Digitale Inline Holographic Microscopy (Dihm) van zwak-verstrooiing onderwerpen
February 8th, 2014
De driedimensionale locaties van zwak-verstrooiende objecten kan uniek worden geïdentificeerd middels inline digitale holografische microscopie (Dihm), die een geringe wijziging betreft een standaard microscoop. De software gebruikt een eenvoudige weergave heuristische combinatie met Rayleigh-Sommerfeld back-overdracht naar de driedimensionale positie en geometrie van een microscopische fase-object verkregen.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de 3D-positie in de geometrie van een ketting van zwemmende bacteriecellen te reconstrueren. Dit wordt bereikt door eerst bacteriecellen te laten groeien tot de juiste concentratie om een geschikte steekproef voor beeldvorming te verkrijgen. Als tweede stap wordt de LED-lichtbron ingesteld en uitgelijnd, waardoor holografische beelden kunnen worden verkregen.
Vervolgens wordt de reconstructiesoftware gebruikt om de 3D-coördinaten van een ketting van bacteriecellen te verkrijgen. De resultaten tonen de mogelijkheid om de 3D-positie en configuratie van de bacteriecellen te reconstrueren op basis van holografische beeldvorming. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals confocale microscopie, is dat labelvrije volumetrische beeldvorming mogelijk is met hoge framesnelheden.
Om te beginnen, inoculeer 10 milliliter KTY-medium met ijskristallen van een bevroren voorraad van streptococcus-stam V 4 0 5 1 1 97, en incubeer de startercultuur in een roterende shaker een nacht bij 35 graden Celsius en 150 RPM. Zodra deze is gegroeid, inoculeer 10 milliliter vers KTY-medium met 500 microliters van de verzadigde startercultuur. Incubeer gedurende 3,5 uur bij 35 graden Celsius en 150 RPM tot de cellen een optische dichtheid bereiken met een golflengte van 600 nanometer van 0,8 tot 1,0.
Dit vertegenwoordigt ongeveer vijf keer 10 tot de achtste cellen per milliliter. Verdun vervolgens de cellen tot een verhouding van één op 400 in vers medium om de eindconcentratie van ongeveer 1 miljoen cellen per milliliter te verkrijgen. Vul vervolgens een spuit met petroleumgel en maak een ring van vet een millimeter hoog op een microscoopglaasje.
Plaats vervolgens een druppel van de monsteroplossing in het midden. Leg voorzichtig een dekglas over het monster en druk lichtjes op het glas om de randen af te sluiten, waarbij u ervoor zorgt dat de vloeistof in contact staat met zowel de schuif als het dekglas. De resulterende monsterkamer moet uiteindelijk 100 tot 200 micrometer diep zijn.
Draai een 60 x olie-immersielens op zijn plaats en voeg een druppel olie toe. Plaats vervolgens de monsterkamer op de microscoopstandaard met het dekglas naar beneden. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan tussen de glazen dekking en de lens.
Focus op het onderste oppervlak van de monsterkamer en focus vervolgens de condensor. Schakel vervolgens de standaardverlichting uit en plaats de LED-kop achter de condensoropening van de microscoop. Zorg ervoor dat de condensor is ingesteld op helderveldmodus en stel de LED-voeding in op maximale uitgang.
Sluit vervolgens de condensorapertuur tot het uiterste en duw de LED in zijn montage totdat de verlichting gecentreerd is op de objectieflensopening. Zet de computer aan en leid vervolgens het lichtpad om naar de camerapoort van de microscoop. Stel de framesnelheid in op 30 frames per seconde en de beeldgrootte op vijf 12 bij vijf 12 pixels in de beeldverwervingssoftware.
Controleer een beeldintensiteitshistogram om ervoor te zorgen dat geen enkel deel van het beeld verzadigd of onderbelicht is. De beeldexpositietijd moet zo kort mogelijk zijn terwijl een goed contrast wordt behouden. Als cellen zich dicht bij een interface verzamelen, focust u de microscoop opnieuw zodat de bacteriecellen enigszins onscherp zijn.
De cellen moeten rond de 10 tot 30 micrometer van het brandpuntsvlak liggen voor optimale reconstructie. Na herfocussering verwerft u een reeks videoframes en slaat u deze op als een ongecomprimeerd a VI-bestand. Start vervolgens de DIHM-software die gratis te downloaden is om een videoframe om te zetten in een numeriek hergefocusseerd beeldstapel.
Voorbeeldframes worden geleverd met de software om met de reconstructie te beginnen. Voer het frame van belang en zijn achtergrond in als afzonderlijke afbeeldingsbestanden in de vakken. Het achtergrondbeeld vertegenwoordigt redelijk de achtergrond van de video in afwezigheid van de hologram en zal worden gebruikt om eventuele vaste patroonruis die kan interfereren met de holografische lokalisatie en analyse te onderdrukken.
Voer vervolgens de uitvoerstapelparameters in in de globale instellingenvakken. Voer eerst de axiale positie van het eerste frame in startfocus in. Voer vervolgens het aantal sneden in de gereconstrueerde stapel in in aantal stappen, en ten slotte, voer de werkelijke afstand tussen elke snede in de stapel in in stappengrootte.
Stel de stappengrootte in op hetzelfde als de laterale pixelspatiëring om objecten met de juiste verhoudingen te reconstrueren met behulp van de voorbeeldgegevens. Deze waarde moet 0,233 micrometer zijn. Voer vervolgens de verlichting, golflengte en medium brekingsindex van de camera in, evenals de laterale bemonsteringsfrequentie.
In het vak pixel per micron kan de laterale bemonsteringsfrequentie van de camera worden gevonden door de objectieflensvergroting te delen door de pixelgrootte van de camerasensor. Met behulp van de voorbeeldgegevens zou het getal 60 x gedeeld door 14 micrometer gelijk zijn aan 4,29 pixels per micron. Als het middelpunt van het object donker is in het hologram, drukt u op de knop Z-gradiënt omdraaien.
Dit zal een filter toepassen dat objecten onder het brandpuntsvlak in het oorspronkelijke monster extraheert. Schakel vervolgens de bandpassfilter in, die verantwoordelijk is voor het onderdrukken van de bijdrage van luidruchtige pixels aan het beeld. Het wordt toegepast op elke beeldsnede onmiddellijk na generatie.
Controleer vervolgens de tussenuitvoerschakeling op de aan/uit-toestand en zorg ervoor dat deze zijn ingeschakeld. Wanneer deze schakelaars zijn ingeschakeld, zal dit ervoor zorgen dat er twee video's worden gemaakt. De eerste uitvoer is de hergefocuste stapel met een bestandsnaam die eindigt op stack a V. De tweede stapel is de feitelijke gradiëntbewerking met een bestandsnaam die eindigt op gradiënt a VI. Ideaal zou deze tweede stapel het object van belang bevatten dat als een helder object tegen een donkere achtergrond is gemarkeerd.
Na het instellen van alle
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie toont het gebruik van digitale inline holografische microscopie (DIHM) om de driedimensionale posities en geometrieën van zwemmende bacteriecellen te reconstrueren. De techniek maakt labelvrije volumetrische beeldvorming bij hoge framesnelheden mogelijk, wat een aanzienlijk voordeel biedt ten opzichte van traditionele methoden.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biofysica
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Digitale inline holografische microscopie (DIHM) is een aangepaste microscopietechniek.
- Het maakt de unieke identificatie van zwak verspreidende objecten in drie dimensies mogelijk.
- Holografische beeldvorming kan dynamische processen in real-time vastleggen.
- Bestaande methoden zoals confocale microscopie vereisen vaak markering, wat het gedrag van biologische monsters kan veranderen.
Doel van de studie
- Om de 3D-positie en geometrie van zwemmende bacteriecellen te reconstrueren.
- Om de effectiviteit van DIHM bij het vastleggen van dynamische cellen aan te tonen.
- Om de voordelen van DIHM te vergelijken met traditionele beeldvormingsmethoden.
Gebruikte methoden
- Bereiding van bacteriecelculturen in geschikte concentraties.
- Uitlijning van een LED-lichtbron voor optimale holografische beeldvorming.
- Gebruik van reconstructiesoftware om 3D-coördinaten te verkrijgen.
- Analyse van de resulterende holografische beelden om de celconfiguratie te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- De 3D-posities van bacteriecellen werden met succes gereconstrueerd.
- De techniek toonde beeldvorming met hoge framesnelheid zonder het gebruik van labels.
- Resultaten gaven een duidelijk voordeel aan ten opzichte van confocale microscopie in termen van beeldvormingssnelheid en monsterintegriteit.
- Holografische beeldvorming bleek effectief voor dynamische biologische processen.
Conclusies
- DIHM is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van dynamische bacteriecellen.
- De methode maakt gedetailleerde 3D-beeldvorming mogelijk zonder het monster te veranderen.
- Deze techniek zou toepasbaar kunnen zijn in verschillende biologische onderzoeksgebieden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Digital inline holographic microscopy (DIHM) enables label-free volumetric imaging of weakly-scattering biological samples at high frame rates, addressing a key limitation in live-cell imaging where traditional methods require labeling or lack 3D spatial resolution. This capability supports early discovery workflows by providing quantitative, model-free measurements of cellular position and geometry in native conditions, reducing mechanistic ambiguity in target validation and phenotypic screening. The technique’s compatibility with standard imaging hardware and scalable sample volumes positions it as a reusable platform for de-risking therapeutic hypotheses in discovery biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables unambiguous, model-free measurement of object location and shape in microscopic samples, supporting therapeutic hypothesis interrogation without exogenous labels.
- Operational Value: Uses standard CMOS/CCD cameras and LED or laser illumination, allowing integration into existing microscopy workflows without specialized reagents.
- Predictive Value: Provides quantitative 3D coordinates of cellular structures, facilitating functional target validation and biological de-risking through direct observation of native dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Captures interference patterns that contain depth information for 3D reconstruction, enabling label-free assessment of cellular responses in complex microenvironments.
- Operational Value: Defines accessible sample volume via camera sensor size and illumination coherence, supporting standardization across platforms with volumes up to 5 mm³ using laser illumination.
- Predictive Value: Employs Rayleigh-Sommerfeld back propagation and Gouy phase anomaly heuristics to generate reproducible, quantitative outputs for assay readiness and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling real-time observation of dynamic biological processes in disease-relevant systems.
- Operational Value: Allows high-frame-rate imaging without sample alteration, preserving native behavior for longitudinal tracking in preclinical models.
- Predictive Value: Delivers mechanistic de-risking by reducing ambiguity in cellular geometry and positioning, informing risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
DIHM fits within the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to lead identification and preclinical validation, particularly where label-free, volumetric, and dynamic imaging are required to compare experimental conditions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by providing model-free 3D localization of weakly-scattering objects like bacterial cells or subcellular structures.
- Screening: Enables assay readiness through quantitative, refocused image stacks that allow comparison of cellular configurations across conditions.
- Analytics: Generates X, Y, Z coordinate outputs via feature extraction, enabling statistical analysis of spatial distributions and motion patterns.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving sample integrity during longitudinal imaging of dynamic processes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging capability rather than a single-use technique, leveraging free reconstruction software and standard hardware.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through label-free, model-free 3D reconstruction of object geometry and position.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via numerical refocusion and fixed-pattern noise suppression using background subtraction.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk through early, high-fidelity observation of native cellular dynamics.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization via quantitative spatial data that informs target confidence and lead selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in holographic image acquisition and numerical reconstruction using Rayleigh-Sommerfeld back propagation.
- Needs instrumentation capable of plane-wave illumination and CMOS/CCD image capture at defined frame rates and resolutions.
- Demands cross-team standardization of illumination coherence, step size, and lateral sampling frequency for reproducible 3D reconstruction.
- Requires adaptation of output stack parameters (start focus, number of steps, step size) to match experimental scale and magnification.
- Practical limitation: optimal reconstruction requires objects to lie 10–30 microns from the focal plane, necessitating precise sample preparation and focusing.
