Lasermicrodissectie van neuronen van Gedifferentieerd Human Neuroprogenitor Cellen in Cultuur

Het algemene doel van het volgende experiment is het ontwikkelen van een menselijk neuronale cultuurmodel, het identificeren van neuronale markers en het isoleren van een zuivere populatie neuronen voor genexpressieanalyse. Dit wordt bereikt door eerst menselijke neuroprogenitorcellen te expanderen om een continue voorraad progenitorcellen te creëren. Als tweede stap worden de neuroprogenitorcellen gekweekt in de aanwezigheid van differentiatiesupplementen en neurotrofe groeifactoren in schaaltjes die zijn gecoat met hechtingsfactoren.

Vervolgens wordt immunofluorescente kleuring voor neuronale markers uitgevoerd om het lot van de gedifferentieerde neurale progenitorcellen te bepalen. Ten slotte wordt laser capture microdissectie uitgevoerd op neuronen die zijn gekweekt op PEN-membraanplaatjes om neuron-specifieke genexpressieanalyse te faciliteren. De resultaten tonen aan dat de gedifferentieerde neurale progenitorcellen overwegend van neuronale aard zijn.

Op basis van immunofluorescente kleuring en de vangst van neuronen. Middels laser-capture microdissectie kunnen menselijke neurale progenitorcellen worden uitgebreid en gedifferentieerd tot neuronrijke culturen. Voor in vitro studies, aangezien deze culturen ook gliale cellen bevatten, kunnen we laser-capture microdissectie gebruiken om een zuivere populatie neuronen te isoleren.

Deze procedures zullen worden gedemonstreerd door Ron Bouchard, senior research associate in onze microscope core facility. Om deze procedure te starten, wordt een bevroren voorraad menselijke neurale progenitorcellen, geïsoleerd uit foetaal brein, gereactiveerd door deze snel op te warmen tot 37 °C en vervolgens toe te voegen aan een T 75 die 15 mL voorverwarmd neurobasaal medium bevat, aangevuld met 10 ng/mL EGF en FGF. Na het cultiveren van de cellen gedurende drie dagen worden de neurosferen overgebracht naar een 15 mL buis en gepellet door centrifugatie bij 1000 RPM gedurende vijf minuten. Na centrifugatie wordt het supernatant weggegooid, waarbij ongeveer 100 µL medium achterblijft, en wordt de celpellet overgebracht naar een eppendorfbuis.

Een celpellet van 100 µL is voldoende om te verdelen over twee T 75-flasks. Indien de hoeveelheid minder is, reduceer dan het aantal flasks, aangezien neurale progenitorcellen anders niet prolifereren. Als de cellen dun worden uitgezaaid, breek dan de neurosferen grondig op tot een suspensie van enkelvoudige cellen door 50 keer op en neer te pipetteren, terwijl de 200 µL-tip tegen de bodem van de buis wordt gehouden.

Controleer de voortgang visueel met een microscoop om te bevestigen dat de neurosferen zijn gedissocieerd. Verdeel vervolgens de celsuspensie in gelijke delen en voeg deze toe aan twee T 75-flasks: één voor verdere expansie en één voor differentiatie.

Incubeer vervolgens de kolven. Vervang het medium van de neurale progenitorcellen in de kolf die is gemarkeerd voor expansie door middel van centrifugatie. Verwijder daarna het oude medium en voeg nieuw medium toe.

Vervang het medium elke vier tot vijf dagen totdat de neurosferen hun oorspronkelijke grootte van 300 tot 500 microns hebben bereikt. Om de differentiatie van neurale progenitorcellen naar een neuronrijke cultuur te starten, plaatst u een enkel dekglas in elke put van een 24-wells plaat en coatet u deze door 500 microliters van 100 micrograms per milliliter poly-L-lysine aan elke put toe te voegen. Incubeer de schalen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en aspireer vervolgens de poly-L-lysine-oplossing.

Spoel de plaat met gedeïoniseerd steriel water en aspireer opnieuw. Coat vervolgens de wells van de plaat met 500 µL muis laminine in een concentratie van 5 µg/mL en incubeer gedurende 30 minuten. Was na de incubatie de wells met PBS, aspireer opnieuw en laat ze drogen in de weefselkweekkast. Breng vier dagen na het splitsen van de cellen de kleine neurosferen over van de kolf die is bestemd voor differentiatie naar de gecoate 24-wells plaat.

Voeg een dichtheid van ongeveer 500 neurosferen per well toe. Na zes uur incubatie, wanneer de neurosferen aan het schaaltje zijn gehecht, wordt het proliferatiemedium verwijderd en wordt differentiatiemedium toegevoegd. Dit medium bestaat uit neurobasaal medium, B 27-supplement, N-G-F, B-D-N-F, D-B-C en retinoïnezuur. Plaats de plaat terug in de incubator. Na het kweken van neurogene progenitorcellen in neuronale differentiatiemedium gedurende twee weken, wordt een neuronrijke cultuur verkregen.

Spoel de neuronen één keer met PBS en fixeer ze vervolgens in 4%paraformaldehyde gedurende 30 minuten. Spoel de cellen na fixatie drie keer met PBS. Bereid de cellen vervolgens voor op immunokleuring door ze 60 minuten bij kamertemperatuur te incuberen met permeabilisatiebuffer.

Voeg vervolgens polyklonale en monoklonale antilichamen in 3% BSA in PBS toe aan de wells. Voeg in elke well een ander antilichaampaar toe en incubeer deze een nacht bij vier graden Celsius in een shaker. Was de dekglasjes de volgende ochtend drie keer met PBS en incubeer ze vervolgens 90 minuten in het donker bij kamertemperatuur met anti-rabbit P SI three en anti-US fitzy secundaire antilichamen na de incubatie.

Was de dekglasjes drie keer met PBS. Breng vervolgens 10 µL monteermedium aan op een objectglas. Haal het dekglasje uit de kweekschaal en plaats het ondersteboven op het monteermedium.

Veeg voorzichtig het overtollige montagemedium weg en verzegel de randen met nagellak. Om de cellen voor te bereiden op microdissectie, moeten neurogenetische progenitorcellen eerst worden gedifferentieerd tot een neuronrijke cultuur op een PEN-membraan. Gebruik hiervoor objectglazen gecoat met poly-L-lysine en laminine.

Voer alle volgende stappen uit onder RNA-vrije omstandigheden. Kleur vervolgens de culturen met histogene kleuring om de cellen te visualiseren; histogene kleuring kleurt de kernen paars en het cytoplasma lichtroze, waardoor neuronen en gliacellen eenvoudig te onderscheiden zijn aan hun kenmerkende morfologie. Plaats het preparaat gedurende 30 seconden in 75% ethanol en gedeïoniseerd steriel water.

Plaats het preparaat vervolgens op een Kim wipe. Voeg 200 µL histo gene toe en wacht 20 seconden. Plaats het preparaat daarna opeenvolgend gedurende elk 30 seconden in gedeïoniseerd steriel water, 75% ethanol, 95% ethanol en 100% ethanol.

Plaats het daarna gedurende vijf minuten in xyleen en droog het gedurende vijf minuten op een Kim wipe. Plaats vervolgens een PEN-membraanplaatje over het gewone objectglas en plaats deze in het Veritas laser capture micro dissectie-systeem of LCM met behulp van de software. Maak een roadmap-afbeelding om de gebieden met zuivere neuronale populaties zonder astrocyten te lokaliseren.

Markeer deze neuronen met de tekengereedschappen. Voer vervolgens laser-captuur uit van deze gebieden met behulp van computergestuurde precisie en automatisering in een proces van twee stappen. Eerst wordt IR op meerdere plaatsen afgevuurd met een laservermogen van 70 milliwatts en een puls van 2.500 microseconden om het membraan aan de dop te bevestigen.

Vervolgens wordt het gemarkeerde gebied uitgesneden met een UV-snijinstrument bij een lage instelling van 10 millivolt. De combinatie van deze processen zorgt ervoor dat de gemarkeerde gebieden selectief worden opgevangen op LCM-macro-caps. Wanneer er minimaal 100 neuronen zijn opgevangen, wordt een microscoop gebruikt om het membraan van de cap te verwijderen en in een buisje te plaatsen.

Isoleer totaal RNA uit LCM-monsters met een P OPU RNA-isolatiekit en behandel dit met DNase. Amplificeer vervolgens het geïsoleerde RNA met een ribo amp RNA-amplificatiekit volgens de instructies van de kit. Voer tot slot een real-time R-T-P-C-R-analyse uit met TAC MAN-probes om het menselijk neurofilament heavy chain aan te tonen.

Een neuronrijke cultuur wordt verkregen door de differentiatie van vier dagen oude neurosferen met behulp van met poly-L-lysine en laminaat gecoate oppervlakken in combinatie met differentiatiespecifieke groeifactoren. Na twee weken wordt, zoals hier getoond, een neuronrijke cultuur verkregen in gebieden met een lage dichtheid. De cellen kunnen differentiëren tot astrocyten, zoals hier te zien is.

Astrocytendifferentiatie kan ook worden gestuurd door de groeifactor CNTF te gebruiken in plaats van de factoren die voor neurondifferentiatie worden gebruikt. Neurondifferentiatie kan worden geïdentificeerd met behulp van antilichamen tegen specifieke neuronale markers, zoals NeuN en synapsine, acetylcholinesterase en synaptofysine, en BDNF en GAP 43. Positieve kleuring is een bewijs dat de gedifferentieerde cellen kenmerken van primaire neuronen hebben. Daarnaast kunnen astrocyten worden geïdentificeerd via positieve stat3- en GFAP-immunokleuring.

Lasercapture-microdissectie van neuronen wordt uitgevoerd op cellen die zijn gedifferentieerd op PEN-membraanpreparaten gecoat met poly-L-lysine en laminine; hier worden neuronen getoond die zijn gekleurd met histo-kleuring. Om de cellen te visualiseren, kunnen de cellen van belang vervolgens worden omlijnd met een laser, waardoor het PEN-membraan smelt en aan de capture-cap hecht die erboven is geplaatst. Uiteindelijk kunnen talrijke cellen worden omlijnd en op dezelfde cap worden opgevangen voor DNA- of RNA-analyse.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u neuronen kunt isoleren met behulp van laser capture microdissectie.