Lasermicrodissectie van neuronen van Gedifferentieerd Human Neuroprogenitor Cellen in Cultuur
16 september 2013
Menselijke neuroprogenitor cellen (NPC) werden uitgebreid onder uitdijende omstandigheden. NPCs werden gedifferentieerd in neuron-rijke culturen in aanwezigheid van een combinatie van neurotrofinen. Neuronale merkers werden gedetecteerd door immunofluorescentie kleuring. Om een zuivere populatie van neuronen te isoleren, werden NPCs gedifferentieerd PEN membraan glijbanen en lasermicrodissectie werd uitgevoerd.
Het algemene doel van het volgende experiment is om een humaan neuronaal cultuurmodel te ontwikkelen, neuronale markers te identificeren en een pure populatie neuronen te isoleren voor genexpressieanalyse. Dit wordt bereikt door eerst humane neuro-progenitorcellen uit te breiden om een continue toevoer van progenitorcellen te creëren. Als tweede stap worden de neuro-progenitorcellen gekweekt in aanwezigheid van differentiatiesupplementen en neurotrofe groeifactoren in schalen bedekt met hechtingsfactoren.
Vervolgens wordt immunofluorescente kleuring voor neuronale markers uitgevoerd om het lot van de gedifferentieerde neuro-progenitorcellen te bepalen. Ten slotte wordt laser capture microdissectie van neuronen uitgevoerd die zijn gekweekt op PEN membraan Slides om neuronspecifieke genexpressieanalyse te vergemakkelijken. Resultaten worden verkregen die aantonen dat gedifferentieerde neuro-progenitorcellen overwegend neuronaal van aard zijn.
Op basis van immunofluorescente kleuring en het vangen van neuronen. Door laser capture microdissectie, kunnen de humane neuro-progenitorcellen worden uitgebreid en gedifferentieerd in neuronrijke culturen. Voor in vitro studies, aangezien deze culturen enkele gal cellen hebben, kunnen we laser capture micro dissectie gebruiken om een pure populatie neuronen te isoleren.
Ron Bouchard, een senior onderzoeksmedewerker in onze microscoopkernfaciliteit, zal deze procedures demonstreren. Om deze procedure te starten, leven een bevroren voorraad humane neuro-progenitorcellen geïsoleerd uit foetaal hersenweefsel snel op door ze op te warmen tot 37 graden Celsius en ze vervolgens toe te voegen aan een T 75 met 15 milliliter voorverwarmd neuro basaal medium, aangevuld met 10 nanogram per milliliter, EG, F en FGF. Na het kweken van de cellen gedurende drie dagen, worden de neurosferen overgebracht in een 15 milliliter buis en worden ze gepelleteerd door centrifugatie bij 1000 RPM gedurende vijf minuten. Na centrifugatie wordt het supernatant weggegooid, waardoor ongeveer 100 microliter medium achterblijft, en wordt het celpelletje overgebracht in een eenor buis.
Een celpelletje van 100 microliter is voldoende om te splitsen in twee T 75 kolven. Als er minder is, verminder dan het aantal kolven omdat neuro-progenitorcellen niet kunnen prolifereren. Als het dun wordt gesplitst, breek dan de neurosferen grondig op in een enkele celsuspensie door 50 keer omhoog en omlaag te pipetteren terwijl de 200 microliter tip tegen de bodem van de buis wordt gehouden.
Controleer visueel de voortgang met een microscoop om ervoor te zorgen dat de neurosferen worden losgemaakt. Verdeel vervolgens de celsuspensie gelijkmatig en voeg deze toe aan twee T 75 kolven. Een voor voortzetting van de expansie en een andere voor differentiatie.
Bekijk vervolgens de kolven. Verander het medium van de neuro-progenitorcellen in de kolf die is gemarkeerd voor expansie door centrifugatie. Gooi vervolgens het oude medium weg en voeg nieuw medium toe.
Verander het medium elke vier tot vijf dagen totdat de neurosferen hun oorspronkelijke grootte van 300 tot 500 microns bereiken. Om de differentiatie van neuro-progenitorcellen in een neuronrijke cultuur te starten, plaats een enkele dekglas in elk putje van een 24-putjesplaat en bedek door 500 microliter van 100 microgram per milliliter poly L lysine toe te voegen aan elk. Wel incubeer de schalen gedurende 30 minuten op kamertemperatuur, aspibeer vervolgens de polyol lysine-oplossing.
Spoel de plaat af met gedeïoniseerd steriel water en aspibeer opnieuw. Bekleed vervolgens de putjes van de plaat met 500 microliter van vijf microgram per milliliter muis laminine en incubeer gedurende 30 minuten. Na incubatie, was de putjes met PBS, aspibeer opnieuw en laat ze drogen in de weefselkweekhood. Vier dagen na het splitsen van de cellen, breng de kleine neurosferen over van de kolf gelabeld voor differentiatie naar de beklede 24-putjesplaat.
Voeg een dichtheid toe van ongeveer 500 neurosferen per putje na incubatie gedurende zes uur wanneer de neurosferen zich hebben gehecht aan de schaal, verwijder het proliferatiemedium en voeg differentiatie toe. Medium bestaande uit neuro basaal medium B 27 supplement N-G-F-B-D-N-F-D-B-C en retinoïnezuur. Plaats de plaat terug in de incubator na de kweek van neuro-progenitorcellen in neuronaal differentiatiemedium gedurende twee weken, een neuronrijke cultuur is verkregen.
Spoel de neuronen eenmaal in PBS en fixeer ze vervolgens in 4% paraform aldehyde gedurende 30 minuten. Eenmaal gefixeerd, spoel de cellen drie keer met PBS. Bereid vervolgens de cellen voor op immunokleuring door ze gedurende 60 minuten in een permeabele buffer bij kamertemperatuur te incuberen.
Voeg vervolgens polyklonale en monoklonale antilichamen toe in 3% BSA in PBS aan de putjes. Voeg een ander antilichaampaar toe in elk, wel incubeer ze een nacht lang bij vier graden Celsius in een shaker. De volgende ochtend was de dekglazen drie keer met PBS en incubeer ze vervolgens met anti-konijn P SI drie en anti-US fitzy secundaire antilichamen bij kamertemperatuur in het donker gedurende 90 minuten na incubatie.
Was de dekglazen drie keer met PBS. Plaats vervolgens 10 microliter montagemedium op een glasplaat. Neem het dekglas uit de kweekschaal en plaats het ondersteboven op het montagemedium.
Veeg voorzichtig eventueel overtollig montagemedium weg en verzegel de randen met nagellak. Om de cellen voors te bereiden op microdissectie, differentiëer eerst neuro-progenitorcellen in een neuronrijke cultuur op PEN membraan. Slides bedekt met poly L lysine en laminine.
Voer alle volgende stappen uit onder RNA-vrije omstandigheden. Vervolgens worden de culturen gekleurd met histo gen staal om de cellen te visualiseren. Histo gen kleurt de kernen paars en het cytoplasma lichtroze, waardoor het gemakkelijk is om neuronen en gliacellen te onderscheiden door hun verschillende morfologieën. Plaats de plaat in 75% ethanol en gedeïoniseerd steriel water gedurende 30 seconden.
Plaats vervolgens de plaat op een Kim doek. Voeg 200 microliter histo gen toe en wacht 20 seconden. Plaats vervolgens de plaat
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op het ontwikkelen van een humaan neuronaal cultuurmodel om neuronale markers te identificeren en een pure populatie neuronen te isoleren voor genexpressie-analyse. Menselijke neuroprogenitorcellen (NPC's) worden uitgebreid en gedifferentieerd in neuron-rijke culturen met behulp van neurotrofinen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Neuro-ontwikkeling
Achtergrond
- Menselijke neuroprogenitorcellen (NPC's) kunnen onder specifieke omstandigheden worden uitgebreid.
- Neurotrofinen spelen een cruciale rol bij neuronale differentiatie.
- Immunofluorescencekleuring wordt gebruikt om neuronale markers te identificeren.
- Laser capture microdissectie maakt de isolatie van specifieke celpopulaties mogelijk.
Doel van studie
- Om een continue levering van menselijke neuroprogenitorcellen te creëren.
- Om NPCs te differentiëren in neuronen voor verdere analyse.
- Om pure neuronale populaties te isoleren voor genexpressiestudies.
Gebruikte methoden
- Uitbreiding van menselijke neuroprogenitorcellen onder proliferende omstandigheden.
- Cultuur van NPCs met neurotrofe groeifactoren.
- Immunocleuring om neuronale markers te detecteren.
- Laser capture microdissectie op PEN-membraanslides om neuronen te isoleren.
Belangrijkste resultaten
- Gedifferentieerde neuroprogenitorcellen vertonen voornamelijk neuronale kenmerken.
- Succesvolle isolatie van pure neuronale populaties voor analyse.
- Identificatie van specifieke neuronale markers door immunofluorescence.
- Facilitering van genexpressie-analyse in geïsoleerde neuronen.
Conclusies
- De studie stelt met succes een humaan neuronaal cultuurmodel vast.
- Neurotrofinen zijn effectief in het bevorderen van neuronale differentiatie.
- Laser capture microdissectie is een waardevolle techniek voor het isoleren van neuronen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Laser capture microdissection of neurons from differentiated human neuroprogenitor cells enables precise molecular profiling of neuron-specific populations, supporting mechanistic de-risking in neurodegeneration research. This workflow enhances predictive confidence in early discovery by isolating pure neuronal samples for downstream gene expression analysis. The approach is strategically positioned to inform target validation and translational continuity in neurobiology-focused portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neuronal differentiation pathways and molecular mechanisms relevant to neurodegenerative disease.
- Supports functional target validation by isolating neuron-specific populations for gene expression analysis.
- Facilitates biological de-risking by distinguishing neuronal from glial contributions in mixed cultures.
- Improves predictive confidence for advancing neurobiology targets in the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated neuron-rich cultures for quantitative molecular assays.
- Standardizes immunofluorescence-based marker identification for reproducible cell-type characterization.
- Enables reliable isolation of pure neuronal populations for downstream screening or omics workflows.
- Supports assay scalability and platform reuse by providing a renewable source of differentiated neurons.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro neuronal models with disease-relevant molecular endpoints for translational biomarker studies.
- Provides continuity from early discovery through preclinical validation by enabling neuron-specific molecular analyses.
- Reduces mechanistic ambiguity in neurodegeneration models by isolating pure neuronal populations.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from neuroprogenitor expansion through neuronal differentiation to molecular analysis, supporting both early discovery and preclinical research phases.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by enabling neuron-specific gene expression profiling.
- Screening: Delivers reproducible, marker-validated neuronal cultures for quantitative assay development.
- Analytics: Provides high-quality RNA samples from isolated neurons for robust molecular readouts.
- Translational Research: Supports alignment of in vitro findings with disease-relevant molecular signatures.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for neuron isolation applicable across neurobiology projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuronal target validation.
- Operational Value: Standardizes neuron isolation and molecular analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of neurobiology programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neurodegeneration targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroprogenitor culture, neuronal differentiation, and immunofluorescence staining.
- Needs access to laser capture microdissection instrumentation and RNA analysis infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of cell culture and staining protocols.
- Adaptation may be needed for different neuroprogenitor sources or disease models.
- Sample purity and RNA integrity are critical for downstream molecular analyses.
