Name: Protocollen voor het beoordelen van radiofrequentie Interacties met gouden nanodeeltjes en Biological Systems voor niet-invasieve Hyperthermie Cancer Therapy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-28T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Leer de verwarmingsreactie van gouden nanodeeltjes in radiofrequente velden te beoordelen voor kankertherapie. Deze methode omvat in vitro toxiciteitsstudies en in vivo muismodellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de NIH (U54CA143837), de NIH MD Anderson Cancer Center Ondersteuning Subsidies (CA016672), de V Foundation (SAC), en een onbeperkte onderzoek subsidie ​​van de Kanzius Research Foundation (SAC, Erie, PA). Wij danken Kristine Ash van de afdeling Chirurgische Oncologie, MD Anderson Cancer Center, om administratieve bijstand.

Een volledige experimentele overzicht in figuur 1 weergegeven. Verdere details worden weergegeven in onderstaande stappen 1-3. 1. Het beoordelen van RF Verwarming van NP colloïden: AuNPs als voorbeeld <ol><li> In het algemeen, voor elk NP monster wordt onderzocht, het monster eerst een paar keer wassen door een centrifuge filter met gedeïoniseerd (DI) water naar de achtergrond ionen en verontreinigingen te verwijderen. Alle ionen en contaminanten zal zijn verwijderd uit de AUNP schorsing wanneer de vloeistof wordt uitgewassen heeft vergelijkbare RF verwarmingssnelheden (HRS) als DI water. Dit zuiveringsproces maakt ook hogere concentraties NP te verkrijgen. Het is vermeldenswaard dat, hoewel gebruik AuNPs in dit voorbeeld, kan de fundamentele beginselen worden toegepast op andere materialen NP. </li><li> Als voorbeeld, zuiveren een flesje van 500 ml commercieel verkrijgbaar AuNPs diameter van 5 nm en vervolgens daarop een 13.56 MHz RF-veld van elektrische-field sterkte 90 kV / m. <ol><li> Neem ~ 125 ml uit de voorraad AUNP oplossing en split tussen zes 50 kDa centrifuge filter buizen. Centrifugeer bij 3000 rpm. gedurende 2 min 5 sec. Verwijder gefilterd buffer en vulling filters met meer voorraad oplossing. Herhaal dit tot alle 500 ml is gefilterd. </li><li> Vervang de gefilterde buffer met een vergelijkbaar volume van DI-water en herhaal ongeveer 8 keer (of totdat de gefilterde buffer RF HRs gelijkwaardig zijn aan DI-water). Opmerking, UV-Vis-analyse kan ook worden gebruikt om verontreiniging absorptiepieken controleren. Zodra de buffer verontreinigingen volledig zijn verwijderd, pipet ongeveer 0,5 ml DI water in elk filter en resuspendeer de AuNPs door herhaald pipetteren. Dit moet de AuNPs volledig te verwijderen uit het filter en zorgen voor volledige resuspensie. Combineer alle zes schorsingen in een 15 ml Eppendorf buis. </li><li> Zodra de AuNPs zijn gezuiverd en geconcentreerd, analyseert het monster met behulp van ICP-OES en / of ICP-MS, UV-vis en Zeta potentieel voor gegevens over concentration en NP stabiliteit, respectievelijk. SEM en / of TEM analyse kan ook worden gebruikt om morfologische gegevens te verkrijgen. Gedetailleerde monstervoorbereiding voor deze technieken is te vinden in de literatuur 4. </li></ol></li><li> Met behulp van de Kanzius RF-systeem in eerdere studies 8 beschreven, of afleidingen van dit systeem, plaats een 1,3 ml cilindrische kwartscuvet zodat het RF elektrische veld in de lucht (zonder monster aanwezig) zou zijn ~ 90 kV / m in de cuvet. Voor een standaard zoutoplossing monster (0,9% NaCl) het elektrisch veld wordt verminderd tot ~ 1,1 kV / m.. Dit zijn de voorwaarden bij benadering gebruikt om vergelijkingen worden gemaakt tussen de verschillende systemen. <ol><li> Pipetteer 1,3 ml van een 1,000 mg / l monster van gezuiverd AUNP colloïde in de kwartscuvette en introduceren deze in het RF-veld. Dit kan worden gedaan met behulp van een custom-built Teflon monsterhouder. Expose monster naar de RF-veld gedurende 120 seconden of totdat het monster 70 ° C bereikt elektrische vonken of snel koken te voorkomen. Capture de thermal imaging data (evenals controle gebieden) met behulp van een IR-camera en bijbehorende software. Herhaal deze procedure drie keer. </li><li> Filter de steekproef via een andere 50 kDa centrifuge filter om de AuNPs uittreksel uit het DI waterbuffer. Drie keer opnieuw bloot de buffer naar de RF-veld weer. Het verschil in uren tussen de AUNP colloïde en de achtergrond DI waterbuffer bepaalt de HR als gevolg van de AuNPs zelf. Verwachten dat HRs van ~ verkrijgen 0,3 ° C / sec en 0,05 ° C / sec tot een AUNP afhankelijke HR van ~ 0.25 ° C / sec geven. Resuspendeer de resterende AuNPs van de filter in 1,3 ml water voor in vitro / vivo experimenten. </li></ol></li></ol> 2. Nanodeeltjes bijgestaan ​​RF-geïnduceerde Hyperthermie: In vitro studies <ol><li> Deze in vitro studies kan worden toegepast op elk type van kanker celtype dat 2D monolagen vormen. In dit experiment gebruikt humane hepatocellulaire carcinoom afgeleide Hep3B cellen. <ol><li> Plaat ~ 50.000 celIs aan de voorkant drie putjes van een 12-wells plaat met 1 ml groeimedium. Herhaal dit 6 keer (gebruik drie platen voor NP studies en drie platen als controle). Incubeer bij 37,5 ° C gedurende 24 uur vóór de invoering van de NP. Steriliseren NP eerste gebruik van bioveiligheid kast UV-blootstelling aan licht gedurende 5 minuten. </li><li> In elk putje introduceren 0,1 ml van een 1,000 mg / L AUNP oplossing en laat nog eens 24 uur. Voeg 0,1 ml water toe aan elk putje van de drie controle celplaten en ook laat voor 24 uur. </li><li> Na 24 uur zijn verstreken, zuigen de cel media en wassen met PBS aan elk oppervlak gebonden AuNPs verwijderen. Vervang de cel media. Cellen zijn nu klaar voor blootstelling aan radiogolven. </li></ol></li><li> Plaats elke 12-well cel pak binnen het RF-veld. Wacht tot de cellen tot 31 ° C afgekoeld Zet de RF-generator en bloot voor 3,5 minuten. De eindtemperatuur van het celmedium wordt ~ 37 ° C. Zet de RF-veld. Verwijder de cellen en plaats ze in een incubator gedurende 24 uur voor analyse. <ol> &lt;li&gt; Verwijder cellen uit de incubator en zuig cel media. Voeg 1,6 ml celmedium aan elk putje en 0,4 ml MTT reagens. Incubeer de cellen gedurende 4 uur. Zuig media en vervangen door 2 ml dimethylsulfoxide (DMSO). Plaats de cel platen op een bankje rocker en laat gedurende 10 minuten om de DMSO aan de MTT reagentia oplosbaar te maken. Tenslotte pipet 100 ul elk putje in een 96-well plaat en optisch lees goed bij 570 nm met een plaatlezer zoals SPECTROstar Nano plaatlezer. </li></ol></li></ol> 3. Nanodeeltjes bijgestaan ​​RF-geïnduceerde Hyperthermie: In vivo studies <ol><li> Deze in vivo onderzoeken kunnen worden toegepast op elk type van kanker dat vaste tumoren vormen in een orthotope of ectopische muizenmodel. Dit experiment maakt gebruik Hep3B leverkanker cellen in een buitenbaarmoederlijke tumor BALB-C Naakt muismodel. </li><li> Let op: alle in vivo experimenten worden uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante richtlijnen, verordeningen en regelgevende instanties. Ook het protocol gedemonstreerd werd uitgevoerd onder de leiding en goedkeuring van de Universiteit van Texas MD Anderson Cancer Centers Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). <ol><li> Kweek een geschikt aantal cellen (-100 k) in een weefselkweek kolf met het geschikte groeimedium. Incubeer in een 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende de duur van celkweek. </li><li> Behandel de cellen met trypsine (los te maken van de kolf) en produceren een oplossing van 2 miljoen cellen per 25 ul. Voeg een gelijk hoeveelheid Matrigel (op ijs) en meng de laatste injectie te bereiden. Injecteer deze oplossing in de gewenste positie op de rug van de muis en wacht een geschikte hoeveelheid tijd voor de tumoren groeien tot de gewenste grootte (2-4 weken meeste cellen). Voordat RF-blootstelling, moet BALB-C Naakt muizen solide buitenbaarmoederlijke tumoren dragen 0,5-1 cm diameter. </li></ol></li><li><ol><li> Bereid de muizen te gebruiken (in dit geval BALB-C muizen Naakt) door anaesthetizing ze met een oplossing van ketamine en xylazine door IP injectie. Terwijl de muizen in slaap vallen, bewaar ze in een temperatuur gecontroleerde kamer bij 37 ° C. 20 muizen in totaal nodig zijn, allemaal met vergelijkbare grootte tumoren. Tien muizen worden gebruikt in combinatie met en zonder AuNPs (waarbij de laatste alleen PBS injecties) terwijl de resterende 10 muizen worden verdeeld RF-blootgestelde en niet-blootgestelde controles RF: beide groepen zonder AUNP injecties. </li><li> Eenmaal goed verdoofd, injecteer de AuNPs rechtstreeks in de tumor met behulp van een 1-cc spuit met een 27 G naald. De AUNP oplossing moet op een Au concentratie van 200 mg / L in 0,1 ml PBS. Na injectie, gebruik dan een chirurgische wattenstaafje om bloed te absorberen en veeg de injectieplaats met een alcoholdoekje. </li><li> Monteer vervolgens de muis te behandelen op het ontvangende hoofd van de RF-generator. De muis moet worden geplaatst dat de tumor dichtst bij de transmissie weg. Scherm de gebieden die niet worden behandeld, evenals sensitief gebieden zoals ogen, oren en tenen, met kopertape. Zorg ervoor dat de koperen band de juiste wijze is met de aarding vliegtuig zodat kosteloos opbouw plaatsvindt. Ook moet het belichtingsgebied een ruimte van minstens 1 cm groter dan de grootte van de gewenste behandelingsplaats hebben. </li><li> Positie IR thermische camera zodat de tumor en de behandeling gebied zichtbaar zijn. Schakel RF gedurende 5 minuten. Noteer de resulterende temperatuur curve. Als therapie bereikt temperaturen hoger dan 42 ° C stop behandeling onmiddellijk. </li></ol></li><li><ol><li> Na blootstelling aan RF herstellen van de muizen uit narcose in een warme kamer, totdat ze zich bewust zijn. </li><li> Herhaal het experiment met dezelfde muizen 48 uur later (stap 3.3.1 - 3.4.1). </li><li> Na het experiment euthanaseren de muizen in overeenstemming met de institutionele protocollen en procedures. Noteer het gewicht van de tumor. Voor histologische analyse bevestig de tumoren met behulp van formaline en insluiten in paraffine. Tumorsecties zijn meestal gekleurd with hematoxyline en eosine en voor de doelstellingen om het meten van de therapeutische werkzaamheid, bijvoorbeeld Ki-67 relevant, gesplitst caspase-3, enz. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gannon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+nanotube-enhanced+thermal+destruction+of+cancer+cells+in+a+noninvasive+radiofrequency+field%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Carbon nanotube-enhanced thermal destruction of cancer cells in a noninvasive radiofrequency field.</a> Cancer. 110, 2654(2007).</li>
<li>Curley, S. A., Cherukuri, P., Briggs, K., Patra, C. R., Upton, M., Dolson, E., Mukherjee, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+radiofrequency+field-induced+hyperthermic+cytotoxicity+in+human+cancer+cells+using+cetuximab-targeted+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Ther.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Noninvasive radiofrequency field-induced hyperthermic cytotoxicity in human cancer cells using cetuximab-targeted gold nanoparticles.</a> J. Exp. Ther. Oncol. 7, 313(2008).</li>
<li>Gannon, C. J., Patra, C. R., Bhattacharya, R., Mukherjee, P., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+gold+nanoparticles+enhance+non-invasive+radiofrequency+thermal+destruction+of+human+gastrointestinal+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Intracellular gold nanoparticles enhance non-invasive radiofrequency thermal destruction of human gastrointestinal cancer cells.</a> Journal of Nanobiotechnology. 6, 2(2008).</li>
<li>Raoof, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+antibody-conjugated+gold+nanoparticles+in+the+endolysosomal+nanoenvironment%3A+implications+for+noninvasive+radiofrequency-based+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Stability of antibody-conjugated gold nanoparticles in the endolysosomal nanoenvironment: implications for noninvasive radiofrequency-based cancer therapy.</a> Nanomedicine. 8, 1096(2012).</li>
<li>Glazer, E. S., Massey, K. L., Zhu, C., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+carcinoma+cells+are+susceptible+to+noninvasive+radio+frequency+fields+after+treatment+with+targeted+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Pancreatic carcinoma cells are susceptible to noninvasive radio frequency fields after treatment with targeted gold nanoparticles.</a> Surgery. 148, 319(2010).</li>
<li>Glazer, E. S., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiofrequency+field-induced+thermal+cytotoxicity+in+cancer+cells+treated+with+fluorescent+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Radiofrequency field-induced thermal cytotoxicity in cancer cells treated with fluorescent nanoparticles.</a> Cancer. 116, 3285(2010).</li>
<li>Glazer, E. S., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+radiofrequency+ablation+of+malignancies+mediated+by+quantum+dots%2C+gold+nanoparticles+and+carbon+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Delivery%22%5BJournal%5D)">Non-invasive radiofrequency ablation of malignancies mediated by quantum dots, gold nanoparticles and carbon nanotubes.</a> Therapeutic Delivery. 2, 1325(2011).</li>
<li>Corr, S. J., Raoof, M., Mackeyev, Y., Phounsavath, S., Cheney, M. A., Cisneros, B. T., Shur, M., Gozin, M., McNally, P. J., Wilson, L. J., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrate-Capped+Gold+Nanoparticle+Electrophoretic+Heat+Production+in+Response+to+a+Time-Varying+Radiofrequency+Electric-Field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Citrate-Capped Gold Nanoparticle Electrophoretic Heat Production in Response to a Time-Varying Radiofrequency Electric-Field.</a> J. Phys. Chem. C. 116, 24380(2012).</li>
<li>Kruse, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Radio-Frequency+Coupling+Network+for+Heating+of+Citrate-Coated+Gold+Nanoparticles+for+Cancer+Therapy%3A+Design+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">A Radio-Frequency Coupling Network for Heating of Citrate-Coated Gold Nanoparticles for Cancer Therapy: Design and Analysis.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 58, 10(2011).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negligible+absorption+of+radiofrequency+radiation+by+colloidal+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid+Interf.+Sci%22%5BJournal%5D)">Negligible absorption of radiofrequency radiation by colloidal gold nanoparticles.</a> J. Colloid Interf. Sci. 358, 47(2011).</li>
<li>Liu, X., Chen, H. J., Chen, X., Parini, C., Wen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+frequency+heating+of+gold+nanoparticle+dispersions+for+non-invasive+thermal+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Low frequency heating of gold nanoparticle dispersions for non-invasive thermal therapies.</a> Nanoscale. , (2012).</li>
<li>Sassaroli, E., Li, K. C. P., O'Neill, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radio+frequency+absorption+in+gold+nanoparticle+suspensions%3A+a+phenomenological+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+D+App.+Phys%22%5BJournal%5D)">Radio frequency absorption in gold nanoparticle suspensions: a phenomenological study.</a> J. Phys. D App. Phys. 45, 075303(2012).</li>
<li>Worle-Knirsch, J. M., Pulskamp, K., Krug, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oops+they+did+it+again%21+Carbon+nanotubes+hoax+scientists+in+viability+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Oops they did it again! Carbon nanotubes hoax scientists in viability assays.</a> Nano Lett. 6, 1261(2006).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Deze protocollen kan de experimentator volledig geanalyseerd in hoeverre nanomaterialen (in dit geval AuNPs) kan RF-hyperthermie behandeling van kanker te verhogen. Het eerste protocol specifiek bezighoudt met het analyseren van de productie van warmte uit zeer geconcentreerd en gezuiverd AUNP monsters. Hoewel andere groepen warmteproductie hebben gemeld hoofdzakelijk van de buffers die de AuNPs gesuspendeerd in en niet AuNPs zelf 9-11, de RF systemen lagere concentraties AuNPs met een diameter&gt; 10 nm, als...

De absorptie van RF-energie op biologisch weefsel (vanwege de inherente elektrische permittiviteit) resulteert in verhoogde temperaturen weefsel als functie van de tijd, die uiteindelijk leidt tot celdood door hyperthermie. Er wordt verondersteld dat kanker hyperthermie kan worden geoptimaliseerd door het gebruik van gerichte nanomaterialen die internalisering in de kankercel en fungeren als RF-thermische sensoren, waardoor de aangrenzende gezonde, normale cellen intact. Verschillende rapporten hebben al aangetoond dat een verscheidenheid aan NP&#39;s zo effectief RF warmtebronnen die helpen bij kanker necrose 1-4 kan handelen. In deze groet, goud NP (AuNPs) 3-5, koolstof nanobuisjes 1 en quantum dots 6, 7 hebben spannende kenmerken vertoonde bij toepassing in zowel in vitro als in vivo RF experimenten. Hoewel de precieze aard van het verwarmingsmechanisme van deze NP bij blootstelling aan een RF-veld wordt nog steeds gediscussieerd, een reeksfundamentele experimenten met AuNPs heeft grote betekenis gelegd op zowel NP grootte en aggregatie toestanden. Er werd aangetoond dat alleen AuNPs met een diameter &lt;10 nm verwarmt wanneer blootgesteld aan een RF-veld 8. Ook wordt deze verwarming mechanisme aanzienlijk verzwakt wanneer de AuNPs worden samengeteld. Deze aggregatie toestand werd ook bevestigd in in vitro modellen die belang gelegd op het optimaliseren AUNP colloïdale stabiliteit binnen endolysomal intracellulaire compartimenten voor effectieve RF-therapie 4. Echter, de technieken en experimentele principes gebruikt om deze gegevens te verzamelen en evalueren problematisch, vooral bij valideren RF warmteprofielen van NP colloïden. Verscheidene rapporten hebben aangetoond dat jouleopwarming van de achtergrond ionische suspensie die de NP gesuspendeerd in de belangrijkste bron van RF warmteproductie en niet de NP zelf 9-12 kunnen zijn. Hoewel onze recent artikel 8 heeft gevalideerd thij gebruik van RF-interacties in het opwekken van warmte uit AuNPs van een diameter kleiner dan 10 nm, willen we deze protocollen beschrijven meer in detail in dit artikel. We tonen ook aan de protocollen en technieken die nodig zijn om de doeltreffendheid van AuNPs als hypertherme thermische middelen, zowel in vitro als in vivo experimenten leverkanker modellen evalueren. Hoewel we voornamelijk gericht op eenvoudige colloïden-citraat bedekte AuNPs, kunnen dezelfde technieken worden toegepast op andere AUNP hybriden zoals antilichaam-en chemotherapie-geconjugeerde complexen. Bij het opvolgen van deze beginselen de experimentator hopelijk kunnen de mogelijkheden voor nanomateriaal een effectieve RF-geïnduceerde thermische hypertherme agent snel evalueren.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagens/Materiaal</td></tr><tr><td>500 ml gouden nanodeeltjes (5 nm)</td><td>Ted Pella, INC</td><td>15702-5</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4/-15 Centrifugeerfilters (50 kDa)</td><td>Millipore</td><td>UFC805024/UFC910096</td><td>(4 ml en 15 ml volumes)</td></tr><tr><td>MEM X1 Celkweekmedium</td><td>Cellgro</td><td>10-101-CV</td><td>(voeg extra voedingsstoffen toe indien nodig)</td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td>Sigma</td><td>F4135-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Kopertape</td><td>Ted Pella</td><td>16072</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Apparatuur</td></tr><tr><td>Kanzius RF-systeem (13,56 MHZ)</td><td>ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, VS)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IR-camera</td><td>FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, VS)</td><td>Neem contact op met FLIR</td><td></td></tr><tr><td>1,3 ml Kwartscuvet</td><td>ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, VS)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teflon monsterhouder met draaitafel</td><td>ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, VS)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPECTROstar Nano Microplate reader</td><td>BGM Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis spectrometer</td><td>Applied Nanofluorescence, Houston, TX)</td><td>NS1 NanoSpectralyzer</td><td></td></tr><tr><td>ICP-&#8211;S</td><td>PerkinElmer</td><td>Optima 4300 DV</td><td></td></tr><tr><td>ZetaSizer</td><td>Malvern</td><td>Zen 3600 ZetaSizer</td><td></td></tr></tbody></table>

protocollen voor het beoordelen van radiofrequentie interacties met gouden nanodeeltjes en biological systems voor niet-invasieve hyperthermie cancer therapy

Protocols for Assessing Radiofrequency Interactions with Gold Nanoparticles and Biological Systems for Non-invasive Hyperthermia Cancer Therapy

Kankertherapieën die minder toxisch en invasief dan hun bestaande tegenhangers zijn zeer gewenst. Het gebruik van elektrische RF-velden die diep in het lichaam, waardoor minimale toxiciteit, worden momenteel bestudeerd als een levensvatbare middel van niet-invasieve kankertherapie. Het is voorzien dat de interacties van RF-energie met geïnternaliseerde nanodeeltjes (NP) warmte die vervolgens kunnen leiden tot oververhitting (hyperthermie) van de cel kan bevrijden, uiteindelijk eindigt in cel necrose. In het geval van niet-biologische systemen presenteren we gedetailleerde protocollen betreffende kwantificeren van de warmte vrijgemaakt door hooggeconcentreerde NP colloïden. Voor biologische systemen, in het geval van in vitro experimenten, beschrijven we de technieken en de voorwaarden die moeten worden nageleefd om kankercellen effectief bloot aan RF-energie zonder bulk media verwarming artefacten aanzienlijk verduistert de gegevens. Tot slot geven we een gedetailleerde methodologie fof in vivo muismodellen met buitenbaarmoederlijke lever kanker tumoren.

1. Het beoordelen van RF verwarming van NP colloïden: AuNPs als voorbeeld. Na volgende paragraaf 1.1 - 1.2.3 verwachten dat een sterk geconcentreerde, stabiele en gezuiverde oplossing van 5 nm en 10 nm diameter AuNPs hebben. Van de 500 ml als ingekocht voorraadoplossing, zal minimaal 4 ml oplossing te verkrijgen met een concentratie van 1000 mg / L. Het verschil in uren tussen de AuNPs en achtergrond DI water bufferoplossing bij deze concentratie dient -0,25 ° C / s en 0,1 ° C / sec 5 nm en 10 ...

We beschrijven protocollen gebruikt om de interacties van 13,56 MHz radiofrequentie (RF) onderzoeken elektrische velden met gouden nanodeeltjes colloïden in zowel niet-biologische en biologische systemen (in vitro / vivo). Deze interacties worden onderzocht voor toepassing bij kankertherapie.

Protocollen voor het beoordelen van radiofrequentie Interacties met gouden nanodeeltjes en Biological Systems voor niet-invasieve Hyperthermie Cancer Therapy

Cancer therapies  which are less toxic and invasive than their existing counterparts are highly  desirable. The use of RF electric-fields that penetrate ...

Het algemene doel van deze procedure is om de opwarmende eigenschappen van goudnanodeeltjes in een radiofrequent elektrisch veld van 13,56 megahertz in vitro en in vivo te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst de opwarmingssnelheid van geconcentreerde goudnanodeeltjes en hun buffer in een kwartsvat te bepalen. De tweede stap van de procedure is het uitvoeren van in vitro toxiciteitsstudies van goudnanodeeltjes met gecultiveerde kankercellen.De derde stap is het uitvoeren van in vivo-studies van goudnanodeeltjes in een ectopisch muiskankermodel. Uiteindelijk kunnen de resultaten, via analyse van de nanodeeltjes in suspensie, in vitro en in vivo, aantonen of het onderzochte nanodeeltje een effectief middel zou kunnen zijn voor gebruik bij RF-gemedieerde hyperthermie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van nanodeeltjes-gemedieerde niet-invasieve radiofrequentie-hyperthermie, zoals of de opwarming wordt veroorzaakt door de deeltjes zelf en of dit voor therapeutische doeleinden kan worden ingezet.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ondervinden, omdat er niet veel goed vastgestelde protocollen zijn voor het uitvoeren van dit type experimenten. De procedure zal worden gedemonstreerd door Cisneros, een onderzoeksassistent, Stuart Core, een postdoctoraal onderzoeker, en Leila Green, eveneens een postdoctoraal onderzoeker. Begin als voorbeeld met een commercieel verkrijgbare fles van 500 milliliter goudnanodeeltjes met een diameter van vijf nanometer.Neem ongeveer 125 milliliter van de voorraadoplossing van goudnanodeeltjes en verdeel deze over zes centrifugefilterbuizen van 50 kilodalton; centrifugeer de nanodeeltjes bij 3000 RPM gedurende twee minuten en vijf seconden. Verwijder het supernatant, bestaande uit de gefiltreerde buffer, en vul elk filter opnieuw bij met meer voorraadoplossing.Zet het centrifugeren voort en verwijder de buffer en vul de buisjes opnieuw, totdat de gehele nanopartikeloplossing is gefiltreerd. Vervang na de laatste toevoeging de gefiltreerde buffer door een gelijk volume gedeïoniseerd water en herhaal dit proces ongeveer acht keer nadat het gefiltreerde bufferstalen in de RF-machine zijn geladen. Maak met de software van de infraroodcamera kaders over de QVE om het opwarmingsprofiel vast te leggen. Na acht wasbeurten benadert de opwarmingsdata van het filtraat van goudnanopartikels van vijf nanometer die van gedeïoniseerd water.UV-vis analyse kan ook worden gebruikt om de absorptiepieken van verontreinigingen te monitoren. Hier wordt een schoon spectrum getoond. Zodra de verontreinigingen uit de buffer volledig zijn verwijderd, suspenderen we de nanodeeltjes in 0,5 milliliters gedeïoniseerd water in de filterbuisjes, waarmee de nanodeeltjes van het filter worden verwijderd.Combine vervolgens alle zes suspensies in één buis van 15 milliliter. Analyseer de monster nu met UV-VIS en zetapotentiaal voor stabiliteitsgegevens. Gebruik ICP-OES en/of ICP-massaspectrometrie om de nanodeeltjesconcentratie te bepalen.SEM- en/of TEM-analyse kan ook worden gebruikt om morfologische gegevens te verkrijgen met behulp van een Kansas RF-systeem of afgeleiden van de belasting, een kwartsvit van 1,3 milliliter spuit, waarbij het RF-elektrisch veld wordt ingesteld op ongeveer 90 kilovolts per meter in de lucht waar de Q-vit zich bevindt. Voor een standaard zoutoplossing met 0,9% natriumchloride zou het elektrisch veld worden verminderd tot ongeveer 1,1 kilovolts per meter. Dit zijn de bijbenaderde condities die worden gebruikt om vergelijkingen tussen verschillende RF-systemen mogelijk te maken.Vul nu een schone kwartsviaal met 1,3 milliliters van een gezuiverde gouden nanodeeltjessuspensie met een concentratie van 1000 milligrams per liter. Stel het monster gedurende 120 seconds bloot aan het RF-veld of totdat het monster 70 degrees Celsius bereikt. Overblootstelling kan leiden tot elektrische vlambogen of snel koken.Leg de thermische beeldgegevens en de controlegebieden vast met behulp van een IR-camera en de bijbehorende software. Herhaal deze procedure drie keer op hetzelfde monster. Filter het monster nu vervolgens door een ander centrifugefilter van 50 kilodalton om de goudnanodeeltjes uit de waterbuffer te extraheren.Stel vervolgens alleen de buffer opnieuw bloot aan het RF-veld. Opnieuw bepaalt drie keer het verschil in de hrs tussen het colloïdaal goudnanodeeltjes en het filtraat de HR als gevolg van de goudnanodeeltjes zelf. Ten slotte suspenderen we de resterende goudnanodeeltjes van het filter in 1,3 milliliters water voor verdere experimenten.Deze in vitro studies kunnen worden toegepast op elk type kankercel dat 2D-monolagen vormt. In dit voorbeeld worden humane hepatocellulaire carcinoom-afgeleide Hep three B-cellen gebruikt om ongeveer 50,000 cellen te plaatsen in drie wells van een 12-well plaat met één milliliter groeimedium.Vul de media aan om de cellen te laten groeien totdat drie platen gevuld zijn voor de nanodeeltjesstudies en drie platen gevuld zijn als controles. Incubeer de platen gedurende 24 uur bij 37,5 °C. Voeg de volgende dag 0,1 mL van een goudnanodeeltjesoplossing van 1000 mg/L toe aan elke well van de drie nanodeeltjesplaten en de controleplaten.Voeg 0,1 milliliter water toe aan elke well en incubeer alle platen nog eens 24 uur. Na deze 24 uur wordt het celmedium geaspireerd en worden de cellen gewassen met PBS om alle aan het oppervlak gebonden goudnanodeeltjes te verwijderen. Vervang vervolgens het celmedium.De cellen zijn nu klaar voor de RF-blootstelling. Plaats elke 12-wells celplaat in het RF-veld en wacht tot de cellen zijn afgekoeld tot 31 °C. Zodra ze licht zijn afgekoeld, worden de cellen gedurende 3,5 minuten blootgesteld aan RF.De uiteindelijke temperatuur van het celmedium zal ongeveer 37 °C zijn. Plaats de cellen in een incubator en wacht 24 uur voordat u ze analyseert. Wanneer de cellen gereed zijn, aspireer dan het medium en vervang dit door twee milliliters van 25% MTT-reagens in medium.Laat de cellen vervolgens nog vier uur incuberen. Vervang daarna het MTT-medium door twee milliliter DMSO. Plaats de celplaten gedurende 10 minuten op een bench rocker zodat de DMSO de MTT-reagentia kan solubiliseren.Pipetteer tot slot monsters van 100 µL uit elke put naar een 96-wellplaat en lees de plaat optisch af bij 570 nm. Deze in vivo studies kunnen worden toegepast op elk type kanker dat solide tumoren vormt in een orthotopisch of ectopisch spiegelmodel. In dit voorbeeld worden Hep three B leverkankercellen gebruikt met BPC naakte muizen.Begin met ongeveer 100.000 cellen, trypsiniseer de cellen en maak een oplossing van 2 miljoen cellen per 25 µL. Voeg een gelijke hoeveelheid ijskoude Matrigel toe aan de celsuspensie en meng deze grondig door herhaaldelijk op te zuigen met een pipet. Injecteer nu de gemengde suspensie op de gewenste positie op de rug van elk dier.Na een paar weken zullen de tumoren een diameter van een halve tot één centimeter hebben; begin op dit moment met de RF-behandeling en anesthetiseer de muizen met een oplossing van ketamine en xylazine via een IP-injectie en houd ze warm. Injecteer vervolgens de goudnanodeeltjes direct in de helft van de tumoren met een spuit van 1 cc en een naald van 27 of 30 gauge. Gebruik een chirurgisch gaasje om bloed te absorberen en veeg de injectieplaats schoon met een alcoholdoekje.Inject ter controle alleen PBS in de andere helft van de tumoren. Behandel nu de helft van de muizen in elke groep. Bevestig de muis aan de ontvangende kop van de RF-generator en scherm de niet-behandelde gebieden af met kopertape, inclusief de ogen, oren en tenen.Het belangrijkste onderdeel van dit experiment is de juiste aarding van de muizen. Zonder adequate aarding kan ladingopbouw op de dieren leiden tot thermische of electrodermale letsels. Dit kan eenvoudig worden voorkomen.Positioneer de tumor ten opzichte van de transmissiekop op een afstand die ten minste één centimeter groter is dan de breedte van de gewenste behandelplaats. Positioneer vervolgens de IR-thermische camera zodanig dat de tumor en het behandelgebied zichtbaar zijn. Schakel de RF gedurende vijf minuten in en registreer de resulterende temperatuurcurve.Als de oppervlaktetemperatuur van de huid stijgt boven 42 °C, stop dan de behandeling onmiddellijk na de RF-blootstelling. Laat de muizen herstellen in een warme kamer totdat ze bij bewustzijn zijn. Herhaal de behandelingen tweemaal per week gedurende drie weken.Euthanaseer de muizen vervolgens 48 uur na de laatste RF-blootstelling en verwerk de tumoren. De RF-verhitting van de gezuiverde goudnanodeeltjes werd bepaald door het verschil in hrs tussen deze en de achtergrondoplossing van gedeïoniseerd water. De resultaten waren conform de verwachting voor zowel de nanodeeltjes van vijf nanometer als die van 10 nanometer.De gezuiverde goudnanodeeltjes zijn geïntegreerd in Hep three B-cellen, afgeleid van een menselijk hepatocellulair carcinoom. Wanneer dergelijke cellen worden blootgesteld aan een RF-veld, zijn ze doorgaans minder levensvatbaar dan cellen die aan RF worden blootgesteld zonder geïnternaliseerde nanodeeltjes. Figuur drie toont een geïdealiseerd scenario waarin de gebruikte goudnanodeeltjes op zichzelf een beperkte toxiciteit hebben, maar uitstekende RF-geïnduceerde cytotoxische eigenschappen vertonen; raadpleeg de literatuur voor een uitgebreid overzicht van de tot nu toe behaalde in vitro resultaten met verschillende typen nanomaterialen.Hep 3B leverkankercellen werden gebruikt om tumoren te genereren op de ruggen van babsi naakte muizen. Deze tumoren werden geïnjecteerd met in PBS gesuspendeerde goudnanodeeltjes, gevolgd door RF-blootstelling. Analyse na de behandeling onthulde dat de behandeling de tumorgroei beheerst en de tumormassa verminderde.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u nanodeeltjes kunt beoordelen voor gebruik bij RF-gemedieerde hyperthermie door hun RF-responsieve eigenschappen en de in vitro en in vivo oplossing te bepalen. Vergeet niet dat werken met RF-elektrische velden van hoge vermogens extreem gevaarlijk kan zijn. Raak nooit een actief elektrisch veld aan en reik er nooit in.Voer metingen van het elektrisch veld uit en gebruik indien nodig een geschikte afscherming, zoals een kooi van Faraday. Minimaliseer in het algemeen altijd uw blootstelling aan aanhoudende elektrische velden met een hoge sterkte.

protocols-for-assessing-radiofrequency-interactions-with-gold

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Dit artikel beschrijft een protocol voor het hele lichaam hyperthermie bij muizen die koorts kunnen als voorwaarden te stimuleren tot 12 tot 24 uur.

Protocol voor Long Duration Whole Body Hyperthermie in Muizen

We beschrijven de synthese en eigenschappen van multifunctionele Fe2O3-Au nanodeeltjes geproduceerd door een natte chemische benadering en onderzoeken hun fotothermische eigenschappen door middel van laserbestraling. De samengestelde Fe2O3-Au nanodeeltjes behouden de eigenschappen van beide materialen, waardoor een multifunctionele structuur met uitstekende magnetische en plasmonische eigenschappen ontstaat.

Multifunctionele Hybrid Fe<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 3</sub&gt; Gewerkt -de Au nanopartikels voor Efficient Plasmonische Verwarming

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de fabricage van ijzeroxide nanodeeltjes-shelled microbubbels (NSM's) door middel van zelfassemblage, synergetische magnetische, akoestische en optische responsiviteit in één nanotherapeutisch platform voor magnetische hyperthermie en fototherme combinatie kankertherapie.

Magnetische,akoestische en optisch-drievoudig-responsieve microbubbels voor magnetische hyperthermie en pothotothermale combinatie kankertherapie

Dit protocol presenteert technieken en methodologie die nodig zijn voor de nauwkeurige afgifte van magnetische nanodeeltjeshyperthermie met behulp van een geavanceerd leverings- en monitoringsysteem.

In vitro en in vivo levering van magnetische nanodeeltjeshyperthermie met behulp van een op maat gemaakt leveringssysteem

Dit werk schetst een protocol om dynamische, niet-invasieve monitoring van warmteoverdracht van laserbestraalde gouden nanodeeltjes naar tBLMs te bereiken. Het systeem combineert impedantiespectroscopie voor de real-time meting van geleidingsveranderingen over de tBLMs, met een horizontaal gerichte laserstraal die gouden nanodeeltjesverlichting aandrijft, voor warmteproductie.

Vastgebonden dubbellaagse lipidembranen om de warmteoverdracht tussen gouden nanodeeltjes en lipidembranen te bewaken

Hier wordt een protocol gepresenteerd om gecontroleerde hyperthermie te gebruiken, gegenereerd door magnetische resonantiegeleide hoge intensiteit gerichte echografie, om medicijnafgifte te activeren van temperatuurgevoelige liposomen in een rhabdomyosarcoommuismodel.

Magnetische resonantie-geleide hoge intensiteit gerichte echografie gegenereerde hyperthermie: een haalbare behandelingsmethode in een Murine Rhabdomyosarcoom-model

Het artikel beschrijft een protocol om de voorbijgaande temperatuurprofielen en de gekoppelde spatiotemporele variatie van de interstitiële vloeistofdruk te simuleren na de verwarming die wordt geleverd door een dipolair radiofrequente hyperthermiesysteem. Het protocol kan worden gebruikt om de respons te beoordelen van biofysische parameters die de micro-omgeving van de tumor kenmerken op interventionele hyperthermietechnieken.

Een computationele modelleringsbenadering om de invloed van hyperthermie op de micro-omgeving van de tumor te onderzoeken

Dit artikel presenteert het protocol voor het voorbereiden van tumorweefselfantomen die optische eigenschappen repliceren voor plasmonische fotothermische therapie. Het beschrijft fantoomvoorbereiding, fotothermische evaluaties en validatie van het ontwikkelde numerieke model op basis van fotothermische temperatuurmetingen voor het beoordelen van therapeutische parameters, en biedt een ethisch, kosteneffectief alternatief voor in vivo studies voor voorbereidende tests.

Plasmonische fotothermische kankertherapie: in nanodeeltjes ingebedde tumorweefsel-nabootsende fantomen voor het visualiseren van fotothermische temperatuurverdeling

Dit protocol presenteert technieken en methodologie die nodig zijn voor gerichte hyperthermische therapie in solide tumormodellen. De aanpak maakt gebruik van de fotothermische conversie van nabij-infrarood licht door intratumoraal geïnjecteerde gouden nanostaafjes om plaatselijke verwarming in de micro-omgeving van de tumor te induceren.

Induceren van gerichte milde hyperthermie in muizentumormodellen door fotothermische conversie van nabij-infrarood licht door intratumorale gouden nanostaafjes

Deze video demonstreert de procedures voor de karakterisering van humane pancreatische eilandjes met hematoxyline en eosine (H &amp; E) en immunohistochemie (IHC). Pancreas delen van het hoofd, lichaam en staart regio's worden gekleurd door zowel H &amp; E en IHC te eilandje endocriene samenstelling (insuline, glucagon, en pancreas polypeptide), cel-replicatie (Ki67) en inflammatoire infiltraten (H &amp; E, CD3) te bepalen. De uncinate regio is gelokaliseerd met behulp van IHC voor pancreas...

Kleuring Protocols for Human pancreatische eilandjes

Leer de verwarmingsreactie van gouden nanodeeltjes in radiofrequente velden te beoordelen voor kankertherapie. Deze methode omvat in vitro toxiciteitsstudies en in vivo muismodellen.

Protocollen voor het beoordelen van radiofrequentie Interacties met gouden nanodeeltjes en Biological Systems voor niet-invasieve Hyperthermie Cancer Therapy (Video) | JoVE Journal

Protocollen voor het beoordelen van radiofrequentie Interacties met gouden nanodeeltjes en Biological Systems voor niet-invasieve Hyperthermie Cancer Therapy

Meer video's verkennen