Digitale Inline Holographic Microscopy (Dihm) van zwak-verstrooiing onderwerpen

Het algemene doel van het volgende experiment is om de 3D-positie in de geometrie van een ketting van zwemmende bacteriecellen te reconstrueren. Dit wordt bereikt door eerst bacteriecellen te laten groeien tot de juiste concentratie om een geschikte steekproef voor beeldvorming te verkrijgen. Als tweede stap wordt de LED-lichtbron ingesteld en uitgelijnd, waardoor holografische beelden kunnen worden verkregen.

Vervolgens wordt de reconstructiesoftware gebruikt om de 3D-coördinaten van een ketting van bacteriecellen te verkrijgen. De resultaten tonen de mogelijkheid om de 3D-positie en configuratie van de bacteriecellen te reconstrueren op basis van holografische beeldvorming. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals confocale microscopie, is dat labelvrije volumetrische beeldvorming mogelijk is met hoge framesnelheden.

Om te beginnen, inoculeer 10 milliliter KTY-medium met ijskristallen van een bevroren voorraad van streptococcus-stam V 4 0 5 1 1 97, en incubeer de startercultuur in een roterende shaker een nacht bij 35 graden Celsius en 150 RPM. Zodra deze is gegroeid, inoculeer 10 milliliter vers KTY-medium met 500 microliters van de verzadigde startercultuur. Incubeer gedurende 3,5 uur bij 35 graden Celsius en 150 RPM tot de cellen een optische dichtheid bereiken met een golflengte van 600 nanometer van 0,8 tot 1,0.

Dit vertegenwoordigt ongeveer vijf keer 10 tot de achtste cellen per milliliter. Verdun vervolgens de cellen tot een verhouding van één op 400 in vers medium om de eindconcentratie van ongeveer 1 miljoen cellen per milliliter te verkrijgen. Vul vervolgens een spuit met petroleumgel en maak een ring van vet een millimeter hoog op een microscoopglaasje.

Plaats vervolgens een druppel van de monsteroplossing in het midden. Leg voorzichtig een dekglas over het monster en druk lichtjes op het glas om de randen af te sluiten, waarbij u ervoor zorgt dat de vloeistof in contact staat met zowel de schuif als het dekglas. De resulterende monsterkamer moet uiteindelijk 100 tot 200 micrometer diep zijn.

Draai een 60 x olie-immersielens op zijn plaats en voeg een druppel olie toe. Plaats vervolgens de monsterkamer op de microscoopstandaard met het dekglas naar beneden. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan tussen de glazen dekking en de lens.

Focus op het onderste oppervlak van de monsterkamer en focus vervolgens de condensor. Schakel vervolgens de standaardverlichting uit en plaats de LED-kop achter de condensoropening van de microscoop. Zorg ervoor dat de condensor is ingesteld op helderveldmodus en stel de LED-voeding in op maximale uitgang.

Sluit vervolgens de condensorapertuur tot het uiterste en duw de LED in zijn montage totdat de verlichting gecentreerd is op de objectieflensopening. Zet de computer aan en leid vervolgens het lichtpad om naar de camerapoort van de microscoop. Stel de framesnelheid in op 30 frames per seconde en de beeldgrootte op vijf 12 bij vijf 12 pixels in de beeldverwervingssoftware.

Controleer een beeldintensiteitshistogram om ervoor te zorgen dat geen enkel deel van het beeld verzadigd of onderbelicht is. De beeldexpositietijd moet zo kort mogelijk zijn terwijl een goed contrast wordt behouden. Als cellen zich dicht bij een interface verzamelen, focust u de microscoop opnieuw zodat de bacteriecellen enigszins onscherp zijn.

De cellen moeten rond de 10 tot 30 micrometer van het brandpuntsvlak liggen voor optimale reconstructie. Na herfocussering verwerft u een reeks videoframes en slaat u deze op als een ongecomprimeerd a VI-bestand. Start vervolgens de DIHM-software die gratis te downloaden is om een videoframe om te zetten in een numeriek hergefocusseerd beeldstapel.

Voorbeeldframes worden geleverd met de software om met de reconstructie te beginnen. Voer het frame van belang en zijn achtergrond in als afzonderlijke afbeeldingsbestanden in de vakken. Het achtergrondbeeld vertegenwoordigt redelijk de achtergrond van de video in afwezigheid van de hologram en zal worden gebruikt om eventuele vaste patroonruis die kan interfereren met de holografische lokalisatie en analyse te onderdrukken.

Voer vervolgens de uitvoerstapelparameters in in de globale instellingenvakken. Voer eerst de axiale positie van het eerste frame in startfocus in. Voer vervolgens het aantal sneden in de gereconstrueerde stapel in in aantal stappen, en ten slotte, voer de werkelijke afstand tussen elke snede in de stapel in in stappengrootte.

Stel de stappengrootte in op hetzelfde als de laterale pixelspatiëring om objecten met de juiste verhoudingen te reconstrueren met behulp van de voorbeeldgegevens. Deze waarde moet 0,233 micrometer zijn. Voer vervolgens de verlichting, golflengte en medium brekingsindex van de camera in, evenals de laterale bemonsteringsfrequentie.

In het vak pixel per micron kan de laterale bemonsteringsfrequentie van de camera worden gevonden door de objectieflensvergroting te delen door de pixelgrootte van de camerasensor. Met behulp van de voorbeeldgegevens zou het getal 60 x gedeeld door 14 micrometer gelijk zijn aan 4,29 pixels per micron. Als het middelpunt van het object donker is in het hologram, drukt u op de knop Z-gradiënt omdraaien.

Dit zal een filter toepassen dat objecten onder het brandpuntsvlak in het oorspronkelijke monster extraheert. Schakel vervolgens de bandpassfilter in, die verantwoordelijk is voor het onderdrukken van de bijdrage van luidruchtige pixels aan het beeld. Het wordt toegepast op elke beeldsnede onmiddellijk na generatie.

Controleer vervolgens de tussenuitvoerschakeling op de aan/uit-toestand en zorg ervoor dat deze zijn ingeschakeld. Wanneer deze schakelaars zijn ingeschakeld, zal dit ervoor zorgen dat er twee video's worden gemaakt. De eerste uitvoer is de hergefocuste stapel met een bestandsnaam die eindigt op stack a V. De tweede stapel is de feitelijke gradiëntbewerking met een bestandsnaam die eindigt op gradiënt a VI. Ideaal zou deze tweede stapel het object van belang bevatten dat als een helder object tegen een donkere achtergrond is gemarkeerd.

Na het instellen van alle