Name: Prostaglandine-extractie en analyse in Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Leer prostaglandine-extractie en analyse in Caenorhabditis elegans met behulp van LC-MS/MS. Deze geoptimaliseerde methode biedt hogere gevoeligheid en specificiteit voor lipidenonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de UAB Gerichte Metabolomics en Proteomics Laboratorium, dat is mede ondersteund door de UAB Skin Disease Research Center (P30 AR050948 naar C. Elmets), de UAB-UCSD O&#39;Brien Acute Kidney Injury Center (P30 DK079337 naar A. Agarwal ) en de UAB Lung Health Center (R01 HL114439, R01 HL110950 tot JE Blalock). Steun voor de massaspectrometer was van een NCRR Shared Bezetting subsidie ​​(S10 RR19261 naar S. Barnes). We danken ook Ray Moore voor technische ondersteuning. C. elegans stammen werden verstrekt door de Caenorhabditis Genetics Center, dat wordt gefinancierd door de NIH. Dit werk werd ondersteund door NIH (R01GM085105 naar MAM, waaronder een ARRA administratief supplement).

Het protocol zoals hieronder beschreven is verdeeld in drie secties: worm cultuur, prostaglandine extractie, en prostaglandine-analyse. Zoals gezegd kunnen meerdere punten als monsters tijdelijk bij -80 ° C of -20 ° C worden opgeslagen 1. Worm Cultuur We raden ongeveer 6 g gemengde podium wormen voor uitgebreide LC-MS/MS. Dit zou voldoende materiaal te verschaffen voor het detecteren van ten minste zes afzonderlijke injecties. Voor kwantificering van bekende PG door MRM in een enkele injectie of twee, 1-2 g voldoende. Analyse van de fragmenten van gesynchroniseerde kweken uit een bepaalde fase is mogelijk. Maximaal 4 verschillende stammen tegelijkertijd worden gekweekt. Bijvoorbeeld, een wildtype controle en drie mutante stammen. <ol><li> Bereid 65 X-large (16 cm) NGM platen en geconcentreerde bacteriën voor extra voeding. Gebruik NA22 bacteriën te zaaien. Om geconcentreerde bacteriën zorgen voor extra voeding, grow minstens vier liter NA22 in LB medium voor 16-24 uur. Spin down, verwijder het supernatant en resuspendeer bacteriën in 100 ml M9 buffer. 200 tot 400 ml van de geconcentreerde bacteriële oplossing kan nodig zijn voor elke worm stam. Bewaren bij 4 ° C. </li><li> Start worm culturen op 5 X-grote platen. Groeien wormen voor ongeveer 3 tot 4 generaties totdat platen zijn vol zwangere volwassenen. Geconcentreerde bacteriën moet worden toegevoegd aan platen aan honger te voorkomen, indien nodig (~ 1 ml / plaat en laat volledig drogen voordat u het deksel). </li><li> Wassen gravid hermafrodieten uit platen met M9 buffer en het verzamelen van de wormen in een ml conische polypropyleenbuis 50. </li><li> Laat gravid hermafrodieten om zich te vestigen op de bodem (meestal ongeveer 3-5 minuten). Verwijder supernatant, waaronder bacteriën, eieren en larvale stadium wormen. Opnieuw in suspensie in 15 ml M9 buffer en meng. </li><li> De overdracht 200 ul worm schorsing aan elk van de 60 geplaatste NGM platen. Dispergeren wormen over de borden. Houd worm oplossing gemengdgoed totdat alle platen geënt zodat deze ongeveer gelijk aantal wormen ontvangen. </li><li> Aanvullen met geconcentreerde bacteriën als nodig (~ 1 ml/plate/12 tot 24 uur periode) aan honger te voorkomen. Laat platen aan de lucht drogen voordat u deksels. Groei wormen 2-4 generaties afhankelijk van de oorspronkelijke aantal geplaatste wormen of tot platen vol zwangere volwassenen. </li><li> Oogst worm platen een stam tegelijk. Wassen wormen uit de platen met M9 buffer en in een 50 ml polypropyleen buizen (bv. 6 tubes). Gebruik M9 buffer om een ​​plaat te wassen, vervolgens over de worm gevulde buffer naar de volgende plaat. Na het wassen van een nummer (bijvoorbeeld. 10 e) van platen, de overdracht van de worm gevulde buffer om de 50 ml buis. De buis wordt tot de top met M9 buffer. Herhaal de was voor de rest van de platen. </li><li> Als de zwangere volwassenen naar de bodem in 5-6 min., de bovenstaande vloeistof (~ 35 ml) en consolideren in een of twee buizen. Vul de buizen om met fr 50 mlesh M9 buffer, laat staan ​​voor 3-5 minuten, en verwijder supernatant verlaten zwangere volwassenen. 3 herhalen of totdat de supernatant transparant. </li><li> Met een grote diameter Pasteur pipet zoveel wormen mogelijk twee 15 ml polypropyleen conische buizen. Spin down op 1000 RCF (~ 3500 rpm in CentraSL2) gedurende 5 min in een klinische centrifuge. Verwijder supernatant en herhaal totdat alle wormen worden overgedragen en pellets in dezelfde buis. Verwijder zoveel mogelijk supernatant en bewaar wormen bij -80 ° C. Herhaal dit voor alle stammen. </li></ol> 2. Prostaglandine Extraction De reagentia die nodig zijn voor de extractie worden hieronder weergegeven. De methode is aangepast van die van Golovko en Murphy 17 en omvat acetonextractie gevolgd door vloeistof-vloeistof zuivering, die LC-MS/MS gevoeligheid verhoogt. Een Bullet Blender homogenisator 5 wordt gebruikt in de werkwijze, maar soortgelijke resultaten kunnen worden verkregen met een Dounce homogenisator. Gebutyleerde hydroxytoluene (BHT) en verdamping onder stikstof (N2) gas gebruikt om oxidatie te voorkomen. Alle glaswerk moet worden siliconized (Sigmacote) naar lipidebindende verminderen. Extractie met organische oplosmiddelen moet worden uitgevoerd in een chemische kap. <ol><li> Weeg een ml polypropyleen conische buis 50. Breng circa 6,0 g bevroren wormen uit de 15 ml conische buis bewaard bij -80 ° C door te snijden door de buis met een heet scheermesje in de buurt van de 6,5 ml markering. Een methanol-gereinigde spatel kan worden gebruikt om de bevroren pellet worm verwijderen van de bodem van de buis. Door doorsnijden van de pellet aan het onderste gedeelte, minder dichte larven wormen en resterende bacteriën ophalen uit de top van de pellet wordt achtergelaten. </li><li> Breng de bevroren wormen de vooraf gewogen 50 ml conische buis. Indien meerdere monsters worden verwerkt, maken gebruik van dezelfde hoeveelheid (6,0 g) van weefsel voor vergelijkende studies. Als de wormen dooi tot een pasta, wormen toevoegen of verwijderen met de spatel om de gewenste massa te verkrijgen. Optioneel: add 1,00 ng PGF 2α-d4 norm als een interne controle voor de extractie-efficiëntie. </li><li> Voeg 12 ml ijskoude 02:01 aceton / zoutoplossing met 0.005% BHT om de worm schorsing en meng goed door vortexen. Verdeel 1,5 ml van de worm suspensie aan elk van twaalf 5 ml zichzelf staande kunststof buizen voor gebruik in de Bullet Blender. </li><li> Voeg 0,7-0,8 ml van 0,5 mm diameter Ceria gestabiliseerd zirkoniumoxide kralen aan elke buis 5 ml. Sluit doppen stevig vast en laad de 12 buizen in de Bullet Blender 5 homogenisator. Voer de blender gedurende 3 min op snelheid 8-9 en plaats de buizen op ijs. Zorg ervoor dat de doppen zeer goed sluiten of de inhoud kan worden gemorst. Controleer 10 ul van homogenaat van de ene buis op een dia met behulp van een stereoscoop. Er moet heel weinig intacte wormen overgebleven. Herhaal dezelfde snelheid nog een minuut, indien nodig. </li><li> De homogenaten gelijkmatig over te brengen naar vier 10 ml conische glazen buizen met behulp van een &quot;pasteurpipet 9. Vermijd het overbrengen van kralen. Was de kralen uit drie buizen Sequentially met 1 ml 1:2 aceton / zoutoplossing met BHT. Herhaal dit voor de andere buizen totdat alle korrels worden gewassen. Draagt ​​de resterende oplossing (~ 4 ml) tot de 10 ml glazen buizen en leg ze op ijs. </li><li> Centrifugeer de 10 ml glazen buizen bij 4 C in een klinische centrifuge bij ongeveer 1000 g gedurende 10 min °. Breng de bovenstaande van elke buis een schone glazen 10 ml conische buis. </li><li> In een chemische kap, een gelijk volume hexaan aan elke 10 ml glazen buis. Bijvoorbeeld, voeg 3,5 ml hexaan en 3,5 ml aceton / zoutoplossing. Vortex bij maximale snelheid 30 sec. </li><li> Centrifugeer de 10 ml glazen buizen bij 4 C in een klinische centrifuge bij ongeveer 1000 g gedurende 10 min °. Gooi de bovenste fase die hexaan en neutraal geladen lipiden. </li><li> Zuur de onderste fase tot pH 3,5 met 2 M mierenzuur (ongeveer 100-150 ul). Test pH met behulp van pH-strips. </li><li> Voeg een gelijk volume chloroform aan elke buis. Vortex bij maximale snelheid gedurende 30 seconden en centrifugeer de buizen bij 4 ° C ina klinische centrifuge bij ongeveer 1000 g gedurende 10 minuten. </li><li> Verwijder de bovenste waterige fase. Steek een pipet tip via alle resterende melkachtige interfase naar de lagere chloroform fase, het vermijden van de interfase. Verzamel de onderste fase van elk van de 4 buizen naar een schone 15 ml conische glazen buis. Incubeer bij -20 ° C gedurende ten minste 24 uur. Op dit punt, kan het extract worden bij -20 ° C gedurende twee weken opgeslagen. </li><li> Neem het extract uit de vriezer en gooi de resterende melkachtige waterige toplaag, indien aanwezig. Breng de chloroformfase een label teflon-bekleed ½-Dram glazen flesje met een nieuwe Pasteur pipet. In een chemische kap, verdampen de chloroform oplosbare fractie tot droog onder een zachte stroom van N 2 gas. Het gedroogde extract kan bij -20 ° C gedurende maximaal 2 weken bewaard. Een algemeen schema voor PG extractie en analyse wordt getoond in figuur 1. </li></ol> 3. Prostaglandine Analyse <ol><li> Bereid voorraadoplossingen van individuele referentie prostaglandinen, zoals PGF 2α of PGF 2 α-d4 (1 ug / ml) in methanol en verdun met methanol: water (08:02 v / v) om een werkoplossing te verkrijgen. Bereid een reeks verdunningen (100, 10, 1, 0,1, 0,01 ng / ml) tot een standaardcurve te genereren. </li><li> Voeg 200 ul methanol: water (08:02 v / v) op de gedroogde C. elegans vetextract (s) en meng. Als er minder dan 6 gram worm weefsel werd geëxtraheerd, moet de droge stof worden gesuspendeerd in minder volume methanol: water oplossing. </li><li> Bereid de mobiele fase, bestaande uit 0,1% mierenzuur in water [A] en acetonitril dat 0,1% mierenzuur [B]. </li><li> Stel de autosampler bij 4 ° C en plaats het monster flacons in een 70-count 1,5 ml flacon rack. </li><li> Evenwicht van de Synergy hydro-RP C18 kolom met 0,1% mierenzuur bij een debiet van 0,2 ml / min gedurende 5 minuten. </li><li> Breng het monster (20-50 pi) in de kolom. Voer gradiënteluering starting met 10% B en gaan tot 80% B 0-11 min, 80-100% B 11-14 min, en keert terug naar 10% B in 16 min.. De totale looptijd is 20 minuten. De retentietijden van 13 authentieke standaarden worden in tabel 1 voor referentie 3. </li><li> Steek de kolom effluent in de massa spectrometer met een ESI-interface die in de negatieve ion modus. Stikstof wordt gebruikt als vernevelaar en gordijnen gas (CUR = 10). De botsing gas, botsingsenergie, en de temperatuur worden ingesteld op 10, -35 eV en 600 ° C, respectievelijk. Ontclustering potentiële (DP), botsingsenergie (CE) en mobiele exitpotentieel (CXP) worden ingesteld op -90, -35 en -10, respectievelijk. </li><li> Voor onderzoek scans (Q1 scans), gebruikt negatieve ion modus het massabereik van m / z 315-360 voor twee PG (figuur 2). Het bereik kan worden aangepast, afhankelijk van de massa van de verbinding (en) plaats. Uittreksel ionen van de totale ionenstroom (TIC) van LC-MS ion chromatogrammen en bepalen of de winningted ionen overeen met gedeprotoneerde of adduct ionen, of fragment-ionen. </li><li> Voor MRM experimenten overgang massa m / z 355/311 wordt gebruikt om het F1 klasse detecteren, m / z 353/193 wordt gebruikt voor de klasse F2 en m / z 351/193 of 351/191 wordt gebruikt voor de klasse F3 (Figuur 3). MRM wordt ook gebruikt om de interne standaard (bijvoorbeeld m / z 357/197 voor PGF 2α-d4) detecteren en de standaardkromme te genereren. Zie Murphy et al.. Voor aanvullende informatie over PG massale overgangen 18. </li><li> Voor MS / MS-experimenten, gebruik m / z 355 voor F1 klasse, m / z 353for F2 klasse, en m / z 351for F3 klasse PG&#39;s. C. elegans MS / MS gegevens voor F-serie PG is in figuur 4 en tabel 2 3,16. MS / MS-gegevens voor zoogdieren eicosanoïden is beschikbaar op <a href="http://www.lipidmaps.org" target="_blank">www.lipidmaps.org</a> . </li><li> Verwerk de analytische gegevens met behulp Analyst-software (versie 1.4.2, Applied Biosystems). </li></ol>

<ol><li>Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+synthesis+and+adiposity+regulation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans.</a> Trends Endocrinol. Metab. 20, 58-65 (2009).</li>
<li>Marza, E., Lesa, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyunsaturated+fatty+acids+and+neurotransmission+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Polyunsaturated fatty acids and neurotransmission in Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. Soc. Trans. 34, 77-80 (2006).</li>
<li>Edmonds, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin%2FFOXO+signaling+regulates+ovarian+prostaglandins+critical+for+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction.</a> Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).</li>
<li>Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+maternal+phospholipid+composition+and+IP%283%29-dependent+embryonic+membrane+dynamics+by+a+specific+fatty+acid+metabolic+event+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans.</a> Genes Dev. 26 (3), 554-566 (2012).</li>
<li>Kosel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eicosanoid+formation+by+a+cytochrome+P450+isoform+expressed+in+the+pharynx+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Eicosanoid formation by a cytochrome P450 isoform expressed in the pharynx of Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. J. 435, 689-700 (2011).</li>
<li>Kubagawa, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+signals+derived+from+polyunsaturated+fatty+acids+control+sperm+recruitment+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte signals derived from polyunsaturated fatty acids control sperm recruitment in vivo.</a> Nat Cell Biol. 8, 1143-1148 (2006).</li>
<li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acylethanolamine+signalling+mediates+the+effect+of+diet+on+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 473, 226-229 (2011).</li>
<li>Gerisch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bile+acid-like+steroid+modulates+Caenorhabditis+elegans+lifespan+through+nuclear+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A bile acid-like steroid modulates Caenorhabditis elegans lifespan through nuclear receptor signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5014-5019 (2007).</li>
<li>Edison, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+pheromones+regulate+multiple+complex+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans pheromones regulate multiple complex behaviors.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 378-388 (2009).</li>
<li>Funk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandins+and+leukotrienes%3A+advances+in+eicosanoid+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology.</a> Science. 294, 1871-1875 (2001).</li>
<li>Wang, D., Dubois, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eicosanoids+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Eicosanoids and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 10, 181-193 (2010).</li>
<li>Cha, Y. I., Solnica-Krezel, L., DuBois, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+prostanoids%3A+deciphering+the+developmental+functions+of+cyclooxygenase-derived+prostaglandins%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fishing for prostanoids: deciphering the developmental functions of cyclooxygenase-derived prostaglandins.</a> Dev. Biol. 289, 263-272 (2006).</li>
<li>Hata, A. N., Breyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacology+and+signaling+of+prostaglandin+receptors%3A+multiple+roles+in+inflammation+and+immune+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Pharmacology and signaling of prostaglandin receptors: multiple roles in inflammation and immune modulation.</a> Pharmacol. Ther. 103, 147-166 (2004).</li>
<li>Sugimoto, Y., Narumiya, S., Ichikawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+function+of+prostanoid+receptors%3A+studies+from+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Distribution and function of prostanoid receptors: studies from knockout mice.</a> Prog. Lipid Res. 39, 289-314 (2000).</li>
<li>Basu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoprostanes%3A+novel+bioactive+products+of+lipid+peroxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Res%22%5BJournal%5D)">Isoprostanes: novel bioactive products of lipid peroxidation.</a> Free Radic. Res. 38, 105-122 (2004).</li>
<li>Hoang, H. D., Prasain, J. K., Dorand, D., Miller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterogenous+mixture+of+F-series+prostaglandins+promotes+sperm+guidance+in+the+C.+elegans+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A heterogenous mixture of F-series prostaglandins promotes sperm guidance in the C. elegans reproductive tract.</a> PLoS Genetics. 9 (1), e1003271(2013).</li>
<li>Golovko, M. Y., Murphy, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+LC-MS%2FMS+procedure+for+brain+prostanoid+analysis+using+brain+fixation+with+head-focused+microwave+irradiation+and+liquid-liquid+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">An improved LC-MS/MS procedure for brain prostanoid analysis using brain fixation with head-focused microwave irradiation and liquid-liquid extraction.</a> J. Lipid Res. 49, 893-902 (2008).</li>
<li>Murphy, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+and+tandem+mass+spectrometry+of+eicosanoids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization and tandem mass spectrometry of eicosanoids.</a> Anal. Biochem. 346, 1-42 (2005).</li>
<li>Milne, G. L., Yin, H., Morrow, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+biochemistry+of+the+isoprostane+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Human biochemistry of the isoprostane pathway.</a> J. Biol. Chem. 283, 15533-15537 (2008).</li>
<li>Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+identification+of+anandamide+and+2-arachidonoylglycerol+in+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biodivers%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes.</a> Chem. Biodivers. 5, 2431-2441 (2008).</li>
<li>Kulas, J., Schmidt, C., Rothe, M., Schunck, W. H., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450-dependent+metabolism+of+eicosapentaenoic+acid+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450-dependent metabolism of eicosapentaenoic acid in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Arch. Biochem. Biophys. 472, 65-75 (2008).</li>
<li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+polyunsaturated+fatty+acid+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

We beschrijven een procedure voor eicosanoid extractie en analyse, gericht op de F-serie PG&#39;s. Er zijn verschillende delen van de procedure die kan problematisch zijn. Ten eerste, is het essentieel dat de worm culturen niet verhongeren, zoals honger kan PG metabolisme te veranderen. Voor aanvullende voeding, worden NA22 bacteriën in plaats van de meer algemeen gebruikte OP50 bacteriën aanbevolen omdat NA22 bereikt hogere dichtheid. De NA22 stam mist antibioticaresistentie en is vatbaar voor besmetting. Ten tweede, wormen synthetiseren individuele PG isomeren in geringe hoeveelheden in verhouding tot zoogdierweefsels. Dit kan deels te wijten aan redundantie onder de talrijke isomeren. Wij adviseren ongeveer 6 g weefsel voor een uitgebreide analyse en sterkere signalen. Minder weefsel (1-2 g) kan worden gebruikt als de droge stof wordt opnieuw gesuspendeerd in minder methanol: water oplossing PG concentratie verhogen. Echter, slechts een tot twee injecties worden uitgevoerd. De detectielimiet van LC-MS/MS ons systeem is ongeveer 10 pgPGF 2α / ml. Een ml gemengde dicht op elkaar gepakte stadium wormen (ongeveer 1 g) levert ongeveer 25-50 pg van CePGF2. Meer gevoelige massaspectrometrie systemen kunnen de hoeveelheid worm weefsel nodig voor de analyse te beperken. Ten derde kunnen verschillen in extractie-efficiëntie onder PG monsters variabele resultaten opleveren. Wij hebben gevonden dat extractie efficiëntie vergelijkbaar wanneer weefsels worden geëxtraheerd in parallel. Om de efficiëntie te bepalen, voeg 1,0 ng PGF 2α-d 4 aan de homogenisatiestap als een interne controle. MRM overgang met massa m / z 357/197 wordt gebruikt om PGF 2α-d4 concentratie ten opzichte van een 1 ng / ml standaardoplossing meten. De hoeveelheid PGF 2α-d 4 verloren tijdens extractie wordt berekend. De parameters chromatografie en massa overgangen we opnemen kan worden aangepast aan andere PG en eicosanoïden detecteren. Ondanks aanzienlijke inspanningen, hebben wij niet in staat om D-serie of E-ser identificerenies PGS in de extracten 17. Bovendien hebben we ontdekt 8-iso PGF 2α en 8-iso PGE2 die kenmerkend vrije radicalen geïnitieerde peroxidatie, die een selectieve mengsel van stereoisomeren PG 19 genereert. Of wormen synthetiseren andere PG is niet bekend. Endocannabinoids en diverse epoxy en hydroxy metabolieten van arachidonzuur en eicosapentaeenzuur zuren gevonden in C. elegans haalt 5,7,20,21. Wij raden het gebruik van zowel MRM en MS / MS in vergelijking met authentieke standaarden voor kwantificering en identificatie, respectievelijk. Van nieuwe eicosanoïden, moet deze analyses worden aangevuld met een studie van vet mutanten die deficiënt zijn in PUFA synthetiserende enzymen 22, alsmede een functionele assay, indien mogelijk. Een waarschuwing voor de analyse van vetten mutanten is dat kleine hoeveelheden PUFA&#39;s aanwezig in wormen zijn voldoende voor PG-synthese. Bijvoorbeeld, vet-2 (wa17) mutanteneen kleine hoeveelheid D12 desaturaseactiviteit (~ 5% van de wild type 22) en deze mutanten produceren nog PG 6. vet-3 (WA22) en vet-4 (WA14) mutanten niet PG afgeleid van arachidonzuur en eicosapentaeenzuur zuren 16 synthetiseren . We hebben ook ontdekt dat vet mutanten compenseren voor het verlies van PUFA klassen door up-reguleren PG synthese van de resterende lessen. Bijvoorbeeld, vet-3 (WA22) mutanten niet aan de meeste PGs afgeleid van 20-koolstof PUFA synthetiseren. In plaats daarvan, ze lijken te up-reguleren roman PGs afgeleid van 18-koolstof PUFA 16. Tot op heden hebben we niet geïdentificeerd een C. elegans stam die volledig deficiënt is in PG-synthese. Het is mogelijk dat PG essentieel zijn voor groei of ontwikkeling.

Prostaglandines (PG&#39;s) zijn een belangrijke klasse van lipiden hormonen die zijn uitgebreid onderzocht en betrokken is bij de voortplanting, immuniteit, en ontwikkeling in een breed scala van organismen 12-14. PG zijn ideaal voor uitgebreide systemenbiologie gevolgd omdat ze een serieschakeling van lipiden afkomstig uit een gemeenschappelijke precursor (s). De nematode C. elegans is een van de meest gebruikte modelorganismen om fundamentele vragen in de genetica en systeembiologie pakken. We hebben aangetoond dat C. elegans synthetiseert F-serie PG&#39;s die gids beweeglijk sperma aan eicellen 3,6,16. F-series PG afgeleid van 20-carbon PUFA met drie, vier en vijf dubbele bindingen, omvattende de F1, F2 en F3 respectievelijk de klasse geïdentificeerd 3,16. De PG&#39;s worden onafhankelijk van cyclooxygenase enzymen gesynthetiseerd, maar PGF 1α en PGF 2α stereoisomeren steeds gevergoede. Kwalitatieve en kwantitatieve analyses van C. elegans PG, LC-MS/MS is een krachtige en gevoelige analytische techniek. Voordat deze analyse is het belangrijk om een ​​optimale extractie method Doordat de performance van het analyseproces sterk afhankelijk van de kwaliteit extract. Vloeistofchromatografie en massaspectrometrie kan alleen voorzien massa-verhouding (m / z) belasten, en wenselijk piekvorm en de retentietijd van de PG moederion. Metabool profiel van PG&#39;s in C. elegans is een uitdagende taak die verschillende MS overnamestrategieën. LC-MS volledige scan of survey scanning (Q1 scanning) heeft het voordeel dat de meeste ioniseerbaar PG een massaspectrometrische respons te genereren. Terwijl de enquête scan geeft nuttige informatie over de totale profilering van PG&#39;s met betrekking tot wild-type en mutant C. elegans, detectie van kleine PGs wordt gecompromitteerd vanwege een lage gevoeligheid. Toch voorminder, kan LC-MS onderzoek scanning een algemeen beeld geven van PG en is bijzonder nuttig voor het analyseren mutanten voorspeld metabolisme van een grote PG bevolking treffen. In metaboliet identificatie, wordt LC-MS/MS analyse van chemisch gesynthetiseerde PG normen eerst uitgevoerd om hun product ion spectra te verkrijgen als referentie verbindingen. Deze spectra kunnen worden vergeleken met het spectrum van een onbekende metaboliet. Monitormodus Multiple reactie (MRM) wordt gebruikt voor verhoogde gevoeligheid en specificiteit. Een MRM experiment wordt bereikt door het specificeren van de ouder-ion / product ionenmassa overgang van een verbinding. Door te weten de massa en de structuur van de doelanalyten, kan men theoretisch MRM overgangen voorspeld voor vele onbekende metabolieten. Een geoptimaliseerde LC-MS/MS methode voor het profileren van isomere PG&#39;s in C. elegans is niet gemeld. Hier beschrijven we een extractie-en geïntegreerde massaspectrometrie aanpak bestaande uit LC-MS en LC-MS / MS methoden voor het opsporen, kwantificeren en onderzoekt C. elegans PG metabolieten. Deze benadering kan worden toegepast op andere eicosanoïden.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>X-large (16 cm) platen</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875714</td><td></td></tr><tr><td>E. coli stam NA22</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>NA22</td><td><a href="http://www.cgc.cbs.umn.edu" target="_blank">http://www.cgc.cbs.umn.edu</a></td></tr><tr><td>Aceton, 399.5%</td><td>Fisher Scientific</td><td>A928-4</td><td></td></tr><tr><td>Butylated Hydroxytolueen</td><td>MP Biomedicals</td><td>101162</td><td></td></tr><tr><td>Hexaan, HPLC-kwaliteit</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-1</td><td></td></tr><tr><td>Mierenzuur, 399%</td><td>Acros</td><td>AC27048-0010</td><td>Beschikbaar via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Chloroform, HPLC-kwaliteit</td><td>Acros</td><td>AC26832-0010</td><td>Beschikbaar via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>PGF2&alpha;-d4</td><td>Cayman Chemicals</td><td>316010</td><td>Cayman heeft een breed scala aan standaarden beschikbaar om te kopen</td></tr><tr><td>Steriele schroefdop zelfdragende 5 ml buis</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-651</td><td>Voor gebruik met Bullet Blender</td></tr><tr><td>0.5 mm zirkoniumoxide korrels</td><td>Next >>> Advance</td><td>ZrOB05</td><td></td></tr><tr><td>10 ml glazen conische zwaargewicht gegradueerde centrifugebuizen</td><td>Kimble Kimax</td><td>45200-10</td><td>Beschikbaar via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>15 ml glazen conische buizen</td><td>Corning Pyrex</td><td>8082-15</td><td>Beschikbaar via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Sigmacote (Siliconiseringsreagens)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Teflon gevoerde afgesloten 1/2 Dram glazen flesje</td><td>Fisher Scientific</td><td>V1235C-TFE</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">APPARATUUR</td></tr><tr><td>CentraSL2 Klinische Centrifuge</td><td>Thomas Scientific</td><td>2517N92-TS</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender 5 blauwe homogenisator</td><td>Next >>> Advance</td><td>BBY5MB</td><td>Een 40 ml Dounce homogenisator kan als alternatief worden gebruikt</td></tr><tr><td>Synergi 4 &mu;m Hydro-RP 80 &#197; LC Column 250 x 2.0 mm</td><td>Phenomenenex</td><td>00G-4375-B0</td><td>HPLC-kolom</td></tr><tr><td>SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm</td><td>Phenomenenex</td><td>AJ0-7510</td><td></td></tr><tr><td>SecurityGuard Guard Cartridges Kit</td><td>Phenomenenex</td><td>KJ0-4282</td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu Prominence HPLC met gekoelde automatische sampler</td><td>Shimadzu Scientific Instruments, Inc.</td><td></td><td>Elk standaard HPLC-systeem gekoppeld aan een triple quadrupole massaspectrometer zou voldoende moeten zijn</td></tr><tr><td>API 4000 triple quadrupole massaspectrometer</td><td>Applied Biosystems/MDS SCIEX</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> <table border="1"> <tbody> <tr> <td colspan="2">M9 buffer recept (4 liter)</td> </tr> <tr> <td>12 g</td> <td>KH2PO4</td> </tr> <tr> <td>24 g</td> <td>Na2HPO4</td> </tr> <tr> <td>20 g</td> <td>NaCl</td> </tr> <tr> <td>Tot 4 liter</td> <td>De-ioniseerd water</td> </tr> <tr> <td colspan="2">Deel in acht 1 liter flessen. Autoclaveer en laat afkoelen.</td> </tr> <tr> <td>0.5 ml/fles</td> <td>1 M MgSO4</td> </tr> </tbody> </table> </td></tr></tbody></table>

prostaglandine-extractie en analyse in<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is in opkomst als een krachtig diermodel om de biologie van lipiden 1-9 te bestuderen. Prostaglandinen zijn een belangrijke klasse van eicosanoïden die lipide signalen afgeleid van meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFA) 10-14 zijn. Deze signaalmoleculen zijn moeilijk te bestuderen vanwege hun lage overvloed en reactief karakter. Kenmerkend prostaglandinen een cyclopentaanring structuur binnen de vetzuur backbone. In zoogdieren kan prostaglandines worden gevormd door cyclooxygenase enzym-afhankelijke en-onafhankelijke routes 10,15. C. elegans synthetiseert een breed scala van prostaglandines onafhankelijk van cyclooxygenases 6,16,17. Een grote klasse van F-serie prostaglandines is geïdentificeerd, maar de studie van eicosanoïden is in een vroeg stadium met veel ruimte voor nieuwe ontdekkingen. Hier beschrijven we een werkwijze voor de extractie en analyse van prostaglandinen en andere eicosanoïden. Geladen lipides worden uit massa worm kweken met een vloeistof-vloeistof extractie techniek en geanalyseerd door vloeistofchromatografie gekoppeld met electrospray ionisatie tandem massaspectrometrie (LC-ESI-MS/MS). De opname van gedeutereerde analogen van prostaglandinen, zoals PGF 2 α-d 4 als interne standaard wordt aanbevolen voor kwantitatieve analyse. Multiple Reaction Monitoring of MRM kunnen worden gebruikt te kwantificeren en te vergelijken specifieke typen prostaglandine tussen wild-type en mutante dieren. Botsingsgeïnduceerde afbraak of MS / MS kan worden gebruikt om informatie te verkrijgen over belangrijke structurele kenmerken. Vloeistofchromatografie massaspectrometrie (LC-MS) onderzoek scans van een geselecteerd massabereik, zoals m / z 315-360 kan worden gebruikt om globale veranderingen in prostaglandine niveau te beoordelen. We geven voorbeelden van alle drie analyses. Deze methoden zullen onderzoekers te voorzien van een toolset voor het ontdekken van nieuwe eicosanoïden en de afbakening van hun metabole routes.

Voorbereiding van het monster werd uitgevoerd door vloeistof-vloeistof extractie aangepast van Golovko en Murphy 17. Het leverde uitstekend herstel van de interne standaard (PGF 2α-d4). De algemene regeling voor de PG extractie uit C. elegans wordt getoond in figuur 1. Chromatografische omstandigheden werden geoptimaliseerd om basislijnscheiding van&gt; 30 eicosanoïde standaarden (Tabel 1 toont 13-normen) bieden. Een Hydro-Rp kolom (250 x 2,0 mm ID) met water en acetonitril dat 0,1% mierenzuur ontvangen de beste scheiding en gevoeligheid. Enquête scans van wild-type en vet-3 mutant extracten weergegeven in figuur 2 document globaal niveau van ionen binnen de massa bereik van 315-360 atomaire massa-eenheden. Vet-3 (WA22) mutanten missen de meeste 20-koolstof-PUFA&#39;s. Een F3-klasse PG is gemarkeerd. In figuur 3, MRM analyses van een wildtype extract tonen verschillende PG isomeren van de F1 (figuur 3A </stro<html> ng&gt;), F2 (figuur 3B) en F3 (Figuren 3C en 3D) klassen. De F3 klasse kan worden gedetecteerd met een van twee massa overgangen, m / z 351/193 of m / z 351/191. CePGF2 hoofdzakelijk uit de PGF 2α enantiomeer. CePGF1 waarschijnlijk PGF 1α of zijn enantiomeer. Figuur 4 toont de botsing-geïnduceerde ontleding van CePGF2 (RT = 11,8) in vergelijking met de PGF2 α standaard (RT = 11,8). Kleine verschillen in de product-ionen zijn waarschijnlijk te wijten aan lage CePGF2 overvloed en co-eluerende verbindingen in het extract. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematisch diagram van C. elegans PG extractie en LC-MS-analyses. Merk op dat aceton / zoutoplossing en chloroform beide 0.005% BHT aan lipide oxidatie te minimaliseren. Verwijzen naar de tekst voor meer informatie.https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2.jpg" /> Figuur 2. Enquête scans van m / z 315-360 van wild-type en vet-3 (WA22) mutant extracten. Vloeistofchromatografie retentietijd (RT) wordt getoond in panel [A]. Onttrokken ionen bij RT = 11.3 worden getoond voor wild-type [B] en vet-3 (WA22) [C] extracten. Een F3-klasse PG met massa m / z 351 is gemarkeerd. Cps, tellingen / sec; amu, atomaire massa-eenheid. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3.jpg" /> Vijgure 3. MRM analyses van wild-type extracten. F1 klasse PG&#39;s worden gedetecteerd met massale overgang m / z 355/311 [A]. Merk op dat meerdere hydrofobe verbindingen (RT&gt; 14 min), die waarschijnlijk niet in PG&#39;s zijn ook gedetecteerd met deze overgang. F2 klasse PG&#39;s worden gedetecteerd met massale overgang m / z 353/193 [B]. F3 klasse PG&#39;s worden gedetecteerd met ofwel massa transitie m / z 351/193 [C] of m / z 351/191 [D]. Merk op dat de extracten bevatten meerdere PG-isomeren van elke klasse. Nummers corresponderen met PG getoond in Tabel 2. De concentratie van CePGF2 is 1,8 ng / ml. RT, retentietijd; cps, tellingen / sec. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4.jpg" /> Figuur 4. Botsingsgeïnduceerde ontleding van chemisch synthesized PGF 2α en CePGF2. Arrows in panel [A] duiden product of fragmentatie ionen gedeeld tussen PGF 2α en CePGF2 (RT = 11.8). Het product ionen bij m / z 309 en m / z 193, zijn van aangegeven splitsingsplaatsen (gemarkeerd a en b), overeen met de structuren die zijn getoond en zijn kenmerkend F-series PG [B]. Cps, tellingen / sec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Standaard </td><td> RT (min) </td><td> [MH] - m / z </td><td> Belangrijkste product ionen in MS / MS </td></tr><tr><td> 20-hydroxy-PGE2 </td><td> 9.43 </td><td> 367 </td><td> 349, 331, 287, 234, 189, 129, 109 </td></tr&gt; <tr><td> PGF 3 - </td><td> 11.26 </td><td> 351 </td><td> 333, 307, 289, 271, 245, 219, 209, 193, 191, 171, 165, 111 </td></tr><tr><td> Tromboxaan B 2 </td><td> 11.66 </td><td> 369 </td><td> 289, 191, 177, 169, 151 </td></tr><tr><td> PGF2 - </td><td> 11.80 </td><td> 353 </td><td> 335, 309, 291, 273, 263, 247, 235, 209, 193, 171, 165, 111 </td></tr><tr><td> PGF 1 - </td><td> 11.79 </td><td> 355 </td><td> 337, 319311, 301, 293, 275, 265, 237, 211, 195 </td></tr><tr><td> Lipoxine B 4 </td><td> 12.38 </td><td> 351 </td><td> 201, 191189, 165, 155, 115, 107, 71, 59 </td></tr><tr><td> PGD2 </td><td> 12.56 </td><td> 351 </td><td> 315, 271203, 189 </td></tr><tr><td> 5 (S), 6 (R) - Lipoxin A4 </td><td> 12.83 </td><td> 351 </td><td> 235, 217, 189, 144, 135, 115, 99, 59 </td></tr><tr><td> PGA 2 </td><td> 14.02 </td><td> 333 </td><td> 315, 297, 271, 235, 191, 189, 175, 163, 137, 113, 109 </td></tr><tr><td> Δ12-PGJ 2 </td><td> 14.20 </td><td> 333 </td><td> 271, 189, 123 </td></tr><tr><td> Leukotrieen B4 </td><td> 14.73 </td><td> 335 </td><td> 181, 109, 93, 71, 69, 59, 57 </td></tr><tr><td> 15d-Δ 12,14-PGJ 2 </td><td> 16.80 </td><td> 315 </td><td> 297, 271, 217, 203, 158 </td></tr><tr><td> 5 (S)-HPETE </td><td> 17.88 </td><td> 335 </td><td> 97, 83, 81, 57 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Retentietijden en belangrijkste product ionen van 13 eicosanoïde normen uit de LC-MS/MS methode 3. Meer dan 30 standaarden werden gebruikt om de LC-MS/MS programma. De chromatografische retentie tijden (RT&#39;s) verschillen, zelfs onder zeer vergelijkbaar PG&#39;s. Een uitzondering is PGF 1α en PGF 2α. Toch hebben deze PG&#39;s zijn distinguished door hun ouder ion massa ([MH] - m / z) en botsingsgeïnduceerde ontleding spectra (MS / MS). <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Prostaglandine klasse </td><td> No in figuur 3 </td><td> [MH] - m / z </td><td> Belangrijkste product ionen in MS / MS </td></tr><tr><td> F1 (CePGF1) </td><td> 1 </td><td> 355 </td><td> 319, 301, 311, 293, 275, 265, 237, 223, 211, 195, 157 </td></tr><tr><td> F1 </td><td> 2 </td><td> 355 </td><td> 311, 301, 293, 275, 265, 211, 195, 167, 157 </td></tr><tr><td> F2 (CePGF2) </td><td> 3 </td><td> 353 </td><td> 309, 291, 273, 263, 247, 209, 193, 171, 165, 127 </td></tr><tr><td> F2 </td><td> 4 </td><td> 353 </td><td> 309, 291, 273, 263, 255, 247, 219, 209, 193, 171, 113 </td></tr><tr><td> F3 </td><td> 5 </td><td> 351 </td><td> 315, 307, 289, 275, 249, 205, 193, 191, 167, 153, 139 </td></tr><tr><td> F3 </td><td> 6 </td><td> 351 </td><td> 333, 289, 271, 261, 245, 223, 193, 191, 163 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Botsingsgeïnduceerde ontledingsprodukt ionen voor verschillende grote C. elegans F1, F2 en F3 PG getoond in figuur 3. MS / MS of andere minder overvloedig isomeren worden niet weergegeven. Deze gegevens zijn afkomstig uit meerdere analyses en niet alle product-ionen kan zichtbaar zijn in een bepaalde run. Gezien de complexiteit van de extracten, sommige minder overvloedig product ionen afkomstig zijn van een andere ouder ion met gelijke retentietijd of het resultaat van interferentie. Peak 2 is waarschijnlijk een stereo-isomeer van CePGF1 en peak 4 waarschijnlijk een stereo-isomeer van CePGF2. Zie Edmonds, et al.. (2010) voor aanvullende gegevens 3.

In dit artikel beschrijven we een geoptimaliseerd voor de extractie en analyse van prostaglandines en andere eicosanoïden uit<em&gt; C. elegans</em&gt; Gebruik van LC-MS/MS.

Prostaglandine-extractie en analyse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Deze procedure is bedoeld om prostaglandinen en andere eicosanoïden in extracten van sea elegance te identificeren en te meten. Kweek eerst de wormen in grootschalige culturen. Extraheer vervolgens de hydrofiele lipiden uit het wormweefsel met een vloeistof-vloeistofextractietechniek en injecteer de lipidenextracten in een HPLC-kolom die gekoppeld is aan een massaspectrometer.Analyse vervolgens de gegevens van de vloeistofchromatografie-tandemmassaspectrometrie. Uiteindelijk kan deze lc-MS/MS-benadering van gezuiverde warme extracten nieuwe metabolieten identificeren en ook bekende metabolieten meten, zoals de S-serie prostaglandinen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals enzym-immunoassays, is dat deze zeer gevoelig en specifiek is, terwijl deze tegelijkertijd uitgebreid en flexibel is. Deze techniek zal worden gedemonstreerd door Hugh Hong, een promovendus uit mijn laboratorium. Voor de supplementaire voeding van de wormen gebruiken we pellet en NA 22.Centrifugeer de bacteriële cultuur, verwijder het supernatant en resuspendeer de bacteriële pellet in 100 milliliters M9-buffer. Bewaar de geconcentreerde bacteriële oplossing bij vier graden Celsius. Start de wormculturen op vijf extra grote NGM-platen.Ga door met het voortplanten van de wormen gedurende drie tot vier generaties totdat de platen vol zijn. Voeg naar behoefte ongeveer één milliliter van de geconcentreerde bacteriën toe aan de wormplaten om uithongering van de volwassenen te voorkomen. Laat de platen volledig aan de lucht drogen voordat u het deksel plaatst.Was vervolgens de geoogste hermafrodieten van de platen af met M9-buffer. Oogst de wormen in een conische polypropyleen buis van 50 ml. Laat de wormen daarna naar de bodem zakken.Verwijder het supernatant dat bacteriën, eitjes en wormen in het larvale stadium bevat. Resuspendeer de resterende wormen nu in 15 milliliters M9-buffer en meng voorzichtig. Verdeel 200 microliters van de wormsuspensie over elk van de 60 gezaaide NGM-platen.Houd de wormoplossing goed gemengd totdat alle plaatjes zijn geënt om ervoor te zorgen dat ze ongeveer gelijke aantallen wormen ontvangen. Verdeel de wormen over de plaatjes. Laat de wormen twee tot vier generaties groeien, waarbij elke 12 tot 24 uur één milliliter geconcentreerde bacteriën per plaatje wordt toegevoegd.Wanneer de platen vol zijn met volwassen GR-wormen, worden de wormen per stam geoogst. Spoel de wormen met M9-buffer van de platen af en breng ze over naar zes polypropyleen buizen van 50 ml. Vul de buizen met M9-buffer om de wormen te wassen.Zodra de volwassen wormen naar de bodem zijn gezakt, verwijdert u ongeveer 35 milliliters van het supernatant. Trek vervolgens de wormen over naar één of twee buisjes. Herhaal de M9-was drie keer of totdat het supernatant transparant is met een breedborest pasteurpipet.Breng zoveel mogelijk wormen over naar een conische polypropyleen buis van 15 milliliter. Centrifugeer 5 minuten bij 1000 RCF en verwijder het supernatant. Herhaal de stappen voor het oogsten, wassen en samenvoegen voor de overige stammen.Bewaar voorraden van de geoogste wormstammen bij -80 °C. Noteer het gewicht van een conische polypropyleenbuis met behulp van een roodgloeiend scheermesje. Snijd een bevroren polypropyleenbuis met geoogste wormen vlakbij de markering van 6 mL door.Onder steriele omstandigheden. Breng ongeveer zes gram van het bevroren wormpellet over naar het monster. Voeg één nanogram van de interne standaard en 12 milliliters ijskoude aceton-zoutoplossing toe.Verdeel met de BHT-mix 1,5 milliliters van het wormensuspensie gelijkmatig over 12 zelfstaande plastic buisjes van vijf milliliter. Voeg 0,7 milliliters van de gestabiliseerde zirconiumoxide-kralen toe. Homogeniseer de wormensuspensie indien nodig.Herhaal het proces gedurende nog een minuut met een pasturepipet van negen inch om minder dan 10% intacte wormen over te houden. Breng het homogenaat voorzichtig over naar vier conische glazen buisjes van 10 milliliter, zonder de kraaltjes mee te verplaatsen. Voeg de kraaltjes uit drie buisjes samen en was deze met één milliliter aceton-zoutoplossing met BHT.Herhaal deze wasstap voor de overige buizen met beads. Breng de wasoplossing over in de glazen buizen op ijs. Centrifugeer vervolgens het homogenaat bij 1000 Gs gedurende 10 minuten.Breng bij vier graden Celsius het supernatant van elke buis over naar een schone glazen conische buis van 10 milliliter. Voeg vervolgens in een zuurkast een gelijk volume hexaan toe aan elke buis en vortex bij maximale snelheid gedurende 30 seconden. Centrifugeer daarna bij vier graden Celsius bij 1000 Gs gedurende 10 minuten.Verwijder de bovenste fase die hexaan en neutraal geladen lipiden bevat en voeg twee millimolair mierenzuur toe om de onderste waterige fase te verzuren. Controleer met pH-strips of de pH 3,5 bedraagt. Voeg nu gelijke volumes chloroform toe aan elke buis en vortex deze op maximale snelheid gedurende 30 seconden.Centrifugeer de monsters bij vier graden Celsius bij ongeveer 1000 ×g gedurende 10 minuten. Plaats een glazen pipetpunt in de onderste chloroformase en probeer de vaste interface te vermijden door de buis te kantelen. Trek de extracten uit vier buizen over naar één enkele conische glazen buis van 15 milliliter.Spoel de lucht in de glazen buis weg met stikstofgas en incubeer bij -20 °C gedurende 24 uur tot twee weken. Gooi na het ontdooien van het extract de resterende melkachtige waterige bovenlaag weg, indien aanwezig. Gebruik hiervoor een nieuwe Pasteurpipet.Overbreng het chloroform in een chemische zuurkast naar een gelabeld, met Teflon bekleed half DRM glazen vial. Laat het organische oplosmiddel verdampen onder een zachte stroom nitrogengas en bewaar de monsters bij -20 °C voor maximaal twee weken. Bereid eerst stamoplossingen van individuele referentie-prostaglandines in methanol.Genereer nu een standaardcurve door middel van seriële verdunning in 80% methanol. Los vervolgens de gedroogde lipidenextracten van sea elegance op in 200 µL 80% methanol voor analyse. Injecteer 20 tot 50 µL van het monster in de reverse phase-kolom en voer de gradiëntanalyse uit zoals beschreven in het tekstprotocol met gebruik van een ESI-interface in negatieve ionenmodus.Introduceer het kolomeffluent in de massaspectrometer. Stel het botsingsgas in op 10 elektronvolt. De botsingsenergie op minus 35 elektronvolt.De temperatuur op 600 °C. De decluttering-potentiaal op -90 en de celuitlaatpotentiaal op -11 genereren een standaardcurve om de verschillende klassen prostaglandinen in de geëxtraheerde monsters te analyseren met behulp van analyst-software. Verwerk de gegevens om de prostaglandinen in de wormextracten te identificeren.Survey-scans van extracten van het wildtype en de fat three mutante worm tonen de globale ionenniveaus binnen het massabereik van 315 tot 360 atomaire massa-eenheden. In vergelijking met de wildtype wormen missen de fat three mutanten de meeste PFAS met 20 koolstofatomen, zoals geïllustreerd door een prostaglandine van de F drie-klasse. Met de massalaadingsverhouding 3 51 gemarkeerd in grijs, kunnen MRM-analyses de verschillende klassen prostaglandinen identificeren.Bijvoorbeeld, prostaglandinen van de F1-klasse zijn aanwezig in wildtype-extracten, evenals diverse andere hydrofobe verbindingen met langere retentietijden; door de massatransitie te variëren kan een verdere analyse van de F2- en F3-klasse prostaglandinen worden uitgevoerd, wat aangeeft dat de wormextracten meerdere prostaglandine-isomeren van elke klasse bevatten. Vergelijking van de collision-induced decomposition van het C. elegans-prostaglandine met het standaardprostaglandine kan worden gebruikt om product-ionen van verwachte splitsingsplaatsen in kaart te brengen. Om lipidoxidatie te voorkomen.Vergeet niet de juiste voorzorgsmaatregelen te nemen. Voeg bijvoorbeeld het antioxidant VHT toe aan de aangegeven oplossing en spoel het extract door met stikstofgas.

prostaglandin-extraction-and-analysis-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Na blootstelling aan specifieke omgevingsstressors, ondergaat de rondworm Caenorhabditis elegans een uitgebreide fenotyische plasticiteit om een stressbestendig 'dauer'-juveniel stadium te betreden. We presenteren methoden voor de gecontroleerde inductie en beeldvorming van neuroplasticiteit tijdens dauer.

In vivo beeldvorming van Dauer-specifieke neuronale Verbouwing in C. elegans

We presenteren een immunofluorescentie-imaging methode voor ruimtelijke en temporele lokalisatie van actieve ERK in de ontleed C. elegans gonade. De hier beschreven protocol kan worden aangepast voor visualisatie van elke signalering of structurele eiwit in het C. elegans gonade, mits een geschikt antilichaam reagens beschikbaar is.

Ruimtelijke en temporele analyse van Active ERK in de<em&gt; C. elegans</em&gt; Kiembaan

We presenteren een geautomatiseerde methode voor driedimensionale wederopbouw van de Caenorhabditis elegans germline. Onze methode bepaalt het aantal en de positie van elke kern binnen de kiemcellen en analyses germline eiwit distributie en cytoskeletal structuur.

Computationele analyse van de Caenorhabditis elegans Germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet

Dit protocol laat zien hoe een eiwit nucleaire translocatie onder hittestress bijhouden met behulp van een groene fluorescentie proteïne (GFP) fusieproteïne als merkstof en 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kleuring. De DAPI kleuring protocol is snel en behoudt de GFP en eiwit subcellular localisatie-signalen.

Opsporen van Eiwit Subcellular Localisatie door Green fluorescentie eiwit Tagging en 4', 6-Diamidino-2-phenylindole vlekken in Caenorhabditis elegans

Het sperma moet met succes door de eileider navigeren om een eicel te bevruchten. Hier beschrijven we een assay voor het meten van sperma migratie binnen de C. hermafrodiet baarmoeder. Deze analyse kan kwantitatieve gegevens over sperma distributie binnen de baarmoeder na het koppelen, evenals op snelheid, richtings snelheid, en omkerings frequentie verstrekken.

Het meten van sperma begeleiding en beweeglijkheid binnen de Caenorhabditis van het hermafrodiet-reproductieve kanaal

Dit artikel presenteert methoden voor het genereren, zuiveren en kwantificeren van Caenorhabditis elegans extracellulaire blaasjes.

Zuivering en analyse van Caenorhabditis elegans Extracellular Blaasjes

Proteostatische achteruitgang is een kenmerk van veroudering en vergemakkelijkt het begin van neurodegeneratieve ziekten. We schetsen een protocol om proteostase kwantificeerbaar te meten in twee verschillende Caenorhabditis elegans-weefsels door heterologe expressie van polyglutamine-herhalingen gefuseerd met een fluorescerende verslaggever. Dit model maakt een snelle in vivo genetische analyse van proteostase mogelijk.

Kwantificering van weefselspecifieke proteostatische achteruitgang van Caenorhabditis elegans

Een protocol voor het in beeld brengen van de dynamische microtubuli in vivo met behulp van fluorescerend gelabeld Eindbindend eiwit is gepresenteerd. We beschreven de methoden om de dynamische microtubuli in het posterieure laterale microtubuli (PLM) neuron van C. elegans te labelen,in beeld te geven en te analyseren .

In vivo Beoordeling van microtubule dynamica en oriëntatie in Caenorhabditis elegans neuronen

Hier wordt een beschrijving gegeven van de eenvoudige en relatief snelle isolatie van Caenorhabditis elegans genomisch DNA van een of enkele dieren met behulp van een in de handel verkrijgbare weefselkit. Het resulterende gDNA-preparaat is een geschikt sjabloon voor PCR.

Kleinschalige extractie van Caenorhabditis elegans Genomisch DNA

Dit protocol beschrijft een RNA-interferentie en ChIP-test om de epigenetische overerving van RNAi-geïnduceerde uitschakeling en geassocieerde chromatinemodificaties in C. elegans te bestuderen.

Analyse van transgenerationele epigenetische overerving in C. elegans met behulp van een fluorescerende reporter en chromatine-immunoprecipitatie (ChIP)

Dit protocol stelt methoden vast voor het extraheren en kwantificeren van reacties op het vluchtige seksferomoon in C. elegans, en biedt hulpmiddelen om chemische communicatie en navigatietraject te bestuderen.

Vluchtige seksferomoonextractie en chemo-aantrekkingstest bij Caenorhabditis elegans

Leer prostaglandine-extractie en analyse in Caenorhabditis elegans met behulp van LC-MS/MS. Deze geoptimaliseerde methode biedt hogere gevoeligheid en specificiteit voor lipidenonderzoek.

Prostaglandine-extractie en analyse in

Meer video's verkennen