Name: 4D multimodale beeldvorming van Citrobacter rodentium Infecties in Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Leer 4D multimodale beeldvorming van Citrobacter rodentium-infecties in muizen met behulp van diffuse lichttomografie en micro-CT. Deze methode maakt longitudinale monitoring van bacteriële kolonisatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De in vivo imaging faciliteit aan het Imperial College werd gefinancierd door het MRC.

1. Muizen Voorbereiding <ol><li> Kopen of te fokken genoeg 18-20 g C57BL/6J-muizen nodig zijn voor de studie. </li><li> Als muizen zijn gekocht bij een externe leverancier na transport van de instelling, wennen muizen gedurende 1 week geautoclaveerd voedsel en water de darmflora stabiliseren. </li><li> Wegen, oor inkeping, en scheiden het vereiste aantal muizen per kooi. </li><li> De dag voorafgaand aan de infectie, voordat u narcose, controleer dan of er voldoende zuurstof en isofluraan voor de duur van de procedure. Indien nodig, voeg meer isofluorane of vervang de zuurstoffles. Vervolgens controleren het gewicht van de verdoving aaseters, indien zij hebben opgedaan meer dan 50 g sinds hun eerste gebruik, gooi deze weg en vervangen door verse aaseters. </li><li> Anestheseren muizen met 3% isofluorane in de XGI-8 Anesthesie System en epileren met VEET gedurende 7 minuten. </li><li> Opmerkingen: <ul><li> Grondige ontharing is essentieel, vooralzwarte muizen als melanine in de vacht aanzienlijk verzwakt de lichtgevende signaal 3,15. </li><li> Ontharen van muizen duurt meestal 8-10 dagen voor de vacht begint weer teruggroeien. Om 4D multimodale beeldvorming presteren over langere periodes, ontharen muizen wanneer nodig, zodat het gebied van belang is naakt voor de beeldvorming sessies. </li><li> Muizen zijn gehuisvest in een Biosafety Level 2 (BSL-2) opvangvoorziening. </li></ul></li></ol> 2. Bacteriële Celpreparaat <ol><li> Bereid genoeg Luria Burtani bouillon en agar platen aangevuld met kanamycine [50 ug ml-1] nodig zijn voor de studie en bewaar bij 4 ° C totdat ze nodig waren. </li><li> De dag voordat de infectie ontdooien een cryovial van C. rodentium stam ICC180 en voeg onmiddellijk een cryobead tot 15 ml LB-bouillon aangevuld met Kanamycine [50 ug ml -1] en cultuur overnacht bij 220 rpm, 37 ° C. Als controle voor middelgrote contaminatie, bereiden een extrageënte 15 ml LB-bouillon aangevuld met Kanamycine [50 ug ml -1] en cultuur bij 220 rpm, 37 ° C. </li><li> De volgende ochtend (~ 16 uur), controleer dan de medium controle voor troebelheid als een teken van de groei van bacteriën. Als de besturing is duidelijk, de overdracht van de ICC180 cultuur een falcon buis en centrifugeer bij 4.000 tpm. Vervolgens was de bacteriële pellet in PBS. Dan resuspendeer in 1,5 ml PBS (1/10 ste van het oorspronkelijke volume van LB aangevuld met kanamycine) en meng het bacterieel inoculum creëren. </li><li> Om te controleren of ICC180 goed is gekweekt en is bioluminescent voorafgaand aan infectie van de muizen, de afbeelding van het inoculum in de IVIS Spectrum CT met BLI en de automatische instelling in de Living Afbeelding 4.3.1 tovenaar zoals eerder beschreven 1. Opmerking: <ul><li> Stam ICC180 is een lichtgevende afgeleide van wild-type C. rodentium ICC169 2. Deze bacteriestam is de lux operon CDABE inclusief Kanamycin resistentie gen ingebracht in een pseudogen van xylE in het chromosoom 2. </li><li> Het uitvoeren van alle bacteriële kweken met de standaard aseptische technieken en indien nodig ofwel de aankoop steriele verbruiksgoederen / reagentia of autoclaaf voorafgaand aan gebruik. </li><li> In stap 2.4, kan de bioluminescentie lezing (p / s / cm 2 / sr) worden gebruikt om bacteriële aantallen schatten vóór de infectie van muizen. </li></ul></li></ol> 3. Infectie van Muizen met Bioluminescent C. rodentium en Beoordeling van de bacteriële kolonisatie <ol><li> Voorafgaand aan de infectie, controleren of er voldoende zuurstof en isofluraan voor de duur van de procedure. Indien nodig, voeg meer isofluorane of vervang de zuurstoffles. Vervolgens controleren het gewicht van de verdoving aaseters, indien zij hebben opgedaan meer dan 50 g sinds hun eerste gebruik, gooi deze weg en vervangen door verse aaseters. </li><li> Anestheseren muizen met 3% isofluorane met een XGI-8 Anaesthesia Systeem om humane terughoudendheid te bieden. </li><li> Meng de bacteriële inoculum grondig en trekken 0,2 ml (ongeveer 5 x 10 9 kve ICC180) in de spuit. </li><li> Verwijder muizen uit de narcose systeem een ​​voor een en nekvel ze door stevig grijpen de huid achter de nek met uw duim en wijsvinger. </li><li> Duw de maagsonde naald naar het dak van de mond, op de tong, en de slokdarm en injecteer het bacterieel inoculum in de maag. </li><li> Na orale maagsonde van de muizen, toezicht op hun manier van lopen en ademhaling voor tekenen van nood kan een teken zijn dat de bacteriële inoculum is afgeleverd in de longen kan worden. Euthanaseren alle muizen die zijn geïnoculeerd in de longen. </li><li> Gavage geïnfecteerde muizen met 200 ul PBS als voertuigcontrole, zoals beschreven in stappen 3.1-3.6. </li><li> Om te bevestigen dat de orale sondevoeding correct werd uitgevoerd, afbeelding geïnfecteerde en mock geïnfecteerde muizen in de IVIS Spectrum CT met BLI en de automatische instelling in de LivingAfbeelding 4.3.1 tovenaar zoals eerder beschreven 1. </li><li> Bepaal het aantal levende bacteriën in het inoculum door seriële verdunning in PBS en in drievoud spotten op LB-agar aangevuld met kanamycine [50 ug ml-1]. </li><li> Bereken het aantal ICC180 cfu / ml van het vinden van een verdunning waar ongeveer 5-50 kolonies en tel het aantal kolonies van elke vlek op dat verdunning en noteer de verdunning die de kolonies werden geteld op. Vervolgens berekent het gemiddelde aantal cfu (van de drie plekken) en vermenigvuldig deze waarde met de verdunningsfactor 50 (elke vlek is 20 ul van het oorspronkelijke monster 1 ml) en de verdunning van de kolonies werden geteld op, waardoor cfu / ml. </li><li> Monitor kolonisatie van de muizen dagelijks door het verzamelen uitwerpselen van elke muis in een vooraf gewogen Eppendorf buis (gewogen op een goede balans) en verdund 1/10 in PBS gebaseerd op het gewicht van het monster (0,1 g ml-1). </li><li> Bepaal het aantal levensvatbare bacteriën inde ontlasting door seriële verdunning in PBS en in drievoud spotten op LB-agar aangevuld met kanamycine [50 ug ml-1]. </li><li> Bereken het aantal levende bacteriën per gram faeces volgens de punten 3.9, vermenigvuldigt het aantal cfu / ml van de fecale verdunningsfactor in PBS (stap 3.10) van 0,1 g ml-1 tot cfu / g. </li><li> Om te bepalen dat muizen werden geïnoculeerd met een zuivere cultuur ICC180 en dat alle kolonies bioluminescent. Neem de agar platen uit stap 3.8, beoordeelt de bacteriële kolonie morfologie hetzij door het oog of kies een vertegenwoordiger kolonie van de plaat en te analyseren met behulp van lichtmicroscopie. Eventueel kan de identificatie van bacteriën door stamspecifieke kolonie PCR worden uitgevoerd om cultuur zuiverheid te beoordelen. Vervolgens heeft het imago van de platen in de IVIS Spectrum CT met BLI zoals beschreven in stap 3.7 en controleer of 100% van de kolonies op de plaat zijn bioluminescentie. Opmerkingen: <ul><li> In stap 3.4, bij het plaatsen van de maagsonde naaldAls je weerstand voelt niet dwingen de maagsonde naald, omdat dit zorgt ervoor dat de entstof te gaan in de longen. In plaats daarvan, opnieuw steek de naald en voorzichtig opnieuw te proberen. </li><li> Stap 3.1 is optioneel en muizen kunnen mondelinge gavaged worden zonder verdoving, afhankelijk van de instituten het dierenwelzijnsbeleid. </li><li> Ontlasting moet worden uitgestreken de dag dat ze worden verzameld. C. rodentium zal groeien, zelfs indien bij 4 ° C geïncubeerd in PBS en kan de kwantificering van cfu / g ontlasting onjuist. </li></ul></li></ol> 4. Dagelijkse Composite 3D Diffuus licht Imaging Tomografie met μCT Imaging (DLIT-μCT) van geïnfecteerde muizen Dierenwelzijnsoverwegingen: DLIT-μCT impliceert DLIT optische beeldvorming geïntegreerd met een snelle, lage stralingsdosis μCT scan (~ 23 mGy voor een twee muis scan, ~ 53 mGy voor een enkele muis-scan) van een geïmmobiliseerd dier. Deze dosis hoopt zich bij elke opnamesessie, zodat het doel is te houden de dosis als low mogelijk (en altijd ver onder de LD 50/30), terwijl nog steeds de studie volbrengen. In sommige gevallen, als er geen teken van infectie in een conventionele BLI scan van muizen, de μCT scan kan worden vermeden dosis verder te minimaliseren. Ook al dosis wordt gehouden zo laag mogelijk, in langdurige studies als er een bezorgdheid over de blootstelling aan straling, zullen muizen worden gedood bij het eerste teken van nadelige symptomen of aan het einde van de μCT beeldvorming periode. <ol><li> Voorafgaand aan de beeldvorming, initialiseren de IVIS Spectrum CT en controleer of de X-ray veiligheidsblokkeringen werken en dat de verhitte fase is op de juiste temperatuur (37 ° C) voor de beeldvorming. Vervolgens moet u het peil van isoflourane in de anesthesie-systeem en het gewicht van de verdoving aaseters. Indien nodig, voeg meer isofluorane en als de aaseters hebben opgedaan meer dan 50 g sinds hun eerste gebruik, gooi ze weg en vervangen door verse aaseters. </li><li> Opzetten van het Spectrum CT, zodat de beeldvorming parameters diedraaien de functie automatische belichting in Living Afbeelding 4.3.1 zijn geoptimaliseerd voor de beeldvorming bacteriële luciferase. Kies Bewerken&gt; Voorkeuren&gt; Acquisitie en Auto Exposure Window. Selecteer vervolgens&gt; Range Values&gt; Exp. (Seconden) en stel de&gt; Max. tot 300s. Ten slotte selecteert u&gt; Target Graaf (minimum)&gt; Luminescente en ingesteld op 10,000 telt. </li><li> Steek de ene muis imaging platform in de Spectrum CT en loodrecht het in de anesthesie. </li><li> Schakel de X-ray veiligheidsvergrendeling en initialiseren van de IVIS. </li><li> Zodra de IVIS Spectrum CT is geïnitialiseerd, verdoven de muizen met 3% isofluorane met een XGI-8 anesthesie-systeem op een menswaardige terughoudendheid te bieden. </li><li> Om te bepalen of het nodig is om een DLIT-μCT scan, pre-imago van de muizen met behulp van BLI zoals eerder 1 beschreven, in de ene muis imaging platform uit te voeren. Als een sterk signaal wordt verkregen muis geschikt voor DLIT beeldvorming. Laat de verdoofde muis in de ene muis imaging platform na de BLI scan klaar voor DLIT-μCT. </li><li> Gebruik de Imaging Wizard in de Living Image software 4.3.1 voor de set-up van de DLIT-μCT scan. De Imaging Wizard bepaalt automatisch de FOV, belichtingstijd, F-stop en binning voor de DLIT en het FOV, belichtingstijd, filter sets en binning voor de μCT beeldvorming om het beste signaal te geven ruisverhouding. Wanneer u wordt gevraagd door de Imaging Wizard, zijn alleen de 560, 580, 600, en 620 nm emissie filters en selecteer de ene muis μCT scan. Klik vervolgens op&gt; Ophalen om de beeldvorming te starten. </li><li> Terug de verdoofde muis naar zijn kooi na beeldvorming, verwijder de ene muis imaging platform van het Spectrum CT en desinfecteren met behulp van 1% Tri-gen. Indien nodig, vervangen schuimkussen dat de muis wordt op het risico van kruisbesmetting tussen muizen minimaliseren. </li><li> Afbeelding muizen dagelijks tot dag 8 na infectie (PI) met DLIT-μCT, zoals beschreven in stappen 4,1-4,8, de longitudinale beeldgegevens moeten 4D mo maken genererenvie van infectie. Opmerking: <ul><li> In stap 4.7, raden wij het gebruik van de 560-620 nm emissie filters om afbeelding bacteriële bioluminescentie. Hoewel de piek van bacteriële bioluminescentie is ongeveer 485 nm, door weefsel optica (de aanzienlijke vermindering van blauw / groen fotonen murine weefsel) is het belangrijk om de oranje / rode fotonen voor 3D-reconstructies die de berekening van de signaal diepte vergemakkelijken . </li><li> De &#39;auto&#39; belichtingsinstellingen in Living Afbeelding 4.3.1 voor DLIT moeten worden aangepast aan de hoeveelheid fotonen gevangen en de maximale imaging tijd gebruikt voor elk filter set te optimaliseren. </li><li> Het is alleen nodig als de invloed van de BLI pre-beeldvorming beschreven in stap 4.6 als de onderzoeker niet zeker of er een bioluminescente detecteerbaar signaal, bijvoorbeeld bij gebruik van een nieuwe infectie model. </li></ul></li></ol> 5. 3D Reconstructie van DLIT-μCT Imaging gegevens <ol><li> Open Living Image software 4.3.1 en selecteer&gt;, Bladeren en open de map met de DLIT-μCT bestanden. </li><li> Open de DLIT-μCT bestand in de Living Afbeelding Browser, bijvoorbeeld C. rodentium Dag 1 PI door te klikken op Load. </li><li> In de Tool Palette select&gt; Surface Topografie&gt; Naakt muis, passen de drempel, en klik vervolgens op&gt; Generate Surface. Als het oppervlak reconstructie is succesvol een oppervlakte omtrek wordt weergegeven in het venster 3D. </li><li> Om de diensten verschaft μCT scan in het venster 3D bekijken, verberg het oppervlak omtrek (Klik&gt; 3D optische instrumenten en deselecteer&gt; Beeldscherm Surface Object), of verlaag de oppervlakte dekking (Klik&gt; 3D optische instrumenten en pas de&gt; ondoorzichtigheid schuifbalk). </li><li> Voor gedetailleerde anatomische lokalisatie van de 3D DLIT reconstructie moet de 3D volumetrische data (μCT scan) wijzigen zodat alleen het skelet muis zichtbaar is en dat het de optimale contrast. Klik&gt; 3D Multimodaliteit gereedschappen en selecteer&gt; logaritmische Histogram, Gradient Verlichting, Kwaliteit en Denoise. Tot slot passen de Histogram schuifbalk naar rechts en de 3D volumetrische data verandering contrast kijken. Houd het aanpassen van de gegevens totdat alleen de botten zijn duidelijk zichtbaar. Indien gewenst, verandert de kleur van de overdrachtsfunctie punten op het histogram. </li><li> Volgende select&gt; DLIT 3D Wederopbouw in de Tool Palette en zorg ervoor dat alleen de 560, 580, 600, en 620 nm filter sets, die nodig zijn voor de beeldvorming bacteriële luciferase in vivo, zijn geselecteerd. Klik op&gt; Start. De gegevens Preview menu Venster verschijnt nu met de spectraal gefilterde BL signalen van de muis die werd afgebeeld in 2D. Deze signalen worden automatisch thresholded door de software, maar kan handmatig worden aangepast, indien nodig met behulp van tabs aan de onderkant van het menu. De drempel bepaalt de minimum data-intensiteit (weergegeven als een percentage van het maximum signaal in de afbeelding), die zal worden opgenomen data in de reconstructie. </li><li> Volgende select&gt; DLIT 3D Wederopbouw in de Tool Palette en controleer of de optische eigenschappen die voor de DLIT reconstructie correct zijn. Selecteer&gt; tabblad Eigenschappen en zorg ervoor dat de instellingen voor Tissue Properties is ingesteld op de muis weefsel, is Source Spectrum ingesteld op bacteriën. </li><li> Klik&gt; Reconstrueer aan de DLIT reconstructie uit te voeren. </li><li> Om de DLIT-μCT 3D-film klikken genereren&gt; Extra&gt; 3D-animatie en selecteer&gt; Preset Animaties&gt; CCW Y-as en&gt; Totaal Looptijd&gt; 10 sec (25 frames per seconde). Zodra de instellingen voor de 3D-animatie juist pers&gt; Opnemen en opslaan van de DLIT-μCT 3D reconstructies als. Avi-bestanden gelabeld met het experiment, groep en tijdstip in een aparte map. Opmerking: <ul><li> Het is van belang bij het uitvoeren van 3D-reconstructies van DLIT-μCT data naar een PC te gebruiken met Living Afbeelding 4.3.1 en dienstenpakket 1 is geïnstalleerd en dat de PC een grafische kaart geschikt voor het uitvoeren van de multi-modaliteit beeldvorming software. This software kan worden gedownload, en GPU specificaties zijn opgenomen in de release notes ( <a href="http://www.caliperls.com/support/software-downloads.htm" target="_blank">http://www.caliperls.com/support/software-downloads.htm</a> ). </li><li> Als de DLIT-μCT 3D reconstructies na gered lijken achteruit, wordt uw computer een oude versie van zijn grafische driver en dit kan door een update van de website van de fabrikant downloaden worden verholpen. </li><li> In stap 5, presenteren wij onze voorkeursinstellingen voor het genereren van 3D DLIT-μCT reconstructies. Er zijn echter meerdere punten in de 3D-reconstructies waar parameters die niet in dit protocol worden besproken kunnen worden gemodificeerd. Voor een uitgebreide gids voor 3D-reconstructies met behulp van Living Afbeelding 4.3.1 wordt verwezen naar de fabrikant handleiding. </li><li> Het is belangrijk om de 3D-reconstructies met identieke instellingen in de multi-modaliteit beeldvorming gereedschap zodanig dat ze vergelijkbaar te maken. Naastdeze, bij het maken van de DLIT-μCT 3D reconstructies, is het belangrijk om de video&#39;s met hetzelfde aantal frames per seconde en de totale duur (lengte), anders wordt de timing van de 4D video is niet homogeen te maken. </li></ul></li></ol> 6. Generatie van een 4D film van C. rodentium Infectie <ol><li> Duidelijk alle van de DLIT-μCT 3D-reconstructies met de juiste experiment, tijdstip en de groep in een gemakkelijk toegankelijke map labelen. </li><li> Maak een nieuw bestand in Windows Live Movie Maker en steek de DLIT-μCT reconstructies in chronologische volgorde vanaf dag 1 PI met het tabblad gereedschappen uit de map bereid in stap 6.1. </li><li> Bijschriften toe te voegen aan het begin van elke video het beschrijven van de tijdstip, bijvoorbeeld dag 1 PI door de juiste DLIT-μCT video te selecteren en dan Home&gt; Bijschrift toevoegen. Een tekstvak verschijnt op het scherm, waar de juiste legende wordt toegevoegd. Pas de lettertype grootte, stijl, kleur, en rechtvaardiging als desired met identieke tabbladen om Microsoft Word in de werkbalk software. Tot slot verplaatst de titel om de linker bovenhoek van de video. </li><li> Herhaal stap 7.3 voor alle DLIT-μCT video&#39;s. </li><li> Voeg een titelpagina, bijvoorbeeld C. rodentium infectie dagen 1-8 door te klikken op Home&gt; Titel. Een tekstvak verschijnt op het scherm waar de juiste titel wordt toegevoegd aan een lege dia. Pas de lettertype grootte, stijl, kleur, en de verantwoording naar wens gebruik identiek tabbladen om Microsoft Word in de werkbalk software. </li><li> Sla het project als Movie Maker-project * MMP in een geschikte map met de titel van de film. Deze stap is essentieel als u de film wilt wijzigen. </li><li> Sla de film als een. Wmv-bestand. Klik Filmmenu maker&gt; Opslaan film&gt; voor computer. </li><li> Zetten de movie maker bestand met behulp van een file converter naar. Avi of een andere geschikte bestandstype compatibel zijn met uw computer. Opmerkingen: <ul><li> Het wordt aanbevolen dat de 4D filmsworden gegenereerd op een PC met Windows Live Movie Maker geïnstalleerd ( <a href="http://windows.microsoft.com/en-GB/windows7/products/features/movie-maker" target="_blank">http://windows.microsoft.com/en-GB/windows7/products/features/movie-maker</a> ) en een goede multi-media programma kan afspelen. wmv of. avi-bestanden typen. </li></ul></li></ol>

<ol><li>Chang, M. H., Cirillo, S. L., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Luciferase+to+Image+Bacterial+Infections+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice.</a> J. Vis. Exp. (48), e2547(2011).</li>
<li>Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infect Immun. 74, 5391-5396 (2006).</li>
<li>Wiles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+specificity%2C+colonization+and+clearance+dynamics+in+vivo+following+oral+challenges+with+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Cell Microbiol. 6, 963-972 (2004).</li>
<li>Wiles, S., Dougan, G., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+a+%27hyperinfectious%27+bacterial+state+after+passage+of+Citrobacter+rodentium+through+the+host+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Emergence of a 'hyperinfectious' bacterial state after passage of Citrobacter rodentium through the host gastrointestinal tract.</a> Cell Microbiol. 7, 1163-1172 (2005).</li>
<li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifidobacterial+surface-exopolysaccharide+facilitates+commensal-host+interaction+through+immune+modulation+and+pathogen+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Bifidobacterial surface-exopolysaccharide facilitates commensal-host interaction through immune modulation and pathogen protection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2108-2113 (2012).</li>
<li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li>
<li>Collins, J. W., et al. Pre-treatment with Bifidobacterium breve UCC2003 modulates Citrobacter rodentium-induced colonic inflammation and organ specificity of infection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCollins%2C+JW+%22Microbiology%22">Microbiology</a>. , 10-1099 (2012).</li>
<li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol. Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li>
<li>Hardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+replication+of+Listeria+monocytogenes+in+the+murine+gall+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder.</a> Science. 303, 851-853 (2004).</li>
<li>Szittner, R., Meighen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence%2C+expression%2C+and+properties+of+luciferase+coded+by+lux+genes+from+a+terrestrial+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium.</a> J. Biol. Chem. 265, 16581-16587 (1990).</li>
<li>Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+antituberculosis+drug+activity+in+vitro+and+in+macrophages+using+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence.</a> J. Antimicrob. Chemother. 67, 404-414 (2012).</li>
<li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J. Biomed. Opt. 12, 024007(2007).</li>
<li>Cronin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+vivo+bioluminescent+imaging+for+the+study+of+bacterial+tumour+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting.</a> PLoS One. 7, e30940(2012).</li>
<li>Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrobacter+rodentium+of+mice+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Citrobacter rodentium of mice and man.</a> Cell Microbiol. 7, 1697-1706 (2005).</li>
<li>Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+variations+of+skin+pigmentation+in+C57BL%2F6+mice+affect+optical+bioluminescence+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation.</a> Mol. Imaging Biol. 13, 1114-1123 (2011).</li>
<li>Wiles, S., Crepin, V. F., Childs, G., Frankel, G., Kerton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+biophotonic+imaging+as+a+training+aid+for+administration+of+substances+in+laboratory+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Use of biophotonic imaging as a training aid for administration of substances in laboratory rodents.</a> Lab Anim. 41, 321-328 (2007).</li>
<li>Crepin, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+role+of+the+Tir%3ANck+and+Tir%3AIRTKS%2FIRSp53+signalling+pathways+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dissecting the role of the Tir:Nck and Tir:IRTKS/IRSp53 signalling pathways in vivo.</a> Mol. Microbiol. 75, 308-323 (2010).</li>
<li>Willekens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+radiation+dose+in+micro-CT+with+optimization+of+the+scan+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22ContrastMedia+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the radiation dose in micro-CT with optimization of the scan protocol.</a> ContrastMedia Mol. Imaging. 5, 201-207 (2010).</li>
<li>Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-animal+X-ray+dose+from+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Small-animal X-ray dose from micro-CT.</a> Mol Imaging. 3, 149-158 (2004).</li>
<li>Sato, F., Sasaki, S., Kawashima, N., Chino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+effects+of+whole+or+partial+body+x-irradiation+on+mice%3A+life+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiat.+Biol.+Relat.+Stud.+Phys.+Chem.+Med%22%5BJournal%5D)">Late effects of whole or partial body x-irradiation on mice: life shortening.</a> Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. 39, 607-615 (1981).</li>
<li>Kohn, H. I., Kallman, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+strain+on+acute+x-ray+lethality+in+the+mouse.+II.+Recovery+rate+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat.+Res%22%5BJournal%5D)">The influence of strain on acute x-ray lethality in the mouse. II. Recovery rate studies.</a> Radiat. Res. 6, 329-338 (1957).</li>
</ol>

Productie en gratis toegang tot dit artikel wordt gesponsord door PerkinElmer. De auteurs Kevin P, Francis, Jeff Meganck en Chaincy Kuo zijn medewerkers van de Beugel-A PerkinElmer Company. Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de dieren Wetenschappelijke Procedures Act 1986 en werd goedgekeurd door de lokale Ethische Commissie ter beoordeling.

De 4D film van een bacteriële infectie een nuttig hulpmiddel om grote hoeveelheden van multi-modaliteit beeldvorming gegevens snel en gemakkelijk visualiseren en interpreteren. Deze techniek maakt een gedetailleerde analyse van hoe een infectie verspreidt een individuele muis kan worden gebruikt om te onderzoeken hoe deletie van gastheer of bacteriële genen of bijzondere interventiestrategieën effect bacteriële belasting, distributie en lokalisatie in een longitudinale studie 7. Deze video&#39;s geven ook nuttig leermiddelen en een middel van het verspreiden van informatie aan het publiek. Er zijn een aantal cruciale stappen in dit protocol kunnen hebben voor de kwaliteit van de gegevens van DLIT-μCT beeldvorming en de mogelijkheid om een ​​4D video infectie stellen. Het belangrijkste onderdeel van dit protocol is de succesvolle en homogene infectie van muizen met C. rodentium. Het is essentieel dat de muizen gebruikt voor de studie tussen 18-20 g en dat de bacrial inoculums worden vers bereid en ongeveer 5 x 10 9 cfu, zoals eerder beschreven 2,3. Voorafgaand aan infectie van de muizen is het belangrijk om te controleren dat het inoculum is bioluminescent met de Spectrum CT en zodra het inoculum is opgesteld, moet het voortdurend worden gehomogeniseerd elke muis wordt gavaged zodat de muizen op vergelijkbare infectieuze doses. De DLIT-μCT beeldvorming van muizen is geoptimaliseerd zodat de functie Automatische belichting in Living Afbeelding 4.3.1 software bepaalt automatisch de geoptimaliseerde beeldvorming parameters voor het signaal om goed boven het lawaai. De functie automatische belichting voert de gebruiker gedefinieerde instellingen en parameters die moeten worden gemodificeerd zoals beschreven in de procedure. Doet u dit niet zal resulteren in slechte beelden met een lage aantal fotonen verzameld die niet resulteren in een duidelijke progressie in de infectie, als de fabrieksinstellingen van de Spectrum CT voor automatische belichting zijn geprogrammeerd voor imaging tumoren dievuurvliegluciferase. Reconstructies uitgevoerd met 560-620 nm de beste overeenkomst tussen gesimuleerde en gemeten data en dus zijn de meer betrouwbare gegevens om in de reconstructie. Een beperking van het gebruik van DLIT-μCT is dat ioniserende straling van de μCT scan veroorzaakt sublethale bestraling schade die cumulatief in een longitudinale studie 18. Subletaal blootstelling aan straling kan de immuunrespons verzwakken, leiden tot DNA-schade en apoptose in interne organen 19. Uiteindelijk kan cumulatief subletale stralingsschade dood veroorzaken als de LD 50/30 van ioniserende straling wordt overschreden, die tussen 5-7 Gy naargelang de muis stam en leeftijd van de muizen gebruikt 18,20,21. Hoewel sommige van de moleculaire schade als gevolg van ioniserende straling kan genezen, omdat het overkoepelende principe is om dosis conservatief schatten, wordt dit meestal niet verantwoord in studieplanning. Integendeel, de bedoeling is om te verblijven zoveel below deze grenzen mogelijk terwijl nog steeds het realiseren van de leerdoelen. Dit is vooral belangrijk bij dit onderzoek door de normale immuunrespons op de infectie, kan de frequentie van de beeldvorming en het feit dat transgene, immuno-bestaande of zwaar geïnfecteerde dieren gevoeliger voor ioniserende straling. Bij het ​​plannen van het experiment een 4D film infectie genereren, is het belangrijk de lengte van het experiment beschouwen, het aantal scans μCT vereist tijdens deze periode en de LD 50/30 van ioniserende straling voor de muis stam gebruikt. Een andere mogelijke beperking tot DLIT-μCT is de kracht van de reporter uitdrukking binnen de bacteriestam wordt gebruikt, omdat dit van invloed op bacteriële detectielimieten en imaging keer. Het is sterk aanbevolen dat de onderzoekers gebruiken gevalideerde bacteriestammen die volledig virulent, maar geoptimaliseerd voor maximale lux operon meningsuiting, zoals eerder aangetoond voor BLI2,3. Een waarschuwing aan het huidige ontwerp van de 4D beeldvorming is dat elke film bestaat uit afzonderlijke DLIT-μCT scans die verschillende foton schalen hebben. Dit kan de beelden moeilijk te interpreteren maken als de wijzigingen in de lokalisatie van de BL brandpunten, of de intensiteit zijn subtiel, of als er een intense BL focus, omringd door meerdere zwakke foci. Daarom is voor longitudinale visualisaties, is het belangrijk de kleurenbalken consistent houden over de tijdstippen. Het begrip 4D film infectie kan worden toegepast op elke geschikte wijze gemerkte bacteriële pathogenen. Toekomstige ontwikkeling van deze techniek zal streven naar fluorescentiebeelvorming tomografie (FLIT) alsook DLIT gebruiken om het onderzoek van gastheer reacties op infectie met behulp van een combinatie van bioluminescentie bacteriële pathogenen en injecteerbare fluorescerende nabij infrarood sensoren om gastheer responsen te onderzoeken om infectie te vergemakkelijken. In aanvulling op deze, alleen in dit protocol hebben webeschrijven het gebruik van bioluminescente bacteriën 4D films infectie creëren. Echter, in sommige gevallen noodzakelijk om fluorescent gemerkte bacteriën gebruiken kunnen bijvoorbeeld gelabeld met IRFP, zodat de bioluminescente reportergen kan worden gebruikt voor het onderzoeken van genetica van tijdens infectie. Belangrijk is, zal het gebruik van multi-modaliteit beeldvorming combineert DLIT / FLIT-μCT ons toelaten om meerdere parameters niet-invasieve onderzoeken van een bacteriële infectie, die aanzienlijk zal bijdragen tot de vermindering, verfijning en vervanging van het gebruik van dieren bij wetenschappelijk onderzoek zoals uiteengezet in het initiatief van de NC3R&#39;s ( <a href="http://www.nc3rs.org.uk/" target="_blank">http://www.nc3rs.org.uk/</a> ).

Kleine diermodellen, met name het gebruik van muizen, worden routinematig gebruikt om bacteriële pathogenese onderzoeken of interventiestrategieën testen op infecties, zoals antibiotica, probiotica, prebiotica en vaccins 1-7. De belangrijkste experimentele uitlezingen van kleine dieren infecties pathogenen, ruimtelijke en temporele lokalisatie van de infectie, en veranderingen in de immuunrespons van het geïnfecteerde organisme. In vivo optische beeldvorming is een waardevol hulpmiddel voor infectieziekten en kan worden gebruikt voor het monitoren meerdere experimentele uitlezingen door het gebruik van reportergenen (luciferase, fluorescent eiwit, beta-lactamase, enz.), fluorescente kleurstoffen, nanodeeltjes of chemiluminescente probes gericht op een eiwit biologisch proces of micro-organisme 6. Bioluminescentie (BLI) is een optisch beeldvormende modaliteit gebruikt om de kolonisatie van kleine dieren, zoals muizen en ratten controleren door pathogene bacria 3,6,8,9. Muizen geïnfecteerd met recombinant bacteriën een luciferase expressie, zoals het lux operon CDABE van Photorhabdus luminescens. Deze bacteriën kunnen vervolgens worden gedetecteerd door de productie van licht met een CCD gevestigd in vivo imaging systeem 3,6,9. Belangrijk is alleen metabool actieve micro-organismen bioluminescerende (BL), waardoor alleen levensvatbare bacteriële cellen worden gemeten door deze methode 10,11. Gebruik 2D BLI, de locatie van de BL bron wordt afgeleid uit het oppervlak van het dier wanneer het signaal wordt uitgezonden 8. De exacte anatomische lokalisatie van de BL foci in vivo moet worden bepaald door ex vivo analyse van 3,6,9 organen kunnen daarentegen samengestelde 3D ​​diffuus licht imaging tomografie (DLIT) worden gebruikt om een kwantitatieve 3D reconstructie van de BL samenstellen bron 12. DLIT wordt uitgevoerd door het verzamelen van BL beelden zijn gemaakt met behulp gedefinieerd smalle band-pass optische filters enze vervolgens invoeren in een diffuse optische tomografie 3D reconstructie-algoritme 1,7,12,13. Momenteel, multi-modaliteit beeldvorming is de enige methode beschikbaar true non-invasieve anatomische lokalisatie van bioluminescent foci in vivo krijgen zonder dat ex vivo analyse. Onlangs, hebben we gebruik gemaakt van een combinatie van DLIT co-ingeschreven bij μCT beeldvorming om Citrobacter rodentium (C. rodentium) kolonisatie dynamiek evalueren na profylactische behandeling met een probioticum bacterie 7. C. rodentium is een muizen specifiek darmpathogeen gebruikt om het model menselijke besmetting met enteropathogene en enterhemorrhagic Escherichia coli 14. C. rodentium infectie veroorzaakt colitis, doorgaans geassocieerd met milde gewichtsverlies, diarree, gepolariseerde Th1 immuunrespons en duidelijke pathologische veranderingen, waaronder dikke crypte hyperplasie en vastmaken en uitwissen laesie formatiop 14. Naast deze, C. rodentium pathogenese is grondig bestudeerd met behulp van BLI en de kolonisatie dynamiek in C57BL/6J-muizen zijn goed gedocumenteerd, waardoor deze bacterie een ideaal model organisme voor gebruik met multi-modaliteit beeldvorming 3,4,7. Dit protocol is de eerste van een methodologie voor geïntegreerde DLIT-μCT beeldvorming van een bacteriële infectie met behulp van een multimodale beeldvorming platform, de IVIS Spectrum CT, en het genereren van een 4D-film toont de ware dynamiek van deze infectie niet-invasief schetsen.

<table><tbody><tr><td>Bioluminescent C. rodentium</td><td>Frankel lab</td><td>ICC180</td><td>Wiles et al., 2004</td></tr><tr><td>Veet</td><td>Boots</td><td></td><td>Optimale ontharingstijd is 7 min. Ontharing werkt beter als de crème goed wordt ingewreven.</td></tr><tr><td>Isofluoraan (100% v/v)</td><td>Abbott</td><td>B506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Medische zuurstof</td><td>BOC Medical</td><td></td><td>Grootte F-cilinder. Opgelet: een geschikte regulator is vereist.</td></tr><tr><td>Luria Bertani bouillon</td><td>Merck</td><td>1.10285.0500</td><td>25 g in 1L Gedemineraliseerd water.</td></tr><tr><td>Luria Bertani agar</td><td>Merck</td><td>1.10283.0500</td><td>37 g in 1L Gedemineraliseerd water.</td></tr><tr><td>Kanamycinesulfaat</td><td>Sigma (Fluka)</td><td>60615</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml polypropyleen conische Falcon-buizen</td><td>BD (Falcon)</td><td>352070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Universals</td><td>Corning (Gosselin)</td><td>E5633-063</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1 ml-sering</td><td>BD (Plastipak)</td><td>300013</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Orale doseringsnaald (16G x 75 mm) gebogen</td><td>Vet Tech</td><td>DE005</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microbanks (Cryovial)</td><td>Pro-Lab Diagnostics</td><td>PL.170/Y</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum CT</td><td>Caliper- a PerkinElmer Company</td><td>133577 Rev A/ Spectrum CT</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>6kVA UPS</td><td>Caliper- a PerkinElmer Company</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>XGI-8 anesthesiesysteem</td><td>Caliper- a PerkinElmer Company</td><td>118918</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>XAF-8 Anesthesiefilter houtskool</td><td>Caliper- a PerkinElmer Company</td><td>118999/00</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Living Image v4.3.1 SP1</td><td>Caliper- a PerkinElmer Company</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Benchtop schuddende incubator</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 44</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4"> </td></tr></tbody></table>

4d multimodale beeldvorming van<em&gt; citrobacter rodentium</em&gt; infecties in muizen

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om longitudinaal monitoren een bioluminescerend bacteriële infectie met behulp van composiet 3D diffuus licht beeldvorming tomografie met geïntegreerde μCT (DLIT-μCT) en het latere gebruik van deze gegevens om een ​​vierdimensionale (4D) filmpje van de infectie cyclus te genereren. Om de 4D infectie films te ontwikkelen en de DLIT-μCT beeldvorming voor bacteriële infectie studies met behulp van een IVIS Spectrum CT valideren, gebruikten we een infectie met lichtgevende C. rodentium, die zelfbeperkende colitis bij muizen veroorzaakt. In dit protocol, schetsen we de infectie van muizen met lichtgevende C. rodentium en niet-invasieve bewaking van kolonisatie door dagelijkse DLIT-μCT imaging en bacteriële telling van feces gedurende 8 dagen. Het gebruik van de IVIS Spectrum CT vergemakkelijkt naadloze co-registratie van optische en μCT scans met behulp van een enkel imaging platform. De lage dosis μCT modaliteit maakt de beeldvorming van muizenOp verschillende tijdstippen tijdens infectie, het verstrekken van gedetailleerde anatomische lokalisatie van lichtgevende bacteriën brandpunten in 3D zonder dat artefacten uit de cumulatieve straling. Belangrijk is dat de 4D films van geïnfecteerde muizen bieden een krachtige analytische tool om bacteriële kolonisatie dynamiek volgen in vivo.

Infectie van C57BL/6J-muizen met 5 x 10 9 kve C. rodentium is een goed beschreven bacteriële infectie model en resulteert in een zelf-beperkend gastrointestinale infectie die pieken tussen dagen 6-8 na infectie en duurt tussen 3-4 weken 2,14. De infectie wordt beperkt tot het intestinale lumen van het murine immuunsysteem en als gevolg daarvan, worden de bacteriën continu werpen in de feces. Kolonisatie van muizen door C. rodentium kan non-invasief worden gevolgd door directe bacteriële opsomming van uitwerpselen, of bioluminescentieweergave 2,3. Dit manuscript schetst een geoptimaliseerd protocol voor het uitvoeren van 3D-en 4D multimodale beeldvorming in C. rodentium binnen muizen om bacteriële belasting en lokalisatie tijdens infectie te controleren. De in figuur 1 tonen de resultaten controles die nodig zijn voor succesvolle 4D beeldverwerking. Voorafgaand aan de infectie van muizen is het essentieel te ontmoedigenmijn die de bacteriële inoculum gebruikt is bioluminescentie (Figuur 1A) en dat na de orale sondevoeding van een muis met lichtgevende C. rodentium, dat het signaal kan worden waargenomen in de maag van het dier en niet in de longen (Figuur 1B) 16. Naast het monitoren van bacteriële kolonisatie met bioluminescentieweergave, is het verstandig om bacteriële aantallen kwantificeren faeces die wordt gebruikt als een indirecte meting van bacteriële kolonisatie van de maag mucosa Figuur 2 toont de typische bacteriële verontreiniging in feces uit 8 C57BL6 / J. muizen die zijn geïnfecteerd met 5 x 10 ~ 9 cfu ICC180 en bewaakt van 8 dagen PI Colonization stijgt van dag 2 tot dag PI 6-7 waar de infectie pieken bij ongeveer 5 x 10 10 cfu / g, dat is in lijn met eerdere rapporten 2,3,17. Om het belang van evaluatie benadrukkenting van de verspreiding van de infectie in een enkele muis, figuren 1b en 3, alsmede Video 1 zijn gegenereerd uit dezelfde muis na C. rodentium infectie, zoals hierboven beschreven. Dagelijks DLIT-μCT werd gebruikt om de ruimtelijke verdeling van bioluminescente bacteriën in deze muis evalueren, met het skelet als een anatomische referentie. Figuur 3 toont de DLIT-μCT reconstructie van C57BL/6J muizen geïnfecteerd met ICC180 op 3 belangrijke tijdstippen PI At dag 3 PI kleine bioluminescent foci kan worden waargenomen in de dikke darm, dat een matige toename bioluminescentie intensiteit met dag 5 PI met weinig verandering in ruimtelijke verdeling vertonen. Op dag 7 PI zagen we een aanzienlijke verhoging van bioluminescentie en bioluminescent foci verspreid over het gehele colon. Video 1 is een compilatie van 3D DLIT-μCT reconstructies van dagen 1-8 PI met ICC180 en illustreert C.rodentium binnen het proximale maagdarmkanaal tussen dagen 1-2 PI die zich verspreidt naar de dikke darm op dag 3 PI Vanaf dagen 4-6 PI het aantal bacteriën in de dikke darm uit te breiden tot een piek op dag 7 PI waar de bacteriële brandpunten bestrijkt de gehele dikke darm. Op dag 8 PI slechts twee verschillende bacteriële foci aanwezig in de proximale en distale colon. De mogelijkheid om de volledige 3D reconstructie bekijken op elk tijdstip in chronologische volgorde vormt een krachtig instrument om gastheer pathogeen interacties te analyseren en is gemakkelijker te interpreteren dan een 3D-foto van dezelfde dataset. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig1.jpg" /> Figuur 1. 2D bioluminescentie beeldvorming van A) Bioluminescent C. rodentium ICC180 inoculum en B) een muis na orale gavage met 200 ul van het inoculum. Arrowhead (&gt;) illustreert bioluminescentie C. rodentium </<html> em&gt; in de maag. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig2.jpg" /> Figuur 2. C. rodentium kolonisatie dynamiek. Kwantificering van C. rodentium kolonievormende eenheden van feces voor 8 dagen PI <img alt="Figuur 3" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3.jpg" /> Figuur 3. Diffuus licht beeldvorming tomografie-μCT scan van bioluminescentie C. rodentium besmetting van de ene muis gecontroleerd op dag 3, 5 en 7 PI Arrowhead (&gt;) illustreert colon kolonisatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50450/50450fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . Video 1.p :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik hier om de video te bekijken. 4D film van C. rodentium besmetting van de ene muis gevolgd vanaf dag 1-8 PI

Multi-modaliteit beeldvorming is een waardevolle benadering voor het bestuderen van bacteriële kolonisatie in kleine proefdiermodellen. Dit protocol beschrijft infectie van muizen met bioluminescente<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; En de longitudinale monitoring van bacteriële kolonisatie met composiet 3D diffuus licht beeldvorming tomografie met μCT beeldvorming om een ​​4D-film van te maken<em&gt; C. rodentium</em&gt; Infectie.

4D multimodale beeldvorming van<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infecties in Muizen

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Het algemene doel van deze procedure is om de infectiecyclus van zero DUM te monitoren met behulp van composiete diffuse lichtbeeldtomografie met geïntegreerde micro-CT, om zo een vierdimensionale film van de infectie te maken. Dit wordt bereikt door eerst een bioluminescent bacterieel inoculum voor te bereiden. De tweede stap van de procedure is het infecteren van muizen via orale gavage met zero dunum.De geïnfecteerde muizen worden vervolgens dagelijks in beeld gebracht met behulp van D light micro ct, en de laatste stappen bestaan uit het reconstrueren van de 3D DLI micro CT-gegevens en het samenstellen hiervan tot een vier-dimensionale film van de infectiecyclus. Uiteindelijk kunnen de resultaten de verandering in de distributie en lokalisatie van de bacteriële last tonen via vier-dimensionale multimodale beeldvorming van geïnfecteerde muizen. Dr. James Collins.Een postdoc in mijn lab zal vandaag de procedure demonstreren. Laat in de namiddag, op de dag vóór de infectie, een cryovial van zodium stam IC 180 ontdooien. Zodra deze is ontdooid, voeg één cryobead bacteriën toe aan 15 milliliters LB met kanamycine. Zet de cultuur vervolgens overnacht te groeien bij 37 °C met schudden op 220 RPM. Cultureer de volgende ochtend ook 15 milliliters niet-geïnoculeerde LB als controle voor contaminatie van het medium.Als de niet-geïnoculeerde controle niet troebel is, breng dan de geïnoculeerde cultuur over naar een buis van 50 milliliter en centrifugeer deze 10 minuten bij 4.000 RPM bij vier graden Celsius. Resuspendeer de pellet in een volume PBS en herhaal de centrifugatie. Resuspendeer de cellen vervolgens grondig in 1,5 milliliter PBS om het bacteriële inoculum te creëren. Om te verifiëren dat de ICC 180-cultuur bioluminescent is en om het aantal bacteriën te schatten, beeldt u de cultuur in het ivus spectrum CT af met behulp van bioluminescentie-imaging met open filter en gebruikt u de auto-instelling in de living image, 4.3 0.1 wizard.Dit is in detail beschreven in een eerder gepubliceerde video. Om de infectie van muizen met bioluminescente see rodent aan te tonen, zullen we één muis infecteren en één muis gebruiken voor een schijninfectie met PBS. Voordat de infectie wordt uitgevoerd, wordt de muis gebenestheerd met 3% isof fluorine met behulp van een XGI eight anesthesiesysteem om een humane fixatie te garanderen terwijl de anesthesie volledig is ingetreden.Meng het bacteriële inoculum en trek een bekend aantal bacteriën in 0,2 milliliters op in een spuit voor orale gavage. Pak nu de eerste muis die geïnfecteerd moet worden vast door deze stevig in de nekvel te grijpen. Let op dat de muizen vóór de beeldvorming zijn onthaard met depilatiecrème zoals beschreven in het tekstartikel; duw de naald over de tong richting het gehemelte en naar beneden door de slokdarm en injecteer het bacteriële inoculum in de maag.Indien er weerstand is, forceer de naald dan niet, omdat het inoculum anders in de longen terechtkomt; voer de naald voorzichtig opnieuw in. Als de muis vervolgens problemen heeft met ademen of lopen, moet deze worden geëuthanaseerd voor de schijninfectie. Dien via een sonde 0,2 milliliters PBS toe aan een muis om te bevestigen dat de orale gavage correct is uitgevoerd.Beeld de muizen in het IVUS-spectrum CT via bioluminescentie-imaging met open filter en gebruik de auto-instelling in de living image. De 4.3 0.1 imaging wizard zoals eerder beschreven, Delight micro CT omvat Delight optische imaging geïntegreerd met een micro-CT-scan met een lage stralingsdosis. Omdat de dosis per imagingsessie bij de dieren cumuleert, streven we ernaar de dosis zo laag mogelijk te houden.Vanwege deze overwegingen moeten de muizen worden geëuthanaseerd bij de eerste tekenen van schadelijke symptomen of aan het einde van de micro-CT-beeldvormingsperiode. Optimaliseer voor deze studie de parameters van de automatische belichtingsfunctie in Living Image 4.3 0.1 voor de in vivo beeldvorming van bacteriële luciferase. Selecteer eerst 'edit', vervolgens 'preferences', daarna 'acquisition' en tot slot 'auto exposure window'.Select vervolgens de bereikwaarden, gevolgd door de experimenttijd in seconden, en stel het maximum in op 300 seconden. Selecteer tot slot de minimale doel telling, gevolgd door luminescentie, en stel deze waarde in op 10.000 counts. Zodra het systeem is geïnitialiseerd, is de anesthesie ingesteld en zijn de röntgenbeveiligingen gecontroleerd.Ga over tot het anesthetiseren van een muis. Gebruik een XGI eight anesthetisiesysteem met een zuurstofflow van 2 L/min en 3% isofluoraan. Wanneer de muis gereed is voor beeldvorming, opent u de imaging wizard in de software.Dit instrument optimaliseert automatisch verschillende parameters om de best mogelijke signaal-ruisverhouding te bieden voor elk geselecteerd emissiefilter. Wanneer u door de imaging wizard wordt gevraagd, voegt u de emissiefilters van vijf hondertzesenzestig, achthonderzechstig, honderdzevenzestig en zeshonderdtwintig nanometer toe. Zorg vervolgens dat de one mouse micro CT-scan is geselecteerd en klik op acquire om de beeldvorming te starten.Nadat de geanestheseerde muis naar zijn kooi is teruggeplaatst, verwijdert u het platform voor één muis uit de spectrum CT en desinfecteert u het dierplatform met 1% tri gene. Let op: als het dierplatform sterk vervuild is, kan het schuimkussen worden vervangen. Ga door met het dagelijks beelden van de muizen tot acht dagen na infectie om de longitudinale beelddata te genereren.Langere proefperioden vergroten de kans op artefacten als gevolg van cumulatieve stralingsblootstelling. Om hoogwaardige, reproduceerbare drie DD licht micro CT-reconstructies te produceren, zijn verschillende stappen vereist. Open eerst de living image-software, 4.3 0.1 en selecteer Browse in het browse-venster.Open de map met de delight micro CT-bestanden door op laden te klikken. Open het DLI micro CT-bestand in de living image browser. Zie bijvoorbeeld deum dag zeven na infectie.Selecteer in het instrumentenpalet oppervlaktetopografie en vervolgens nude mouse. Pas de drempelwaarde aan en klik daarna op generate surface. Als de reconstructie van het oppervlak is geslaagd, wordt een contour van het oppervlak weergegeven in het 3D-weergavevenster.Om de gereconstrueerde micro-CT-scan in het 3D-weergavevenster te bekijken, kunt u ofwel de oppervlaktecontour verbergen of de oppervlakte-opaciteit verlagen. Beide opties zijn toegankelijk door eerst de 3D-optische hulpmiddelen te selecteren. Deselecteer vervolgens het objectoppervlak weergeven of pas de opaciteitsschuifregelaar aan om een gedetailleerde anatomische lokalisatie van de drie DD-lichtreconstructie te verkrijgen.Pas de 3D-volumetrische gegevens aan met betrekking tot het dierskelet. Om het skelet met optimaal contrast te bekijken, klikt u op 3D multimodality tools en schuift u de histogramschuifregelaar naar rechts tot alleen de botten duidelijk zichtbaar zijn. Klik vervolgens, indien nog niet geselecteerd, op logarithmic histogram, reverse coloring gradient illumination quality en de-noise.Indien gewenst, kan de afbeelding worden bijgesneden om ongewenste structuren uit de 3D-reconstructie te verwijderen vanuit het toolpalet; selecteer D light 3D-reconstructie. Zorg ervoor dat alleen de filters van 565, 860 en 620 nanometer zijn geselecteerd. Klik vervolgens op start.Dit opent het venster voor gegevensvoorbeeldweergave met de spectraal gefilterde bioluminescentiesignalen van de muis die in 2D is afgebeeld. Deze signalen worden automatisch door de software gedrempeld, maar kunnen indien nodig handmatig worden aangepast met behulp van de tabbladen onderaan het menu. De drempelwaarde bepaalt de minimale gegevensintensiteit die als gegevens in de reconstructie zal worden opgenomen.Select vervolgens uit het gereedschapspalet de D light micro CT 3D-reconstructie en controleer de optische eigenschappen. Door op het tabblad eigenschappen te klikken, moeten de weefseleigenschappen worden ingesteld op muisweefsel en het bronspectrum op bacteriën. Klik nu op reconstrueren om de D light-reconstructie uit te voeren.De werkelijke locatie van het met rood omcirkelde D-lichtsignaal bevindt zich binnen de bekkengordel. Dit is gemakkelijker te interpreteren wanneer het beeld tijdens de video roteert. Om de DLI micro-CT 3D-video te genereren, gaat u naar het menu 'tools' en selecteert u '3D animation', 'preset animations', 'counterclockwise axis' en vervolgens de totale duur.Stel deze waarde in op 10 seconden of 25 frames per seconde. Zodra de instellingen voor de 3D-animatie correct zijn, drukt u op opnemen en slaat u de DLI micro CT 3D-reconstructies op als VI-bestanden. Het is essentieel om deze reconstructies met identieke instellingen uit te voeren, zodat ze vergelijkbaar zijn.Het is daarnaast belangrijk om de video's te maken met hetzelfde aantal frames per seconde en dezelfde totale duur. Anders is de timing van de 40 video's niet homogeen. Open op de computer Windows Live Movie Maker en maak een nieuw bestand aan.Voeg de DLI micro-CT-reconstructies in chronologische volgorde in, beginnend vanaf dag één na infectie. Voeg via het tabblad tools bijschriften toe aan het begin van elke video door de video te selecteren, naar home te gaan en vervolgens op add caption te klikken. De tekst in het bijschrift kan via de werkbalk worden opgemaakt en de positie van het bijschrift is aanpasbaar.Voeg nu een titelpagina toe door op 'Home' en vervolgens op 'Titel' te klikken. Typ uw titel in het vak en gebruik de werkbalk om de tekst op te maken. Sla het project vervolgens op als een MMP-bestand.Dit is essentieel als u de film wilt bewerken. Sla de film ten slotte op als een WMV-bestand vanuit het menu van de movie maker; selecteer 'film opslaan' en kies de optie 'four computer'. De bedieningselementen zijn essentieel voor een goede techniek. Alvorens de muizen te infecteren, is vastgesteld dat het gebruikte bacteriële inoculum bioluminescent was.Na de orale gavage met bioluminescente rodenten werd gecontroleerd of het signaal waarneembaar was in de maag van het dier, aangegeven door een witte pijlpunt, en afwezig was in de longen. Dezelfde muis zal in daaropvolgende voorbeelden van een individuele infectie worden getoond. Zero denture is een extracellulair pathogeen dat tijdens de gedemonstreerde infectie beperkt blijft tot het lumen van de darm.Het wordt zo uitgescheiden via de feces, die werden geanalyseerd om aan te tonen dat de kolonisatie toeneemt van dag twee tot dag zes of zeven, wanneer de infectie dagelijks zijn piek bereikt. D licht micro CT werd gebruikt om de ruimtelijke distributie van bioluminescente bacteriën in deze muis te evalueren, waarbij het skelet als anatomische referentie diende. Op dag drie na infectie werden kleine bioluminescente foci waargenomen in het colon, aangegeven door een blauwe pijl.Deze foci vertoonden een matige toename in bioluminescentie-intensiteit op dag vijf na infectie; met weinig verandering in de ruimtelijke verdeling op dag zeven na infectie was er een significante toename in bioluminescentie en verspreidden de bioluminescente foci zich over de gehele dikke darm. Drie DD light micro CT-reconstructies van dag één tot acht na infectie illustreren de verspreiding van de sero deum-infectie. De bacteriële infectie begint als afzonderlijke foci binnen het proximale maag-darmstelsel.Tegen de derde dag verspreidt de infectie zich naar de dikke darm. Gedurende de volgende paar dagen verspreiden de infectiehaarden zich verder en nemen ze in omvang en aantal toe. De infectie bereikt haar piek op dag zeven.Vervolgens waren de kolonies op dag acht gereduceerd tot twee afzonderlijke bacteriële brandhaarden in het proximale en distale colon. Deze technologie zal onderzoekers in staat stellen om het mechanisme van bacteriële kolonisatie en infectie in real time te bestuderen en om de effectiviteit van interventiestrategieën te onderzoeken.

4d-multimodality-imaging-of-citrobacter-rodentium-infections-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Valentine, M. E., et al., Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the use of a bioluminescence-based imaging approach to monitor bacterial infection in a live mouse model. Sequential bioluminescent and X-ray imaging enables real-time visualization and anatomical localization of infection spread throughout the host.

Real-Time Imaging of Bacterial Infection in a Mouse Model Using Bioluminescence

Source: Luyts, N., et al. Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the induction and tracking of urinary tract infection in a mouse model using bioluminescent E. coli injected into the bladder, where bacterial adhesion, invasion, and intracellular replication occur. The emitted light from the bioluminescent operon serves as a real-time marker of bacterial load during infection...

Visualization of Urinary Tract Infection in a Mouse Model Using Bioluminescence

Citrobacter rodentium infectie biedt een waardevol model voor enterische bacteriële infecties te bestuderen, evenals het hosten immuunreacties en colitis bij muizen. Dit protocol beschrijft de meting van de barrière integriteit, pathogeen belasting en histologische schade waardoor de grondige karakterisering van pathogeen en gastheer bijdragen aan murine infectieuze colitis.

De<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Muis Model: Studeren pathogeen en gastheer Bijdragen aan infectieuze colitis

Streptococcus pneumoniae is de toonaangevende ziekteverwekker waardoor ernstige community-acquired pneumonie en verantwoordelijk voor meer dan 2 miljoen doden wereldwijd. De invloed van bacteriële factoren betrokken bij fitness of virulentie kan worden gevolgd in real-time in een acute muis longontsteking of bacteriëmie model met behulp van bioluminescentie bacteriën.

Na in Real Time de impact van Pneumokokken virulentiefactoren in een acute longontsteking Muis Model Met behulp van Bioluminescent Bacteriën

Diermodellen hebben bewezen waardevolle instrumenten definiëren gastheer en pathogeen specifieke mechanismen die bijdragen aan de ontwikkeling van chronische ontsteking. Hier beschrijven we een muismodel van orale infectie met het humaan pathogeen Porphyromonas gingivalis en detail methoden om de progressie van inflammatie lokale en systemische plaatsen.

Een muismodel voor pathogenen geïnduceerde Chronische ontsteking op lokale en systemische sites

Dit protocol beschrijft de cefoperazon muismodel van Clostridium difficile infectie (CDI) met een klinisch relevante en genetisch handelbaar stam, R20291. Nadruk op klinische ziekte monitoring, C. difficile bacteriële opsomming, toxine cytotoxiciteit en histopathologische veranderingen in heel CDI in een muismodel worden beschreven in het protocol.

-Cefoperazone behandelde muismodel van klinisch relevante<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Strain R20291

Een gedetailleerd protocol voor een muismodel voor enterohemorrhagic E. coli (EHEC) kolonisatie met behulp van bacteriën bioluminescentie-label wordt gepresenteerd. Het opsporen van deze bioluminescente bacterie door een niet-invasieve in vivo imaging systeem in levende dieren kan verder ons huidige begrip van EHEC kolonisatie.

Detectie van de Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonisatie in lymfkliertest Host door niet-invasieve In Vivo bioluminescentie systeem

We beschrijven de optische beeldvorming van muizen besmet met Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) met behulp van verslaggever enzym fluorescentie (REF). Dit protocol vergemakkelijkt de gevoelige en specifieke detectie van M. tuberculosis in pre-klinische diermodellen voor pathogenese, therapeutics en vaccin onderzoek.

Mycobacterium tuberculosis in muizen met verslaggever enzym fluorescentie Imaging

Een nieuwe monstervoorbereidingsmethode wordt gedemonstreerd voor de analyse van op agar gebaseerde, bacteriële macrokolonies via matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatiebeeldvorming massaspectrometrie.

Onderzoek naar microbiële samenwerking via beeldvorming massaspectrometrie analyse van bacteriekolonies gekweekt op agar en in weefsel tijdens infectie

De vertaling van de bevindingen van intravitale microscopie wordt uitgedaagd door de geringe dieptepenetratie in het weefsel. Hier beschrijven we een muismodel met dorsale vensterkamer dat co-registratie van intravitale microscopie en klinisch toepasbare beeldvormingsmodaliteiten (bijv. CT, MRI) mogelijk maakt voor directe ruimtelijke correlatie, waardoor de klinische vertaling van intravitale microscopiebevindingen mogelijk wordt gestroomlijnd.

Een dorsaal huidplooi raamkamer tumor muismodel voor gecombineerde intravitale microscopie en magnetische resonantie beeldvorming in translationeel kankeronderzoek

Hier beschrijven we een procedure die orgaanbrede detectie van pathogene bacteriën tijdens infectie en kwantificering van fluorescerende reporteractiviteiten mogelijk maakt.

Driedimensionale tomografie van het hele orgaan met hoge resolutie van microbiële infecties

Leer 4D multimodale beeldvorming van Citrobacter rodentium-infecties in muizen met behulp van diffuse lichttomografie en micro-CT. Deze methode maakt longitudinale monitoring van bacteriële kolonisatie mogelijk.

4D multimodale beeldvorming van

Meer video's verkennen