Intravitale Microscopie van de microcirculatie in de Muis cremasterspier voor de Analyse van de perifere stamcelmigratie
5 november 2013
Intravitale microscopie van de muis M. cremaster microcirculatie biedt een unieke en goed gestandaardiseerd in vivo model voor de analyse van perifere beenmerg stamcellen migratie.
Het algemene doel van deze procedure is om interacties tussen stamcellen en endotheelcellen in vivo te visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst een femorale arteriële katheter in een sedatieerde dier te introduceren voor intra-arteriële toegang. Tijdens de tweede stap wordt de chroom spier chirurgisch voorbereid voor intravitale fluorescentiemicroscopie.
Vervolgens wordt de belangrijkste stamcelpopulatie geïnjecteerd via de femorale arteriële katheter. Uiteindelijk kunnen de interacties tussen de adoptief overgedragen stamcellen en het endotheel van de hoofdspiermicrocirculatie worden gevisualiseerd en gekwantificeerd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van regeneratieve geneeskunde, zoals hoe de migratie van therapeutisch toegepaste stamcellen wordt gereguleerd binnen een levend organisme?
Voordat de microchirurgie begint, verbindt D air een katheter aan een ene milliliter spuit met 0,9% natriumchloride. Scheer dan voorzichtig de voorkant van het rechter scrotum, evenals de rechter dij en lies van een 20 tot 25 milligram anesthetische mannelijke muis. Verzamel al het losse haar met een vochtige wattenstaaf en plaats de muis vervolgens met de buik naar boven op een plexiglas, op maat gemaakte kijkfase bestaande uit een basisplaat en een tweede plaat aan de rand van de basisplaat voor het verhogen van beide achterpoten en het scrotum.
Na het fixeren van de voeten met een elastische doek, plaats de fase op een verwarmingspad om de lichaamstemperatuur van het dier op 37 graden Celsius te houden. Gebruik vervolgens met een 10 tot 16 voudige vergroting een dissectiemicroscoop en een paar schaar om een eerste incisie te maken in de rechter dij, net voor de femorale vaten van het knie tot de lies. Identificeer de femorale arterie en volg deze proximaal, mobieliseer de arterie van het omliggende zachte weefsel.
Gebruik vervolgens thermocauterisatie om een grote arteriële tak te identificeren die naar de linker testikel leidt. Plaats een zes oh proleen blijvende hechting oppervlakkig aan de linker testikel. Identificeer vervolgens en thermo cauteriseer de grote arteriële tak die mediaal langs de dij loopt.
Gebruik vervolgens met zachte tractie de femorale arterie aan het distale deel van de rechter dij en plaats vervolgens een hechting rond de proximale femorale arterie zo dicht mogelijk bij het centrum van het dier. Plaats nu een losse knoop rond de femorale arterie, maar knoop deze niet vast. Breng vervolgens zachte tractie aan op de hechting om een arteriële kinking te creëren.
Na het vaststellen van de kinking, gebruik een paar micro schaar om voorzichtig de arterie te vergroten, let vooral op om de femorale ader niet te beschadigen. Plaats vervolgens de eerder voorbereide microkatheter in de incisie. Verwijder voorzichtig de kinking om de passage van de katheter te vergemakkelijken.
Arteriële bloedstroom zou onmiddellijk zichtbaar moeten zijn in de katheter. Breng de katheter langzaam een paar millimeter voorbij de vorige kinking. Bind vervolgens de voorbereide ligatuur vast voor de bevestiging van de katheter.
Spoel nu voorzichtig de katheter door met de natriumchloride en aspireer vervolgens de oplossing om de juiste positie van de katheter te bevestigen. Gebruik een stukje tape om de katheter verder op de operatiefase te bevestigen. Nadat de katheter voldoende is bevestigd en opzij is geplaatst, snijd de huid en fascia boven het ventrale aspect van het rechter scrotum.
Zorg ervoor dat u het onderliggende weefsel niet aanraakt met enig instrument. Verleng de incisie tot de inguinale vouw en houd het naar het distale uiteinde van het scrotum. Scheid vervolgens voorzichtig de onderliggende zachte en bindweefsels boven de cremasterzak zonder het weefsel zelf aan te raken.
Plaats vervolgens een zes oh proleen blijvende hechting aan het distale uiteinde van de cremaster om de spier lichtjes te verlengen. Trek vervolgens voorzichtig de spier naar achteren en voorwaarts om het resterende zachte weefsel onder de spierzak te reseceren. Na de volledige scheiding van het bindweefsel, gebruik een paar schaar om de C masterzak aan de craniale rand te openen en de incisie vanaf deze opening naar het distale uiteinde van de spier uit te breiden.
Na het thermisch cauteriseren van het kleine vat dat de testikel op de cremaster verbindt, gebruik schaar om de resterende verbindingen tussen de spier en de testikel door te snijden. De geopende cremaster zal nu plat op de fase liggen. Plaats nu vier zes oh proleen blijvende hechtingen aan de randen van het weefsel en bevestig ze met de elastische doek.
Gebruik een ene milliliter spuit om het cremaster spierweefsel vanaf dit punt continu te bevochtigen met PBS. Nadat de voorbereiding 15 minuten heeft gerust, injecteer 0,05 tot 0,1 milliliter 1% rodine dextrine via de linker femorale arterie voor contrastversterking van de micro vaten. Beweeg nu de muis en de fase onder een charge-coupled device.
Videocamera verbonden fluorescentiemicroscoop, gemodificeerd voor epi-verlichting, met speciale aandacht om de femorale arteriële katheter niet te verplaatsen. Nadat het wateronderdoelobjectief is aangepast voor voldoende visualisatie van de chma microcirculatie, definieert u stochastisch zes post capillaire ES voor latere analyse van stevige stamcelhechting. Laad vervolgens een ene milliliter spuit met 200 microliters van de eerder gelabelde fluorescente donor beenmerg stamcellen.
Tikt voorzichtig op de spuit om de suspensie op te schorsen, suspendeer de celsuspensie en breng vervolgens de cellen door de femorale katheter toe in injecties van 40 microliter voor een totaal van vijf opeenvolgende injecties. Neem het rollen van de stamcellen onmiddellijk na de celinjectie op. Definieer rollen als een meer dan 50% vermindering van de celsnelheid langs de endotheellijning in combinatie met de typische cellulaire plak- en loslaatbewegingen.
Na voltooiing van de intra vitale microscopie, verwijder voorzichtig de cremaster spier en bewaar deze voor latere analyse. Over het algemeen is de interactie van direct geïnjecteerde stam- of voorlopercellen met het vasculaire endotheel binnen de cremaster spier microcirculatie een zeldzame gebeurtenis en komt deze uitsluitend voor in de post capilla
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie maakt gebruik van intravitale microscopie om de interacties tussen stamcellen en endotheelcellen in de microcirculatie van de m. cremaster van de muis te analyseren. Deze methode biedt een gestandaardiseerd in vivo-model voor het onderzoeken van de migratie van perifere beenmergstamcellen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Regeneratieve Geneeskunde
- Celbiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van stamcelmigratie is cruciaal voor regeneratieve therapieën.
- Intravitale microscopie maakt real-time visualisatie van cellulaire interacties mogelijk.
- De microcirculatie van de M. cremaster bij de muis dient als een effectief model voor deze studies.
- Voorgaand onderzoek heeft het belang van endotheelinteracties bij het gedrag van stamcellen benadrukt.
Doel van de studie
- Om interacties tussen stamcellen en endotheelcellen in vivo te visualiseren.
- Om de migratie van stamcellen binnen een levend organisme te kwantificeren.
- Om kernvragen in het veld van de regeneratieve geneeskunde te beantwoorden.
Gebruikte methoden
- Catheterisatie van de femorale arterie bij een gesedeerde muis voor intra-arteriële toegang.
- Chirurgische preparatie van de chroma-spier voor intravitale fluorescentiemicroscopie.
- Injectie van de stamcelpopulatie via de femorale arteriecatheter.
- Visualisatie en kwantificering van interacties tussen stamcellen en het endotheel.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle real-time visualisatie van interacties tussen stamcellen en endotheelcellen.
- Kwantitatieve gegevens over migratiepatronen van stamcellen verkregen.
- Inzichten in de regulerende mechanismen van stamcelmigratie.
- Potentiële implicaties voor de verbetering van regeneratieve therapieën.
Conclusies
- De techniek van intravitale microscopie is effectief voor het bestuderen van stamceldynamiek.
- Dit model kan het begrip van het gedrag van stamcellen in vivo verbeteren.
- Bevindingen kunnen toekomstige strategieën voor regeneratieve geneeskunde informeren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Intravitale microscopie van de microcirculatie in de cremasterspier van de muis maakt directe visualisatie en kwantificering van interacties tussen stamcellen en endotheel in vivo mogelijk, waardoor een kritiek gat in het begrip van perifere stamcelmigratie voor regeneratieve therapieën wordt gedicht. Deze benadering biedt mechanistische inzichten in chemokine-gemedieerde rekrutering- en adhesieprocessen, wat bijdraagt aan targetvalidatie en predictieve modellering in de vroege ontdekkingsfase. Door een reproduceerbaar in vivo-model vast te stellen, wordt het vertrouwen in voorspellingen over het gedrag van stamcellen versterkt en worden go/no-go-beslissingen in de preklinische ontwikkeling onderbouwd.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen over mechanismen van stamcelrekrutering en pathway-verduidelijking te onderzoeken in een fysiologisch relevante micro-omgeving.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicovermindering door het kwantificeren van rolling- en firm-adhesiegebeurtenissen als functionele read-outs van endotheelinteractie.
- Voorspellende waarde: Genereert kwantitatieve gegevens over migratiepatronen van stamcellen die bijdragen aan portfolio-triage en mechanistische risicovermindering van regeneratieve kandidaten.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door gestandaardiseerde condities vast te stellen voor de analyse van interacties tussen stamcellen en endotheel.
- Reproduceerbaarheid: Pakt de standaardisatie van de assay aan via gecontroleerde superfusie van chemokines en consistente microcirculatoire meetwaarden.
- Schaalbaarheid: Benadrukt het potentieel voor hergebruik van het platform voor het evalueren van meerdere stamcelpopulaties of micro-omgevingsmodulatoren onder identieke beeldvormingscondities.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Bespreekt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door het modelleren van de migratie van perifere stamcellen die relevant is voor weefselherstel en toepassingen in de regeneratieve geneeskunde.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Beschrijft hoe geobserveerde interacties onder specifieke chemokinerbehandelingen (bijv. SDF-1α, TNF-α) de afstemming van biomarkers en het voorspellende vertrouwen in preklinische modellen ondersteunen.
- Mechanistische risicoreductie: Richt zich op de voorspellende waarde door micro-omgevingsvoorwaarden te koppelen aan de efficiëntie van de rekrutering van stamcellen, wat translationele biomarkerstrategieën informeert.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van doelwitvalidatie via lead-identificatie tot preklinisch onderzoek, en biedt real-time, kwantitatieve resultaten van het gedrag van stamcellen in een levend systeem.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing van de regulatie van stamcelmigratie en pathway-verduidelijking via endotheelinteractiedynamiek ondersteunt.
- Screening: Beschrijft de gereedheid van de assay door gestandaardiseerde preparatie van de cremasterspier en kwantitatieve visualisatie van rollende en adherente stamcellen.
- Analytics: Benadrukt metingen zoals cel-snelheidsreductie (>50%) en stick-release-bewegingen als gedefinieerde outputs voor het vergelijken van experimentele condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de methode met preklinische continuïteit door evaluatie mogelijk te maken van chemokine-gemedieerde effecten op de rekrutering van stamcellen, relevant voor weefselspecifieke homing.
- Enterprise-hergebruik: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit voor het screenen van stamcelproducten of modulerende agentia over meerdere projecten heen, vanwege de aanpasbaarheid aan diverse chemokinen en celtypen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in mechanismen van stamcelmigratie, validatie van targets voor endotheelinteractiepaden, vermindering van mechanistische ambiguïteit in regeneratieve mechanismen.
- Operationele waarde: Standaardisatie van chirurgische preparatie en beeldvormingsprotocollen, reproduceerbaarheid van microcirculatoire condities, schaalbaarheid voor het testen van meerdere variabelen.
- Strategische waarde: Betere go/no-go beslissingen op basis van kwantitatieve interactiegegevens, kapitaalefficiëntie door vroegtijdige risicoreductie, verminderd biologisch risico in een laat stadium bij de ontwikkeling van celtherapie.
- Portfolio-impact: Risicogewogen prioritering van stamcelkandidaten op basis van de efficiëntie van de endotheelinteractie onder gedefinieerde micro-omgevingscondities.
Overwegingen voor implementatie
- Vereiste expertise in microchirurgie, intravitale microscopie en fluorescente celmarkering voor een succesvolle catheterisatie en weefselpreparatie.
- De benodigde instrumentatie omvat een fluorescentiemicroscoop met epi-illuminatie, een waterimmersie-objectief en een temperatuurgecontroleerde tafel om fysiologische condities te handhaven.
- Standaardisatie tussen teams vereist een consistente definitie van rolling (>50% snelheidsreductie) en criteria voor stevige adhesie tussen verschillende operateurs en locaties.
- Overwegingen voor adaptatie omvatten het optimaliseren van chemokine-superfusieconcentraties en injectievolumes voor verschillende stamcelpopulaties en modelsystemen.
- Praktische beperkingen omvatten de zeldzaamheid van interacties tussen stamcellen en endotheel in de microcirculatie en de afhankelijkheid van fluorescente markering voor een duidelijk onderscheid met endogene leukocyten.
