Protocollen voor het beoordelen van radiofrequentie Interacties met gouden nanodeeltjes en Biological Systems voor niet-invasieve Hyperthermie Cancer Therapy
28 augustus 2013
We beschrijven protocollen gebruikt om de interacties van 13,56 MHz radiofrequentie (RF) onderzoeken elektrische velden met gouden nanodeeltjes colloïden in zowel niet-biologische en biologische systemen (in vitro / vivo). Deze interacties worden onderzocht voor toepassing bij kankertherapie.
Het algemene doel van deze procedure is om de verwarmingseigenschappen van gouden nanodeeltjes in een elektrisch veld van 13,56 megahertz radiofrequentie te beoordelen, in vitro en in vivo. Dit wordt bereikt door eerst de opwarmingssnelheid van geconcentreerde gouden nanodeeltjes en hun buffer in een kwartsvet te beoordelen. De tweede stap van de procedure is om in vitro toxiciteitsstudies uit te voeren van gouden nanodeeltjes met gekweekte kankercellen.
De derde stap is om in vivo-onderzoeken uit te voeren van gouden nanodeeltjes in een ectoop muiskankermodel. Uiteindelijk kunnen de resultaten laten zien of het onderzochte nanodeeltje een effectief middel kan zijn voor gebruik met RF-gemedieerde hyperthermie door analyse van de nanodeeltjes in suspensie, in vitro en in vivo. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van nanodeeltje-gemedieerde niet-invasieve radiofrequentie hypotherma, zoals is verwarming te wijten aan de deeltjes zelf en kan het voor therapeutische doeleinden worden gebruikt?
Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat er niet veel goed gevestigde protocollen zijn voor het uitvoeren van dit type experimenten. Het demonstreren van de procedure zal worden gebrandmerkt Cisneros, een onderzoeksassistent, Stuart Core, een postdoctoraal wetenschapper, en Leila Green, een andere postdoctoraal wetenschapper. Als voorbeeld, begin met een commercieel verkrijgbare fles van 500 milliliter gouden nanodeeltjes met een diameter van vijf nanometer.
Neem ongeveer 125 milliliter van de stam gouden nanodeeltjesoplossing en verdeel deze tussen zes centrifugeerfilterbuizen van 50 kilodalton, centrifugeer de nanodeeltjes gedurende 3000 RPM gedurende twee minuten en vijf seconden. Verwijder de supernatant, dat de gefilterde buffer is, en vul elke filter opnieuw. Met meer stamoplossing.
Ga door met centrifugeren en verwijder de buffer en laad de buizen opnieuw totdat alle nanodeeltjesoplossing is gefilterd. Na de laatste toevoeging, vervang de gefilterde buffer met een vergelijkbaar volume gedeïoniseerd water en herhaal het proces ongeveer acht keer meer nadat de gefilterde buffermonster naar de RF-machine is geladen. Gebruik de infraroodcamerasoftware om vakken over de QVE te maken om het opwarmingsprofiel vast te leggen. Na acht wasbeurten nadert de opwarmingsgegevens van het vijf nanometer gouden nanodeeltjesfiltraat die van gedeïoniseerd water.
UV vis-analyse kan ook worden gebruikt om contaminant absorptie.Peaks. Hier wordt een schoon spectrum getoond. Zodra de bufferverontreinigingen volledig zijn verwijderd, suspenderen we de nanodeeltjes in 0,5 milliliter gedeïoniseerd water in de filterbuizen die de nanodeeltjes uit de filter verwijderen.
Combineer vervolgens alle zes suspensies in één 15 milliliter buis. Analyseer nu het monster met behulp van UV VIS en zeta potentieel voor stabiliteitsgegevens. Gebruik I-C-P-O-E-S en of ICP massa spec om de nanodeeltjesconcentratie te bepalen.
SEM en of TEM-analyse kunnen ook worden gebruikt om morfologische gegevens te verkrijgen met behulp van een Kansas RF-systeem of afleidingen van belasting, een 1,3 milliliter spuit kwarts vete, en stel het RF elektrische veld in op ongeveer 90 kilovolt per meter in lucht waar de Q vete zou resideren. Voor een standaard zoutroep met 0,9% natriumchloride zou het elektrische veld worden verminderd tot ongeveer 1,1 kilovolt per meter. Dit zijn de geschatte omstandigheden die worden gebruikt om vergelijkingen te maken tussen verschillende RF-systemen.
Laad nu een schone kwarts vete met 1,3 milliliter gezuiverde gouden nanodeeltjes suspensie op een concentratie van 1000 milligram per liter. Stel het monster bloot aan het RF-veld gedurende een periode van 120 seconden of tot het monster 70 graden Celsius bereikt. Overmatige blootstelling kan leiden tot elektrische boogvorming of snel koken.
Vang de thermische beeldgegevens op evenals controlegebieden met behulp van een IR-camera en de bijbehorende software. Herhaal deze procedure drie keer op hetzelfde monster. Filter nu het monster door een andere centrifugeerfilter van 50 kilodalton om de gouden nanodeeltjes uit de waterbuffer te extraheren.
Stel vervolgens de buffer alleen opnieuw bloot aan het RF-veld. Nogmaals, drie keer het verschil in de uren tussen het gouden nanodeeltjes colloid en het filtraat bepaalt de HR door de gouden nanodeeltjes zelf. Ten slotte schorsen we de resterende gouden nanodeeltjes van de filter in 1,3 milliliter water voor verdere experimenten.
Deze in vitro-studies kunnen worden toegepast op elk type kankerceltype dat 2D-monolagen vormt. In dit voorbeeld zullen humane hepatocellulaire carcinoombesmette Hep drie B-cellen worden gebruikt om ongeveer 50.000 cellen te plateren. In drie putjes van een 12-putjesplaat met één milliliter groei.
Media blijf cellen laden totdat drie platen zijn gevuld voor nanodeeltjesstudies, en drie platen zijn gevuld als controles. Bewaar de platen gedurende 24 uur bij 37,5 graden Celsius. De volgende dag introduceert u 0,1 milliliter van een 1000 milligram per liter gouden nanodeeltjesoplossing in elk putje van de drie nanodeeltjesplaten naar de controleplaten.
Bij 0,1 milliliter water in elk, putje bewaar alle platen gedurende nog eens 24 uur. Na nog eens 24 uur aspireert u het celmedium en spoelt u de cellen met PBS om eventuele aan het oppervlak gebonden gouden nanodeeltjes te verwijderen. Vervang vervolgens het celmedium.
De cellen zijn nu klaar voor RF-blootstelling. Plaats elke 12-putjescelpack binnen het RF-veld en wacht tot de cellen zijn afgekoeld tot 31 graden Celsius. Zodra ze licht zijn afgekoeld, stelt u de cellen bloot aan 3,5 minuten van rf.
De uiteindelijke temperatuur van het celmedium zal ongeveer 37 graden Celsius zijn. Breng de cellen over in een incubator en wacht 24 uur voordat u ze analyseert. Wanneer de cellen klaar zijn, aspireer het medium en vervang het door twee milliliter 25%MTT reagens in media.
Laat vervolgens de cellen nog eens vier uur incuberen. Vervang vervolgens het MTT-medium met twee milliliter DMSO. Plaats de celplaten op een bench rocker gedurende 10 minuten om het
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de interacties van radiofrequente elektrische velden van 13,56 MHz met goudnanodeeltjescolloïden in zowel biologische als niet-biologische systemen. De focus ligt op het beoordelen van de opwarmende eigenschappen van deze nanodeeltjes voor potentiële toepassingen in de kankertherapie.
Belangrijke componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Interacties van nanodeeltjes
- Radiofrequentietherapie
- Toepassingen voor kankerbehandeling
Achtergrond
- Goudnanodeeltjes kunnen warmte genereren wanneer ze worden blootgesteld aan radiofrequente velden.
- Dit verwarmingingseffect kan worden benut bij hyperthermiebehandelingen voor kanker.
- Inzicht in de verwarmingingskenmerken is cruciaal voor therapeutische toepassingen.
- Eerdere studies hebben veelbelovende resultaten laten zien bij het gebruik van nanodeeltjes voor niet-invasieve behandelingen.
Doel van de studie
- Om de opwarmingssnelheid van goudnanodeeltjes in een radiofrequent elektrisch veld te beoordelen.
- Om de toxiciteit van goudnanodeeltjes op gecultiveerde kankercellen te evalueren.
- Om in vivo studies uit te voeren met behulp van een ectopisch muiskankermodel.
Gebruikte methoden
- Beoordeling van de opwarmingssnelheid van geconcentreerde goudnanodeeltjes in een kwartsvat.
- In vitro toxiciteitsstudies met gekweekte kankercellen.
- In vivo studies in een ectopisch muizenkankermodel.
- Analyse van nanodeeltjes in suspensie om hun effectiviteit bij RF-gemedieerde hyperthermie te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- De resultaten wijzen op het potentieel van goudnanodeeltjes als effectieve middelen voor RF-gemedieerde hyperthermie.
- De verhittingseigenschappen werden succesvol beoordeeld in zowel in vitro als in vivo settings.
- Toxiciteitsstudies boden inzicht in de veiligheid van het gebruik van goudnanodeeltjes bij kankertherapie.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de therapeutische toepassingen van nanodeeltjes bij niet-invasieve behandelingen.
Conclusies
- De studie ondersteunt het gebruik van goudnanodeeltjes bij RF-gemedieerde hyperthermie voor de behandeling van kanker.
- Verder onderzoek is nodig om hun toepassing in klinische settings te optimaliseren.
- Inzicht in de opwarmingsmechanismen kan therapeutische strategieën in de oncologie verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het beoordelen van door nanodeeltjes gemedieerde radiofrequentieverhitting maakt preklinische risicoreductie van niet-invasieve hyperthermieplatformen mogelijk door de thermische output en biologische respons in gecontroleerde in vitro- en in vivo-modellen te kwantificeren. Deze workflow ondersteunt doelwitvalidatie door causale verbanden vast te stellen tussen eigenschappen van de nanodeeltjes, RF-blootstelling en cytotoxische resultaten, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen in de verdere ontwikkeling van oncologische pijplijnen. De methode biedt voorspellende zekerheid bij mechanistische risicoreductie door nanodeeltjes-specifieke thermische effecten te isoleren van achtergrondeffecten, waardoor ambiguïteit bij het testen van therapeutische hypothesen wordt verminderd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt de therapeutische hypothese door vast te stellen of de waargenomen cytotoxiciteit voortvloeit uit RF-verhitting door nanodeeltjes in plaats van aspecifieke effecten.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk via een vergelijkende analyse van nanodeeltjescolloïden versus buffercontroles om nanodeeltjesspecifieke thermische bijdragen te isoleren.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's door opwarmingssnelheden en cellevensvatbaarheidsuitkomsten te kwantificeren om nanodeeltjes met gunstige RF-responsieve profielen prioriteit te geven.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde nanodeeltjessuspensies voor voor downstream screening door contaminanten te verwijderen via sequentiële ultrafiltratie en stabiliteit te bevestigen via UV-vis en zetapotentieel.
- Operationele waarde: Standardiseert de assay-gereedheid door een consistente nanodeeltjesconcentratie (1000 mg/L) en suspensievolume (1,3 mL) te definiëren voor reproduceerbare RF-blootstelling over experimenten heen.
- Schaalbaarheidswaarde: Maakt hergebruik van het platform mogelijk door gestandaardiseerde quartz vet loading en IR-thermische beeldvormingsprotocollen die cross-systeemvergelijkingen van opwarmingsprofielen mogelijk maken.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Stelt de relevantie voor de ziekte vast door de werkzaamheid van nanodeeltjes te testen in hepatocellulaire carcinoommodellen afgeleid van Hep3B, zowel in vitro (2D-monolagen) als in vivo (ectopische muistumoren).
- Translationele continuïteit: Slaat de brug van ontdekking naar preklinische validatie door aan te tonen dat RF-geïnduceerde tumorgroei wordt gecontroleerd en de tumormassa in vivo wordt verminderd na intratumorale toediening van nanodeeltjes.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door in vitro cytotoxiciteit (MTT-assay) te correleren met in vivo resultaten van tumorsuppressie onder gecontroleerde RF-parameters.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd over het gehele ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische werkzaamheidstesten, waarbij kwantitatieve thermische en biologische read-outs worden geleverd die besluitvormingsmomenten in elke fase ondersteunen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten door nanodeeltjes-specifieke opwarmingssnelheden (HR) te meten via differentiële thermische analyse van colloïden versus filtraat na RF-blootstelling.
- Screening: Waarborgt de reproduceerbaarheid van de assay door gestandaardiseerde zuivering van nanodeeltjes (acht wasbeurten) en bevestiging van de stabiliteit vóór gebruik in cellulaire of diermodellen.
- Analytics: Genereert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen, waaronder temperatuurcurven uit IR-imaging, celviabiliteit (% viabiliteit via MTT/DMSO) en reductie van de tumormassa om analyse van vergelijkbare condities mogelijk te maken.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan op de preklinische continuïteit door RF-gemedieerde controle over tumorgroei aan te tonen in ectopische modellen na intratumorale injectie van nanodeeltjes, ter ondersteuning van voortgang op basis van biomarkers.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare capaciteit via gestandaardiseerde protocollen voor de zuivering van nanodeeltjes, RF-blootstellingsparameters (90 kV/m in lucht, 1,1 kV/m in zoutoplossing) en thermische eindpuntcriteria (70°C voor colloïden, 37°C voor cellen, 42°C huidlimiet in vivo).
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door mechanische risicoreductie van RF-nanopartikelinteracties, waardoor het aantal fout-positieven bij de identificatie van thermische effectoren wordt verminderd.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via gedefinieerde ultrafiltratieworkflows, kwartsvetbelading en IR-beeldgevingsprotocollen die batchvariabiliteit minimaliseren.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen door de verwarmingscapaciteit van nanodeeltjes te koppelen aan in vitro cytotoxiciteit en in vivo tumorrespons, wat het biologische risico in een laat stadium vermindert.
- Impact op portfolio: Risicogestuurde prioritering op basis van kwantitatieve thermische output en therapeutische index, wat een kapitaalefficiënte voortgang van leidende kandidaten mogelijk maakt.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van nanodeeltjes, RF-veiligheidsprotocollen en analyse van thermische beeldvorming om vlamboogvorming, koken of artefacten door ladingopbouw te voorkomen.
- Is afhankelijk van instrumentatie, waaronder centrifugefilters (50 kDa), kwartsvetten, RF-generatoren (13,56 MHz), IR-camera's met analyse-software en ICP-OES/MS voor de validatie van de concentratie.
- Vraagt om standaardisatie tussen teams uit de nanotechnologie, farmacologie en oncologie om afstemming te bereiken over de preparatie van nanodeeltjes, dosering en definities van thermische eindpunten.
- Vereist overwegingen voor aanpassing bij de overgang van in vitro (2D-monolagen) naar in vivo (solide tumor) modellen, met name wat betreft doseringsvolume, injectietechniek en aardingsprotocollen om elektrodermale letsels te voorkomen.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van grondige verwijdering van verontreinigingen via sequentiële wasstappen om te garanderen dat de waargenomen opwarming afkomstig is van de nanodeeltjes, en strikte naleving van de RF-blootstellingslimieten om thermische schade aan niet-doelweefsels te vermijden.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Chapters in this video
0:05
Title
1:30
Assessing RF Heating of Nanoparticle Colloids: Gold Nanoparticles as an Example
4:45
Nanoparticle-assisted RF-induced Hyperthermia: In vitro Studies
6:45
Nanoparticle-assisted RF-induced Hyperthermia: In vivo Studies
8:57
Hep3B Liver Cell Derived Tumors Treated by Nanoparticle-RF
10:06
Conclusion
