Name: Intravitale Microscopie van de microcirculatie in de Muis cremasterspier voor de Analyse van de perifere stamcelmigratie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Leer intravitale microscopie van de microcirculatie in de muis cremasterspier voor analyse van perifere stamcelmigratie. Deze methode visualiseert stamcel-endotheelinteracties in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het gehele protocol na celisolatie duurt ongeveer 2 uur. 1. Microchirurgische Voorbereiding <ol><li> Voer stamcelisolatie van de donor beenmerg en fluorescente labeling van de geïsoleerde subpopulatie volgens gestandaardiseerde protocollen 9,12 Laat cellen rusten gedurende de tijd het dier wordt uitgevoerd. Voor fluorescentielabelling raden wij CFDA (carboxyfluoresceïne diacetaat succinimidylester). </li><li> Verdoven mannelijke muizen gewicht van 20-25 g met ketamine (75 mg / kg) en xylazine (2,5 mg / kg). Gedurende de chirurgische procedures en experimentele protocollen moeten anesthesie gehandhaafd door supplementen (10% van de eerste injectie, ip) indien nodig (gewoonlijk 30-60 minuten). </li><li> Scheer voorzichtig de voorste aspect van de juiste scrotum evenals de rechterdij en lies. Verzamel alle haren te verliezen met een vochtig wattenstaafje. Plaats de muis ventrale zijde naar boven op een plexiglas waarneemplatform en bevestig de vergoedingt gebruik van elastische draperen. Het podium is op maat gemaakt, bestaande uit een basisplaat en een tweede plaat aan de caudale rand van de bodemplaat voor verheffing van beide benen en het scrotum. Plaats het toneel een verwarmingselement om de lichaamstemperatuur te handhaven op 37 ° C. Na fixatie op het podium, plaats het dier onder een operatie microscoop en de volgende bewerking uit stappen met 10 - tot 16-voudige vergroting. </li><li> Maak de eerste incisie met behulp van huid schaar op de rechterdij, net anterior van de femorale schepen vanaf de knie tot aan de lies. </li><li> Identificeer de femorale slagader en volg het proximaal, het mobiliseren van de slagader van de omliggende weke delen. Identificeer en snijd een grote tak naar de linker testikel behulp thermocautery. Daarna plaatst u een verblijf hechtdraad oppervlakkig op de linker testikel. Gentle tractie zal vergemakkelijken verdere proximale mobilisatie van de slagader. </li><li> Na voltooiing van de proximale mobilisatie, identificeren en snijd een grote tak loopt medially in de dij door thermocautery. Daarna ligeren de femorale slagader in het distale gedeelte van de rechter dij. Gentle tractie op de ligatuur zal verdere voorbereiding helpen. </li><li> Draai aandacht nu het proximale femorale slagader opnieuw en plaats een hechtdraad rondom de arterie zo proximaal mogelijk. Bereid een knoop maar nog niet bind het naar beneden. Pas lichte tractie aan de hechtdraad en creëren een slagaderlijke knikken. </li><li> Na vaststelling van de knikken, incisie de slagader wordt voorzichtig met een microscissor. Wees extra voorzichtig de lies niet te beschadigen. </li><li> Plaats een voorbereide microcatheter (inwendige diameter 0,28 mm) via de incisie. De katheter moet deaired (0,9% natriumchloride, NaCl) en aangesloten op een 1 ml injectiespuit voor insertie. </li><li> Na succesvol inbrengen van de katheter, maak de capsule knikken om doorgang van de katheter vergemakkelijken. Arteriële bloedstroom moet onmiddellijk zichtbaar zijn binnen de katheter. Zachtjes vooraf de katheter een paar millimeters dan de vorige knikken. Daarna vastbinden het voorbereid rietbinder voor fixatie van de katheter. </li><li> Voorzichtig Spoel de katheter (0,9% NaCl) en zuig de juiste positie te bevestigen. Gebruik een stuk tape om de katheter verder te verzekeren om de bewerking fase. </li><li> Na adequate fixatie, zet de katheter opzij voor de volgende voorbereidende stappen van de cremasterspier. Solliciteer regelmatig spoelen en aspiratie van de katheter om de 5-10 minuten om stolselvorming te voorkomen. </li><li> Draai de aandacht nu naar rechts scrotum en maak een insnijding door het snijden van de huid en fascia boven de ventrale aspect van de juiste scrotum. Verzorgen het onderliggende weefsel niet aan te raken met alle instrumenten. </li><li> Verleng de incisie tot de lies vouw en caudaal naar het distale uiteinde van het scrotum. </li><li> Zorgvuldig aparte onderliggende zacht en bindweefsel boven de cremaster zak, zonder aan te raken. Identificeer het distale uiteinde van de cremaster en plaats hier een verblijf hechtdraad SLightly breiden de spier. Resect nu resterende zacht weefsel onder de spier zak door voorzichtig aan de spier caudaal en ventraal. </li><li> Na volledige scheiding van bindweefsel, opent de cremaster zak op een punt van de craniale rand met een schaar. Verleng de incisie van deze opening naar het distale uiteinde van de spier. </li><li> Dicht de kleine schip aansluiten van de testikel en de cremaster behulp thermocautery, daarna snijd de resterende verbindingen tussen de spieren en de testikel met een schaar. </li><li> Afleggen van de testikel, uit het veld microscopie. </li><li> De geopende cremaster ligt nu plat op het podium. Plaats vier 6-0 Prolene hechtingen verblijf aan de randen van het weefsel en bevestig ze met elastische laken om de cremasterspier weefsel verspreid. Vanaf nu continu bevochtigen van het weefsel met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met een 1 ml injectiespuit (figuur 1). </li><li> Laat nu de voorbereiding om te rusten gedurende 15 minuten. Daarna injecteren0,05-0,1 ml van 1% Rhodamine-dextran via de linker dijslagader voor contrast verbetering van de microvasculatuur. Als een chemokines of inflammatoire middelen zijn gepland voor de toepassing, moet u nu lokaal bevochtig de spier met de respectieve reagens met een injectiespuit 1 ml. Bij een controle-experiment, verder bevochtigen met PBS. </li></ol> 2. Intravitale Microscopie <ol><li> Houd de aan de operatie tijdstip vastgesteld muis en bewegen onder een fluorescentiemicroscoop aangepast voor epi-verlichting en verbonden met een CCD (ladingsgekoppelde inrichting) videocamera. Wees extra voorzichtig het dijbeenslagader katheter niet te ontwrichten. </li><li> Voeren experimenten met behulp van een water immersie objectief. </li><li> Na het aanpassen van de doelstelling voor voldoende visualisatie van de cremaster microcirculatie en vóór celinjectie, stochastisch definiëren zes postcapillaire venules voor latere analyse van de firma stamcel therapietrouw. </li><li> Dien-fluorescent gelabelde stamcellen,opgelost in 200 pl PBS, 0,4 x 10 6 cellen per injectie met een totaal van vijf opeenvolgende injecties met behulp van de femorale slagader katheter en een 1 ml spuit. Zwenk de celmonster vóór de eerste injectie. </li><li> Record stamcellen direct rollen na celinjectie, waardoor definitie van &quot;rollen&quot; een vermindering van meer dan 50% van de mobiele snelheid langs de endotheliale bekleding in combinatie met typische cellulaire &quot;stick release&quot; bewegingen. Voer het tellen van het rollend stamcellen en alle stamcellen passeren van een vooraf gedefinieerde venular afstand gedurende 1 min van waarneming na elke injectie. De hoeveelheid stamcellen walsen wordt uitgedrukt als percentage van alle passerende cellen. Niet cellen tellen vertonen willekeurige kort tethering verschijnselen als rollende cellen. </li><li> Na de laatste injectie cel bepalen aantal stevig hechtende stamcellen tellen en voor de hoeveelheid ten opzichte van de berekende endotheliale oppervlak van ee zes voorgedefinieerde venulen (diameter x lengte x π) als hechtende cellen / mm 2. Stevige adhesie wordt beschouwd als er geen celbeweging detecteerbaar gedurende 30 sec. </li><li> Na voltooiing van de microscopie intravitale verwijder voorzichtig de cremasterspier en opslaan in correspondentie met latere analyse (immunohistochemie of moleculaire biologie). Offer het dier door cervicale dislocatie. De analyse van intravitale microscopie opnames voor kwantificering van stamcellen walsen en stevig endotheliale adhesie, en microvasculaire hemodynamica, zoals rode bloedcellen snelheid (mm / s), scheepslengte (urn), diameter vat (urn), wand aandeel koers (sec -1); moet offline worden uitgevoerd door een onderzoeker geblindeerd aan de respectieve experimentele weefsel behandeling gebruik te maken van een image processing software. </li></ol>

<ol><li>Madlambayan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+stem+and+progenitor+cell+contribution+to+neovasculogenesis+is+dependent+on+model+system+with+SDF-1+as+a+permissive+trigger%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger.</a> Blood. 114, 4310-4319 (2009).</li>
<li>Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+stem+cells+find+their+way+home%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">How do stem cells find their way home?</a> Blood. 106, 1901-1910 (2005).</li>
<li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).</li>
<li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research%3A+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li>
<li>Leister, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peritoneal+cavity+chamber+for+intravital+microscopy+of+the+liver+under+conditions+of+pneumoperitoneum%5BTitle%5D)+AND+%22Surg.+Endosc%22%5BJournal%5D)">A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum.</a> Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).</li>
<li>Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+bone+marrow-derived+mast+cells+roll+on+P-selectin+under+conditions+of+flow+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo.</a> Lab Invest. 74, 634-643 (1996).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> J. Vis. Exp. , e2874(2011).</li>
<li>Kaminski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+NOS+is+required+for+SDF-1alpha%2FCXCR4-mediated+peripheral+endothelial+adhesion+of+c-kit%2B+bone+marrow+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells.</a> Lab Invest. 88, 58-69 (2008).</li>
<li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGB-1+induces+c-kit%2B+cell+microvascular+rolling+and+adhesion+via+both+toll-like+receptor-2+and+toll-like+receptor-4+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells.</a> J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).</li>
<li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+intravascular+administration+of+mesenchymal+stem+cells+safe%3F+Mesenchymal+stem+cells+and+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy.</a> Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).</li>
<li>Donndorf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+migratory+properties+of+human+CD+133%28%2B%29+stem+cells+in+vivo+after+intraoperative+sternal+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li>
</ol>

Alle dierproeven, uitgevoerd voor dit manuscript zijn goedgekeurd door de lokale Animal Care en gebruik Comite. De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

<html> Intravitale fluorescentiemicroscopie maakt directe visualisatie en kwantitatieve analyse van stamcel-endotheel interacties. De cremasterspier model is bijzonder bruikbaar, omdat blootstelling en microchirurgische technieken intravitaal visualisatie zijn goed vastgesteld tijdens het onderzoek leukocyt-endotheel interacties en diverse chemische componenten kunnen door eenvoudige superfusieapparaat techniek selectief worden toegepast op het doelweefsel. Door de afwezigheid van bewegingsartefacten en ernstige beeldrui...

Het doel van dit artikel is om de techniek van het opklaren (IVM) toegepast op de muis cremaster microcirculatie voor directe observatie en analyse van perifere beenmerg stamcelmigratie beschrijven. Het huidige concept van de stamcel gebaseerde weefsel en orgaan regeneratie betreft de homing van beenmerg afgeleide stamcellen naar het beschadigde weefsel 1. Een cruciale stap voor een succesvolle stamcelmigratie bevat stamcellen interactie met de lokale endotheel binnen de benadeelde orgel gevolgd door transendotheliale migratie en uiteindelijk orgel innesteling 2. Intravitale analyse van deze stamcellen - endotheelcelinteracties een ideaal parameter voor de kwantificering van een stamcel gebaseerde regeneratieve respons in verschillende pathofysiologische instellingen in vivo. Verder lijkt denkbaar dat in de toekomst intravitale analyse van het trekkende capaciteit specifieke stamcellen populations binnen gestandaardiseerde microcirculatie omgevingen, kunnen worden aangebracht voor het bevorderen van deze populaties aan verdere klinische testen. Intravitale microscopie werd oorspronkelijk ontwikkeld voor waarneming en kwantificering van leukocyt-endotheelcel interacties in vivo in het gebied van inflammatoire onderzoek 3. Eerste succesvolle opnames van intravitale microscopie studies werden gemeld door Cohnheim reeds in de 19e eeuw, het bestuderen van tongen en mesenteria kikkers &#39;onder een lichtmicroscoop 4. Sinds zijn eerste gebruik IVM een enorme technische ontwikkeling en vandaag heeft ondergaan bepaalde essentiële componenten vormen voorwaarden om kwantitatieve IVM voeren: (i) weefsel preparaten die optische toegang mogelijk maken, (ii) moleculaire probes die kunnen worden gedetecteerd door een microscoop, (iii ) een microscoop gekoppeld aan een detectiesysteem en (iv) computer gebaseerde analysesystemen die parameters plaats kan halen uit de beelddataset 4. Een verscheidenheid van weefsel voorbereidingen is geïntroduceerd voor IVM studies waaronder de mesenteria en de lever van de muis en rat 5, de dorsale huidplooi kamers van muis 6 en hamster, het konijn oor en de hamster wang zakje een paar te noemen. In het volgende zullen we ons richten op de muis cremasterspier, wat een ideale weefsel voor intravitale observaties, als voorbereiding en visualisatie mogelijk door een goed gestandaardiseerde chirurgische ingreep, en in het algemeen geen problemen van bewegingsartefacten optreden. De open cremasterspier voorbereiding werd voor het eerst in de jaren 1970 gedragen door Baez en collega 7. Oorspronkelijk beschreven voor ratten, is het succes vastgesteld ook de muis 8. Na eerdere studies vooral was gericht op leukocyten interacties met de vaatwand, onze eigen groep onlangs de muis cremasterspier preparaat als waardenoriëntaties geïntroduceerdlijk hulpmiddel voor directe visualisatie en kwantitatieve analyse van stamcel-endotheel interacties binnen een gedefinieerde micro 9. Verschillende stamcel subpopulaties bestudeerd gebruikmaking dit model, zoals muizen c-kit + beenmerg stamcellen en mesenchymale stamcellen, alsook menselijke CD 133 + beenmergstamcellen 10-12. Na celisolatie van donor beenmerg en fluorescentielabelling voor visualisatie, worden de stamcellen selectief toegepast in de cremaster microcirculatie met behulp van een arteriële injectie via de slagader, waardoor elke cel beknelling binnen op afstand organen vermijden. Bovendien is de cremasterspier model is vooral handig omdat verschillende chemokines mogelijk bemiddelen lokale stamcelmigratie binnen de respectieve instellingen, kunnen worden plaatselijk door eenvoudige superfusie techniek toegepast op het te onderzoeken weefsel.

<table><tbody><tr><td>Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine 6 G (1%)</td><td>Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td><td>83697</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin (Ketanest)</td><td>Pfizer, Berlin, Germany</td><td>niet beschikbaar</td><td></td></tr><tr><td>Xylacin (Rompun)</td><td>Bayer, Leverkusen, Germany</td><td>niet beschikbaar</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate - gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>PAN Biotech, Aidenbach, Germany</td><td>P04-36500</td><td></td></tr></tbody></table>

intravitale microscopie van de microcirculatie in de muis cremasterspier voor de analyse van de perifere stamcelmigratie

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In het tijdperk van intravasculaire celtoepassing protocollen in het kader van regeneratieve celtherapie, de onderliggende mechanismen van stamcellen migratie naar weefsel nonmarrow zijn nog niet volledig opgehelderd. We beschrijven hier de techniek van intravitale microscopie toegepast op de muis cremaster microcirculatie voor analyse van perifere beenmerg stamcellen migratie in vivo. Intravitale microscopie van M. cremaster eerder geïntroduceerd in het gebied van inflammatoire onderzoek voor directe waarneming van leukocyten interactie met het vasculaire endotheel. Aangezien voldoende perifere stamcellen en celmigratie omvat Vertaald eerste stappen van rollend en stevige adhesie aan de endotheliale voering is het denkbaar de M. cremaster model toe te passen voor waarneming en kwantificering van de interactie van intravasculary toegediende stamcellen met het endotheel. Diverse chemische componenten selectief kan worden toegepast op het doel tafgifte door eenvoudige superfusie technieken is het mogelijk om essentiële microenvironmental randvoorwaarden vast te stellen, voor de eerste stamcelrekrutering plaatsvinden in een levend organisme buiten het beenmerg.

In het algemeen, interactie van direct ingespoten stamcellen of voorlopercellen met het vasculair endotheel binnen de cremasterspier microcirculatie is een zeldzame gebeurtenis en komt uitsluitend in postcapillaire venulen (diameter: 30-80 pm). Door fluorescentie labeling rollen en stevig hechtende stamcellen duidelijk meetbaar zijn gescheiden van endogene circulerende leukocyten van de waargenomen venulen (figuur 2). De microcirculatie voorwaarden voorgesteld door de snelhe...

Intravitale microscopie van de muis M. cremaster microcirculatie biedt een unieke en goed gestandaardiseerd in vivo model voor de analyse van perifere beenmerg stamcellen migratie.

Intravitale Microscopie van de microcirculatie in de Muis cremasterspier voor de Analyse van de perifere stamcelmigratie

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Het algemene doel van deze procedure is om interacties tussen stamcellen en endotheelcellen in vivo te visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst een katheter in de arteria femoralis in te brengen bij een gesedeerd dier voor intra-arteriële toegang. Tijdens de tweede stap wordt de skeletspier chirurgisch voorbereid voor intravitale fluorescentiemicroscopie.Vervolgens wordt de betreffende stamcelpopulatie geïnjecteerd via de katheter in de arteria femoralis. Uiteindelijk kunnen de interacties tussen de adoptief overgedragen stamcellen en het endotheel van de microcirculatie van de hoofdspier worden gevisualiseerd en gekwantificeerd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de regeneratieve geneeskunde, zoals de vraag hoe de migratie van therapeutisch toegepaste stamcellen binnen een levend organisme wordt gereguleerd?Voordat de microchirurgie wordt gestart, wordt een katheter aangesloten op een spuit van 1 milliliter met 0,9% natriumchloride. Scheer vervolgens voorzichtig de voorzijde van het rechter scrotum, evenals de rechterdij en de lies van een geanestheseerde mannelijke muis van 20 tot 25 milligram. Verzamel alle losse haren met een bevochtige wattenstaaf en plaats de muis vervolgens met de buikzijde naar boven op een op maat gemaakte kijktafel van plexiglas, bestaande uit een basisplaat en een tweede plaat aan de zijkant van de basisplaat voor het omhoogheffen van zowel de achterpoten als het scrotum.Nadat de poten met een elastisch doek zijn vastgezet, plaatst u de tafel op een warmteplat om de lichaamstemperatuur van het dier op 37 °C te houden. Gebruik vervolgens een dissectiemicroscoop met een 10- tot 16-voudige vergroting en een schaar om een initiële incisie te maken bij het rechterdijbeen, net anterior van de femorale vaten, vanaf de knie tot de lies. Identificeer de arteria femoralis en volg deze proximaal, waarbij u de arterie mobiliseert uit het omringende zachte weefsel.Identificeer vervolgens met behulp van thermocauterisatie een grote arteriële tak die naar de linker睾丸 leidt en klem deze door te doorsnijden. Plaats een oppervlakkige 6-0 Prolene-hechtnaad ter fixatie bij de linker睾丸. Identificeer daarna de grote arteriële tak die mediaal in het dijbeen loopt en cauteriseer deze thermisch.Pas vervolgens voorzichtig tractie toe, ligeer de arteria femoralis aan het distale deel van de rechterdij en plaats daarna een hechting rond de proximale arteria femoralis zo dicht mogelijk bij het centrum van het dier. Plaats nu een losse knoop rond de arteria femoralis, maar trek deze nog niet aan. Oefen vervolgens een lichte tractie uit op de hechting om een knik in de arterie te veroorzaken.Nadat de knik is aangebracht, wordt de arterie zorgvuldig op maat gebracht met een microschaar, waarbij speciale aandacht wordt besteed om beschadiging van de vena femoralis te voorkomen. Plaats vervolgens de eerder voorbereide microkatheter in de incisie. Maak de knik voorzichtig los om de passage van de katheter te vergemakkelijken.De arteriële bloedstroom moet onmiddellijk zichtbaar zijn in de katheter. Schuif de katheter langzaam enkele millimeters voorbij de vorige knik. Knoop vervolgens de voorbereide ligatuur vast voor de fixatie van de katheter.Spoel de katheter nu voorzichtig door met het natriumchloride en aspireer vervolgens de oplossing om de correcte positie van de katheter te bevestigen. Gebruik een stuk plakband om de katheter verder op de operatietafel te bevestigen. Nadat de katheter adequaat is gefixeerd en opzij is geschoven, wordt de huid en fascie boven het ventrale aspect van het rechter scrotum ingesneden.Zorg ervoor dat het onderliggende weefsel niet met instrumenten wordt aangeraakt. Breid de incisie uit tot aan de liesplooi en voorzichtig tot aan het distale uiteinde van het scrotum. Scheid vervolgens voorzichtig de onderliggende zachte weefsels en het bindweefsel boven de zak van de m. cremaster, zonder het weefsel zelf aan te raken.Plaats vervolgens een 6-0 prolene hechtingsdraad aan het distale uiteinde van de musculus cremaster om de spier licht te rekken. Trek daarna de spier voorzichtig caudaal en anterieur om het resterende weke weefsel onder de cremasterzak te resecteren. Nadat de volledige scheiding van het bindweefsel is voltooid, wordt een schaar gebruikt om de cremasterzak bij de craniale rand te openen en de incisie vanuit deze opening naar het distale uiteinde van de spier uit te breiden.Nadat het kleine bloedvat dat de testikel met de cremaster verbindt thermisch is gecauteriseerd, worden de overige verbindingen tussen de spier en de testikel met een schaar doorgesneden. De geopende cremaster ligt nu plat op de objecttafel. Plaats vervolgens vier 6-0 Prolene-hechtingsdraden aan de randen van het weefsel en fixeer deze met het elastische drape.Om het weefsel van de m. cremaster vanaf dit punt uitgespreid te houden, gebruikt u een syringe van 1 milliliter om het weefsel continu te bevochtigen met PBS. Laat de preparatie 15 minuten rusten en injecteer vervolgens 0,05 tot 0,1 milliliter 1% rodine-dextrine via de linker arteria femoralis voor contrastverbetering van de microvasculatuur. Plaats nu de muis en de objecttafel onder een charge-coupled device.Videocamera-gekoppelde fluorescentiemicroscoop, aangepast voor epi-illuminatie, waarbij speciale zorg wordt besteed om de catheter van de arteria femoralis niet te verschuiven. Na het afstellen van het waterimmersie-objectief voor voldoende visualisatie van de chma-microcirculatie worden stochastisch zes postcapillaire ES gedefinieerd voor latere analyse van de stevige adhesie van stamcellen. Vul vervolgens een spuit van 1 milliliter met 200 µL van de eerder gelabelde fluorescente donorbeenmergstamcellen.Tik voorzichtig tegen de spuit om de celzuivering te resuspenderen en dien de cellen vervolgens toe via de femorale katheter in injecties van 40 µL, voor een totaal van vijf opeenvolgende injecties. Registreer het rollen van de stamcellen onmiddellijk na de celinjectie. Definieer rollen als een reductie van meer dan 50% van de celsnelheid langs de endotheliale wand in combinatie met de typische hecht- en loslaatbewegingen van de cel.Na voltooiing van de intravitale microscopie wordt de m. cremaster zorgvuldig verwijderd en bewaard voor latere analyse. Over het algemeen is de interactie van direct geïnjecteerde stam- of progenitorcellen met het vasculaire endotheel binnen de microcirculatie van de m. cremaster een zeldzame gebeurtenis en vindt deze, dankzij de fluorescerende markering, uitsluitend plaats in de postcapillaire beetjes. De rollende cellen, aangegeven door de zwarte pijl, en de stevig hechtende stamcellen, aangegeven door de witte pijlen, kunnen duidelijk worden onderscheiden van de circulerende endogene leukocyten in de beetjes.De microcirculatoire omstandigheden, gerepresenteerd door de bloedstroomsnelheid en de wandafschuifsnelheid, verschillen doorgaans niet significant tussen de betreffende experimentele groepen met verschillende chemokinebehandelingen. Lokale behandeling van het ker master spierweefsel met verschillende chemokines of mediatoren van de ontstekingsrespons. Bijvoorbeeld, stromal cell derived factor one alpha of tumor necrosis factor alpha is in staat om specifieke micro-omgevingscondities na te bootsen.Dergelijke omstandigheden versterken de interacties tussen stamcellen en endotheelcellen in verschillende mate, afhankelijk van het toegepaste specifieke chemokine of mediator en de geïnjecteerde stamcelpopulatie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe stamcel- en athecelinteracties in vivo kunnen worden gevisualiseerd via intravitale microscopie van de CreER-spiermicrocirculatie.

intravital-microscopy-microcirculation-mouse-cremaster-muscle-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een nieuwe veelzijdige methode voor het observeren van de microcirculatie wordt gepresenteerd. Het wordt beschouwd als geschikt voor waarneming op lange termijn, en voor de combinatie met pharmacophysiological of moleculaire biologische interventies.

In vivo micro-circulatie meting in de skeletspier door Intra-vitale Microscopie

Intravitale microscopie om temporele en ruimtelijke hemodynamische en inflammatoire gebeurtenissen in de pial microcirculatie te volgen.

Intravitale Microscopie van de hersenen van muizen microcirculatie met behulp van een gesloten Cranial Window

Een weefsel voorbereiding is beschreven voor visualisatie en experimentele manipulatie van de levende microcirculatie. In verdoofde mannelijke muizen, is de dunne, zeer goed doorbloede cremaster spier voorbereid intravitale microscopie tot microvasculaire netwerken, inclusief arteriolen, capillairen en venulen studie. Dit preparaat wordt gemakkelijk aangepast voor ratten en hamsters.

De muis Cremaster Muscle Voorbereiding voor intravitale Imaging van de microcirculatie

Microiontophoresis betekent verplaatsing van ionen uit een micropipet in reactie op een verschil in elektrische potentiaal tussen de binnen-en buitenkant van de micropipet. Biologisch actieve moleculen worden daarbij geleverd in verhouding tot elektrische stroom. We illustreren acetylcholine microiontophoresis in combinatie met micromanipulatie tot endotheel-afhankelijke vasodilatatie studie in de microcirculatie.

Microiontophoresis en Micromanipulatie voor intravitale Fluorescentie Imaging van de microcirculatie

Beschrijven we een protocol van helderveld intravitale microscopie voor het meten van dynamische neutrofiel-endotheliale cel interacties tijdens neutrofielen werving in reactie op de bron van een neutrofiel chemoattractant in vivo. Neutrofiele intraluminale kruipen, transendotheliale migratie en chemotaxis in de muis cremaster spierweefsel worden gevisualiseerd met een time-vervallen video fotografie en gevolgd met ImageJ.

Tracking neutrofielen intraluminale Crawling, transendotheliale migratie en chemotaxis in weefsel door intravitale Video Microscopie

Digitale intravitale epifluorescentie microscopie van postcapillaire venulen in de cremasteric microcirculatie is een handige methode om inzicht te krijgen in leukocyten-endotheliale...

Real-time Digital Imaging van leukocyt-endotheliale Interactie in ischemie-reperfusie schade (IRI) van de Rat cremasterspier

Hier beschrijven we een experimentele techniek van fluorescentie intravitale microscopie heterotypische bloedplaatjes interacties op de neutrofiel geactiveerd endotheel visualiseren tijdens vasculaire inflammatie en trombose in levende muizen. Deze microscopische techniek waardevol zal zijn voor het moleculaire mechanisme van vasculaire ziekte te bestuderen en farmacologische middelen testen onder pathofysiologische omstandigheden.

Real-time beeldvorming van heterotypische Bloedplaatjes-neutrofiele Interacties op het geactiveerd endotheel tijdens vasculaire ontsteking en trombose in Live Muizen

Deze vereenvoudigde toepassing van intravitale microscopie van mesenterische aderen bij muizen kan worden gebruikt in verschillende ontstekingsmodellen om leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukemie-interacties te observeren.

Intravitale Microscopie van leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukocyten Interactions in mesenteriale Veins in Muizen

Monocyten zijn belangrijke bemiddelaars/mediators van arteriogenesis in het kader van perifere arteriële ziekte. Met behulp van een kelder membraan-achtige matrix en intravital microscopie, onderzoekt dit protocol monocyt homing en tumor-gerelateerde angiogenese na monocyt injectie in de femorale slagader afbinding lymfkliertest model.

Intravital microscopie van monocyt Homing en Tumor-gerelateerde angiogenese in een lymfkliertest Model van perifere arteriële ziekte

Hier laten we zien hoe je intravitale microscopie uitvoert op postcapillaire venules van de muiscremaster spier. Vaak toegepast op verschillende modellen van ontsteking en sepsis, met name die veroorzaakt door chemokines en cytokines, benadrukken we de relevantie ervan in de studie van muscolopathies waarbij overdreven gespierde leukocyten infiltratie.

Leukocyten infiltratie van Cremaster Spier in muizen beoordeeld door Intravital Microscopie

De rekrutering van leukocyten en bloedplaatjes vormt een essentieel onderdeel dat nodig is voor de effectieve groei van collaterale slagaders tijdens arteriogenese. Multifotonenmicroscopie is een efficiënt hulpmiddel voor het volgen van celdynamica met een hoge spatio-temporele resolutie in vivo en minder fototoxiciteit om leukocytenrekrutering en extravasatie tijdens arteriogenese te bestuderen.

Multifoton intravitale beeldvorming voor het monitoren van leukocytenrekrutering tijdens arteriogenese in een Murine Hindlimb-model

Leer intravitale microscopie van de microcirculatie in de muis cremasterspier voor analyse van perifere stamcelmigratie. Deze methode visualiseert stamcel-endotheelinteracties in vivo.

Intravitale Microscopie van de microcirculatie in de Muis cremasterspier voor de Analyse van de perifere stamcelmigratie

Meer video's verkennen