Name: Digitale Inline Holographic Microscopy (Dihm) van zwak-verstrooiing onderwerpen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Leer digitale inline holografische microscopie om 3D-posities van zwemmende bacteriële cellen te reconstrueren zonder labels. Deze methode biedt hoge beeldsnelheden en behoudt de natuurlijke staat van levende monsters.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Linda Turner voor hulp aan de microbiologische voorbereiding. RZ en LGW werden gefinancierd door het Instituut Rowland aan Harvard en CGB werd gefinancierd als geleerde een CAPES Foundation, Science without Borders Program, Brazilië (Process # 7340-11-7)

1. Setup and Data Acquisition <ol><li> Grow een cultuur van Streptococcus stam V4051-197 (gladde zwemmen) cellen in KTY medium uit ingevroren voorraad 22. Incubeer in een rondschudapparaat nacht bij 35 ° C en 150 rpm, tot verzadiging. </li><li> Inoculeren 10 ml vers KTY medium met 500 ul van de verzadigde cultuur. Incubeer nog eens 3,5 uur bij 35 ° C en 150 rpm totdat de cellen te bereiken een optische dichtheid van ongeveer 1,0 bij λ = 600 nm (ongeveer 5 x 10 8 cellen / ml). </li><li> 1:400 verdund in vers medium tot de eindconcentratie van beweeglijke cellen te verkrijgen. </li><li> Op een microscoopglaasje, maak een ring vet (bijvoorbeeld van een injectiespuit gevuld met vaseline) ongeveer 1 mm hoog en een druppel van de monsteroplossing in het centrum. Plaats een deksel glas aan de bovenkant en druk licht aan de randen te verzegelen, zodat vloeistof in contact met zowel glijbaan en dekglas. De resulterende monsterkamer moet arou zijnnd 100-200 urn in de diepte. </li><li> Plaats de monsterkamer in de microscoop met de dekglas naar beneden en voorzichtig, om de vorming van luchtbellen in de olie tussen glas en de lens te voorkomen. </li><li> Focus de microscoop op het bodemoppervlak van de monsterkamer en breng de condensor te concentreren. </li><li> Schakel de standaard verlichting en de LED hoofd achter de condensor opening van de microscoop. Zet de LED voeding om een ​​maximaal rendement. </li><li> Sluit de condensor diafragma in zijn volle omvang, en indien nodig, nudge de LED in de berg tot aan de verlichting is gericht op de doelstelling lensopening. </li><li> Schakel de computer en de camera, en omleiden al het licht van de camera-poort van de microscoop. Stel de framesnelheid en de beeldgrootte in het beeld acquisitie software. </li><li> Maak het frame belichtingstijd zo kort mogelijk behoud goed contrast. Controleer een beeld histogram om ervoor te zorgen dat het beeld niet verzadigingted of onderbelicht. </li><li> Indien nodig, te heroriënteren de microscoop zodat interessant object enigszins onscherp (meestal met 10-30 micrometer). Het object en de focal plane moet in hetzelfde medium (dwz de focal plane moet binnen de monsterkamer liggen). </li></ol> 2. Reconstructie De eerste stap van de verwerking gegevens numeriek heroriënteren een videoframe in een reeks van verschillende dieptes, waardoor een stapel afbeeldingen. Gebruiksvriendelijke software om dit te doen kan hier worden gevonden: <a href="http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html">http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html</a> samen met bijvoorbeeld foto&#39;s (verkregen met behulp van een omgekeerde microscoop en een 60X olie-immersie objectief) en een scène bestand voor ray getraceerd rendering. <ol><li> Voer het kader van belang en zijn respectievelijke achtergrond als afzonderlijke afbeeldingsbestanden, in de relevante vakken op de interface. Een achtergrond is een frame dat fairly vertegenwoordigt de achtergrond van de video, in afwezigheid van het hologram en wordt gebruikt om vaste patroon ruis die kan interfereren met het hologram lokalisatie en analyse onderdrukken. </li><li> Voer waarden in de algemene instellingen dozen op de linkerkant van het scherm voordat u het programma. De eerste drie zijn uitgang stack parameters: axiale positie van het eerste frame (&#39;Start focus&#39;), het aantal schijfjes in de gereconstrueerde stapel (&#39;Aantal stappen&#39;); axiale afstand tussen elk segment in de stapel (&#39;Step size&#39;) . </li><li> Om objecten met de juiste verhoudingen te reconstrueren moeten de stapgrootte even groot als de laterale spatiëring dat beeldpunt. Voer laterale bemonsteringsfrequentie van de camera (1/pixel afstand) bij de &#39;Pixel / micron&#39; doos, de verlichting golflengte en middelgrote brekingsindex in de laatste twee vakjes. De standaardwaarden van het programma zijn geschikt voor de reconstructie van de voorbeeld data. </li><li> Druk op de knop &#39;Flip Z-gradiënt&#39; als het centrum van het object is donker in het hologram (zie voorbeeld kader 2005 en de discussie sectie voor meer details). </li><li> Controleer het bandfilter aan / uit stand (standaard is ingeschakeld). Deze optionele bandfilter, gelegen in een vak onder de gradiënt-flip switch, is verantwoordelijk voor het onderdrukken van de bijdrage van luidruchtige pixels. Het banddoorlaatfilter wordt toegepast op elk beeld segment onmiddellijk na generatie. </li><li> Controleer de tussenliggende uitgang schakelaar aan / uit staten (standaard is ingeschakeld). Stappen Intermediate analyse zijn geschreven in twee output video, niet-gecomprimeerde AVI-bestanden:. De eerste is de heroriëntatie van stapel (bestandsnaam eindigt op &#39;_stack.avi&#39;), de tweede is de stack na de axiale helling operatie (bestandsnaam eindigt op &#39; _gradient.avi). Idealiter zal deze tweede stapel het voorwerp van belang benadrukt als een helder voorwerp tegen een donkere achtergrond bevatten. </li><li> Na het instellen van alle parameters, druk op &#39;Uitvoeren&#39; in het hoofdvenster. Het geselecteerde kader verschijnt in de grote doos van de software. </li><li> Gebruik devergrootglas gereedschap gevonden in de werkbalk aan de linkerkant van de afbeelding om in te zoomen (klik links) en uitzoomen (shift + linker muisknop). Gebruik de rechthoek op de werkbalk om een ​​regio van belang (ROI) te selecteren. Leg zo veel van franjes het hologram als mogelijk binnen de rechthoek, omdat dit de reconstructie zal optimaliseren. </li><li> Druk op de &#39;Proces&#39; knop om de twee beeld stapels genereren. Inspecteer de resulterende stapels met behulp van ImageJ (die kan worden verkregen bij <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ). Als het object van belang duidelijk te zien in het verloop afbeeldingsstapel verder met de volgende stap het object coördinaten extraheren. </li></ol> 3. Weergave <ol><li> Naast kader heroriëntatie kan dit programma vinden de x, y, z-coördinaten van elke voxel in het object van belang. Druk op de &#39;Feature Extraction&#39; knop om deze functie in te schakelen. </li><li> Geef een pad, inclusief de verlenging (bijvoorbeeld: c: home output.inc), voor deuitgang coördineert bestand. Selecteer &#39;POV-Ray-style&#39; in het vak &#39;output coördineren stijl&#39;. Dit zorgt ervoor dat het programma op een object bestand dat kan worden gevisualiseerd met behulp van de gratis POV-Ray raytracing softwarepakket (dat kan worden verkregen bij schrijven <a href="http://www.povray.org/">http://www.povray.org/</a> ). </li><li> Opnieuw verwerken van de beelden als in sectie 2 hierboven. Het programma zal een aantal (x, y, z) coördinaten in de geselecteerde ROI, geschreven naar de bestandsnaam in de &#39;Output coördinaat &quot;box verschaffen. Extractie van object coördinaten duurt aanzienlijk langer dan stack generatie. </li><li> Zorg ervoor dat het monster POV-Ray-bestand (met de wederopbouw code meegeleverd) is in dezelfde map als de coördinaten bestand gewoon gegenereerd. Bewerk het pov bestand monster. En vervang de bestandsnaam tussen aanhalingstekens op de lijn # Include &quot;MYFILE.inc&quot; met de naam van het bestand gegenereerd door de reconstructie code. </li><li> Klik op &#39;Uitvoeren&#39; knop in POV-Ray naar een bitmap-afbeelding te maken. Thij camerapositie, verlichting en textuur opties zijn slechts enkele van de aanpassingen mogelijk in POV-Ray, zie de online documentatie voor meer informatie. </li></ol>

<ol><li>Xu, W., Jericho, M. H., Meinertzhagen, I. A., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+in-line+holography+for+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Digital in-line holography for biological applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (20), 11301-11305 (2001).</li>
<li>Sheng, J., Malkiel, E., Katz, J., Adolf, J., Belas, R., Place, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+holographic+microscopy+reveals+prey-induced+changes+in+swimming+behavior+of+predatory+dinoflagellates%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Digital holographic microscopy reveals prey-induced changes in swimming behavior of predatory dinoflagellates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17512-17517 (2007).</li>
<li>Lee, S. H., Roichman, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+tracking+single+colloidal+particles+with+video+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Characterizing and tracking single colloidal particles with video holographic microscopy.</a> Opt. Express. 15 (26), 18275-18282 (2007).</li>
<li>Fung, J., Martin, K. E., Perry, R. W., Katz, D. M., McGorty, R., Manoharan, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+translational%2C+rotational%2C+and+vibrational+dynamics+in+colloids+with+digital+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Measuring translational, rotational, and vibrational dynamics in colloids with digital holographic microscopy.</a> Opt. Express. 19 (9), 8051-8065 (2011).</li>
<li>Lee, S. H., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holographic+microscopy+of+holographically+trapped+three-dimensional+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Holographic microscopy of holographically trapped three-dimensional structures.</a> Opt. Express. 15 (4), 1505-1512 (2007).</li>
<li>Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+techniques+of+digital+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22SPIE+Rev%22%5BJournal%5D)">Principles and techniques of digital holographic microscopy.</a> SPIE Rev. 1, 018005 (2010).</li>
<li>Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+sperm+in+three-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Comm%22%5BJournal%5D)">Tracking sperm in three-dimensions.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 373, 125-129 (2008).</li>
<li>Santi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy+%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Light Sheet Fluorescence Microscopy : A Review.</a> J. Histochem. Cytochem. 59, 129-138 (2011).</li>
<li>van Blaaderen, A., Wiltzius, P. Real-Space Structure of Colloidal Hard-Sphere Glasses. Science. 270, 1177-1179 (1990).</li>
<li>Besseling, R., Weeks, E. R., Schofield, A. B., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Imaging+of+Colloidal+Glasses+under+Steady+Shear%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Imaging of Colloidal Glasses under Steady Shear.</a> Phys. Rev. Lett. 99, 028301 (2007).</li>
<li>Schall, P., Weitz, D., Spaepen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Rearrangements+That+Govern+Flow+in+Colloidal+Glasses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural Rearrangements That Govern Flow in Colloidal Glasses.</a> Science. 318, 1895-1899 (2007).</li>
<li>Rosen, J., Brooker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+incoherent+color+holography%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fluorescence incoherent color holography.</a> Opt. Exp. 15, 2244-2250 (2007).</li>
<li>Jericho, M. H., Kreuzer, H. J., Kanka, M., Riesenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phase+and+refractive+index+measurements+with+point-source+digital+in-line+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Quantitative phase and refractive index measurements with point-source digital in-line holographic microscopy.</a> Appl. Opt. 51 (10), 1503-1515 (2012).</li>
<li>Mudanyali, O., Erlinger, A., Seo, S., Su, T., Ozcan, D. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lensless+On-chip+Imaging+of+Cells+Provides+a+New+Tool+for+High-throughput+Cell-Biology+and+Medical%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical.</a> J. Vis. Exp. 34, (2009).</li>
<li>Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofocusing+in+digital+holographic+phase+contrast+microscopy+on+pure+phase+objects+for+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging.</a> Appl. Opt. 47 (19), (2008).</li>
<li>Elliot, M. S., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+optical+microscopy+of+colloidal+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Coll.+Interf.+Sci%22%5BJournal%5D)">Conventional optical microscopy of colloidal suspensions.</a> Adv. Coll. Interf. Sci. 92, 133-194 (2001).</li>
<li>Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+fluctuations+studied+with+defocusing+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+E%22%5BJournal%5D)">Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy.</a> Phys. Rev. E. 67, 051904 (2003).</li>
<li>Born, M., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBorn%2C+M+%22Principles+of+Optics%2C+6th+Ed%22">Principles of Optics, 6th Ed</a>. , Cambridge University Press. (1998).</li>
<li>Wilson, L., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Localization+of+weak+scatterers+in+digital+holographic+microscopy+using+Rayleigh-Sommerfeld+back-propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">3D Localization of weak scatterers in digital holographic microscopy using Rayleigh-Sommerfeld back-propagation.</a> Opt. Express. 20, 16735-16744 (2012).</li>
<li>Bohren, C., Huffman, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBohren%2C+C+%22Absorption+and+Scattering+of+Light+by+Small+Particles%22">Absorption and Scattering of Light by Small Particles</a>. , John Wiley & Sons. (1983).</li>
<li>Balaev, A. E., Dvoretski, K. N., Doubrovski, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractive+index+of+escherichia+coli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Saratov+Fall+Meeting+2001%3A+Optical+Technologies+in+Biophysics+and+Medicine+III%22%5BJournal%5D)">Refractive index of escherichia coli cells.</a> Saratov Fall Meeting 2001: Optical Technologies in Biophysics and Medicine III. 4707 (1), 253-260 (2002).</li>
<li>Berg, H. C., Manson, M. D., Conley, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+Energetics+of+Flagellar+Rotation+in+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Symp.+Soc.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics and Energetics of Flagellar Rotation in Bacteria.</a> Symp. Soc. Exp. Biol. 35, 1-31 (1982).</li>
<li>Garcia-Sucerquia, J., Xu, W., Jericho, S. K., Klages, P., Jericho, M. H., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+in-line+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Optics%22%5BJournal%5D)">Digital in-line holographic microscopy.</a> Appl. Optics. 45 (5), 836-850 (2006).</li>
<li>Restrepo, J. F., Garcia-Sucerquia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnified+reconstruction+of+digitally+recorded+holograms+by+Fresnel-Bluestein+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Optics%22%5BJournal%5D)">Magnified reconstruction of digitally recorded holograms by Fresnel-Bluestein transform.</a> Appl. Optics. 49 (33), 6430-6435 (2010).</li>
<li>Dubois, F., Joannes, L., Legros, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+three-dimensional+imaging+with+a+digital+holography+microscope+with+a+source+of+partial+spatial+coherence%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Optics%22%5BJournal%5D)">Improved three-dimensional imaging with a digital holography microscope with a source of partial spatial coherence.</a> Appl. Optics. 38 (34), 7085-7094 (1999).</li>
<li>Kanka, M., Riesenberg, R., Petruck, P., Graulig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+%28NA%3D0.8%29+in+lensless+in-line+holographic+microscopy+with+glass+sample+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">High resolution (NA=0.8) in lensless in-line holographic microscopy with glass sample carriers.</a> Opt. Lett. 36 (18), 3651-3653 (2011).</li>
<li>Dubois, F., Requena, M. L., Minetti, C., Monnom, O., Istasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+spatial+coherence+effects+in+digital+holographic+microscopy+with+a+laser+source%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Optics%22%5BJournal%5D)">Partial spatial coherence effects in digital holographic microscopy with a laser source.</a> Appl. Optics. 43 (5), 1131-1139 (2004).</li>
<li>Magariyama, Y., Sugiyama, S., Muramoto, K., Kawagishi, I., Imae, Y., Kudo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+bacterial+flagellar+rotation+rate+and+swimming+speed%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of bacterial flagellar rotation rate and swimming speed.</a> Biophysical Journal. 69 (5), 2154-2162 (1995).</li>
<li>Berg, H. C., Brown, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+in+Escherichia+coli+analysed+by+three-dimensional+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis in Escherichia coli analysed by three-dimensional tracking.</a> Nature. 239 (5374), 500-504 (1972).</li>
<li>Brooker, G., Siegel, N., Wang, V., Rosen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+resolution+in+Fresnel+incoherent+correlation+holographic+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Optimal resolution in Fresnel incoherent correlation holographic fluorescence microscopy.</a> Opt. Express. 19 (6), 5047-5062 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

De belangrijkste stap in deze experimentele protocol is het nauwkeurig vastleggen van beelden van een stabiele experimentele opstelling. Met een slechte achtergrond data, high fidelity reconstructie is bijna onmogelijk. Het is ook belangrijk om objectieven vermijden intern fasecontrast element (zichtbaar als een donkere ring bij het kijken door de achterkant van het doel), omdat deze het gereconstrueerde beeld kunnen afbreken. Het doel van belang moeten ver genoeg van de focal plane dat een paar paren van diffractie fra...

Digitale inline holografische microscopie (Dihm) maakt een snelle driedimensionale beeldvorming van microscopische monsters, zoals zwemmen micro-organismen 1,2 en zachte materie systemen 3,4, met een minimale wijziging van een standaard microscoop setup. In deze paper wordt een pedagogische demonstratie van Dihm wordt verstrekt, gecentreerd rond software ontwikkeld in ons lab. Dit document bevat een beschrijving van het instellen van de microscoop, het optimaliseren van data-acquisitie, en de opgenomen beelden tot drie-dimensionale data reconstrueren verwerken. De software (gedeeltelijk gebaseerd op software die is ontwikkeld door DG Grier en anderen 5) en bijvoorbeeld beelden zijn vrij beschikbaar op onze website. Een beschrijving wordt gegeven van de stappen die nodig zijn om de microscoop te configureren, te reconstrueren drie-dimensionale volumes van hologrammen en maken de resulterende volumes van belang gebruik van een gratis ray-tracing software pakket. Het document besluit met een bespreking van factoren die de kwaliteit van de wederopbouwEn een vergelijking van Dihm met concurrerende methoden. Hoewel Dihm werd enige tijd geleden beschreven (voor een algemene herziening van haar principes en ontwikkeling, zie Kim 6), heeft de benodigde rekenkracht en beeldverwerking deskundigheid tot nu toe grotendeels beperkt het gebruik ervan tot gespecialiseerde onderzoeksgroepen met een focus op de ontwikkeling instrument. Deze situatie is aan het veranderen in het licht van recente ontwikkelingen in de computer-en cameratechnologie. Moderne desktop computers kan gemakkelijk omgaan met de verwerking en opslag van gegevens eisen, CCD-of CMOS-camera&#39;s aanwezig in de meeste microscopie labs zijn, en de benodigde software wordt gratis beschikbaar gesteld op het internet door groepen die tijd hebben geïnvesteerd in de ontwikkeling van de techniek. Verschillende systemen zijn voorgesteld voor het afbeelden van de configuratie van microscopische objecten in een driedimensionale monstervolume. Veel van deze technieken scannen 7,8, waarbij een stapel van beelden opgenomen door mechanically vertalen van het beeldvlak door het monster. Scanning confocale fluorescentie microscopie is misschien wel het meest bekende voorbeeld. Meestal wordt een fluorescente kleurstof toegevoegd aan een fase-object om een ​​aanvaardbaar monster contrast bereiken en confocale inrichting gebruikt om ruimtelijk lokaliseren fluorescente emissie. Deze werkwijze heeft tot significante vooruitgang, bijvoorbeeld colloïdale wetenschap waar zij de toegang tot de driedimensionale dynamica van druk systemen 9-11 is toegestaan. Het gebruik van etikettering is een belangrijk verschil tussen fluorescentie confocale microscopie en Dihm, maar andere kenmerken van de twee technieken zijn de moeite waard te vergelijken. Dihm een ​​aanzienlijk snelheidsvoordeel dat de inrichting geen bewegende delen. De mechanische scanning spiegels confocale systemen plaats een bovengrens voor de data-acquisitie rate - meestal ongeveer 30 frames / sec beeld een 512 x 512 pixels. Een stapel van dergelijke beelden van verschillende beeldvlakken worden verkregen door fysisch translAting de monstertafel of objectieflens tussen frames, waardoor een uiteindelijke opnamesnelheid van ongeveer een volume per seconde voor een 30 lijst stapel. Ter vergelijking, kan een holografisch systeem gebaseerd op een moderne CMOS-camera 2000 beelden / sec vast te leggen op hetzelfde beeldformaat en de resolutie, elk frame is verwerkt `offline &#39;aan een onafhankelijke momentopname van het monster volume te geven. Nogmaals: fluorescerende monsters niet vereist voor Dihm, hoewel een systeem ontwikkeld dat holografische reconstructie van een fluorescerende onderwerp 12 uitvoert. Naast driedimensionaal volume informatie Dihm kan ook worden gebruikt om kwantitatief fasecontrast beelden 13 verschaffen, maar die buiten het bereik van de hier besproken. Ruwe Dihm gegevens beelden zijn twee-dimensionaal, en in sommige opzichten er als standaard microscoop beelden, zij het onscherp. Het belangrijkste verschil tussen Dihm en standaard helderveld microscopie ligt in het afbuigende ringen die voorwerpen omringen in het gezichtsveld, dit zijn vanwege de aard van de verlichting. Dihm vereist een meer coherente bron dan helder veld - meestal een LED of laser. De diffractie ringen in het hologram bevatten de informatie die nodig is om een ​​driedimensionaal beeld te reconstrueren. Er zijn twee belangrijke benaderingen van het interpreteren Dihm gegevens; directe montage en numerieke heroriëntatie. De eerste benadering is wanneer het wiskundige vorm van het diffractiepatroon vooraf 3,4 bekend toepassing; deze voorwaarde wordt voldaan door een klein aantal eenvoudige objecten zoals bollen, cilinders en halfvlak obstakels. Directe montage is ook in gevallen waarin axiale positie van het object bekend is van toepassing, en het beeld kan worden gemonteerd met behulp van een opzoektabel van beeldsjablonen 14. De tweede benadering (numeriek heroriëntatie) is eerder algemeen en gebaseerd op het gebruik van de diffractie ringen beeld tweedimensionale hologram numeriek reconstrueren optische veldeen aantal (willekeurig verdeelde) brandvlakken door het monster volume. Verschillende verwante methoden bestaan ​​om dit te doen 6; dit werk gebruikt de Rayleigh-Sommerfeld terug voortplanting techniek zoals beschreven door Lee en Grier 5. De uitkomst van deze procedure is een stack van beelden die het effect van de microscoop focal plane (vandaar de naam `numerieke heroriëntatie &#39;) handmatig veranderen repliceren. Zodra een stapel van beelden is gegenereerd, moet de positie van het subject in het brandpunt volume verkregen. Een aantal beeldanalyse heuristiek, zoals lokale intensiteit variantie of ruimtelijke frequentie-inhoud, zijn voorgelegd aan de scherpte van de focus te kwantificeren op verschillende punten in de steekproef 15. Telkens wanneer een bepaald beeld gegeven wordt gemaximaliseerd (of geminimaliseerd), wordt het object beschouwd in focus. In tegenstelling tot andere programma&#39;s die streven naar een bepaalde focal plane waar een object &#39;in focus&#39; te identificeren, de methode in dit werk eruit pikt points dat in het object van belang liggen, die kan zich uitstrekken over een breed scala van focale vliegtuigen. Deze benadering is toepasbaar op een breed scala van onderwerpen en is bijzonder geschikt voor verlengd zwak verstrooiende monsters (fase voorwerpen), zoals staafvormige colloïden, ketens van bacteriën of eukaryote flagella. In deze monsters wijzigt het contrast wanneer het object door de focal plane passeert, een onscherpe beeld heeft een licht centrum als het object is aan de ene kant van de focal plane en een donker centrum als het op de andere. Zuivere fase objecten hebben weinig tot geen contrast wanneer ze liggen precies in het brandvlak. Dit fenomeen van contrast inversie is besproken door andere auteurs 16,17 en uiteindelijk door de Gouy fase anomalie 18. Dit is een meer rigoureuze voet in de context van holografie zetten elders waar de grenzen van de techniek worden geëvalueerd, de typische onzekerheid in positie is in de orde van 150 nm (ongeveer een pixel) in each richting 19. De Gouy fase anomalie methode is een van de weinige welomschreven Dihm&#39;s voor bepalen van de structuur van uitgebreide objecten in drie dimensies, maar toch sommige objecten problematisch te reconstrueren. Objecten die direct langs de optische as (wijzend naar de camera) liggen zijn moeilijk nauwkeurig te reconstrueren, onzekerheden in de lengte en de positie van het object worden groot. Deze beperking is voor een deel te wijten aan de beperkte bitdiepte van de pixels opnemen van het hologram (het aantal verschillende grijstinten die de camera kan opnemen). Een ander problematisch configuratie treedt op wanneer het object van belang is zeer dicht bij het brandvlak. In dit geval worden de reële en virtuele beelden van het object gereconstrueerd in de nabijheid, die tot ingewikkelde optische velden die moeilijk te interpreteren zijn. Een tweede, iets minder belangrijk zorg is hier dat de resulterende diffractie franjes nemen minder van de beeldsensor, en dit-grovere korrel informatie leidt tot een slechtere kwaliteit van de wederopbouw. In de praktijk wordt een eenvoudige verloop filter toegepast driedimensionaal volume sterke tot inversies detecteren langs de belichting richting. Regio&#39;s waar de intensiteit verandert snel van licht naar donker, of vice versa, worden vervolgens gekoppeld aan verstrooiing regio. Zwak-verstrooiing objecten zijn goed beschreven als een noninteracting verzameling van dergelijke elementen 20, deze individuele bijdragen som aan de totale verstrooide veld die gemakkelijk wordt omgekeerd met behulp van de Rayleigh-Sommerfeld terug voortplanting methode. In dit artikel wordt de axiale intensiteit gradiënt techniek toegepast op een keten van Streptococcus cellen. De cellichamen zijn fase objecten (de soort E. coli heeft een brekingsindex gemeten 21 om 1,384 bij een golflengte λ = 589 nm, de Streptococcus stam waarschijnlijk vergelijkbaar zijn) en worden als een hoge-intensiteit keten van verbonden blobs in the monster volume na verloop filter is toegepast. Standaard drempel en feature extractie toegepaste deze gefilterde volume kan de extractie van volumetrische pixels (voxels) overeenkomt met het gebied binnen de cellen. Een bijzonder voordeel van deze werkwijze is dat het eenduidige reconstructie van de positie van een object in axiale richting. Vergelijkbare methoden (tenminste, die dat record hologrammen dicht bij het ​​object, in beeld gebracht door middel van een microscoop objectief) last van het niet kunnen het teken van deze verplaatsing te bepalen. Hoewel de Rayleigh-Sommerfeld reconstructie methode is ook aanmelden onafhankelijk in die zin is de gradiënt werking stelt ons in staat om onderscheid te maken tussen zwakke fase objecten boven en onder het brandvlak.

<table><tbody><tr><td>Nikon Eclipse Ti-E omgekeerd microscoop</td><td>Nikon Corp.</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>LED</td><td>Thorlabs</td><td>M660L3</td><td>emissiegolflengte &lambda;=660 nm, lijnbreedte ongeveer 20 nm&nbsp;</td></tr><tr><td>LED-voeding</td><td>Thorlabs</td><td>LEDD1B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Schroefdraadadapter</td><td>Thorlabs</td><td>SM2T2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Schroefdraadadapter</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Frame Grabber board</td><td>EPIX</td><td>PIXCI E4</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>High-Speed CMOS camera</td><td>Mikrotron</td><td>MC-1362</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

digitale inline holographic microscopy (dihm) van zwak-verstrooiing onderwerpen

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Zwak-verstrooiing voorwerpen, zoals kleine colloïdale deeltjes en de meeste biologische cellen, vaak aangetroffen in microscopie. Inderdaad zijn een aantal technieken ontwikkeld om deze fase objecten beter visualiseren, fase contrast en DIC behoren tot de meest populaire methoden voor het verbeteren van contrast. Echter, het opnemen van positie en de vorm in de richting out-of-imaging-plane blijft uitdagend. Dit rapport introduceert een eenvoudige experimentele methode om nauwkeurig te bepalen van de locatie en de geometrie van objecten in drie dimensies, met behulp van digitale inline holografische microscopie (Dihm). In grote lijnen is de toegankelijke monstervolume bepaald door de grootte camerasensor in zijdelingse richting en de verlichting samenhang in de axiale richting. Typische monstervolumes variëren van 200 urn x 200 urn x 200 urn met LED-verlichting te5 mm x 5 mm x 5 mm of groter met laserbelichting. Deze verlichting licht is zodanig geconfigureerd dat vlakke golven zijn incident op het monster. Objecten in het monster volume dan licht verstrooien, die interfereert met de verstrooide licht om interferentie patronen vormen loodrecht op de verlichting richting. Dit beeld (het hologram) bevat de diepte informatie die voor driedimensionale reconstructie en kan worden vastgelegd op een standaard beeldvormingsinrichting zoals een CMOS of CCD-camera. De Rayleigh-Sommerfeld back vermeerderingsmethode toegepast om numeriek heroriënteren microscoop afbeeldingen en een eenvoudige weergave heuristische basis van de Gouy fase anomalie wordt gebruikt voor het identificeren verstrooiing objecten in het gereconstrueerde volume. Deze eenvoudige maar robuuste methode resulteert in een eenduidige, model-free meten van de locatie en vorm van objecten in microscopische monsters.

Om de mogelijkheden van Dihm tonen, werden experimenten uitgevoerd op een keten van Streptococcus bacteriën. De ketting zelf gemeten 10,5 mm lang en bestond uit 6-7 sfero-cilindrische cellen (twee van de cellen in de keten nabij delen) met een diameter in het traject 0,6-1 urn. Figuren 1a en 1b tonen de hoofdinterface van de wederopbouw en rendering software. Voorbeelden van numerieke heroriëntatie procedure worden gezien in figuur 2, waarbij een ruimtelijk ban...

De driedimensionale locaties van zwak-verstrooiende objecten kan uniek worden geïdentificeerd middels inline digitale holografische microscopie (Dihm), die een geringe wijziging betreft een standaard microscoop. De software gebruikt een eenvoudige weergave heuristische combinatie met Rayleigh-Sommerfeld back-overdracht naar de driedimensionale positie en geometrie van een microscopische fase-object verkregen.

Digitale Inline Holographic Microscopy (Dihm) van zwak-verstrooiing onderwerpen

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het reconstrueren van de 3D-positie in de geometrie van een keten zwemmende bacteriële cellen. Dit wordt bereikt door eerst bacteriële cellen te kweken tot de juiste concentratie om een geschikt monster voor beeldvorming te verkrijgen. Als tweede stap wordt de LED-lichtbron opgesteld en uitgelijnd, waardoor holografische beelden kunnen worden verkregen.Vervolgens wordt de reconstructiesoftware gebruikt om de 3D-coördinaten van een keten bacteriële cellen te verkrijgen. De resultaten tonen het vermogen om de 3D-positie en configuratie van de bacteriële cellen te reconstrueren op basis van holografische beeldvorming. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals confocale microscopie, is dat labelvrije volumetrische beeldvorming mogelijk is bij hoge framerates.Om te beginnen, inoculeer 10 milliliter KTY-medium met ijskristallen uit een bevroren stock van streptococcus-stam V 4 0 5 1 1 97; incubeer de startcultuur overnight in een rotatieschudmachine bij 35 °C en 150 RPM. Zodra de cultuur is aangegroeid, inoculeer 10 milliliter vers KTY-medium met 500 µL van de verzadigde startcultuur. Incubeer

digital-inline-holographic-microscopy-dihm-weakly-scattering

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol benadrukt de principes en praktische toepassingen van Fase en differentieel interferentie contrast (DIC)...

Phase Contrast en differentieel interferentie contrast (DIC) Microscopie

We beschrijven het gebruik van een standaard optisch microscoop om kwantitatieve metingen van cellulaire massa, volume en dichtheid uit te voeren door een combinatie van lichtveld en differentiële interferentiecontrast beeldvorming.

Kwantitatieve Optische Microscopie: Meting van Cellulaire biofysische eigenschappen met een standaard optische microscoop

We presenteren een compact reflectie digitale holografische systeem (CDHM) voor inspectie en karakterisering van MEMS. Een lens-less ontwerp met behulp van een divergerende ingang golf verstrekken van natuurlijke geometrische vergroting wordt aangetoond. Zowel statische als dynamische studies worden gepresenteerd.

Compact Lens-less Digitale Holografische Microscoop voor MEMS Inspectie en karakterisering

Accurate beoordeling van ontstekingsremmende effecten is van het grootste belang voor de evaluatie van potentiële nieuwe geneesmiddelen voor de behandeling van inflammatoire darmziekte. Digitale holografische microscopie biedt beoordeling van ontsteking in muis- en menselijke colonweefselmonsters evenals geautomatiseerde multimodale evaluatie van epitheel wondgenezing in vitro.

Multimodaal Quantitative Fase Imaging met de Digitale Holografische Microscopie Beoordeelt Nauwkeurig darmontsteking en epitheliale wondheling

Het gebruik van een hyperlens werd beschouwd als een nieuwe super resolutie beeldvormende techniek te wijten aan haar voordelen in real-time beeldvorming en haar eenvoudige implementatie met conventionele optica. Hier presenteren we een protocol met een beschrijving van de fabricage en beeldtoepassingen van een sferische hyperlens.

Demonstratie van een Hyperlens-geïntegreerd Microscoop en super resolutie beeldvorming

Digitale holografische microscopie (DHM) is een volumetrische techniek waarmee imaging monsters die 50-100 X dikker dan helderveld microscopie bij vergelijkbare resolutie, met scherpstellen uitgevoerd na verwerking. Hier DHM wordt gebruikt voor het identificeren, tellen, en bijhouden van micro-organismen bij zeer lage dichtheden en vergeleken met metingen van de optische dichtheid, kiemgetal, en directe.

Kwantificeren van micro-organismen in lage concentraties, met behulp van digitale holografische microscopie (DHM)

Een gedetailleerde instructies wordt beschreven op het bouwen van een sterk geneigd geveegd Tegel (HIST.) Microscoop en het gebruik ervan voor single-molecuul imaging.

Een gids voor het bouwen van een sterk geneigd geveegd tegel Microscoop voor uitgebreide veld-of-view Single-molecuul Imaging

We presenteren een protocol voor de fabricage van spin- en richting-multiplexed zichtbare metahologrammen, en voeren vervolgens een optisch experiment uit om hun functie te verifiëren. Deze metahologrammen kunnen eenvoudig gecodeerde informatie visualiseren, zodat ze kunnen worden gebruikt voor projectieve volumetrische weergave en informatieversleuteling.

Demonstratie van Spin-Multiplexed en Direction-Multiplexed All-Diëlektrische Zichtbare Metahologrammen

Het artikel is voornamelijk gericht op de gecombineerde kracht van optische (lineaire en niet-lineaire) en holografische methoden die worden gebruikt om verschijnselen op nanoschaal te onthullen. De resultaten verkregen uit de biofotonische en oscillerende chemische reacties ' studies worden gegeven als representatieve voorbeelden, die het vermogen van holografie benadrukken om dynamiek op nanoschaal te onthullen.

Verborgen dynamiek van natuurlijke fotonische structuren blootleggen met behulp van holografische beeldvorming

We ontwikkelden een holografische microscoop met twee fotonen die neurale activiteit kan visualiseren, beoordelen en manipuleren met behulp van een hoge spatiotemporale resolutie, met als doel de pathogenese van neuropsychiatrische stoornissen die geassocieerd zijn met abnormale neurale activiteit op te helderen.

Evaluatie en manipulatie van neurale activiteit met behulp van holografische microscopie met twee fotonen

Er werd een multimodaal, snel hyperspectraal beeldvormingsraamwerk ontwikkeld om breedband vibrationele somfrequentiegeneratie (VSFG)-beelden te verkrijgen, samen met helderveld-, tweede harmonische generatie (SHG)-beeldvormingsmodaliteiten. Omdat de infraroodfrequentie resoneert met moleculaire trillingen, wordt microscopische structurele en mesoscopische morfologische kennis onthuld van symmetrie-toegestane monsters.

Multimodale niet-lineaire hyperspectrale chemische beeldvorming met behulp van lijnscanning Vibrationele somfrequentiegeneratiemicroscopie

Leer digitale inline holografische microscopie om 3D-posities van zwemmende bacteriële cellen te reconstrueren zonder labels. Deze methode biedt hoge beeldsnelheden en behoudt de natuurlijke staat van levende monsters.

Digitale Inline Holographic Microscopy (Dihm) van zwak-verstrooiing onderwerpen

Meer video's verkennen