> Gebruik verschillende kleuren om hun thoraces overeenkomen met verschillende behandelingen markeren. Op dit punt als de enkele injectie strategie werd gebruikt, de bijen kunnen worden terug in een kolonie geplaatst na 1 uur observatie. Indien de tweedaagse injectiestrategie werd gebruikt, na injectie met de eerste dsRNA, de bijen worden in een cilinder mesh kooi met aan de zijkant voorzien honing geplaatst in een incubator bewaard bij 34 ° C en 80% vochtigheid . </li><li> Op de tweede dag, volgt u de stappen 2.2 en 2.3 aan de bijen relaxen in het gaas kooien en monteer ze op wasplaten. Voer injecties met de tweede dsRNA zoals het is described in stap 2.4. </li><li> Laat de bijen terug bij kamertemperatuur gedurende 1 uur en te introduceren in een kolonie. </li></ol> Opmerking: Knockdown effecten kunnen worden gedetecteerd door kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR) en western blotting. In het algemeen knockdown werkzaamheid varieert en hangt af van vele factoren. In onze studie kan een dubbele gen knockdown gedetecteerd 7 dagen na een enkele injectie en twee dagen injecties. Deel 2: Zuigorganen extensie respons (PER) assay 1. Verzamelen Bijen van de Bijenkorf Op dag 6 na de injecties, verzamel behandelde bijen uit de kolonie zonder gebruik van een roker. Verzamelen bijen in metalen gaas cilinder kooien. Houd 3 bijen in elke kooi. 2. Montage Bijen voor PER Chill de bijen bij 4 ° C tot ze volledig geïmmobiliseerd. Monteer elke bij verticaal in een plastic buis speciaal ontworpen voor PER. Houd de buik in de buis door using twee kleine stukken tape, en houd het hoofd steken van de buis. Zet de buisjes op een rek met twee rijen van kleine plastic kolommen, en wijst elke buis (bee) met een ID-nummer. Zet vervolgens behandeld bijen op de rekken in een incubator (34 ° C en 80% luchtvochtigheid) en bewaar ze in de incubator voor 2 uur. 3. Het voorbereiden van een serie van sucrose Water Solutions Bereid 0%, 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% en 30% sucrose water oplossingen en laadt de oplossingen in spuiten met 15-20 G naalden. 4. PER Assay Druk antenne van de bij een druppel 0% oplossing (water) gevolgd door 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% en 30% sucrose wateroplossingen. Test alle bijen eerst met water en laat minstens twee minuten het interval tussen elke oplossing wordt gebruikt. Daarom hebben we meestal minstens 20 bijen voor elk onderzoek. Als een bij volledig breidt haar slurf, wordt een positieve reactie geteld. 5.Gegevensbeheer Kortom het totale positieve reacties voor elk individu voor gustatory respons score (GRS). Voer een geschikte statistische analyse van de gegevens. Deel 3. Gen knockdown validatie Vetlaag ontleed uit een andere set van 7 dagen oude behandelde bijen. Een standaard TRIZol procedure wordt toegepast voor RNA-extractie, gevolgd door DNase I behandeling 24. Vg en usp genexpressie geanalyseerd door een twee-staps qRT-PCR. Actine gebruikt als een referentie-gen omdat zij stabiele expressie in verschillende weefsels van honingbijen. Gepubliceerd real-time PCR primers voor vg en usp gen worden in dit experiment 24. De gegevens worden geanalyseerd met behulp van Delta-Delta CT methode 25.

<ol><li>Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+Argonaute+proteins+in+small+RNA-directed+RNA+cleavage+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways.</a> Genes Dev. 18, 1655-1666 (2004).</li>
<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+RNAi+for+the+masses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Mammalian RNAi for the masses.</a> Trends Genet. 19, 9-12 (2003).</li>
<li>Huvenne, H., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+dsRNA+uptake+in+insects+and+potential+of+RNAi+for+pest+control%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review.</a> J. Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).</li>
<li>Beye, M., Hartel, S., Hagen, A., Hasselmann, M., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+developmental+gene+silencing+in+the+honey+bee+using+a+homeobox+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific developmental gene silencing in the honey bee using a homeobox motif.</a> Insect Mol. Biol. 11, 527-532 (2002).</li>
<li>Amdam, G. V., Simoes, Z. L., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+vitellogenin+gene+function+in+adult+honeybees+by+intra-abdominal+injection+of+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA.</a> BMC Biotechnol. 3, 1(2003).</li>
<li>Patel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+a+queen%3A+TOR+pathway+governs+diphenic+caste+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The making of a queen: TOR pathway governs diphenic caste development.</a> PLoS ONE. 6, e509(2007).</li>
<li>Amdam, G. V., Norberg, K., Page, R. E., Erber, J., Scheiner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+vitellogenin+gene+activity+increases+the+gustatory+responsiveness+of+honey+bee+workers+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Downregulation of vitellogenin gene activity increases the gustatory responsiveness of honey bee workers (Apis mellifera).</a> Behav. Brain Res. 169, 201-205 (2006).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+honey+bee+IRS+gene+biases+behavior+toward+food+rich+in+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of honey bee IRS gene biases behavior toward food rich in protein.</a> PLoS Genet. 6, e1000896(2010).</li>
<li>Wang, Y., Brent, C. S., Fennern, E., Amdam, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+perception+and+fat+body+energy+metabolism+are+jointly+affected+by+vitellogenin+and+juvenile+hormone+in+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Gustatory perception and fat body energy metabolism are jointly affected by vitellogenin and juvenile hormone in honey bees.</a> PLoS Genet. 8, e1002779(2012).</li>
<li>Luna, B. M., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+dsRNA+into+Female+A.+aegypti+Mosquitos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos.</a> J. Vis. Exp. (5), e215(2007).</li>
<li>Mussig, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+disruption+of+the+NMDA+receptor+subunit+NR1+in+the+honeybee+brain+selectively+impairs+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation.</a> J. Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).</li>
<li>Stove, V., Smits, K., Naessens, E., Plum, J., Verhasselt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+gene+knock-down+by+a+single+lentiviral+vector+expressing+an+array+of+short+hairpin+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Electron+J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiple gene knock-down by a single lentiviral vector expressing an array of short hairpin RNAs.</a> Electron J. Biotechnol. 19, 13(2006).</li>
<li>Sun, D., Melegari, M., Sridhar, S., Rogler, C. E., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-miRNA+hairpin+method+that+improves+gene+knockdown+efficiency+and+provides+linked+multi-gene+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech%22%5BJournal%5D)">Multi-miRNA hairpin method that improves gene knockdown efficiency and provides linked multi-gene knockdown.</a> Biotech. 41, 59-63 (2006).</li>
<li>Ament, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+ultraspiracle+influences+honey+bee+social+behavior+and+behavior-related+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The transcription factor ultraspiracle influences honey bee social behavior and behavior-related gene expression.</a> PLoS Genet. 8, e1002596(2012).</li>
<li>Amdam, G. V., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hive+bee+to+forager+transition+in+honeybee+colonies%3A+the+double+repressor+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">The hive bee to forager transition in honeybee colonies: the double repressor hypothesis.</a> J. Theor. Biol. 223, 451-464 (2003).</li>
<li>Pankiw, T., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+thresholds+to+sucrose+predict+foraging+division+of+labor+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Ecol.+Sociobiol%22%5BJournal%5D)">Response thresholds to sucrose predict foraging division of labor in honeybees.</a> Behav. Ecol. Sociobiol. 47, 265-267 (2000).</li>
<li>Pankiw, T., Nelson, M., Page, R. E., Fondrk, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+communal+crop%3A+modulation+of+sucrose+response+thresholds+of+pre-foraging+honey+bees+with+incoming+nectar+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Ecol.+Sociobiol%22%5BJournal%5D)">The communal crop: modulation of sucrose response thresholds of pre-foraging honey bees with incoming nectar quality.</a> Behav. Ecol. Sociobiol. 55, 286-292 (2004).</li>
<li>Jaycox, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+Changes+in+Worker+Honey+Bees+%28Apis+mellifera+L.%29+after+Injection+with+Synthetic+Juvenile+Hormone+%28Hymenoptera%3A+Apidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Kan.+Entomol.+Soc%22%5BJournal%5D)">Behavioral Changes in Worker Honey Bees (Apis mellifera L.) after Injection with Synthetic Juvenile Hormone (Hymenoptera: Apidae).</a> J. Kan. Entomol. Soc. 49, 165-170 (1976).</li>
<li>Jaycox, E. R., Skowronek, W., Guynn, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+changes+in+worker+honey+bees+%28Apis+mellifera%29+induced+by+injections+of+a+juvenile+hormone+mimic%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Entomol.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Behavioral changes in worker honey bees (Apis mellifera) induced by injections of a juvenile hormone mimic.</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 67, 529-534 (1974).</li>
<li>Scheiner, R., Pluckhahn, S., Oney, B., Blenau, W., Erber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+pharmacology+of+octopamine%2C+tyramine+and+dopamine+in+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioural pharmacology of octopamine, tyramine and dopamine in honey bees.</a> Behav. Brain Res. 136, 545-553 (2002).</li>
<li>Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+juvenile+hormone+analogue+on+honey+bee+foraging+behaviour+and+alarm+pheromone+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of a juvenile hormone analogue on honey bee foraging behaviour and alarm pheromone production.</a> J. Insect. Physiol. , 277-282 (1985).</li>
<li>Giurfa, M., Malun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+mechanosensory+conditioning+of+the+proboscis+extension+reflex+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Lear+Memory%22%5BJournal%5D)">Associative mechanosensory conditioning of the proboscis extension reflex in honeybees.</a> Lear Memory. 11, 294-302 (2004).</li>
<li>Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+genotype%2C+foraging+role%2C+and+sucrose+responsiveness+on+the+tactile+learning+performance+of+honey+bees+%28Apis+mellifera+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">The effects of genotype, foraging role, and sucrose responsiveness on the tactile learning performance of honey bees (Apis mellifera L.).</a> Neurobiol. Learn Mem. 76, 138-150 (2001).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDK1+and+HR46+gene+homologs+tie+social+behavior+to+ovary+signals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">PDK1 and HR46 gene homologs tie social behavior to ovary signals.</a> PLoS ONE. 4, e4899(2009).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+behaviorally+associated+gene+networks+in+worker+honey+bee+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honey bee ovaries.</a> J. Exp. Biology. 215, 124-134 (2012).</li>
<li>Amdam, G. V., Csondes, A., Fondrk, M. K., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+social+behaviour+derived+from+maternal+reproductive+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complex social behaviour derived from maternal reproductive traits.</a> Nature. 439, 76-78 (2006).</li>
<li>Amdam, G. V., Ihle, K. E., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmdam%2C+GV+%22Hormones%2C+Brain+and+Behavio%22">Hormones, Brain and Behavio</a>. Pfaff, D., et al. , Elsevier Academic Press. (2009).</li>
<li>Guidugli, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitellogenin+regulates+hormonal+dynamics+in+the+worker+caste+of+a+eusocial+insect%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect.</a> FEBS Letters. 579, 4961-4965 (2005).</li>
<li>Corona, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((juvenile+hormone%2C+insulin+signaling%2C+and+queen+honey+bee+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">juvenile hormone, insulin signaling, and queen honey bee longevity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7128-7133 (2007).</li>
<li>Sinha, S., Ling, X., Whitfield, C. W., Zhai, C., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+scan+for+cis-regulatory+DNA+motifs+associated+with+social+behavior+in+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genome scan for cis-regulatory DNA motifs associated with social behavior in honey bees.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 16352-16357 (2006).</li>
<li>Amdam, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+control+of+the+yolk+precursor+vitellogenin+regulates+immune+function+and+longevity+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Hormonal control of the yolk precursor vitellogenin regulates immune function and longevity in honeybees.</a> Exp. Gerontol. 39, 767-773 (2004).</li>
<li>Wang, Q. C., Nie, Q. H., Feng, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%3A+antiviral+weapon+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">RNA interference: antiviral weapon and beyond.</a> World J. Gastroenterol. 9, 1657-1661 (2003).</li>
<li>Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Argonaute+family%3A+tentacles+that+reach+into+RNAi%2C+developmental+control%2C+stem+cell+maintenance%2C+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis.</a> Genes Dev. 16, 2733-2742 (2002).</li>
<li>Hunt, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+genomics+of+honeybee+foraging+and+nest+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Behavioral genomics of honeybee foraging and nest defense.</a> Naturwissenschaften. 94, 247-267 (2007).</li>
<li>Pankiw, T., Waddington, K. D., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+sucrose+response+thresholds+in+honey+bees+%28Apis+mellifera+L.%29%3A+influence+of+genotype%2C+feeding%2C+and+foraging+experience%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Modulation of sucrose response thresholds in honey bees (Apis mellifera L.): influence of genotype, feeding, and foraging experience.</a> J. Comp. Physiol. A. 187, 293-301 (2001).</li>
<li>Pankiw, T., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pheromones%2C+hormones%2C+and+handling+on+sucrose+response+thresholds+of+honey+bees+%28Apis+mellifera+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A.+Neuroethol.+Sens.+Neural.+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.).</a> J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 189, 675-684 (2003).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Onze studie is de eerste poging om tegelijk neerhalen twee genen bij volwassen insecten. Onze resultaten tonen dat beide strategieën dsRNA injecties (een injectie en twee dagen injectie) zijn effectief voor een dubbele genonderdrukking en gelijktijdige gene silencing van vg en usp getest worden 6 dagen na het dsRNA injecties in bijen 8,9. Echter, varieert gen knockdown werkzaamheid bij verschillende insectensoorten afhankelijk transcript niveau van target-gen, eiwit omzet tarieven en dsRNA o...

RNA interferentie (RNAi) is RNA gebaseerde post-transcriptional gene silencing, die optreedt in een grote verscheidenheid van eukaryote organismen. Het proces van RNAi wordt veroorzaakt door endogene of exogene dubbelstrengs RNA (dsRNA) precursors. De dsRNA activeert de ribonuclease eiwit Dicer die bindt en splitst de dsRNA om kleine fragmenten (20-25 bp). Dan is de kleine fragmenten van de dsRNA gids een erkenning en splitsing van complementaire mRNA door argonaute eiwitten, een katalytisch bestanddeel van RNA-induced silencing complex (RISC) 1. In zoogdieren, dsRNA langer dan 30 nt, activeert een antivirale respons (interferon respons, IFN) wat leidt tot niet-specifieke afbraak van RNA transcripten 2. Echter, lange dsRNA bewezen effectief en specifiek in insecten aangezien er een tekort aan dit IFN 3. Lange dsRNA&#39;s zijn gebruikt voor downregulatie van doelgenen in verschillende insectensoorten. Honingbijen zijn een van de pioneer insect organismen waarin functies van veel belangrijke genen in de ontwikkeling en het gedrag zijn geopenbaard door dsRNA 4,5. Verschillende dsRNA levering methoden zijn uitgevoerd in honingbijen: dsRNA voeden efficiënt downregulates doelwit genexpressie in honingbij larven 6, terwijl dsRNA injectie is een effectieve aanpak voor gen knock-down in honingbij embryo&#39;s 4 en volwassen bijen 7,8. Gen knock-down effecten vertoond door het toepassen van dsRNA om insecten zijn van voorbijgaande aard en gelokaliseerd. Studies hebben aangetoond dat zowel abdominale dsRNA injecties en thoracale dsRNA injectie effectief te onderdrukken doelwitgenexpressie in buikvet lichaamscellen insecten 9,10. DsRNA wordt geïnjecteerd in de buik en borstkas holten en vet lichaamscellen in staat zijn tot het nemen van de dsRNA uit de hemolymfe waar de cellen worden gebaad 10. Echter, kunnen genen in andere organen zoals eierstokken en de hersenen, niet gericht door eenabdominale of thoracale injecties. Om de genen in honingbij hersenen richten, heeft hersenen injectie van dsRNA ook uitgevoerd, die effectief beïnvloedt doelwit genexpressie in lokale hersengebieden 11. Hier, we documenteren alleen abdominale dsRNA injectie die wordt vaker gebruikt bij volwassen bijen. RNAi is voornamelijk gebruikt voor richten op een enkel gen en is een krachtig middel om de genfunctie te onthullen. Echter een gen niet geïsoleerd van anderen, het is in complexe regulerende netwerken. Een sleutel tot een biologisch proces te begrijpen is te ontleden hoe de genen met elkaar, die gelijktijdig manipulaties van meerdere genen in plaats van een enkel gen knockdown vereist. In zoogdiercellijnen, hebben wetenschappers in gelijktijdig remmen van twee of drie genen opgevolgd door gebruik afgiftesystemen 12 of multi-microRNA (miRNA) haarspeld designs 13. Maar bij insecten, meerdere genen knockdowns zijn nog niet getest. Hier hebben we present verschillende injectie strategieën die een dubbele gen knockdown kan bereiken. We richten twee genen: vitellogenin (vg) die een dooier eiwit precursor codeert en Ultraspiracle (USP) dat een vermeende receptor voor juveniel hormoon (JH) codeert en kan dienen als een transcriptiefactor bemiddelende reacties op JH 14 in honingbijen. Vg en JH reguleren elkaar in een feedback loop 15 en zijn betrokken bij honingbij gedragregulatie 9. Met behulp van de dubbele-gen knock-down, we verstoren zowel Vg en JH paden en ontdekken hoe zij gezamenlijk invloed honingbij gedrag en fysiologie, en hoe vg, usp en JH interageren 9. Smaak perceptie is een gedrags voorspeller voor honingbij sociaal gedrag 16. In termen van gedragsontwikkeling, nest bijen met hoge smaak perceptie gedragsgestoorde volwassen snel, en meestal voedergewassen vroeg in het leven en liever pollen 16,17 verzamelen. Hoewel de regelgeving mechanisms onderliggende smaak perceptie nog onduidelijk, studies hebben aangetoond dat smaak perceptie verbonden inwendige energie metabolisme 9, hormonale secretie 18,19 en biogene amine paden 20. Zowel Vg en JH zijn belangrijke hormonale regelaars moduleren smaak perceptie 7,21. In het laboratorium kan een variatie van smaak perceptie bij bijen worden beoordeeld door het testen van de proboscis extensie respons (PER) verschillende sacharoseoplossingen. Elke bij wordt getest door het aanraken haar beide antennes met een druppel water, gevolgd door een oplopende concentratie reeks van 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% sucrose. Een positief antwoord wordt genoteerd als een honingbij volledig breidt haar slurf als een druppel water of sucrose wordt geraakt aan elke antenne. Gebaseerd op het aantal positieve reacties op de oplossingen kan de smaak perceptie van elke afzonderlijke bepaald 16. Echter, de toepassing van de PER niet beperkt tot het meten gustatory perceptie. De PER is ook een effectieve methode om de metabole toestand van de bijen, zoals verzadiging vs honger te testen. De bijen met een grotere reacties op sucrose zijn hongeriger in het algemeen (Wang en Amdam, ongepubliceerde gegevens). Voorts kan de PER paradigma worden gebruikt associatief leren en geheugen bij bijen. In dit geval zal de bijen worden opgeleid om de aanwezigheid van sucrose water associëren met een geur. Wanneer de bijen te leren van de vereniging, kan alleen de aanwezigheid van de geur een positieve slurf reactie op te roepen zonder hen te belonen met de sucrose 22,23. In deze video laten we zien hoe PER naar smaak perceptie die is verbonden met vg en usp dubbele knock-down in een eerdere studie 9 evaluatie uit te voeren.

<table><tbody><tr><td>GE Healthcare PCR beads in 96 well plate</td><td>GE Healthcare</td><td>27-9557-01</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>RiboMax T7 RNA production system</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td></td></tr><tr><td>Trizol LS</td><td>Invitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>isopropyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton micro syringe</td><td>Hamilton</td><td>80301</td><td></td></tr><tr><td>30G BD disposable needles</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Syringe</td><td>BD Biosciences</td><td>30960</td><td></td></tr><tr><td>Stereo dissection microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>S6D</td><td></td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-25</td><td></td></tr><tr><td>Wax plate</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rnai-gemedieerde dubbele gene knockdown en smaak perception meting in honingbijen (<em&gt; apis mellifera</em&gt;)

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

Deze video demonstreert nieuwe technieken van RNA interferentie (RNAi), die twee genen tegelijk downregulate in honing bijen met dubbelstrengs RNA (dsRNA) injecties. Het bevat ook een protocol van proboscis extensie respons (PER) test voor het meten van smaak waarneming. RNAi-gemedieerde knockdown gen is een effectieve techniek neerwaarts reguleren van expressie van het doelwitgen. Deze techniek wordt meestal gebruikt voor gen manipulatie, maar heeft beperkingen op interacties en het totale effect tussen genen detecteren. In het eerste deel van deze video, presenteren we twee strategieën tegelijk neerhalen twee genen (de zogenaamde double-gen knockdown). We tonen beide strategieën zijn in staat om twee genen, vitellogenine (vg) en Ultraspiracle (usp), die in een regelgevend feedback loop effectief te onderdrukken. Deze dubbele gen knockdown benadering kan worden gebruikt om verbanden tussen genen ontleden en kunnen gemakkelijk worden toegepastverschillende insectensoorten. Het tweede deel van deze video is een demonstratie van proboscis extensie respons (PER) test bij honingbijen na de behandeling van dubbele gen knockdown. De PER test is een standaard test voor het meten van smaak perceptie bij honingbijen, dat is een belangrijke voorspeller voor hoe snel een honingbij&#39;s gedrags rijping is. Meer smaak perceptie van nest bijen geeft verhoogd gedragsontwikkeling die vaak wordt geassocieerd met een eerdere leeftijd bij aanvang van foerageer-en foerageren specialisatie in pollen. Bovendien kan PER assay toegepast om metabolische toestanden van verzadiging of honger identificeren honingbijen. Tenslotte PER test gecombineerd met pairing verschillende geur stimuli voor het conditioneren van de bijen wordt ook veel gebruikt voor leren en geheugen studies bij honingbijen.

Zowel de single-injectie en twee-daagse-injectie strategieën aanzienlijk verminderd vg (One-way ANOVA, p &lt;0,001) (figuur 2A) en usp (One-way ANOVA, p &lt;0,001) (figuur 2B) transcriptniveaus in honing bijen zes dagen na de dsRNA werd geïnjecteerd. De onderdrukking van usp transcript met de enkele injectie dsRNA mengsel en de twee-daagse injectie vg eerste en tweede usp (vg / usp) was significant lager dan de tweedaagse injectie <e...

In dit protocol beschrijven we twee strategieën die tegelijkertijd in honingbijen te onderdrukken twee genen (dubbel gen knockdown). Dan presenteren we hoe de proboscis extensie respons (PER) test om het effect van de dubbele gen knockdown op honingbij smaak perceptie bestuderen gebruiken.

RNAi-gemedieerde Dubbele Gene Knockdown en Smaak Perception Meting in Honingbijen (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

Dit videoprotocol demonstreert nieuwe technieken om gelijktijdig twee genen uit te schakelen (knockdown) bij volwassen honingbijen en vervolgens een proboscis-extensierespons- of PER-assay uit te voeren om het effect van deze dubbele gen-knockdown op de smaakperceptie van honingbijen te meten. Dit wordt bereikt door eerst dubbelstrengs RNA's te synthetiseren die gericht zijn op de genen voor drie eiwitten, vitelli, genin, ultras, spherical, en het groen fluorescent eiwit.Aangezien het gen dat codeert voor GFP niet in het genoom van de honingbij voorkomt, dient het dubbelstrengs RNA van GFP als negatieve controle. De tweede stap is het injecteren van dubbelstrengs RNA in honingbijen met behulp van vier behandelingsstrategieën: injectie met enkel dubbelstrengs RNA van GFP, een enkele injectie met een mengsel van dubbelstrengs RNA van VG en USP, injectie met dubbelstrengs RNA van vg op de eerste dag gevolgd door injectie met dubbelstrengs RNA van USP op de tweede dag, en injectie met dubbelstrengs RNA van USP op de eerste dag gevolgd door injectie met dubbelstrengs RNA van VG op de tweede dag. Na de injecties werden de bijen gemarkeerd met kleurgecodeerde verfstippen die overeenkomen

rnai-mediated-double-gene-knockdown-gustatory-perception-measurement

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We laten zien hoe u de RNAi voeden techniek te gebruiken om knock down doelwitgenen en score lichaamsgrootte fenotype...

Met behulp van RNA-gemedieerde interferentie voerstrategie om te screenen op genen die betrokken zijn Lichaam Grootte verordening in de nematode<em&gt; C. elegans</em

RNA-interferentie (RNAi) gebaseerde gen knockdown technieken vormen de kern van Tribolium onderzoek. Hier geven we een overzicht van onze larvale RNAi techniek Tribolium castaneum. Larvale RNAi is een eenvoudige, maar krachtige techniek die een snelle toegang tot verlies-van-functie fenotypes biedt, waardoor onderzoekers om de functie van genen te bestuderen in verschillende contexten.

Larvale RNA interferentie in de Rode Bloem Kever, Tribolium castaneum

Met twee methodologie om genexpressie in grote smaak aanhangsels van Aedes aegypti, hebben we de set genen vermoedelijk onderliggende neuronale reacties op bitter en afstotende verbindingen geïdentificeerd, zoals bepaald door elektrofysiologische onderzoeken.

Fysiologische Recordings en RNA Sequencing van de Smaak Appendages van de Gele-koorts Mosquito Aedes aegypti

Hier beschrijven we een werkwijze voor het remmen van genfunctie in ziektedragers muggen door het gebruik van chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes die worden opgenomen door larven.

Chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes gemedieerde gen silencing in Disease Vector muggenlarven

Hier beschrijven wij onze gedetailleerde protocol voor de voorbereiding van de single-cohort bijenvolken - een nuttig instrument voor het analyseren van de role-geassocieerde werknemer fysiologie. We beschrijven ook gedetailleerde protocollen voor de behandeling van werknemers met juveniele hormoon en ecdyson de betrokkenheid van deze hormonen in de regulatie van de werknemer gedrag en / of fysiologie te evalueren.

Voorbereiding van de Single-cohort Colonies and Hormoon Behandeling van werkbijen Analyseer Physiology geassocieerd met Rol en / of endocriene systeem

Hier presenteren we protocollen voor het kweken van een intermediair-kiem kever, Dermestes maculatus (D. maculatus) in het lab. We hebben ook protocollen voor de embryonale en ouderlijke RNAi en methodes te delen voor het analyseren van embryonale fenotypes voor bestudering van genfunctie in deze soort.

Grootbrengen en Double-stranded RNA-gemedieerde gen knock-down in het verbergen Kever, Dermestes maculatus

Dit artikel demonstreert nieuwe technieken ontwikkeld voor mondelinge levering van double-stranded RNA (dsRNA) via de vaatbundels weefsels van planten voor RNA-interferentie (RNAi) in het floëem sap voederen van insecten.

Double-stranded RNA orale afleveringsmethoden voor het opwekken van RNA-interferentie in het floëem en Hemipteran insecten Plant-sap-voeding

Hier gepresenteerd is een protocol om de CRISPR-Cas9 systeem te gebruiken voor het verminderen van de productie van een eiwit in de volwassen honingbij hersenen om antilichaam specificiteit te testen.

Anti-RDL en Anti-mGlutR1 Receptoren Antibody Testen in Honingbij Hersensecties met behulp van CRISPR-Cas9

RNA interferentie is een breed toepasbare, krachtige techniek voor het manipuleren van genexpressie in specifieke ontwikkelingsstadia. Hier beschrijven we de noodzakelijke stappen voor de implementatie van deze techniek in de aquatische duikkever Thermonectus marmoratus, van de verwerving van gensequenties tot het knockdownen van genen die de structuur of het gedrag beïnvloeden.

RNA Interferentie in aquatische kevers als een krachtig instrument voor het manipuleren van genexpressie op specifieke ontwikkelingstijdpunten

Hier beschrijven we methoden voor efficiënte pop- en volwassen injecties in Nasonia vitripennis als toegankelijke alternatieven voor embryomicro-injectie, waardoor functionele analyse van genen van belang mogelijk is met behulp van RNA-silencing via RNA-interferentie (RNAi) of gen knock-out via CRISPR / Cas9 genoombewerking.

Pupal en volwassen injecties voor RNAi en CRISPR Gen editing in Nasonia vitripennis

Dit protocol is ontwikkeld om het begrip te vergroten van hoe agrochemicaliën de reproductie van honingbijen(Apis mellifera)beïnvloeden door methoden vast te stellen om honingbijenkoninginnen en hun werkverzorgers bloot te stellen aan agrochemicaliën in een gecontroleerde, laboratoriumomgeving en zorgvuldig hun relevante reacties te volgen.

Beoordeling van agrochemisch risico voor gepaarde honingbijenkoninginnen

Leer RNAi-gemedieerde dubbele genen knockdown en smaakperceptiemeting bij honingbijen (Apis mellifera) met de PER-test. Deze methode onthult genetische netwerken die gedrag reguleren.

RNAi-gemedieerde Dubbele Gene Knockdown en Smaak Perception Meting in Honingbijen (

Meer video's verkennen