Name: Adenovirale transductie van Naïeve CD4 T-cellen aan Treg Differentiatie Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 33 s
Description: Leer adenovirale transductie van naïeve CD4 T-cellen voor Treg-differentiatie met behulp van CAR-transgene muizen. Deze methode maakt tijdelijke overexpressie van genen mogelijk zonder celviabiliteit of differentiatiepotentieel te beïnvloeden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Lirui Du bedanken voor het construeren van de pCAGAdDU vector en Oliver Gorka voor bepaling van de fixatie protocol.

1. Klonen van een gen van belang in een Entry Vector <ol><li> Kloon het gen van belang in een invoer vector. PCR amplificatie van het gen, gevolgd door blunt-end ligatie in een topoisomerase-gekoppelde vector (bijv. pENTR / D-TOPO) of restrictie-enzym-gemedieerde klonering kan worden gebruikt voor deze procedure. </li></ol> 2. Het overbrengen van het gen van belang in de pCAGAdDu Destination Vector <ol><li> Overdracht van het gen van interesse van de binnenkomst vector in de bestemming vector door LR recombinatie (bijvoorbeeld Gateway LR Clonase II Enzym Mix). Dit zal de adenovirale expressievector (afbeelding 1). </li><li> Lineariseren 10 ug van het adenovirale expressievector in een Pad restrictie digest, neerslaan van het DNA en resuspendeer in water in een concentratie van 3 ug per 100 ul. Linearisatie bevrijdt de virale inverted repeats (ITR), die nodig zijn voor replicatie en inkapseling van het vIral DNA in virusdeeltjes. </li></ol> 3. Generatie van de Primary Virus Lysate <ol><li> Seed 1 x 10 5 HEK293A cellen in 2 ml kweekmedium (DMEM, 10% FBS, 5% Penstrep) in een putje van een 6-wells plaat en incuberen van de cellen gedurende 6-14 uur bij 37 ° C in een 10% CO 2 incubator om hen in staat om zich te houden. Cellen moeten dan ongeveer 50% confluentie. </li><li> Lipofectie: Overdracht 6 pl jetPEI reagens in 94 pi van 50 uM NaCl, vortex kort. Voeg de gemengde oplossing van 100 gl gelineariseerde adenovirus vector terwijl vortexen en incubeer de transfectie mix gedurende 15-30 minuten bij kamertemperatuur. </li></ol> Voer alle volgende stappen uit onder de juiste voorwaarden voor bioveiligheid adenovirusinfectie! <ol start="3"><li> Verdeel de oplossing druppelsgewijs aan de HEK293A cel bevattende putje en incubeer de cellen bij 37 ° C en 10% CO2. Bij gebruik van een fluorescentie marker, evalueren de Transfectie efficiëntie visueel na 12-36 uur met behulp van een omgekeerde fluorescentie microscoop. Voeg 0,5 ml vers medium om de 3 dagen. </li><li> Controle om de 2 - 3 dagen met een lichte of fluorescentie microscoop voor cytopathische effecten (CPE), die zijn gebieden met vergrote en afgeronde cellen die beginnen te los. Dit wijst op efficiënte virusproductie. Bij het ​​optreden van bredere zones van CPE (figuur 3), duurt het 24-72 uur voordat alle cellen worden geïnfecteerd. </li><li> Als alle cellen vertonen tekenen van CPE, maar voor een totale onthechting van cellen plaatsvindt, los van de cellen door zachte pipetteren en overdracht cellen met supernatans (SN, 3 - 5 ml) een 15 ml polystyreen buis. </li><li> Bevries de cellen in de SN op droog ijs gedurende 15-20 min en vervolgens ° C ontdooien ze snel bij 37 breuk van de cellen. Herhaal deze vries-en-dooi-cyclus (F / TC) nog twee keer. Houd de primaire virus lysaat op ijs voor gebruik binnen een dag of bevriezen bij -80 ° C voor opslag op lange termijn. Eventuele aanvullende F/ TC het virus titer met 30 - 50%. </li></ol> 4. Virus Amplification <ol><li> Zaad en groeien HEK293A cellen tot 90% confluentie op een 14 cm weefselkweek schotel. </li><li> Infecteren van de cellen met de helft van de primaire virus lysaat (1,5-2,5 ml) en incuberen van de cellen gedurende tenminste 36 uur. Vrijwel alle cellen moeten vervolgens worden geïnfecteerd, wat kan worden vastgesteld door fluorescentie microscopie. Voor de re-amplificatie van een reeds geamplificeerd (dat wil zeggen meer geconcentreerd) virusvoorraad, HEK293A infecteren bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 50 (zie 6.3). </li><li> De cellen moeten worden geoogst wanneer ze allemaal te zien CPE maar voordat onthechting. Met een efficiënte virus productie deze toestand wordt bereikt binnen 48 uur na infectie. (Als het langer duurt maximaal een week, overwegen een nieuwe ronde van amplificatie door het verhogen van de hoeveelheid adenovirus voorraad gebruikt voor de in 4.2 beschreven infectie.) </li><li> Maak de cellen door zachte pipetteren en overdracht cellen en SN om een ​​50 ml polystyreen buis. Spin cellen neer op 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de SN en resuspendeer de pellet in een geschikt volume medium en SN (ca. 1 ml). </li><li> Voer 3 F / TC de cellen en centrifugeer bij 800 xg gedurende 15 min bij 4 ° verstoren C. Opstijgen van de SN dat de virusdeeltjes bevat (dwz de geconcentreerde virus lysaat), en de hoeveelheid van het virus lysaat te slaan bij -80 ° C. </li></ol> 5. Virus Titer Bepaling <ol><li> Zaad 10 5 A549-cellen per putje in 5 putjes van een 12-wells plaat in 1 ml medium en laat cellen hechten gedurende 6 uur. </li><li> Gebruik 1 ui van geconcentreerde adenovirus (op ijs ontdooid) om een ​​seriële verdunning in medium (1:5000, 1:10.000, 1:50.000, 1:100.000) uit te voeren en voeg 10 ul per putje. Laat een goed niet-geïnfecteerde om de gating passen in flowcytometrie. </li><li> Na 36 uur, start de SN, wassen met PBS en losmaken cellen (bijvoorbeeld door behandeling met trypsine). Voor biohazard voorzorgsmaatregelen, is het raadzaam om vast te stellen cellen in 100 pi 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en wassen met PBS tegelijk. </li><li> Voer een FACS analyse van infectie marker expressie. Plot &#39;pi viraal lysaat toegepast&#39; tegen het absolute aantal geïnfecteerde cellen (figuur 4). Bepaal de lineaire bereik van de infectie en het berekenen van de titer per ml onverdunde virus van de standaard curve over de lineaire bereik met x = 1000 pi. </li></ol> 6. T-cel infectie <ol><li> Isoleer naïeve / rustende CD4 T-cellen uit DO11.10 tg; CARΔ1 tg muizen met behulp van MACS (Naïeve CD4 + T Cell Isolation Kit II) of FACS-sortering (CD4 + CD25-CD62L + CD44-). </li><li> Voor kleinschalige experimenten, pipet een geschikt volume van virale lysaat om een ​​MOI van 50 te bereiken in een putje van een 96-well ronde bodemplaat. </li><li> Voeg tot 4 x 10 5 T-cellen in een finale infectie volume van 50 ul in T-cel medium (RPMI1640, 10% FBS, 5% Penstrep, 5% NaPyruvate, 1x NEAA, 1x MEM Essentialvitamine, 1x L-glutamine, 1:250.000 Mercaptoethanol, 10 mM HEPES). Voorbeeld: Een MOI van 50 wordt gebruikt om 3 x 10 5 T-cellen te infecteren; de virale titer is 3 x 10 9 ml -1 Volume Virus MOI = x T celaantal / virale titer = 50 x (3 x 10 5) / (3 x 10 ml 9 -1) = 0.005 ml </li></ol> Opmerking: voor de besmetting van grotere aantallen cellen, opschaling met een MOI van 50 in een infectie volume van 165 ul per 10 6 naïeve T-cellen in een polystyreen buis met losse kop (maximaal tp 3 ml per tube). <ol start="4"><li> Incubeer cellen gedurende 90 min bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator. </li><li> Spin down cellen op 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, opstijgen SN, opnieuw in suspensie in 200 ul PBS. Centrifugeer opnieuw en opstijgen SN. </li></ol> (Optioneel kunnen de cellen opnieuw gewassen om het virus efficiënt te verwijderen) <ol start="6"><li> Resuspendeer cellenin 200 pl T-celmedium zonder stimulerende antilichamen en zonder IL-2 of andere cytokinen en pauze van 40 uur bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator om expressie van het gen van belang kan voor activering. </li></ol> 7. T-cel activatie en Polarisatie <ol><li> Pipetteer volume van anti-CD3-en anti-CD28 gekoppelde korrels die het aantal cellen (bijv. 4 x 10 5) gelijk aan een kleine reagens beker, voeg de 10-voudig volume van PBS en ze op een magneet voor 2 min . Opstijgen en resuspendeer de kralen in 200 ul polariserende medium (voor Tregs: T-cel medium + 1 ng / ml TGF, 100 U / ml IL-2). </li></ol> Opmerking: Cellen kunnen ook worden geactiveerd met weefselkweekschaaltjes bekleed met anti-CD28 en anti-CD3 antilichamen of een DO11.10 T cel receptor-specifieke wijze met bestraalde BALB / c splenocyten gepulseerd met peptide 323-339 ovalbumine antigeen. <ol start="2"><li> Centrifugee het rustte cellen als voorheen, opstijgen van de SN en resuspendeer cellen in 200 pi polariserende medium met anti-CD3-en anti-CD28-antilichaam-gekoppelde kralen. Incubeer 72 uur bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator zonder medium. </li></ol> 8. T cel fixatie en kleuring voor flowcytometrie <ol><li> Was de cellen: Spin down cellen op 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, opstijgen SN, opnieuw in suspensie in 200 ul PBS. Centrifugeer opnieuw en opstijgen SN. Voer alle volgende stappen wassen dienovereenkomstig. </li><li> Resuspendeer de cellen in 100 pi bevestigbaar dode cel kleurende oplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C. </li><li> Was de cellen, resuspendeer in 100 ul PBS, voeg 100 pl 4% paraformaldehyde in PBS, incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de cellen, resuspendeer ze in 200 ul ijskoude 70% methanol in PBS en incubeer 30 minuten op ijs. </li></ol> Opmerking: Cellen kunnen behandeld worden voortaan zonder biohazard voorzorg!<ol start="5"><li> Bereid 60 pi meester-mix van 60 ul PBS + 10 ug / ml Fc-blok (anti-FCR3 om niet-specifieke binding te blokkeren). Was de cellen, resuspendeer ze in 40 pl PBS + anti-FCR3 en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 20 ul van PBS + anti-FCR3 die 1 ug PE-gekoppeld anti-Foxp3 antilichaam, mengen en incuberen bij 4 ° C overnacht. </li><li> Was tweemaal cellen in PBS en geanalyseerd cellen op een flow cytometer. </li></ol>

<ol><li>Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+depletion+of+Foxp3%2B+regulatory+T+cells+induces+a+scurfy-like+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).</li>
<li>Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+and+expanding+regulatory+T+cell+populations+by+foreign+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen.</a> Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).</li>
<li>Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+CD25%28%2B%29CD4%28%2B%29+regulatory+T+cells+by+oral+antigen+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+%28Baltimore%2C+Md%29%22%5BJournal%5D)">Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).</li>
<li>Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymically+generated+regulatory+T+cells+control+mucosal+TH2+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation.</a> Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).</li>
<li>Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+generation+of+regulatory+T+cells+in+placental+mammals+mitigates+maternal-fetal+conflict%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict.</a> Cell. 150 (1), 29-38 (2012).</li>
<li>Laurence, A., Amarnath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+Transcription+Factor+Promotes+Instability+of+nTreg+Cells+and+Limits+Generation+of+iTreg+Cells+during+Acute+Murine+Graft-versus-Host+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease.</a> Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).</li>
<li>Terabe, M., Berzofsky, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoregulatory+T+cells+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoregulatory T cells in tumor immunity.</a> Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).</li>
<li>Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., Hämmerling, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Treg+depletion+induces+T-cell+infiltration+and+rejection+of+large+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors.</a> European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).</li>
<li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li>
<li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li>
<li>Chen, W., Jin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+Peripheral+CD4%2BCD25-+Naive+T+Cells+to+CD4%2BCD25%2B+Regulatory+T+Cells+by+TGF-%CE%B2+Induction+of+Transcription+Factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-β Induction of Transcription Factor Foxp3.</a> The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).</li>
<li>Xu, W., Lan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+induced-treg+cells+effectively+attenuates+murine+airway+allergic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation.</a> PloS ONE. 7 (7), e40314(2012).</li>
<li>Circosta, P., Granziero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+%28TCR%29+gene+transfer+with+lentiviral+vectors+allows+efficient+redirection+of+tumor+specificity+in+naive+and+memory+T+cells+without+prior+stimulation+of+endogenous+TCR%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR.</a> Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).</li>
<li>Patel, C., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency%2C+Site-specific+Transfection+of+Adherent+Cells+with+siRNA+Using+Microelectrode+Arrays+%28MEA%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA).</a> J. Vis. Exp. (67), e4415(2012).</li>
<li>Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+T-cell+receptors+in+mouse+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells.</a> J. Vis. Exp. (44), e2307(2010).</li>
<li>Leon, R. P., Hedlund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral-mediated+gene+transfer+in+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).</li>
<li>Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+expression+of+the+coxsackie%2Fadenovirus+receptor+enables+adenoviral-mediated+gene+delivery+in+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).</li>
<li>Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+adenovirus-mediated+gene+transfer+into+primary+T+cells+and+thymocytes+in+a+new+coxsackie%2Fadenovirus+receptor+transgenic+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model.</a> BMC Immunology. 3, 4(2002).</li>
<li>Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+Carma1+by+PP2A+negatively+regulates+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation.</a> The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).</li>
<li>Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roquin+binds+inducible+costimulator+mRNA+and+effectors+of+mRNA+decay+to+induce+microRNA-independent+post-transcriptional+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression.</a> Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).</li>
<li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+adenovirus+and+its+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Update on adenovirus and its vectors.</a> The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).</li>
<li>Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+Human+Cell+Line+Transformed+by+DNA+from+Human+Adenovirus+Type+5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.</a> Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).</li>
<li>Landy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic%2C+structural%2C+and+regulatory+aspects+of+lambda+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination.</a> Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).</li>
<li>Bernard, P., Couturier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+killing+by+the+F+plasmid+CcdB+protein+involves+poisoning+of+DNA-topoisomerase+II+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes.</a> Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).</li>
<li>Thai, T. -H., Calado, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+Germinal+Center+Response+by+MicroRNA-155%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155.</a> Science. 316 (5824), 604-608 (2007).</li>
<li>Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+bic%2FmicroRNA-155+for+Normal+Immune+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function.</a> Science. 316 (5824), 608-611 (2007).</li>
<li>Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Dicer+in+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A role for Dicer in immune regulation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).</li>
<li>Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-29+Regulates+T-Box+Transcription+Factors+and+Interferon-%CE%B3+Production+in+Helper+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells.</a> Immunity. , (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Virusproductie en titratie Voor optimale transfectie resultaten, de kwaliteit en de hoeveelheid gelineariseerde vector uiterst belangrijk. We hadden geen negatieve effecten hebben op de primaire productie lysaat observeren vanuit een aanvankelijke sterke groei van de cultuur sinds de infectie zal snel overgaan zodra efficiënte virus productie plaatsvindt. Echter, virusproductie door HEK293A cellen worden beïnvloed door lange inserts die de doeltreffendheid verminderen. Sommige open reading fram...

Tregs zijn cruciaal om immuun tolerantie te handhaven en overschrijding immuunreacties temperen. Tregs onderdrukken omstander T-cel activatie. Bijgevolg ablatie van Tregs leidt tot fatale auto-immuniteit en zelfvernietiging gedreven door geactiveerde T-cellen 1. Tregs in de thymus ontwikkelen in negatieve selectie van CD4-positieve enkelvoudige precursors, maar ze kunnen ook differentiëren in de periferie van naïeve CD4 T-cellen bij lage dosis antigeen stimulatie met suboptimale costimulatie 1,2. Thymus Tregs lijken weefsel auto-immuniteit onderdrukken tegen zelf-antigenen, terwijl perifere Tregs zijn betrokken bij het verstrekken van tolerantie in de darmen of longen. Deze geïnduceerde Tregs krachtig voorkomen dat T-cel activatie na herkenning van vreemde antigenen in het slijmvlies, waaronder milieu-antigenen van voedsel en lucht, commensale bacteriën en allergenen 3,4. Daarnaast Tregs zijn cruciaal voor maternale tolerantie voor foetale peptiden 5 vast te stellen en voorafvent graft-versus-host ziekte 6. Tegelijkertijd, Tregs ook ongewenste effecten mediëren door verzachtende immuunbewaking van tumorcellen 7,8. Het kenmerk kenmerk van Tregs is de uitdrukking van de subset-opgave transcriptiefactor Foxp3, een vork-head domein-bevattende transcriptiefactor die nodig en voldoende is om te overleggen Treg functie 9,10 is. Sommige signaalwegen die Foxp3 expressie kan induceren zijn bekend. Echter, de moleculaire processen die, reguleren of moduleren Treg differentiatie als reactie op T cel receptor activering minder goed begrepen. Tregs kan zeer effectief worden geïnduceerd in vitro door het stimuleren van naïeve CD4 T-cellen met anti-CD3 en anti-CD28 antilichamen in de aanwezigheid van TGFp en IL-2 11. Zoals de opkomende Tregs zijn functioneel in vivo, de manipulatie van moleculen die Treg differentiatie bevorderen draagt ​​enorm potentieel voor toekomstige therapies, bijvoorbeeld de behandeling van astma, ziekte van Crohn en transplantatie 11,12. Omgekeerd kan therapeutische modulatie van moleculen aan Treg differentiatie blokkeren bieden voordeel in toekomstige aanpak van de gecombineerde behandeling van de tumor patiënten. In vitro differentiatie assays geleverd tot de beschrijving van moleculaire veranderingen die geassocieerd met T cel subsets. Op dit moment, experimentele pogingen om te zoeken of het scherm voor genproducten die controle T cel differentiatie worden gehinderd door het feit dat de meest voorkomende methoden van ectopische genexpressie falen in naïeve T-cellen. Bijvoorbeeld, elektroporatie en retrovirale transductie zijn alleen effectief in geactiveerde T-cellen. In tegenstelling tot de oorspronkelijke verwachtingen lentivirale transductie, die typisch effectief in rustende cellen vereist pre-activatie van naïeve T-cellen met cytokinen 13. Ook de overdracht van cDNA of mRNA tijdens elektroporatieomvat depolarisatie van het plasmamembraan, dat zich verleent kenmerken van T-cel activatie en zelfs mobiliseren Ca2 + signalering en activeer NFAT eiwitten (niet gepubliceerde waarneming en ref. 14). Ook voor retrovirale transductie, de naïeve T-cellen te worden geactiveerd voor 18-40 uur. Gedurende deze tijd, de verdeling van de kernmembraan tijdens celdeling optreedt en maakt de daaropvolgende genomische integratie van het retrovirale vector 15. Deze werkwijzen zijn dus niet in staat de eerste moleculaire regulatie van initiële T-cel ontmoeting met antigen, de beslissende fase van helper T cel differentiatie pakken. Adenovirale transductie is bekend om tijdelijke ectopische genexpressie kan in een aantal humane celtypes die de menselijke Coxsackie adenovirus receptor (CAR) drukken. Het verloopt zonder vereiste voor cel activering of cel-cyclus progressie. De oppervlakte-expressie van CAR is essentieel voor een efficiënte virus hechting en internalisatie en transgene expressie van de afgeknotte versie CARΔ1 onder een T-cel-specifieke promoter bleek muis thymocyten en T-cellen gevoelig zijn voor adenovirale infectie 16 maken. Vooral neemt het transgen niet wijzigen thymocyt ontwikkeling of in vitro differentiatie van naïeve CD4 T-cellen in verschillende subsets (gegevens niet getoond; 17 ref.). Adenovirus-gemedieerde transductie van T-cellen werd eerder gebruikt voor overexpressie 17,18 en knock-down-benaderingen 19,20. De transgene T-cellen kan worden gezuiverd uit commercieel verkrijgbare DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc referentie 17.). Belangrijk adenovirale transductie maakt hoge expressie van een gen van interesse in naïeve T-cellen induceren zonder duidelijke tekenen van activatie. De T-cellen blijft naïef (CD44 laag, CD62L hoog) en rust (CD25 -, CD69 -) na infectiop en kan worden geactiveerd en gedifferentieerd tot Treg Soortgelijke niet-geïnfecteerde cellen. Productie van recombinante adenovirussen kan worden bereikt na transfectie van adenovirale HEK293A cellen met plasmiden (figuur 1). Deze plasmiden bevatten doorgaans de menselijke soort 5 adenovirusgenoom met E1 en E3 genen verwijderd om recombinante adenovirussen replicatie-incompetent 21 renderen. HEK293A cellen vullen replicatie-deficiëntie, zoals ze werden vereeuwigd door middel van stabiele integratie van geschoren adenovirus 22. Aangezien adenovirale vectoren zijn groot (~ 40 kb) en dus niet geschikt voor de traditionele restrictie-enzym-gemedieerde klonen, gebruikten we het Gateway systeem. Het gen van belang wordt eerst gekloneerd in een kleinere vermelding vector, waaruit het gemakkelijk kan worden overgebracht naar de bestemming adenovirale vector lambda via recombinatie reactie (LR) 23. We geconstrueerde de pCAGAdDu vectordoor het combineren van de CAG promotor (kip actinepromotor en CMV versterker) met een expressie-cassette met LR locaties aan weerszijden van de procaryotische ccdB selectie marker 24. Deze expressiecassette gefuseerd met een interne ribosoom toegangsplaats (IRES) element dat co-expressie van eukaryote marker infectie versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP), dat is gefuseerd aan een sequentie die het bovine groeihormoon poly (A)-signaal mogelijk maakt. We kozen CAG cis-regulerende sequenties, omdat het prototype CMV promoter werd gevonden sterk activatie-afhankelijk en daardoor ongunstig voor genexpressie in naïeve T-cellen zijn. Hier geven we een protocol voor efficiënte in vitro Treg differentiatie en een methode om naïeve CD4 T-cellen te transduceren zonder activatie (Figuur 2). De methode maakt ectopische genexpressie of knock down voorgaande CD4 T-cel differentiatie bij de naïeve staat. Het maakt het testen van het effect van een overexpressed gen van belang tijdens de vroege signalering evenementen bij eerste TCR stimulatie tot T-cel deelverzameling inzet. Onze validatie-experimenten geven ook de basis om soortgelijke adenovirus toepassing in de differentiatie van andere T-cel subsets zoals Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, of Tfh cellen vast te stellen.

<table><tbody><tr><td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K240020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R057S</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus-transfectie</td><td>101-10N</td><td></td></tr><tr><td>HEK293A-cellijn</td><td>Invitrogen</td><td>R705-07</td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>6-well platen</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>14 cm weefselkweekschaal</td><td>Nunc</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CAR&Delta;1)1Jdgr</td><td>Taconic Farms</td><td>Model Nr. 4285</td><td></td></tr><tr><td>Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN Biotech</td><td>1502-P110704</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>NaPyruvate</td><td>Lonza</td><td>BE13-115E</td><td></td></tr><tr><td>NEAA 100x</td><td>Lonza</td><td>BE13-114E</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-bufferoplossing (1 M)</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>MEM Essential vitaminmixture (100x)</td><td>Lonza</td><td>13-607C</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 voor Celexpansie en Activering</td><td>Invitrogen</td><td>114-56D</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human TGF-beta 1</td><td>R&amp;D Systems</td><td>240B</td><td></td></tr><tr><td>Proleukin S (18 x 106IE)</td><td>Novartis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L-23105</td><td></td></tr><tr><td>Mouse BD Fc BlockT</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5773-82</td><td></td></tr><tr><td>Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay</td><td>Roche Applied Biosystems</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Probes Master</td><td>Roche Applied Biosystems</td><td>04902343001</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td><td>Roche Applied Biosystems</td><td>4366596</td><td></td></tr></tbody></table>

adenovirale transductie van naïeve cd4 t-cellen aan treg differentiatie studie

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatoire T-cellen (Tregs) zijn essentieel voor immunotolerantie aan zichzelf en aan bepaalde vreemde antigenen. Tregs kunnen vanuit naïeve CD4 T-cellen in vitro met TCR-en co-stimulering in de aanwezigheid van TGFp en IL-2. Dit draagt ​​enorm potentieel voor toekomstige therapie echter de moleculen en signaalwegen control differentiatie grotendeels onbekend. Primaire T-cellen kunnen worden gemanipuleerd door ectopische genexpressie, maar gemeenschappelijke methoden niet aan de belangrijkste naïeve toestand van de T-cel te richten voor primaire antigen herkenning. Hier bieden we een protocol om buitenbaarmoederlijke genen tot expressie in naïeve CD4 T-cellen in vitro voor het induceren van Treg differentiatie. Het geldt transductie met de replicatie-deficiënte adenovirus en legt de opwekking en productie. Het adenovirus kan nemen grote inserts (tot 7 kb) en kan worden uitgerust met de initiatiefnemers te hoog en voorbijgaande OVEREXP bereikenression in T-cellen. Het transduceert effectief naïeve muis T-cellen als ze drukken een transgeen Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Belangrijk na infectie de T cellen blijven naïeve (CD44 laag, CD62L hoog) en rustend (CD25 -, CD69 -) en kan worden geactiveerd en gedifferentieerd tot Tregs Soortgelijke niet-geïnfecteerde cellen. Zo, deze methode maakt manipulatie van CD4 T-cel differentiatie vanaf het allereerste begin. Het zorgt ervoor dat ectopische genexpressie is al op zijn plaats wanneer vroege signalering gebeurtenissen van de eerste TCR stimulatie induceert cellulaire veranderingen die uiteindelijk leiden naar Treg differentiatie.

Virus Production Voor het genereren van hoge virus titers, de timing van HEK293A celoogst in primaire virusproductie of virusreplicatie cruciaal. Representatieve fluorescente en fasecontrastbeelden met visuele tekenen van virusproductie zijn weergegeven in figuur 3. De CPE werden waargenomen 10 dagen na transfectie van HEK293A cellen met een controle pCAGAdDu vector zonder insert. CPE worden gekenmerkt door de verschijning van gebieden met vergrote en round-up cellen die beginn...

Adenovirale genoverdracht in naïeve CD4 T-cellen met transgene expressie van de Coxsackie adenovirus receptor kan de moleculaire analyse van regulatoire T celdifferentiatie<em&gt; In vitro</em&gt;.

Adenovirale transductie van Naïeve CD4 T-cellen aan Treg Differentiatie Studie

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Dit protocol biedt een workflow voor de productie van infectieuze adenovirale particles die worden gebruikt om een gen van belang te transduceren in naïeve T-cellen, die vervolgens ectopic expressie van het transgen vertonen of differentiëren tot regulatoire T-cellen of tregs. Eerst wordt het gen van belang gekloond in de adenovirale bestemmingsvector. De vector wordt vervolgens overgebracht naar de adenovirus-producenten-cellijn, HC 2 93 A, waarna infectieuze adenovirale particles worden gegenereerd.De resulterende virussen worden gebruikt om naïeve T-cellen van muizen te infecteren met een adenovirusreceptor-transgen na infectie. De cellen worden vervolgens in rust gebracht om de expressie van het gen van belang te waarborgen. In naïeve T-cellen worden de T-cellen geactiveerd onder polariserende condities om treg-differentiatie te induceren.Vervolgens worden de cellen gefixeerd en gekleurd voor flowcytometrische analyse. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de expressie van de treg-differentiatiemarker, Fox P three en de infectiemarker GFP laten zien, welke beïnvloed kunnen worden door het overgeëxprimeerde gen van belang. Het belangrijkste voordeel van deze techni

adenoviral-transduction-naive-cd4-t-cells-to-study-treg

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We presenteren een protocol om antigeen-specifieke muis T-cellen te produceren met behulp van retrovirale...

Retrovirale Transductie van T-cel-receptoren in Mouse T-cellen

Wij beschrijven een werkwijze voor het regulerende, geheugen naïeve T-cellen van een menselijke bloed donoren. Gepolariseerde Tregs kan worden vergeleken met andere subgroepen in verschillende genetische en functionele toepassingen met genetische homogeniteit, zoals onderdrukking assay ook hier beschreven.

Genereren van Induced regulatoire T-cellen uit primaire menselijke naïef en geheugen T-cellen

Met effector functies te onderscheiden van andere T-cel subsets, zijn Th17 cellen centraal zijn betrokken bij inflammatoire auto-immuniteit. Deze in vitro Th17 differentiatie protocol verschaft een middel om te bepalen of naïeve CD4 + T-lymfocyten kunnen differentiëren in Th17 cellen en hun rol bij auto-immuniteit en gastheerrespons verder te onderzoeken.

Isolatie en Th17 Differentiatie van naïeve CD4 T-lymfocyten

Naïve CD4+ T-cellen polariseren naar verschillende subsets, afhankelijk van de omgeving op het moment van activering.  De differentiatie van naïve CD4+ T-cellen naar verschillende effector-subsets kan in vitro worden bereikt door de toevoeging van T-celreceptor-stimuli en specifieke cytokine-signalen.

Muis Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolatie en<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiatie in T cel subsets

Hier beschrijven we een protocol om het fenotype van regulatorische T-cellen (Treg) te analyseren die zijn geïsoleerd uit naïeve en chronisch lymphocytaire choriomeningitis-virus geïnfecteerde muizen. Daarnaast bieden we een proces om de onderdrukkende activiteit van de Treg-cellen te evalueren.

Fenotypische en functionele analyse van geactiveerde regulatoire T-cellen Geïsoleerd van Chronische Lymfatische choriomeningitis-virus geïnfecteerde muizen

Vele experimentele systemen zijn gebruikt om de mechanismen reguleren T cel ontwikkeling en functie van een immuunrespons begrijpen. Hier een genetische benadering met behulp van retrovirale transductie wordt beschreven, dat is economisch, tijd efficiënt, en nog belangrijker, zeer informatieve bij het identificeren van de regelgeving paden.

Retrovirale Transductie van helper T-cellen als een genetische benadering om te studeren mechanismen die hun differentiatie en functie

Dit protocol beschrijft de reproduceerbare productie en fenotypering van mens veroorzaakte regulerende T-cellen (iTregs) van naïeve CD4 + T-cellen in vitro. Verschillende protocollen voor FOXP3 inductie mogelijk maken voor de studie van specifieke iTreg fenotypes verkregen met de respectieve protocollen.

In vitro differentiatie van humane CD4 + FOXP3 + geïnduceerde regulatoire T-cellen (iTregs) van naïeve CD4 + T cellen met behulp van een TGF-β-bevattende Protocol

Dit protocol beschrijft de differentiatie van naïeve CD4+ T-cellen tot pathogene Th17-cellen in vitro. In combinatie met een op flowcytometrie gebaseerde benadering met meerdere parameters kan met behulp van deze differentiatiemethode een zuiverheid van 90% van pathogene Th17-cellen worden verkregen uit naïeve CD4+ T-cellen.

In vitro differentiatie van naïeve CD4+ T-cellen tot pathogene Th17-cellen in muizen

De huidige studie toont protocollen voor het beoordelen van de vroege lotsverbintenis van virusspecifieke TFH-cellen en het manipuleren van genexpressie in deze cellen.

Toegang tot vroege differentiatie van virusspecifieke folliculaire helper CD4+ T-cel in acute LCMV-geïnfecteerde muizen

We presenteren een protocol voor retrovirale transductie van gids-RNA in primaire T-cellen van Cas9 transgene muizen, en bieden een efficiënt alternatief voor genbewerking bij het bestuderen van Th17-differentiatie.

Retrovirale CRISPR/Cas9-gemedieerde gentargeting voor de studie van Th17-differentiatie in vitro

Leer adenovirale transductie van naïeve CD4 T-cellen voor Treg-differentiatie met behulp van CAR-transgene muizen. Deze methode maakt tijdelijke overexpressie van genen mogelijk zonder celviabiliteit of differentiatiepotentieel te beïnvloeden.

Adenovirale transductie van Naïeve CD4 T-cellen aan Treg Differentiatie Studie

Meer video's verkennen