Name: Biochemische Titratie van glycogeen In vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-24T19:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Leer een biochemische methode voor glycogentitratie in vitro met behulp van fluorescentie na hydrolyse met alfa-amylase. Deze techniek biedt een betrouwbaar hulpmiddel voor onderzoek naar cellulaire energiedynamiek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij zijn dankbaar voor de Dr Thierry POURCHER voor zodat we de fluorescentie spectrometer gebruiken en voor zijn hulp. Het laboratorium wordt gefinancierd door de Ligue Nationale Contre le Cancer (equipe Labellisee), de Vereniging pour la Recherche contre le Cancer, het Institut National du Cancer (INCA), de Agence Nationale pour la Recherche, METOXIA (EU-programma KP7), het Centrum A. Lacassagne, het Centre National de la Recherche Scientifique, het Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale en de Universiteit van Nice ( <a href="http://www.unice.fr/isdbc/" target="_blank">http://www.unice.fr/isdbc/</a> ). Wij danken dr. M Christiane Brahimi-Hoorn voor het kritisch lezen en redactionele correctie.

Biochemische Titratie van glycogeen 1. Cell Lysis <ol><li> Zaad cellen bij een concentratie van 0,5-2 x 10 6 per 100 mm schaal. </li><li> Behandeling: incubeer cellen 24, 48, of 72 uur in een lage zuurstofconcentratie (hypoxie) in een Bug-Box anaërobe werkplek (Ruskinn Technology Biotrace International Plc, Bridgend, UK) vastgesteld op 1% of 0,1% O 2, 94% of 94,9% N2 en 5% CO2. Parallel incubeer cellen in normoxia (21% O2, 5% CO2). Opnieuw medium (25 mM glucose-bevattend medium) elke 24 uur variaties in de glucoseconcentratie in de tijd van het experiment te minimaliseren. </li><li> Na de behandeling, wassen cellen 2x met PBS om sporen van glucose uit kweekmedium te verwijderen. Schraap de cellen in koude PBS. </li><li> Centrifugeer de oplossing bij 1000 rpm gedurende 5 min, gooi de supernatant en was de pellet eenmaal met PBS. De pellet kan bij -20 ° C worden ingevroren voordat u verder gaat.</li><li> Resuspendeer de pellet in 100 pl gedestilleerd water. Voeg 100 ul van de glycogeen hydrolyse Buffer voorzien van de glycogeen Assay Kit (Abcam). Kook het lysaat bij 95 ° C gedurende 5 minuten om enzymen te inactiveren. </li><li> Vortex en centrifugeer het lysaat bij 13.000 rpm gedurende 10 min om de onoplosbare producten verwijderen. Houd de bovenstaande vloeistof. </li><li> Om glycogeen niveaus normaliseren van het eiwitgehalte van monsters kan kwantificering van eiwitten worden gedaan met 25-35 pl van het supernatant met behulp van de bicinchoninezuur assay (BCA-Interchim). </li></ol> Sommige lysaat kan worden gebruikt om het vrije glucoseconcentratie gemeten in de cellen. 2. Hydrolyse van Glycogeen <ol><li> Meng 50 ul van de supernatant (stap 1) met 1 pl van de hydrolyse Enzym Mix. Dit mengsel bevat glucoamylase. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Bereid de ijkcurve door verdunning van de standaard glycogeen (2 mg / ml) supplied met de kit een oplossing van 10 ug / ml in de hydrolyse buffer. Bereid vervolgens zes afzonderlijke buizen met 0, 4, 8, 12, 16 en 20 pl van 10 ug / ml standaard en elke buis passen aan een eindvolume van 50 pl met hydrolyse buffer tot een concentratie van glycogeen geven van 0, 0.04 , 0,08, 0,12, 0,16 en 0,2 ug / ml. Voeg 1 ul van hydrolyse Enzym Mix van de standaarden en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li></ol> De achtergrond glucoseconcentratie van de cellijn, van de waarde van de vrije glucoseconcentratie moet worden afgetrokken van de waarde van de totale concentratie glucose (glucose uit het glycogeen hydrolyse + vrije glucose) om het niveau van glycogeen in de cel te bepalen. 3. Ontwikkeling en lezen van fluorescentie <ol><li> Voor elke staat, bereiden een buis (buis 1) om gratis glucoseconcentratie en twee buizen te meten (buizen 2 en 3) aan de totale concentratie glucose (elke buis wit metenha verschillende volume van gehydrolyseerde glycogeen). </li><li> Voeg 15 pl supernatant geëxtraheerd eind van stap 1 in buis 1. Voeg 35 ul van hydrolyse buffer te vullen tot een eindvolume van 50 pi. Verkregen fluorescentie zal de vrije glucoseconcentratie geven. </li><li> Voeg X ui gehydrolyseerd glycogeen (verkregen bij stap 2) in buis 2. Stel een eindvolume van 50 pi. Monstervolume (X pl) moet worden aangepast aan celdichtheid en / of celtype om fluorescentie waarden die niet buiten concentraties van de ijkcurve te bepalen. </li><li> Voeg 2 X pi van gehydrolyseerde glycogeen in buis 3. Stel een eindvolume van 50 pi. </li><li> Bereid een ontwikkeling oplossing voor monsters en standaarden door het mengen voor elke buis 48,7 ul van Ontwikkeling buffer, 1 ui van Ontwikkeling Enzym Mix en 0,3 pl OxiRed Probe (in het glycogeen Assay Kit meegeleverd). Bijvoorbeeld, voor 2 voorwaarden, bereiden een mix voor 12 buiss (6 voor normen, 2 gratis glucose en 4 voor de totale glucose fluorescentie). </li><li> Voeg 50 ul van dit mengsel aan elke buis en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Meet de fluorescentie bij een excitatiegolflengte van 535 nm, een emissiegolflengte van 587 nm zoals aanbevolen, en een spleet van 3 nm voor excitatie en emissie. </li></ol>

<ol><li>Pelletier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+Synthesis+is+Induced+in+Hypoxia+by+the+Hypoxia-Inducible+Factor+and+Promotes+Cancer+Cell+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival.</a> Front Oncol. 2, (2012).</li>
<li>Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+look+at+the+biogenesis+of+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A new look at the biogenesis of glycogen.</a> FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).</li>
<li>Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+features+of+glycogen+metabolism+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Specific features of glycogen metabolism in the liver.</a> Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).</li>
<li>Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMP-activated+protein+kinase+does+not+associate+with+glycogen+alpha-particles+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).</li>
<li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+of+alpha+and+beta+particles+in+glycogen+using+molecular+size+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions.</a> Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).</li>
<li>Chee, N. P., Geddes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+liver+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The structure of liver glycogen.</a> FEBS Lett. 73, 164-166 (1977).</li>
<li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+and+its+metabolism%3A+some+new+developments+and+old+themes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochem. J. 441, 763-787 (2012).</li>
<li>Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+metabolism+in+the+normal+red+blood+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Glycogen metabolism in the normal red blood cell.</a> Blood. 40, 836-843 (1972).</li>
<li>Agbanyo, M., Taylor, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+3-deoxy-3-fluoro-D-glucose+into+glycogen+and+trehalose+in+fat+body+and+flight+muscle+in+Locusta+migratoria%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria.</a> Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).</li>
<li>Louzao, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Fluorescent+glycogen%22+formation+with+sensibility+for+in+vivo+and+in+vitro+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj.+J%22%5BJournal%5D)">"Fluorescent glycogen" formation with sensibility for in vivo and in vitro detection.</a> Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).</li>
<li>Sheehan, D. C. H., B, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSheehan%2C+DCH+%22Theory+and+practice+of+histotechnology%22">Theory and practice of histotechnology</a>. , 2nd edition, Batelle Press. (1980).</li>
<li>Baba, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+monoclonal+antibody+that+recognizes+glycogen+and+its+application+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Kokubyo+Gakkai+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry.</a> Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Biochemische titratie van glycogeen in vitro maakt een nauwkeurige kwantificering van cellen glycogeengehalte. In vergelijking met een aantal andere technieken (PAS, immunofluorescentie met een glycogeen antilichaam, enz.), Deze titratie is zeer specifiek, gevoelig en reproduceerbaar. Bovendien is de werkwijze is gunstig omdat het geen radioactiviteit maar een fluorescentie spectrometer vereist. Deze techniek is zuiver kwantitatieve en ofwel informaties glycogeen verspreiding in de cel kan worden gebra...

Glycogeen is een multibranched polymeer van glucose residuen die aanwezig zijn in het cytoplasma van vele celtypen. Het is een van de belangrijkste vormen van energieopslag in cellen en speelt een belangrijke rol in glucosemetabolisme. De meeste zoogdiercellen kunnen opslaan en glycogeen, die snel kunnen worden afgebroken tot glucose om glycolyse en ATP productie te bevorderen tijdens metabole stress produceren. Hepatocyten produceren grote hoeveelheden glycogeen de bloedsuikerspiegel waardoor een continue aanvoer van glucose aan het lichaam. In tegenstelling, de concentratie van glycogeen in andere cellen (spieren, rode bloedcellen, etc.) relatief laag. Echter, plaatselijk, deze hoeveelheden voldoende om energie op korte termijn wanneer de cellen plotseling blootgesteld aan een omgeving beroofd van voedingsstoffen. Glycogeen synthese en afbraak glycogeen volgt dezelfde stappen in alle weefsels (figuur 1). Allereerst glucosebinnenkomt cellen door glucose transporters (gluts) en snel omgezet van glucose-6-fosfaat (G6P) in glucose-1-fosfaat (G1P) van fosfoglucomutase. G1P wordt dan gewijzigd in UDP-glucose, en het koolstofatoom C1 UDP-glucose is een tyrosine residu glycogenin, de verankering eiwit van glycogeen gehecht. Dit molecuul, beschouwd als een glycogeen primer, wordt verlengd met bevestiging van de UDP-glucose naar de terminal glucose door een α (1 → 4) binding via de glycogeen synthase. Tenslotte, wanneer een lineaire keten van meer dan 11 glucose residuen gevormd, het vertakkingsenzym brengt een terminal oligosaccharide gevormd door ten minste 6 glucose residuen ander glucose van de keten nabijgelegen via een α (1 → 6) binding. De herhaling van dit proces geeft een enorme fractale structuur met takken die een helix met 6,5 glucose per beurt vormen. Glycogeen kan omgekeerd gehydrolyseerd worden tot glucose door de gezamenlijke actievan debranching enzymen die de α (1 → 6) gebonden en glycogeenfosforylase dat de α (1 → 4) glycosidische gebonden tussen de laatste resten van glucose van een tak en het glycogeen molecuul hydrolyseert hydrolyseren. Deze reactie heet glycogenolysis wordt geactiveerd door het verhogen van het niveau van AMP (reflecterende ATP consumptie), en geremd door glucose en ATP 2,3. Door elektronenmicroscopie werden glycogeen moleculen zijn beschreven in vele celtypen als β vrije deeltjes (of glycogeen monoparticles) van 15-30 nm in diameter. In specifieke celtypen zoals hepatocyten, kan β deeltjes worden samengevoegd tot een complex rozetten, ook wel α deeltjes die variëren in diameter van 80 nm tot maximaal 200 nm 4 vormen </sup&gt;. De manier waarop deze β deeltjes zijn samengevoegd tot grotere clusters van α-deeltjes te vormen is nog niet volledig opgehelderd. Enig bewijs lijkt aan te tonen dat β deeltjes worden gebonden door covalente binding 5, waterstofbinding, of zelfs door eiwit-eiwit interacties 6. De hoeveelheid glycogeen in de cellen is afhankelijk van vele parameters: (I) de hoeveelheid glycogenin in de cel die glycogeen synthese initieert, (II) de activiteit van glycogeen synthase en fosforylase gereguleerd door eiwit fosforylatie / defosforylatie, (III) hetzij van glucose in de cellen, die afhankelijk is van verschillende parameters zoals de aanvoer van glucose uit het vasculaire systeem en glucoseopname door cellen. Glycogeenopslag zijn strak gereguleerd door allosterische regulering van biosynthetische hormonen via intermediaire metabolieten, door hormonen reguleren energiemetabolisme, en door nutrient sensing signaalwegen 7. Het is belangrijk omkunnen glycogeen kwantificeren in biologische monsters beter te begrijpen van het belang van glycogeen metabolisme in het gehele lichaam en cellulaire niveau. We beschrijven hier een nauwkeurige, reproduceerbare en handige biochemische in vitro test voor glycogeen. Deze techniek is gebaseerd op het kwantificeren glucose fluorescentie voor en na specifieke hydrolyse van glycogeen. Andere methoden bestaan ​​om het niveau van glycogeen schatten in de cellen, maar de meeste zijn niet kwantitatief. Een van de eerste technieken beschreven voor het kwantificeren van glycogeen in de cellen was gebaseerd op metingen van [14C]-glucose opname in glycogeen 8,9. Het gebruik van radioactiviteit maakt dit proces moeilijker te hanteren, maar het heeft het voordeel dat de snelheid van glucose opname in glycogeen en onderscheiden tussen de verdeling van glucose residuen op de buitenste takken en in de kern van het molecuul (het vereist ook een Aanvullende β-amylolysis en een chromatografische stap). Een andere techniek is meer recent ontwikkeld en is gebaseerd op de opname van 2-NBDG (2 - {N-[,3-diazol 4-yl-7-nitrobenz-2-oxa-1] amino}-2-deoxyglucose), een 2-deoxyglucose fluorescerend derivaat, in glycogeen 10. De gemeten fluorescentie-intensiteit geeft de hoeveelheid glycogeen geproduceerd en kan worden gemeten met een fluorescentie lezer. Verdeling van fluorescentie in de cel kan ook worden geëvalueerd door confocale microscopie. Onder de andere nonquantitative technieken, Periodic Acid-Schiff kleuring (PAS) is misschien wel de meest voorkomende. Het kan gebruikt worden voor de detectie van glycogeen in gefixeerde cellen, weefselcoupes in paraffine of bevroren. Deze histologische techniek kleuren niet specifiek polysacchariden, glycolipiden, glycoproteïnen, cellulose en neutrale mucines in paars. De specificiteit van deze test kan worden verhoogd door behandeling van gefixeerde cellen of weefselsecties met diastase, die specifiek verteert glycogeen. Daarnahet niveau van glycogeen kan kwalitatief worden geschat door het vergelijken van gehydrolyseerde monsters (alle koolhydraten gemodificeerde macromoleculen) om gehydrolyseerde monsters (koolhydraten gemodificeerde macromoleculen behalve glycogeen). PAS kleuring en microscopische analyse tegenstelling biochemische analyses van glycogeen, geeft informatie over de verdeling van glycogeen in de cellen, die kunnen worden verspreid of geconcentreerd in een bepaald deel van de cel. Echter, hoewel PAS kleuring schattingen verschillen glycogeen verschillende omstandigheden is niet kwantitatief 11. Een monoklonaal muizenantilichaam oorspronkelijk gebruikt mandibulaire condylaire kraakbeen antigeen waargenomen tussen glycogeen in cellen en gezuiverd glycogeen reageren in vitro 12. Aangezien dit antilichaam herkent specifiek glycogeen gerelateerde suikerketens is een nuttig hulpmiddel voor de detectie van glycogeen door immunohistochemie op een meer specifieke wijze dan de PAS kleuring. </p&gt; Elektronenmicroscopie is een andere techniek die visualisatie van korrels van glycogeen in de cellen en de evaluatie van de mate van glycogeen opslag mogelijk maakt. In feite, glycogeen β deeltjes herkenbaar met een elektron microscopie elektron granulen 1.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31966.047</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen Assay Kit</td><td>Abcam</td><td>ab65620</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Fluorescence Spectrometer</td><td>PerkinElmer</td><td>LS 50B</td><td></td></tr></tbody></table>

biochemische titratie van glycogeen<em&gt; in vitro</em

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogeen is de belangrijkste energetische polymeer van glucose in gewervelde dieren speelt een cruciale rol geheel stofwisseling en in cellulair metabolisme. Vele manieren om glycogeen te sporen bestaat, maar slechts een paar zijn kwantitatief. We beschrijven hier een methode waarbij de Abcam Glycogen testkit, die is gebaseerd op specifieke afbraak van glycogeen tot glucose met glucoamylase. Glucose wordt vervolgens geoxideerd tot een specifiek product dat reageert met de OxiRed probe fluorescentie te produceren. Titratie is nauwkeurig, gevoelig en kan worden bereikt op mobiele extracten of coupes. In tegenstelling tot andere technieken, zij geen informatie over de verdeling van glycogeen in de cel geven. Als voorbeeld van deze techniek, beschrijven we hier de titratie van glycogeen in twee cellijnen, Chinese hamster long fibroblasten CCL39 en humaan coloncarcinoom LS174, geïncubeerd in normoxia (21% O2) tegen hypoxie (1% O2). Onze hypothese was dat hypoxie is een signal die bereidt cellen synthetiseren en opslaan glycogeen om te overleven 1.

Een laag niveau van zuurstof (hypoxie) in tumoren signalen naar tumorcellen dat de energie opslaan volgende nutriënten uitputting behandelen, teneinde te overleven. Als glycogeen is de belangrijkste energetische polymeer van glucose in zoogdiercellen, bestudeerden we de regulatie van glycogeen opslag in hypoxie. De berekening en normalisatie van de concentratie van glycogeen in cellysaten worden uitgevoerd op de ruwe gegevens van fluorescentie weergegeven in de tabellen 1, 2 en 3. De bi...

We beschrijven hier een nauwkeurige, reproduceerbare en handige biochemische methode voor titratie van glycogeen in vitro. Deze techniek gebruikt de Abcam Glycogen testkit en is gebaseerd op opeenvolgende hydrolyse van glycogeen tot glucose en glucose titratie van fluorescentie.

Biochemische Titratie van glycogeen<em&gt; In vitro</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Het algemene doel van deze procedure is om glycogeen in vitro te titratiseren in celmonsters. Dit wordt bereikt door eerst de cellen te lyseren door mechanische verstoring. De tweede stap is om het glycogeen te hydrolyseren met alfa-amylase om de glucose te verkrijgen.Vervolgens wordt de glucose geoxideerd waardoor een fluorescerende soort ontstaat. De laatste stap is om de fluorescentie te meten. Uiteindelijk wordt biochemische titratie van glycogeen gebruikt om veranderingen in glycogeengehalte in cellen te tonen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het competitief, gevoelig, nauwkeurig en zeer specifiek is. Om deze procedure te beginnen, zaait u cellen met een concentratie van 0,5 tot 2 miljoen per 100 millimeter diameter schaal. Incubeer de cellen gedurende 24, 48 of 72 uur in hypoxie in een anaërobe werkstation ingesteld op 1% zuurstof, 94% stikstof en 5% koolstofdioxide.Parallel hieraan, incubeer een andere set cellen in normoxie voor elke zuurstofconditie. Ververs het 25 millimolair glucose bevattende medium elke 24 uur om variaties in de glucoseconcentratie tijdens het experiment na behandeling te minimaliseren. Was de cellen twee keer met PBS om sporen van glucose uit het kweekmedium te verwijderen.Schraap vervolgens de cellen in koud PBS centrifuge, de PBS-oplossing bij 1000 RPM gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en was de pellet eenmaal met PBS. Plaats vervolgens de pellet opnieuw in 100 microliters gedistilleerd water en voeg 100 microliters van de glycogeenhydrolysebuffer toe verkregen uit een glycogeen assay kit.Laat het lysate gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius koken om de enzymen te inactiveren. Zodra het lysate is afgekoeld tot kamertemperatuur, vortex en centrifugeer. De lysate bij 13.000 keer.Gedurende 10 minuten door middel van zwaartekracht om de onoplosbare producten te verwijderen. Leg vervolgens de supernatant opzij om glycogeenniveaus te normaliseren op de eiwitinhoud tussen monsters. Kwantificeer de eiwitten met 25 tot 35 microliters van de supernatant met behulp van de basiszuurtest.Volgend op deze mix, 50 microliters van de supernatant van de vorige stappen met één microliter van de hydrolyse-enzymmix. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en leg het opzij om de kalibratiecurve standaard te bereiden, verdun de standaardkit glycogeen met hydrolysebuffer om een ​​uiteindelijke concentratie van 10 microgram per milliliter te geven. Voeg vervolgens 0, 4, 8, 12, 16 en 20 microliters van de 10 microgram per milliliter toe.Standaard in zes afzonderlijke buisjes verdun elke standaard met hydrolysebuffer om een ​​uiteindelijk volume van 50 microliters en een glycogeenconcentratie van respectievelijk 0,04, 0,08, 0,12, 0,16 en 0,2 microgram per milliliter te geven. Voeg één microliter hydrolyse-enzymmix toe aan de standaarden en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur voor elke zuurstofconditie. Label buis één als vrije glucoseconcentratie en buizen twee en drie als totale glucoseconcentratie.Voeg vervolgens 15 microliters van de geëxtraheerde supernatant toe aan buis één gevolgd door 35 microliters van de hydrolysebuffer om een ​​uiteindelijk volume van 50 microliters te geven. De fluorescentie die overeenkomt met de vrije glucoseconcentratie zal later worden gemeten. Voeg vier microliters van het gehydrolyseerde glycogeen toe aan buis twee en pas aan tot een uiteindelijk volume van 50 microliters met hydrolysebuffer.Om de fluorescentiewaarden binnen de concentraties van de kalibratiecurve te houden, voegt u twee microliters gehydrolyseerd glycogeen toe aan buis drie en past u aan tot een uiteindelijk volume van 50 microliters met hydrolysebuffer. Bereid vervolgens een ontwikkelingsoplossing voor alle monsters en standaarden door 48,7 microliters ontwikkelingsbuffer, één microliter ontwikkelings-enzymmix en 0,3 microliters Oxy Redd Probe te mengen. Voeg voor elk monsterstandaard 50 microliters van deze mix toe aan elke buis en incubeer in het donker gedurende 30 minuten.Bij kamertemperatuur voor de fluorescentiemeting, stelt u de spleet in op drie nanometer voor excitatie en emissie, en meet vervolgens de fluorescentie. De regulatie van glycogeenopslag en hypoxie werd bestudeerd omdat glycogeen de belangrijkste energieke polymeer van glucose in zoogdiercellen is. De berekening en standaardisatie van de glycogeenconcentratie in celsaten werd uitgevoerd op de ruwe gegevens van fluorescentie.Zoals hier getoond van de fluorescentiemetingen, werd de totale vrije glucoseconcentratie berekend. Met behulp van deze resultaten werd de glucosehoeveelheid afgeleid van glycogeen bepaald. De biochemische assay voor glycogeen bevestigde dat de elektronendichte aggregaten die op elektronenmicrografieën van ccl 39 cellen werden waargenomen, glycogeendeeltjes waren.De accumulatie van glycogeen en hypoxie is afhankelijk van de transcriptiefactor. Hypoxie-induceerbare factor een, de belangrijkste transcriptiefactor betrokken bij cellulaire aanpassing aan hypoxie in verschillende kanker- en niet-kankercellijnen, kan glycogeen snel worden gemetaboliseerd door de cel in minder dan zes uur. Bovendien beschermt het gebruik van glycogeen tegen celdood onder omstandigheden van glucosegebrek na volgen van deze procedure.Ook kunnen methoden zoals elektronenmicroscopie en periodieke zuurshiftkleuring worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de verdeling van glycogeen in cellen.

biochemical-titration-of-glycogen-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video describes a spectrophotometric assay for the estimation of glycogen synthase activity. The method relies on the reduction in the absorbance of NADH with time and indicates glycogen synthase activity.

Spectrophotometric Assay to Determine Glycogen Synthase Activity

In this video, we describe a qualitative spectrophotometric assay to determine the extent of branching in a glycogen sample with an uncharacterized structure. Comparing the absorbance maxima of the uncharacterized sample with that of polysaccharides with known branched structures indicates the presence of branching in the uncharacterized sample.

Glycogen Branching Assay to Measure the Degree of Glycogen Branching

Periodienzuur-Schiff-kleuring is een techniek die het polysacharidegehalte van weefsels visualiseert. Dit artikel demonstreert het protocol voor periodienzuur-Schiff-kleuring dat is aangepast voor gebruik op mononucleaire cellen uit perifeer bloed, gezuiverd uit menselijk veneus bloed. Dergelijke monsters zijn verrijkt met lymfocyten en andere witte bloedcellen van het immuunsysteem.

Detecteren Glycogeen in perifeer bloed mononucleaire cellen met Periodic Acid Schiff kleuring

Hier presenteren we een betrouwbare en gemakkelijke analyse om het glycogeengehalte in cyanobacteriële cellen te meten. De procedure omvat precipitatie, selecteerbare depolymerisatie en de detectie van glucose residuen. Deze methode is geschikt voor zowel wildtype als genetisch gemanipuleerde stammen en kan de metabolische techniek van cyanobacteriën vergemakkelijken.

Bepaling van het glycogeengehalte in cyanobacteriën

Technieken om de activiteit van belangrijke enzymen van glycogeenmetabolisme te meten, worden gepresenteerd, met behulp van een eenvoudige spectrofotometer die in het zichtbare bereik werkt.

Spectrofotometrische methoden voor de studie van eukaryote glycogeenmetabolisme

Voor de extractie van leverglycogeen werd een optimale sucroseconcentratie bepaald met behulp van sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie. De toevoeging van een kookstap van 10 minuten om glycogeenafbrekende enzymen te remmen, bleek gunstig.

De extractie van leverglycogeenmoleculen voor de bepaling van de glycogeenstructuur

De test op dierlijk weefsel maakt gebruik van nucleaire scintillatiedetectie om de enzymatische activiteit van glycogeensynthase te bepalen door de opname van radioactief gelabelde glucose in glycogeen te meten.

Radiochemische beoordeling van de enzymactiviteit van glycogeensynthase in dierlijk weefsel

In deze video, tonen we een alternatieve methode voor de detectie en titering van virussen met behulp van een enzymatische antigeen detectie techniek die bekend staat als een immunoperoxidase test. Hier zullen we u tonen hoe u uw viral monsters, de voorbereiding van de cellen voor het testen, en ten slotte de immunoperoxidase test met behulp van seriële verdunningen van de virale titer te bepalen.

Titratie van de Mens Coronavirussen Met behulp van een immunoperoxidase Assay

Na de vorming van neurale buis, de neuroepithelium vernauwt en plooien, terwijl de buis gevuld met embryonale cerebrospinale vloeistof (eCSF) om de embryonale hersenen ventrikels vormen. We hebben deze ventrikel injectie techniek om beter te visualiseren van de vloeistof gevulde ruimte in tegenstelling tot de neuro-vorm in een live-embryo.

Zebravis hersenventrikel Injection

Een algemeen protocol voor het gebruik van isotherme titratie calorimetrie de bindende thermodynamica voor biologische systemen te volgen met matige bindingsaffiniteiten wordt gepresenteerd.

Isotherme Titratie Calorimetrie voor het meten van macromolecuul-ligand Affiniteit

Leer een biochemische methode voor glycogentitratie in vitro met behulp van fluorescentie na hydrolyse met alfa-amylase. Deze techniek biedt een betrouwbaar hulpmiddel voor onderzoek naar cellulaire energiedynamiek.

Biochemische Titratie van glycogeen

Meer video's verkennen