Name: Betere voorbereiding en Conservering van hippocampus Mouse Slices voor een zeer stabiele en reproduceerbare opname van langlopende Potentiëring (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Leer hoe je stabiele en reproduceerbare langdurige potentiatie opneemt in acute hippocampus-sneden van muizen. Dit protocol optimaliseert zuurstofvoorziening en temperatuur voor betrouwbare elektrofysiologische metingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Bernard Foucart voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het Belgische Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FRS-FNRS) en door de Koningin Elisabeth Fonds voor Medisch Onderzoek. Agnès Villers is Research Fellow aan het Belgische Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek.

Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health regelgeving voor de verzorging en het gebruik van dieren in onderzoek en met instemming van de lokale ethische commissie uitgevoerd. 1. Bereiding van kunstmatige cerebro-spinale vloeistof Dezelfde media gebruikt te ontleden, knippen en plakken perfuseren (1 ml / min) gedurende de rustperiode en de elektrofysiologische opnames. Dit medium bestaat uit 124 mM NaCl, 4,4 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 1 mM NaH 2PO 4, 2,5 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4 en 10 mM D-glucose. <ol><li> Weeg de verschillende componenten voor 2 L van ACSF behalve MgSO4 die reeds in oplossing (1M). Met behulp van een standaard oplossing maakt het mogelijk om zeker te zijn van de precieze concentratie van Mg 2 + omdat MgSO4 in poedervorm is sterk hygroscopisch. Ca2 +: Mg2 + verhouding grote invloed LTP inductie en onderhoud14 en zo hun verhoudingen moeten altijd worden gerespecteerd. </li><li> Doe alle onderdelen behalve CaCl2 in een glazen maatcilinder en breng aan 2 L met gedestilleerd H 2 O. </li><li> Roer krachtig. Als alles is opgelost, voeg carbogen door een aquarium borrelaar en slangen aangesloten op de tank (95% O 2, 5% CO 2). Wacht enkele minuten en voeg calciumchloride bij pH is vastgesteld op 7,4 door de inwerking van bicarbonaatbuffer. </li><li> Houd 600 ml in een gekoelde rechthoekige glazen schaal en afkoelen tot 4 ° C met ijs rond het gerecht. Dit medium wordt gebruikt voor dissectie hippocampus. </li><li> Filter de resterende 1400 ml en bewaar in een erlenmeyer. </li></ol> 2. Voorbereiding van de elektrofysiologische Rig en de Brain Slice Recording Kamer De perfusiecircuit is gemaakt van 2 peristaltische pompen, pompen vers vloeistof uit een reservetank en de andere pompende gebruikte vloeistof uit thij opneemt kamer naar een bak. Verse vloeistof wordt toegevoegd aan een home-made perfusie systeem waar het wordt opnieuw zuurstofrijk en opgewarmd voordat de interface opname kamer door de zwaartekracht (Figuur 1A). De interface opname kamer is ontworpen door FST (Fine Science Tools, Vancouver, Canada, Figuur 1B). Weefselcoupes worden gebracht geweven net filter bevestigd aan een verwijderbare goed ring filters kunnen onder omstandigheden-interface worden gehandhaafd door de hoogte van de pompput naald. A home-made plastic buis geblokkeerd op het einde en lateraal geperforeerd (0,5 mm) is bevestigd aan de zuig naald niveau stabiliteit in de kamer. De opname kop is boven een waterbad met een gas dispersie steen die zorgt voor het behoud van een vochtige omgeving door het passeren van vochtige lucht door doorbuiging havens in de schrijfkop (om water druppelvorming verlagen) gemonteerd. Bad en middelgrote temperatuur worden geregeld door continu variëren van de hoogte van gelijkstroom thruwe een siliconenrubber-ingebed verwarmingselement in het waterbad. Thermistors in het waterbad en opname putten kan de kamertemperatuur in te stellen en nauwkeurig gecontroleerd op deze sites. Het verwarmingssysteem van de kamer wordt afgesloten met een globale verwarming regelen van de temperatuur van de hele rig. De software is ontwikkeld door onderzoekers aan de Universiteit van Edinburgh ( <a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a> ) bewaakt en egaliseert de temperatuur van de zuurstofrijke lucht, de hersenen slice, de elektroden en de overige tuig die een stabiele omgeving voor langdurige opnames (figuur 1C) . De gebruikte temperatuur voor muizen hippocampale plakken is 28 ° C. <ol><li> Spoel alle perfusie circuit met gedestilleerd H2O minimaal 20 minuten en start de verwarmingssystemen. </li><li> Start de carbogen borrelen in het circuit. Carbogen komt in de zelfgemaakte perfunderen buizen door fIlter kaarsen en in het waterbad onder de opname kamer. De stroomsnelheid in het waterbad wordt gecontroleerd door een stromingsmeter. Als het debiet te traag is, kan weefsel hypoxie geworden. Omgekeerd, indien de stroomsnelheid te hoog is, kan het gas niet voldoende verwarmd en bevochtigd leidt tot uitdroging van het weefsel. Hoge gasstroom kan ook de kans op water sproeien over het weefsel uit het waterbad hieronder leidt tot osmotische shock. Dit kan worden voorkomen door toevoeging van stukjes nylon mesh (100 urn) en de uitlaat van de afbuiging poorten. </li><li> Tap het circuit en vullen met gefilterd ACSF. </li><li> Zet de ring die het schijfje zullen ondersteunen bij het houden van ruimte. Een geweven net filter met maaswijdte variërend 500-750 urn wordt uitgerekt en bevestigd aan de ring twee-componenten epoxy hars lijm. De geweven netto filter is gemaakt van 87% polyamide en 13% elastaan ​​(panty 15 den). Lijm moet zorgvuldig worden toegepast om de vorming van reliëfs voorkomen aan het oppervlak van de ring. </li><li> Verwijder alle luchtbellen zorgvuldig uit het circuit. </li><li> Pas het niveau van ACSF in de opname kamer met de schroef van de zuigkracht naald. De snelheid van de peristaltische pomp wordt ingesteld op 1 ml / min voor de pomp inlaat en 5 ml / min voor de uitlaat pomp. </li></ol> De perfusie-systeem wordt op een stijve bestand tegen trillingen tafel geplaatst en wordt omgeven door een kooi van Faraday. 3. Voorbereiding van de Dissection Area Chirurgische instrumenten: een scalpel met een # 11 mes, kleine standaard ontleden schaar, de lente schaar, gebogen pincet, twee Heidemann spatulae en een lepel. Aanvullend materiaal: een guillotine, een onderlegger, een McIlwain weefsel chopper met een scheermesje, filterpapier, een glas Pasteur pipet met een rubberen speen, 2 plastic pasteurpipetten waarvan een met een brede mond, een petrischaaltje, een metalen cilinder van 7 mm diameter (figuur 2A). <ol><li&gt; In het ontleden schotel gevuld met koud ACSF (bereid in stap 1), dompel een gekoelde glazen deksel van een kleuring schotel, verpakt in filtreerpapier. Verwijder voorzichtig luchtbellen en zuurstof de ACSF via een aquarium bubbler (Figuur 2A). </li><li> Lay out instrumenten in volgorde van gebruik. Voeg drie lagen filterpapier op het weefsel chopper plaat en een nieuwe scheermesje gereinigd met gedestilleerd water en ether (figuur 2B). Het scheermesje moet horizontaal zijn als het het papier raakt. Mesdruk wordt aangepast aan de helft van de maximale waarde en snelheid ongeveer een derde van de maximale waarde. </li><li> Aandachtig kijken of alles klaar is (instrumenten, temperatuur ...) omdat je tijd niet achteraf hebben. </li><li> Vraag iemand om de ontleding te spuiten met een Pasteur pipet gevuld met koud ACSF. </li><li> Verdoven de muis met Nembutal IP (100 mg / kg) voor onthoofding. Halothaan anesthesie worden gebruikt. We hebben beide methoden en obta vergelekenined dezelfde resultaten. Onthoofding moet onder verdoving uitgevoerd maar cervicale dislocatie kan ook worden gebruikt. Cervicale dislocatie heeft echter een zeer goede gewoonte om dierenleed te voorkomen. </li><li> Ontleden de onderlegger zo snel mogelijk onder koude ACSF continue douche. </li></ol> 4. Brain Verwijdering <ol><li> Terwijl nog steeds de kop met de wijsvinger en de duim van een hand op de snuit, een insnijding met ontleden schaar langs het midden van de bovenkant van de kop vanaf de rand van de guillotine gesneden en actief rostraal aan de frontale bot . </li><li> Knip de huid spier aan weerszijden van de kop van de schedelplaten volledig zichtbaar en verwijder de spieren aan de caudale kant van de weg. </li><li> Met het ontleden schaar, knip de temporalis spier aan elke kant, langs de temporalis plaat, knip dan de frontale platen in het midden, dwars. Maak dan een kleine snee in de occipitale bot, tussen de twee plates. </li><li> Voor elke zijde, gesneden aan de caudale basis van de occipitale platen. </li><li> Knip langs de pijlnaad met veer schaar. </li><li> Met een pincet, verwijder de schedel helften door het verspreiden van hen weg van elkaar. </li><li> Met de scalpel, dwars gesneden net na de reukbol en net voordat het cerebellum dompelen vervolgens de uitgepakte hersenen in het ontleden schotel met koud ACSF. </li></ol> 5. Hippocampus Dissection <ol><li> Zodra de hersenen wordt ondergedompeld in het ontleden schotel, scheiden de twee hersenhelften van elkaar met een scalpel gestoken in het midden. </li><li> De dissectie van de hippocampus wordt uitgevoerd met spatulae onder visuele controle door een binoculair chirurgische microscoop (X25, figuur 2A). Aan de ene hemisfeer, voorzichtig uit de structuren aan de laterale ventrikel zien. Verwijder de hersenstam en diencephalon. Dit gebeurt door toepassing van de spatulae de frontale cortex aan de ene kant en het diencephalon op deandere zijde. Zorg ervoor dat de hippocampus niet aan met de spatulae en niet uitrekken tijdens weefsel snijden. </li><li> Sever de fornix en duw voorzichtig de hippocampus van de cortex (wegrollen), door het invoegen van een spatel in het ventrikel. </li><li> Wanneer de hippocampus wordt gewonnen, verwijder overtollig cortex weefsel en resterende bloedvaten. </li></ol> 6. Het snijden van de Slices <ol><li> Met een brede mond plastic Pasteur pipet de hippocampus in een lepel met zijn alvear oppervlak naar boven (bolle zijde). </li><li> Verwijder overtollig vocht met een standaard plastic Pasteur pipet. </li><li> Tip de lepel verticaal bijna aanraken van het filterpapier van de chopper (Figuur 2B) en drop off van de hippocampus van de lepel, door snel het aanraken van het filterpapier verplaats dan de lepel terug. </li><li> Oriënteer de hippocampus en snijd het dwars op 400 pm met de helikopter (zie figuur 2C voor oriëntatie van de hippocampus ten opzichte van het scheermesje). Zo snel mogelijk te handelen. </li><li> Verwijder het filter papier met de plakjes hippocampus en wikkel het rond de metalen cilinder op de plakjes een beetje spreiden. Vervolgens, gratis de plakjes met sprays van ACSF met behulp van een standaard plastic Pasteur pipet en verzamel ze in een petrischaal gevuld met koud ACSF. </li></ol> 7. Incubatie van Slices in Interface <ol><li> Selecteer plakjes met een standaard plastic Pasteur pipet en snel plaats ze in de opname kamer. Segmenten herstellen van de dissectie trauma direct in de opname kamer, in de interface bij 28 ° C. </li><li> Het schijfje zal waarschijnlijk wastafel. Verlaag het vloeistofniveau aan de slice niveau te bereiken, en vervolgens te verhogen om het te laten zweven. </li><li> Draai het segment in de juiste positie terwijl het verlagen van het niveau. Plakjes altijd georiënteerd op dezelfde manier aan de positionering van de elektroden (2 stimuleren en een registrerende elektroden) in het CA1 gebied vergemakkelijken. </li><li> Stop wanneerhet fluïdum in de interface. A &quot;meniscus&quot; van media over de slice is indicatief voor een voldoende media. De netto-filter moet worden verzadigd met media, maar niet volledig ondergedompeld. </li><li> Houd de kamer bedekt met filtreerpapier geplaatst over het geperforeerde deksel. </li><li> Laat de plak rust ten minste 1,5 uur bij 28 ° C. </li></ol> 8. Registratie van Synaptic Responses <ol><li> Opnemen elektrode: glas haarvaten worden getrokken om een ​​tip weerstand van 2-5 MQ verkrijgen wanneer gevuld met ACSF. Een klein stukje filtreerpapier geplaatst rond de punt van de elektrode en botwas wordt uitgeoefend op het uiteinde dat condens. Stimulatie-elektroden: platina-iridium bipolaire cluster elektroden met een 12,5 micrometer diameter worden gekocht van FHC (USA). Met de juiste zorg, kan elke elektrode minstens 30 keer (Figuur 1B) worden gebruikt. </li><li> Plaats de elektroden in het stratum radiatum van CA1 regio, de elektroden gevoerdup (Figuur 3A). Elektroden neergelaten 75-150 urn onder het oppervlak van het segment met Narishige micromanipulators. De twee stimulatie-elektroden worden geplaatst op twee verschillende bundels van Schaffer collateralen stimuleren. Wanneer de elektroden worden neergelaten op het schijfje, zijn papieren filters zorgvuldig geplaatst rondom aan de kamer te sluiten. </li><li> Bifasische stimulatie (0,08 msec pulsduur per halve golf) wordt uitgevoerd bij constante spanning met een Grass stimulator aangesloten op SIU-V isolatie-eenheden. Maximale respons wordt gecontroleerd door het verhogen stimulusintensiteit van 2 V tot maximaal 12 V. Field EPSPs worden versterkt 1000 keer met een WPI ISO-80 versterker en gefilterd bij 10 Hz en 10 kHz. Het signaal wordt vervolgens naar een computer die via een National Instrument A / D converter. Stimulatie, data-acquisitie en-analyse worden uitgevoerd met behulp van het WinLTP programma ( <a href="http://www.winltp.com">www.winltp.com</a> ). Field EPSPS worden tegen 40% van de maximale amplitude verkregen in een input-outzet curve. Voor elk segment worden de fEPSP hellingen genormaliseerd ten opzichte van de gemiddelde helling over de 30 minuten voorafgaand aan LTP inductie. </li><li> LTP wordt geactiveerd door een enkele trein van stimulatie (100 Hz) en proef sterkte van een pathway terwijl de tweede route dient als controle. </li></ol> 9. Reinigen van de Setup <ol><li> Spoel alle circuit met een 3% oplossing van waterstofperoxide (H 2 O 2) ten minste 10 minuten, laat ze uitlekken. Het circuit zal zorgvuldig worden gespoeld met gedistilleerd water voordat u begint met een experiment. Het gebruik van H 2 O 2 is niet absoluut noodzakelijk als andere laboratoria alleen met gedestilleerd water voor het reinigen, maar we de afzetting van donkere resten in de slang systeem hebben gemerkt bij het ​​gebruik van alleen water. </li><li> Vervang het water in het waterbad onder de opname kamer. </li><li> Bad de stimulatie-elektroden tips in alcohol gedurende 5 minuten. </li></ol>

<ol><li>Bliss, T. V., Lomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+potentiation+of+synaptic+transmission+in+the+dentate+area+of+the+anaesthetized+rabbit+following+stimulation+of+the+perforant+path%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path.</a> J. Physiol. 232 (2), 331-356 (1973).</li>
<li>Douglas, R. M., Goddard, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+of+the+perforant+path-granule+cell+synapse+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation of the perforant path-granule cell synapse in the rat hippocampus.</a> Brain Res. 86, 205-215 (1975).</li>
<li>Squire, L., Kandel, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSquire%2C+L+%22Memory%3A+From+mind+to+molecules%22">Memory: From mind to molecules</a>. , WH Freeman & Company. New York, New York, USA. (1999).</li>
<li>Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+a+critical+period+of+transcription+for+induction+of+a+late+phase+of+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP.</a> Science. 265 (5175), 1104-1107 (1994).</li>
<li>Frey, U., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+tagging+and+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic tagging and long-term potentiation.</a> Nature. 385 (6616), 533-536 (1038).</li>
<li>Bortolotto, Z. A., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+protein+kinase+C+in+a+form+of+metaplasticity+that+regulates+the+induction+of+long-term+potentiation+at+CA1+synapses+of+the+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A role for protein kinase C in a form of metaplasticity that regulates the induction of long-term potentiation at CA1 synapses of the adult rat hippocampus.</a> Eur. J. Neurosci. 12 (11), 4055-4062 (2000).</li>
<li>Migues, P. V., Hardt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKMzeta+maintains+memories+by+regulating+GluR2-dependent+AMPA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PKMzeta maintains memories by regulating GluR2-dependent AMPA receptor trafficking.</a> Nat. Neurosci. 13 (5), 630-634 (2010).</li>
<li>Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. -C., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusional+trapping+of+GluR1+AMPA+receptors+by+input-specific+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity.</a> Neuron. 54 (3), 447-460 (2007).</li>
<li>Vickers, C. A., Dickson, K. S., Wyllie, D. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+maintenance+of+late-phase+long-term+potentiation+in+isolated+dendrites+of+rat+hippocampal+CA1+pyramidal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Induction and maintenance of late-phase long-term potentiation in isolated dendrites of rat hippocampal CA1 pyramidal neurones.</a> J. Physiol. 568 (3), 803-813 (2005).</li>
<li>Fonseca, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+actin+dynamics+are+required+for+the+maintenance+of+long-term+plasticity+and+for+synaptic+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent actin dynamics are required for the maintenance of long-term plasticity and for synaptic capture.</a> Eur. J. Neurosci. 35 (2), 195-206 (2012).</li>
<li>Redondo, R. L., Okuno, H., Spooner, P. A., Frenguelli, B. G., Bito, H., Morris, R. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+tagging+and+capture%3A+differential+role+of+distinct+calcium%2Fcalmodulin+kinases+in+protein+synthesis-dependent+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation.</a> J. Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).</li>
<li>Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis-dependent+long-term+functional+plasticity%3A+methods+and+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 15 (5), 607-613 (2005).</li>
<li>Connor, S. A., Wang, Y. T., Nguyen, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+beta-adrenergic+receptors+facilitates+heterosynaptic+translation-dependent+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activation of beta-adrenergic receptors facilitates heterosynaptic translation-dependent long-term potentiation.</a> J. Physiol. 589 (17), 4321-4340 (2011).</li>
<li>Villers, A., Godaux, E., Ris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+LTP+requires+neither+repeated+trains+for+its+induction+nor+protein+synthesis+for+its+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-lasting LTP requires neither repeated trains for its induction nor protein synthesis for its development.</a> PLoS One. 7 (7), e40823(2012).</li>
<li>Capron, B., Sindic, C., Godaux, E., Ris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+characteristics+of+LTP+induced+in+hippocampal+slices+are+dependent+on+slice-recovery+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">The characteristics of LTP induced in hippocampal slices are dependent on slice-recovery conditions.</a> Learn. Mem. 13 (3), 271-277 (2006).</li>
<li>Villers, A., Godaux, E., Ris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+phase+of+L-LTP+elicited+in+isolated+CA1+dendrites+cannot+be+transferred+by+synaptic+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Late phase of L-LTP elicited in isolated CA1 dendrites cannot be transferred by synaptic capture.</a> Neuroreport. 21, 210-215 (2010).</li>
<li>Nguyen, P. V., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+theta-burst+stimulation+induces+a+transcription-dependent+late+phase+of+LTP+requiring+cAMP+in+area+CA1+of+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Brief theta-burst stimulation induces a transcription-dependent late phase of LTP requiring cAMP in area CA1 of the mouse hippocampus.</a> Learn. Mem. 4 (2), 230-243 (1997).</li>
<li>Dewachter, I., Ris, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+synaptic+plasticity+and+Tau+phosphorylation+by+wild-type+and+mutant+presenilin1%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">Modulation of synaptic plasticity and Tau phosphorylation by wild-type and mutant presenilin1.</a> Neurobiol. Aging. 29 (5), 639-652 (2008).</li>
<li>Dewachter, I., Filipkowski, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulation+of+NMDA-receptor+function+and+down-stream+signaling+in+APP%5BV717I%5D+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">Deregulation of NMDA-receptor function and down-stream signaling in APP[V717I] transgenic mice.</a> Neurobiol. Aging. 30 (2), 241-256 (2009).</li>
<li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Acute+Hippocampal+Slices+from+Rats+and+Transgenic+Mice+for+the+Study+of+Synaptic+Alterations+during+Aging+and+Amyloid+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology.</a> J. Vis. Exp. (49), e2330(2011).</li>
<li>Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slices+have+more+synapses+than+perfusion-fixed+hippocampus+from+both+young+and+mature+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats.</a> J. Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).</li>
<li>Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warmer+preparation+of+hippocampal+slices+prevents+synapse+proliferation+that+might+obscure+LTP-related+structural+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity.</a> Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).</li>
<li>Alger, B. E., Dhanjal, S. S., Dingledine, R., Garthwaite, J., Henderson, G., King, G. L., et al. Appendix: Brain slice methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlger%2C+BE+%22Brain+Slices%22">Brain Slices</a>. Dingledine, R. , Plenum. New York. 381-437 (1984).</li>
<li>Watson, P. L., Weiner, J. L., Carlen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+variations+in+hippocampal+slice+preparation+protocol+on+the+electrophysiological+stability%2C+epileptogenicity+and+graded+hypoxia+responses+of+CA1+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of variations in hippocampal slice preparation protocol on the electrophysiological stability, epileptogenicity and graded hypoxia responses of CA1 neurons.</a> Brain Res. 775, 134-143 (1997).</li>
<li>Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisomycin%2C+an+inhibitor+of+protein+synthesis%2C+blocks+late+phases+of+LTP+phenomena+in+the+hippocampal+CA1+region+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Anisomycin, an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro.</a> Brain Res. 452 (1-2), 57-65 (1988).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+memory+storage%3A+a+dialogue+between+genes+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses.</a> Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).</li>
<li>Fonseca, R., Nägerl, U. V., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+determines+the+protein+synthesis+dependence+of+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity determines the protein synthesis dependence of long-term potentiation.</a> Nat. Neurosci. 9 (4), 478-480 (2006).</li>
<li>Rudy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+a+baby+in+the+bathwater%3F+Maybe%3A+some+methodological+issues+for+the+de+novo+protein+synthesis+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Is there a baby in the bathwater? Maybe: some methodological issues for the de novo protein synthesis hypothesis.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 89 (3), 219-224 (2008).</li>
<li>Sharma, A. V., Nargang, F. E., Dickson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosilence%3A+Profound+Suppression+of+Neural+Activity+following+Intracerebral+Administration+of+the+Protein+Synthesis+Inhibitor+Anisomycin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurosilence: Profound Suppression of Neural Activity following Intracerebral Administration of the Protein Synthesis Inhibitor Anisomycin.</a> J. Neurosci. 32 (7), 2377-2387 (2012).</li>
<li>Volianskis, A., Jensen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+sustained+types+of+long-term+potentiation+in+the+CA1+area+of+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transient and sustained types of long-term potentiation in the CA1 area of the rat hippocampus.</a> J. Physiol. 550 (2), 459-492 (2003).</li>
<li>Ris, L., Villers, A., Godaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+capture-mediated+long-lasting+long-term+potentiation+is+strongly+dependent+on+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Synaptic capture-mediated long-lasting long-term potentiation is strongly dependent on mRNA translation.</a> Neuroreport. 20 (17), 1572-1576 (2009).</li>
<li>Abbas, A. -K., Dozmorov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+LTP+without+triggered+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Persistent LTP without triggered protein synthesis.</a> Neurosci. Res. 63 (1), 59-65 (2009).</li>
<li>Ho, O. H., Delgado, J. Y., O'Dell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+proteins+involved+in+activity-dependent+forms+of+synaptic+plasticity+is+altered+in+hippocampal+slices+maintained+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of proteins involved in activity-dependent forms of synaptic plasticity is altered in hippocampal slices maintained in vitro.</a> J. Neurochem. 91, 1344-1357 (2004).</li>
<li>Whittingham, T. S., Lust, W. D., Christakis, D. A., Passonneau, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+stability+of+hippocampal+slice+preparations+during+prolonged+incubation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Metabolic stability of hippocampal slice preparations during prolonged incubation.</a> J. Neurochem. 43, 689-696 (1984).</li>
<li>Dunlop, D. S., van Elden, W., Lajtha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+conditions+for+protein+synthesis+in+incubated+slices+of+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Optimal conditions for protein synthesis in incubated slices of rat brain.</a> Brain Res. 99, 303-318 (1975).</li>
<li>Taubenfeld, S. M., Stevens, K. A., Pollonini, G., Ruggiero, J., Alberini, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+molecular+changes+following+hippocampal+slice+preparation%3A+loss+of+AMPA+receptor+subunits+and+uncoupled+mRNA%2Fprotein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Profound molecular changes following hippocampal slice preparation: loss of AMPA receptor subunits and uncoupled mRNA/protein expression.</a> J. Neurochem. 81 (6), 1348-1360 (2002).</li>
<li>Gruart, A., Munoz, M. D., Delgado-Garcia, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+CA3-CA1+synapse+in+the+acquisition+of+associative+learning+in+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Involvement of the CA3-CA1 synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice.</a> J. Neurosci. 26 (4), 1077-1087 (2006).</li>
<li>Whitlock, J. R., Heynen, A. J., Shuler, M. G., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+induces+long-term+potentiation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Learning induces long-term potentiation in the hippocampus.</a> Science. 313, 1093-1097 (2006).</li>
<li>Grant, S. G. N., Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+learning%5BTitle%5D)+AND+%22TINS%22%5BJournal%5D)">Targeting learning.</a> TINS. 17 (2), 71-75 (1994).</li>
<li>Izquierdo, I., Medina, J. H., Vianna, M. R. M., Izquierdo, L. A., Barros, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separate+mechanisms+for+short-+and+long-term+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Separate mechanisms for short- and long-term memory.</a> Behav. Brain Res. 103, 1-11 (1999).</li>
<li>Morice, E., Andreae, L. C., Cooke, S. F., Vanes, L., Fisher, E. M. C., Tybulewicz, V. L. J., Bliss, T. V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+long-term+memory+and+synaptic+plasticity+despite+short-term+impairments+in+the+Tc1+mouse+model+of+Down+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Preservation of long-term memory and synaptic plasticity despite short-term impairments in the Tc1 mouse model of Down syndrome.</a> Learn Mem. 15 (7), 492-500 (2008).</li>
<li>Dunlop, D. S., van Elden, W., Plucinska, I., Lajtha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+Slice+Protein+Degradation+and+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Brain Slice Protein Degradation and Development.</a> J. Neurochem. 36, 258-265 (1981).</li>
<li>Izquierdo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+and+the+mechanisms+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Dev.+Res%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation and the mechanisms of memory.</a> Drug Dev. Res. 30, 1-17 (1993).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We hebben in ons laboratorium ontwikkelde een protocol van gecombineerde methoden ontwikkeld en gebruikt door andere laboratoria hebben van een grote deskundigheid op LTP opnamen 11,17. Dit protocol is aangepast om volwassen muis hippocampus en kan worden gebruikt bij dieren van elke leeftijd en elk achtergrond genotype. Ook kan de analyse van LTP in transgene muizen ontwikkelen van neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer 18,19. Gebruik van dit protocol...

Tegenwoordig is er weinig begrip van hoe complexe herinneringen worden opgeslagen en opgeroepen bij de neuronale circuit niveau. Echter, een verenigende hypothese geheugenopslag is vrij en breed geaccepteerde: geheugen worden opgeslagen als veranderingen in de sterkte van synaptische verbindingen tussen neuronen in het centrale zenuwstelsel. Op zijn eigen, heeft het onderzoek naar de synaptische plasticiteit ruimschoots geprofiteerd van twee baanbrekende ontdekkingen. (1) In een rudimentaire experiment, Bliss en Lomo 1, met het intact verdoofde konijn, vond dat de levering van een korte hoogfrequente (1 sec, 100 Hz) stimulatie van de perforant pad van de hippocampus veroorzaakte een langdurige (enkele uur) toename in de gerelateerde synaptische verbindingen. Dit fascinerende fenomeen werd genoemd &quot;Long-Term Potentiëring&quot; of LTP door Douglas en Goddard in 1975 2. (2) Later werd vastgesteld dat een soortgelijk verschijnsel kan worden geactiveerd in hersenenplakken (0,4 mm) kunstmatig in leven gehouden in vitro </em&gt;. De meest bestudeerde LTP in vitro waargenomen door het leveren van een of meerdere tetani een bundel van axons (de zogenaamde Schaffer collateralen) tijdens het opnemen van het resulterende veld prikkelende synaptische potentieel opgeroepen in de piramidale neuronen van de zogenaamde CA1 regio. De mechanismen van LTP inductie zijn grotendeels geopenbaard. Kortom, een Ca2 + influx door NMDA receptoren activeert enzymen twee gevolgen: a fosforylering van AMPA receptoren (die de efficiëntie verhoogt) en een opname van extra AMPA receptoren in het postsynaptische membraan 3. Daarentegen, de mechanismen van de onderhoudsfase LTP grotendeels onbekend, vooral omdat het experimenteel veel moeilijker om een ​​stukje gezonde vele uren dan gedurende 30 tot 60 minuten behouden. Veel studies zijn gewijd aan het begrip van mechanismen en LTP interessante theorieën zijn uitgewerkt in de jaren 4-11. Maar until nu, hebben de precieze moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de stabiele toename van synaptische sterkte niet opgehelderd. Dit zou deels te wijten aan de moeilijkheid om eerdere resultaten te reproduceren in verschillende laboratoria met verschillende technieken voor het opstellen en het onderhoud van de hippocampus plakjes. In hun methodologiedocument, Sajikumar et al.. 12 benadrukte het belang van experimentele omstandigheden voor de bereiding van de rat hippocampale plakken en de registratie van stabiele LTP. In deze video presenteren we alle optimalisatiestappen in ons laboratorium ontwikkeld in de jaren kunnen een zeer stabiele LTP opnemen in muis hippocampale plakken. Deze optimalisatie is gemaakt van protocollen ontwikkeld en met succes gebruikt door andere laboratoria die LTP mechanismen bestuderen in muizen en ratten 13 11. Hiermee ervaren onderzoekers voor inductie en nemen een zeer langdurige LTP in volwassen muizen met een hoge mate van succes. De physiological basis van de geïnduceerde LTP werd zorgvuldig gecontroleerd en aangetoond 14. In deze methodiek papier, tonen wij aan dat alle wijzigingen van de experimentele omstandigheden, zoals temperatuur of oxygenatie een diepgaande invloed op LTP onderhoud kan hebben terwijl de dissectie procedure kan diep wijzigen plakjes prikkelbaarheid. Het moet worden benadrukt dat de precieze controle van al deze parameters vereist een opleiding van enkele maanden voor beginnende studenten.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagens/Materiaal</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 1M</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>63126</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Air Liquide (Belgium)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillairen</td><td>WPI, Inc. (UK)</td><td>TW150-4</td><td></td></tr><tr><td>Stimulatie-elektroden</td><td>FHC (USA)</td><td>CE2B30</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische gereedschappen</td><td>FST (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier 84 g/m2</td><td>Sartorius</td><td>FT-3-105-110</td><td></td></tr><tr><td>Gaas</td><td>Lycra</td><td>15 den</td><td></td></tr><tr><td>Lijmpistool</td><td>UHU</td><td>plus endfest300</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Instrument</td></tr><tr><td>Versterker</td><td>WPI, Inc. (UK)</td><td>ISO-80</td><td></td></tr><tr><td>Interface-opnamekamer</td><td>FST (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peristaltiekpompen</td><td>Gilson (USA)</td><td>Minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td>Temperatuurregelaar</td><td>University of Edinburgh</td><td><a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Weefselsnijder</td><td>Mcllwain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stimulatoren</td><td>Grass (USA)</td><td>S88X + SIU-V</td><td></td></tr><tr><td>Programmaanalyse</td><td>WinLTP</td><td><a href="http://www.winltp.com" target="_blank">www.winltp.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulatoren</td><td>Narishige</td><td>MM-3 en MMO-220A</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisch microscoop</td><td>Leica Microsystem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A/D-converter</td><td>National Instruments</td><td>NIPCI-6229 M-series</td><td></td></tr></tbody></table>

betere voorbereiding en conservering van hippocampus mouse slices voor een zeer stabiele en reproduceerbare opname van langlopende potentiëring

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Lange termijn potentiëring (LTP) is een vorm van synaptische plasticiteit gekenmerkt door een toename in kracht en synaptische verondersteld betrokken te zijn bij het geheugen codering. LTP opgewekt in het CA1 regio acute hippocampale plakken is uitgebreid bestudeerd. Maar de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de onderhoudsfase van dit fenomeen nog steeds slecht begrepen. Dit kan gedeeltelijk te wijten aan de verschillende experimentele omstandigheden die door verschillende laboratoria. Inderdaad, de onderhoudsfase LTP is sterk afhankelijk van externe parameters zoals zuurstof, temperatuur en vochtigheid. Het is ook afhankelijk van interne parameters zoals oriëntatie van het vlak snijden en levensvatbaarheid segment na dissectie. Het optimaliseren van deze parameters kan de inductie van een reproduceerbare en stabiele zeer lange termijn potentiëring. Deze methode biedt de mogelijkheid om de moleculaire mechanismen betrokken bij de stabiele stijging verder onderzoekenin synaptische sterkte in hippocampale plakken. Het benadrukt ook het belang van experimentele condities in in vitro onderzoek naar neurofysiologische verschijnselen.

Deze methode werd gebruikt om de eigenschappen van langdurige lange termijn potentiëring geïnduceerd acute hippocampale plakken van volwassen C57BL/6J-muizen (JANVIER SAS, Frankrijk) 14 geanalyseerd. Verrassend genoeg heeft de verbetering van de experimentele omstandigheden leidden tot een nieuwe manier van kijken naar LTP. We toonden aan dat langdurige verhoging van de synaptische sterkte de synthese van nieuwe eiwitten niet nodig was. Hier laten we zien dat LTP inductie afhankel...

Dit document presenteert een complete methodiek voor te bereiden en te bewaren<em&gt; In vitro</em&gt; Acute hippocampus segmenten van volwassen muizen. Dit protocol omvat de opname van zeer stabiele duurzame lange termijn potentiëring (LTP) voor meer dan 8 uur met een slagingspercentage van 95%.

Betere voorbereiding en Conservering van hippocampus Mouse Slices voor een zeer stabiele en reproduceerbare opname van langlopende Potentiëring

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Het algemene doel van deze procedure is om zeer stabiele en reproduceerbare langetermijnpotentiering in acute hippocampale coupes te kunnen registreren. Dit wordt bereikt door eerst de muizenhersenen te verwijderen en de hippocampus onder de microscoop te dissekeren in koud A CSF. De tweede stap is het snijden van transversale hippocampale coupes met een weefselhacker.Vervolgens wordt het coupeschnitt in de interface-registratiekamer geplaatst, die wordt geperfuseerd met gezuiverde, zuurstofrijke kunstmatige cerebrospinale vloeistof. De laatste stap is het plaatsen van de elektroden en het registreren van de synaptische activiteit in de CA1-regio van de hippocampus. Ten slotte wordt een protocol van hoogfrequente stimulatie gebruikt om de inductie van een zeer stabiele langetermijnpotentiëring aan te tonen.Met deze methode kan inzicht worden verkregen in het mechanisme dat ten grondslag ligt aan synaptische plasticiteit. Deze kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals diermodellen voor neurodegeneratieve aandoeningen, het zenuwstelsel of immuunziekten. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat alle manipulaties een grote vaardigheid en veel oefening vereisen.Begin deze procedure door het perfusiecircuit gedurende minimaal 20 minuten te spoelen met gedestilleerd water. Zet vervolgens de verwarmingssystemen aan. Start het borrelen van carbogen in het circuit.De carbogeengasstroom wordt via luchtverstuivers naar het waterbad onder de registratiekamer geleid. Controleer vervolgens de stroomsnelheid in het waterbad met een debietmeter. Laat daarna het circuit legleggen en vul het aan met gefilterde A CSF om luchtbellen te verwijderen. Plaats vervolgens de ring, die de slice in de houdkamer zal ondersteunen.Verwijder zorgvuldig alle luchtbellen uit het circuit. Stel vervolgens het CSF-niveau in de registratiekamer in met de schroef van de zuignaald; de snelheid van de inlaatpomp wordt ingesteld op 1 ml per minuut en de uitlaatpomp op 5 ml per minuut. Bereid alle chirurgische instrumenten voor voordat de dissectie begint.Om de hersenen van een geofferde muis te verwijderen: houd de kop vast met de wijsvinger en duim en maak met de dissectieschaar een incisie in het midden van de bovenkant van de kop, beginnend bij de rand van de guillotine, knip en loop vervolgens richting het frontale bot. Snijd vervolgens door de cutane spieren aan weerszijden van de kop om de schedelplaten volledig bloot te leggen.Verwijder vervolgens de spieren aan de caudale zijde van de kop. Snijd daarna de musculus temporalis aan elke zijde langs de temporaalplaat door. Snijd vervolgens de frontale platen in het midden transversaal door.Maak nu een kleine incisie in het os occipitale tussen de twee platen. Snijd aan weerszijden aan de basis van de occipitale platen. Snijd vervolgens met de veerschaar langs de sutura sagittalis.Verwijder tot slot de schedel door de helften met een pincet uit elkaar te spreiden. Snijd nu met het scalpel transversaal vlak voor het cerebellum en vlak na de bulbus olfactorius en breng de geëxtraheerde hersenen vervolgens over naar de dissectieschaal met koud A CSF. Zodra de hersenen in de dissectieschaal zijn geplaatst, worden de twee hemisferen onder een binoculair chirurgisch microscoop van elkaar gescheiden met een scalpel dat in het midden is ingevoerd; spreid de structuur van één hemisfeer voorzichtig uit om het laterale ventrikel zichtbaar te maken.Verwijder de hersenstam en het cephalon door één spatel op de frontale cortex en de andere spatel op het cephalon te plaatsen. Zorg ervoor dat de hippocampus niet met de spatel wordt aangeraakt en dat deze niet wordt uitgerekt tijdens het doorsnijden van het weefsel. Doorknipt daarna de fornix.Duw vervolgens voorzichtig de hippocampus uit de cortex door een spatel in het ventrikel in te brengen. Wanneer de hippocampus is geëxtraheerd, verwijdert u overtollig corticaal weefsel en resterende bloedvaten met een plastic Pasteurpipet met brede opening. Verplaats de hippocampus met een lepel, met het alvi-oppervlak naar boven, naar het platform van de chopper.Verwijder overtollig vloeistof uit de lepel met een standaard plastic Pasteur-pipet. Kantel daarna de lepel verticaal, zodat deze het filterpapier op de hakbijl bijna raakt. Laat de hippocampus vallen door het filterpapier snel aan te raken.Trek vervolgens de lepel terug. Orienteer daarna de hippocampus en snijd deze. Maak transversale coupes van 400 microns met de chopper.Voer de procedure zo snel mogelijk uit. Verwijder vervolgens het filterpapier met de hippocampale coupes en wikkel dit rond de metalen cilinder om de coupes enigszins te spreiden. Maak de coupes daarna los met sproeiers A CSF met behulp van een standaard plastic pasteurpipet en verzamel ze in een Petrischaal gevuld met koud.A CSF. Breng de geselecteerde slice met een standaard plastic transferpipet over naar de registratiekamer. Laat de slice herstellen van het dissectietrauma in de registratie-interfacekamer bij 28 °C.Als de slice verder zinkt, verlaag dan het A CSF-niveau tot het niveau van de slice, en verhoog vervolgens het A CSF-niveau opnieuw om de slice te laten drijven. Orienteer de slice daarna in de positie die de plaatsing van elektroden in de CA1-regio vergemakkelijkt. Stop met het verlagen van het A CSF-niveau zodra dit zich op de interface bevindt.De meniscus van het medium rondom de slice is indicatief voor een voldoende niveau van A CSF. Het gaas moet verzadigd zijn met medium, maar mag niet volledig ondergedompeld zijn. Houd de kamer vervolgens afgedekt met filterpapier over het geperforeerde deksel.Laat de slice ten minste één uur en 30 minuten rusten bij 28 °C voor aanvang van de registratie. Hier is een schets die twee onafhankelijke synaptische inputs, S één en S twee, naar dezelfde neuronale populatie weergeeft. Het S één-pad werd gebruikt om LTP te induceren, terwijl het S twee-pad als controle diende.Dit zijn de voorbeeld F-E-P-S-P-sporen die zijn geregistreerd vlak voor de LTP-inductie, aangegeven door de rode sporen, en één uur na de LDP-inductie, aangegeven door de blauwe sporen. Hier zijn de F-EPSP's van een volledig gezonde slice, en hier zijn de F-EPSP's van een slice die een hoge mate van exciteerbaarheid vertoont wanneer de slices niet volledig gezond zijn. Polysynaptische responsen zijn waarneembaar en de potentiering van de F-E-P-S-P-helling is verminderd.Hier is een vergelijking van de tijdsverloopcurves van de F-E-P-S-P-helling na LTP, geïnduceerd door een enkele reeks hoogfrequente stimulatie, opgenomen in 2005, 2010 en 2011 in ons laboratorium. De eerste experimenten, opgenomen in 2005, worden aangegeven door gevulde cirkels. Latere opnames, aangegeven door gevulde vierkanten, profiteerden van een verbeterde dissectieprocedure.De huidige resultaten komen voort uit de optimalisatie van de oxygenatie van de interface en de temperatuurbeheersing, samen met de standaardisatie van de elektroden, zoals aangegeven door de open cirkels. Hier tonen we aan dat het verhogen van de zuurstofstroomsnelheid in het waterbad onder de registratiekamer van 0,15 naar 0,25 liter per minuut, zoals aangegeven door de blauwe curve, een afname van de F-E-P-S-P-helling met 20% induceert bij het verhogen van de temperatuur van 28 naar 29 °C. Zoals aangegeven, induceert de groene curve een toename van de F-E-P-S-P-helling van meer dan 50%.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat elke stap cruciaal is en fouten in het protocol kunnen leiden tot verschillende resultaten. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u zeer stabiele langetermijnpotentiëring kunt verkrijgen. Registratie in acute hippocampale coupes.

improved-preparation-preservation-hippocampal-mouse-slices-for-very

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit artikel schetst de procedures voor het bereiden van de hippocampus segmenten van ratten en transgene muizen voor de studie van synaptische veranderingen geassocieerd met de hersenen ouder worden en leeftijd-gerelateerde neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer.

Voorbereiding van de Acute hippocampus Plakjes van ratten en transgene muizen voor de Studie van Synaptic Wijzigingen bij het ouder worden en amyloïdpathologie

Deze video-artikel beschrijft experimentele procedures om langetermijnplasticiteit en de daarmee geassocieerde processen zoals synaptische tagging, capture en cross-tagging in de CA1-piramideneuronen te bestuderen met behulp van acute hippocampus-sneden van knaagdieren.

Onderzoek van Synaptic Tagging / Capture en Cross-capture met Acute hippocampus Plakjes van Knaagdieren

Dit protocol laat zien op de uitvoering van een geoptimaliseerde N-methyl-D-glucamine (NMDG) beschermende herstelmethode van hersenen segment voorbereiding. Een formulering van één medium wordt gebruikt om op betrouwbare wijze het verkrijgen van gezonde hersenen segmenten van dieren van alle leeftijden en voor diverse experimentele toepassingen.

Voorbereiding van Acute hersenen segmenten met behulp van een geoptimaliseerde N-Methyl-D-glucamine beschermende herstelmethode

Dit protocol beschrijft de stabilisatie van het zuurstofgehalte in een klein volume van gerecycled buffer en methodologische aspecten van de opname van de activiteit-afhankelijke synaptische plasticiteit in verzonken acute hippocampal plakjes.

Synaptische plasticiteit opnemen in Acute Hippocampal plakjes onderhouden in een kleine volumes Recycling-, perfusie-, en onderdompeling-type kamer systeem

We gebruikten opname-en stimulatie elektroden in longitudinale hippocampal hersen schijfjes en longitudinaal geplaatste opname-en stimulatie elektroden in de rugzijde Hippocampus in vivo om extracellulaire postsynaptische potentialen aan te roepen en te demonstreren op lange termijn synaptische plasticiteit langs de longitudinale interlamellar CA1.

Onderzoek op lange termijn synaptische plasticiteit in Interlamellar Hippocampus CA1 door elektrofysiologische veld opname

Het gepresenteerde protocol beschrijft het transport en de voorbereiding van resected menselijk hippocampal weefsel met het uiteindelijke doel om vitale hersenenplakjes te gebruiken als een preklinische evaluatie tool voor potentiële anti-epileptica.

Voorbereiding van acute menselijke hippocampal slices voor elektrofysiologische opnames

Dit is een protocol voor acute slice voorbereiding van volwassen en veroudering muis hippocampi die gebruik maakt van transcardiale perfusie en slice snijden met ijskoude NMDG-aCSF om hypoxische schade aan het weefsel te verminderen. De resulterende plakjes blijven gedurende vele uren gezond en zijn geschikt voor langdurige patch-clamp en field-recordings.

Het minimaliseren van Hypoxie in Hippocampal Slices van volwassen en oudere muizen

Dit protocol beschrijft de voorbereiding van horizontale hippocampal-entorhinal cortex (HEC) plakjes van muizen die spontane scherpe golf rimpelactiviteit vertonen. Plakjes worden geïncubeerd in een vereenvoudigde interface-holdingkamer en opnames worden uitgevoerd onder ondergedompelde omstandigheden met snelstromende kunstmatige cerebrospinale vloeistof om weefsel oxygenatie en de spontane opkomst van activiteit op netwerkniveau te bevorderen.

Acute muis hersenen snijden om spontane Hippocampal Netwerk activiteit te onderzoeken

Dit artikel is bedoeld om een systematisch protocol te beschrijven om horizontale hippocampale hersenplakken bij muizen te verkrijgen. Het doel van deze methodologie is om de integriteit van hippocampale vezelroutes te behouden, zoals het perforantpad en het bemoste vezelkanaal om deukende gyrusgerelateerde neurologische processen te beoordelen.

Horizontale Hippocampal Plakjes van de Hersenen van de Muis

We presenteren een protocol om acute plakjes te bereiden van de dorsaal-intermediaire hippocampus van muizen. We vergelijken dit transversale preparaat met coronale snijden in termen van kwaliteit van opnames en behoud van morfologische kenmerken van opgenomen neuronen.

Voorbereiding van acute plakjes van Dorsale Hippocampus voor hele celopname en neuronale reconstructie in de dentaat gyrus van volwassen muizen

Leer hoe je stabiele en reproduceerbare langdurige potentiatie opneemt in acute hippocampus-sneden van muizen. Dit protocol optimaliseert zuurstofvoorziening en temperatuur voor betrouwbare elektrofysiologische metingen.

Betere voorbereiding en Conservering van hippocampus Mouse Slices voor een zeer stabiele en reproduceerbare opname van langlopende Potentiëring (Video) | JoVE Journal

Betere voorbereiding en Conservering van hippocampus Mouse Slices voor een zeer stabiele en reproduceerbare opname van langlopende Potentiëring

Meer video's verkennen