Bereiding van de Mgm101 recombinatie eiwit met MBP-based Tagging strategie

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van grote oligomere, DNA-bindende eiwitten zoals MGM 1 0 1 met behulp van de maltose-bindend eiwit- of MVP-taggingstrategie. Dit wordt bereikt door eerst het open leesraam van MGM 1 0 1 stroomafwaarts van MVP in de PMLC twee E vector te kloneren voor expressie in e coli. Het M-V-P-M-G-M 1 0 1 fusie-eiwit wordt vervolgens uit e coli gezuiverd via AMLO-affiniteitschromatografie.

MGM 1 0 1 wordt vervolgens uit MVP vrijgemaakt door proteolytische splitsing en van MVP gescheiden via kationuitwisselingschromatografie. Ten slotte worden de MGM 1 0 1-ringen tot homogeniteit gezuiverd door middel van grootte-uitsluitingschromatografie. Uiteindelijk wordt ongeveer 0,8 milligram oplosbare MGM 1 0 1 verkregen.

Eén liter bacteriële kweek kan worden gebruikt voor de biochemische en structurele karakterisering van dit eiwit, dat belangrijk is voor DNA-herstel in mitochondriën. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van een versie van MGM 1 0 1 met een maltosebindend eiwit-tag is dat deze versie minder toxisch, beter oplosbaar en stabieler is dan de niet-getagde versie. Hierdoor kunnen we een hoge expressie van het native MGM 1 0 1-eiwit in e coli verkrijgen.

Hallo, mijn naam is Sarah Vicki. Ik ben senior research support specialist in het laboratorium van Dr. Jji TEN hier op de SUNY Upstate Medical University. Mijn collega, Wan Wong, en ik zullen nu de expressie en zuivering van MGM 1 0 1 demonstreren. Begin met het genereren van het fusie-eiwit door PCR te gebruiken om de mature MGM 1 0 1-coderende sequentie te amplificeren.

Sluit de eerste 22 amino-terminale residuen van MGM 1 0 1, waarvan bekend is dat ze worden afgesplitst, niet in. Na import in de mitochondriën wordt het geamplificeerde MGM 1 0 1 vervolgens stroomafwaarts van de MAL E-sequentie geplaatst, die het maltose-bindende eiwit of MVP codeert in een gemodificeerde versie van de expressievector PM MAL C twee E. Dit genereert de M-V-P-M-G-M 1 0 1-fusie met een linker die een splitsingsplaats bevat voor de precisieprotease. Het plasmide wordt eerst geconstrueerd door e. coli-transformanten te selecteren zonder de blauw-witte selectie.

Het resulterende plasmide PLC two E, MGM 1 0 1 wordt vervolgens geïntroduceerd in de e coli stam, BL two one codon plus DE three RIL, en gekweekt op LB-platen die ampicilline en chloramphenicol bevatten. Begin met het inoculeren van 10 milliliters vers aangevuld LB-medium met de e coli transformanten, geïncubeerd bij 37 degrees Celsius gedurende de nacht met schudden op 200 RPM. Inoculeer de volgende dag twee liters van het aangevulde LB-medium met 10 milliliters van de precultuur.

Kweek de cellen bij 37 °C onder schudding. Wanneer de OD 600 0,5 bereikt, induceer dan de expressie van het M-B-P-M-G-M 1 0 1 fusie-eiwit door IPTG toe te voegen tot een eindconcentratie van 0,3 mM; kweek de cellen vervolgens vijf uur lang onder schudding bij 30 °C. Nadat er vijf uur zijn verstreken, brengt u de culturen over naar centrifugeflessen van 500 ml en verzamelt u de cellen door middel van centrifugatie.

Voeg na het weggooien van het supernatant 30 milliliters lysisbuffer met protease-remmers toe en resuspendeer de celpellet door herhaaldelijk met de pipet op en neer te zuigen. Soniceren vervolgens de celsuspensie 20 seconden lang op ijs. Laat de cellen 30 seconden op ijs afkoelen met behulp van een ultrasone processor bij een duty cycle van 50%.

Herhaal vervolgens de sonicatie- en koelstappen nog twee keer. Houd de suspensie op ijs. Voeg één milliliter van een oplossing van twee milligram per milliliter toe.

Schud de cellysaten van de DNA-voorraad bij vier graden Celsius gedurende twee uur. Nadat er twee uur zijn verstreken, wordt de uiteindelijke zoutconcentratie aangepast naar 500 millimolair door vier milliliter vijf molar natriumchloride toe te voegen aan 36 milliliter lysaat.

Centrifuge vervolgens bij 10,000 ×g bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten om het celdebris te verwijderen. Overbreng de supernatant naar een nieuwe buis. Op dit punt kan een aliquot van 20 µL worden gebruikt om de efficiëntie van de lysis door sonicatie te controleren.

Op een SDS-pagegel. Vervolgens wordt het cellysaat door een amylosekolom geleid. Om het MVP MGM 1 0 1 fusie-eiwit te zuiveren, begint u met het toevoegen van 1,5 milliliters van een 50% suspensie van AMLO-hars aan een conisch buisje van 15 milliliter.

Voeg vervolgens, om het te equilibreren, 13 milliliter lysisbuffer toe en centrifugeer 5 minuten bij 2000 ×g. Herhaal deze wasstap nog vier keer en resuspendeer de hars vervolgens in 0,75 milliliter lysisbuffer. Voeg de geequilibreerde AMLO-slurry toe aan het cellysaat en laat dit voorzichtig roteren bij 4 °C gedurende de nacht.

Laad de volgende dag het mengsel van lysaat en amylosehars in een econo-kolomchromatografiekolom die in een koudekamer is geplaatst. Open de stopkraan om de niet-gebonden eiwitten via zwaartekrachtfiltratie in een opvangbuisje te laten passeren. Was vervolgens de AMLO-hars door 300 milliliters wasbuffer één toe te voegen.

Zodra dit is doorgelopen, wordt de wasstap herhaald met 150 milliliters wasbuffer twee. Na het toevoegen van Elucian-buffer en het opvangen van het EIT zoals beschreven in het tekstprotocol, wordt de opbrengst en zuiverheid van M-V-P-M-G-M 1 0 1 bepaald door een aliquot van het EIT te laden op een SDS-pagegel.

Nadat de gel is gelopen, wordt een Coomassie-kleuring uitgevoerd; er zou een prominente enkelvoudige band van ongeveer 70 kilodalton zichtbaar moeten zijn. Voeg 50 units precision protease toe aan de M-V-P-M-G-M 1 0 1 EITs en plaats dit in een dialysebuis met dialysebuffer. Laat de splitsing gedurende de nacht doorgaan bij vier graden Celsius.

Voer een SDS-PAGE-gel uit zoals voorheen. Om de efficiëntie van de splitsing te beoordelen: een volledige splitsing moet leiden tot twee banden van 42 en 28 kilodalton, die respectievelijk overeenkomen met MVP en MGM 1 0 1. Laad het gesplitste MVP MGM 1 0 1 via meerdere injecties op een bio scale mini macro prep high S-cartridge die is aangesloten op een BioRad biologic DUO flow FPLC-systeem.

Start de kationenuitwisselingschromatografie door een stapsgewijze zoutgradiënt toe te passen van 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mM en 1000 mM natriumchloride. Deze gradiënt wordt gecreëerd door buffer A en buffer B te mengen. Stel de stroomsnelheid in op 0,5 mL per minuut. Verzamel fracties van 2 mL in een fractiecollector; doorgaans elueert MGM 1 0 1 bij 500 mM zout.

Combineer de fracties voor de MGM 1 0 1 piek en controleer de zuiverheid van het eiwit op een SDS-PAGE gel. De MGM 1 0 1 piek moet een enkele band van ongeveer 28 kilodalton vertonen nadat de eiwitfracties uit de kationenuitwisselingschromatografie zijn gecombineerd en het eiwit gedialyseerd is in GF equilibratiebuffer bij 4 °C gedurende de nacht. Zet vervolgens het eiwit over in een Aveva spin 15 R ultrafiltratie-spincolumn en centrifugeer bij 3000 ×g bij 4 °C om het eiwit te concentreren.

Zodra het volume is teruggebracht tot ongeveer één milliliter, wordt MGM 1 0 1 geladen op een gekalibreerde supra six prep grade kolom die is geëquilibreerd met de chromatografiebuffer. Start de grootte-uitsluitingschromatografie met de chromatografiebuffer bij een stroomsnelheid van 0,5 milliliter per minuut. Grote oligomere eiwitten elueren in vroege fracties, terwijl kleine eiwitten in late fracties elueren. De MGM 1 0 1 ringen elueren bij ongeveer 400 Kilodaltons.

Verzamel de fracties van de gezuiverde MGM 1 0 1 pieken met een fractiecollector en breng aliquoten van de fracties aan op een 12% SDS-PAGE gel om de uiteindelijke kwaliteit van het eiwit te controleren. Concentreer het eiwit vervolgens met Aveva. Centrifugeer zes keer bij 3000 ×g bij 4 °C.

Bevries vervolgens de eiwitaliquots in microcentrifugebuisjes snel door ze gedurende twee minuten onder te dompelen in vloeibare stikstof. Bewaar de monsters bij -80 °C gedurende zes tot 12 maanden. Gebruik de MGM 1 0 1 monsters voor een single-stranded DNA-bindingsassay en voor structurele visualisatie via transmissie-elektronenmicroscopie.

De resultaten van de electrophoretic mobility shift assay tonen aan dat het gezuiverde MGM 1 0 1 een sterke bindingsactiviteit heeft voor enkelstrengs DNA. De enkelstrengs DNA-sonde wordt in toenemende mate in de wells van een native polyacrylamidegel vastgehouden door het oligomere MGM 1 0 1.

Wanneer M GM 1 0 1 wordt toegevoegd bij een concentratie hoger dan 400 nanomolar. Deze elektronenmicrografieën tonen de structurele organisatie van hogere orde van MGM 1 0 1. De vers bereide M GM 1 0 1 komt voor als afzonderlijke ringen met een diameter van 20 nanometers, wat zichtbaar kan worden gemaakt via transmissie-elektronenmicroscopie met negatieve kleuring.

Na enkele weken bewaring bij vier graden Celsius vormt MGM 1 0 1 supramoleculaire helixvormige filamenten. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze binnen één week worden voltooid.

Bedankt voor het kijken.