Trypsine Digest Protocol bij het netvlies Vasculature van een muismodel Analyseer

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van het retinale vasculaire netwerk. Dit wordt bereikt door eerst een reeks waterwasbeurten uit te voeren op de geïsoleerde retina. In de tweede stap wordt de retina gedurende ongeveer één tot anderhalf uur in trypsine gedigesteerd bij 37 °C, afhankelijk van de grootte van de retina.

Vervolgens wordt het vaatstelsel geïsoleerd door middel van aanvullende wassingen met water en dissectie onder een microscoop. Uiteindelijk kunnen pathologische vasculaire veranderingen, zoals micro-aneurysma's, capillaire degeneratie en een abnormale ratio tussen endotheelcellen en parasieten, worden gevisualiseerd. Het belangrijkste voordeel van de try-and-digest-methode ten opzichte van bestaande methoden, zoals het prepareren van retinaal platte preparaten, is dus dat het gehele vasculaire netwerk met grote helderheid in beeld kan worden gebracht.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat deze technisch uitdagend is en moeilijk consistent uit te voeren is. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor vasculaire isolatie moeilijk alleen via tekst te leren zijn. Dit is een zeer waardevolle tool in elk laboratorium dat studies naar de retinale vasculaire biologie uitvoert, zoals bij ziekten als diabetische retinopathie. Deze techniek zal worden gedemonstreerd door Jonathan Chow, een getalenteerde medicinstudent uit mijn laboratorium.

Nadat het geënucleerde muis-oog 24 uur is gefixeerd in 10% neutraal gebufferde formaline, plaatst u het oog in een Petrischaal en bedekt u het met een kleine hoeveelheid water. Begin de dissectie door met een dissectieschaar voorzichtig een eerste snede in het hoornvlies te maken. Houd vervolgens het gesneden gebied vast met een rechte pincet en gebruik een schaar om langs de grens van het hoornvlies en de sclera te snijden, waardoor het hoornvlies wordt verwijderd.

Gebruik vervolgens fijne, gebogen en rechte pincetten om de sclera en het choroïdea langzaam en voorzichtig van het retina af te pellen in de richting van de oogzenuw. Verwijder daarna de lens en eventuele resten van de iris en debris van het retina om de neurale retinalagen beter van de bloedvaten te kunnen scheiden.

Voeg ongeveer 500 µL gefiltreerd water (45 µm) toe aan een 24-wells plaat, plaats de retina in een well en schud deze vervolgens voorzichtig gedurende vier tot vijf uur bij kamertemperatuur, waarbij het water elke 30 tot 60 minuten wordt ververst. Ga door met het wassen van de retina in water gedurende de nacht onder zachte schudding. Verwijder de volgende dag bij kamertemperatuur het water en voeg 3% trypsine toe; controleer onder een microscoop of er geen debris in de well aanwezig is. Om te voorkomen dat de vasculatuur eraan hecht, wordt het weefsel vervolgens één tot anderhalf uur geïncubeerd bij 37 °C met zachte schudding of zonder schudding.

Wanneer het weefsel tekenen van desintegratie begint te vertonen, plaatst u het plaatje op de objecttafel van de microscoop en vermijdt u vervolgens de retina. Verwijder voorzichtig de trypsine om de vasculatuur te scheiden. Voeg eerst met een pincet gefilterd water toe aan de retina.

Pel de interne limiterende membraan af, die zichtbaar is als een dunne, transparante laag. Schud de plaat met een milde agitatie. Plaats de plaat na vijf minuten opnieuw op de microscooptafel en voeg voorzichtig opnieuw water toe, waarbij beschadiging van het netvlies wordt vermeden, om het netwerk van vaten los te maken van het aanhechtende retinale weefsel.

Was het netvlies zoals zojuist gedemonstreerd, totdat er na de laatste wasbeurt nauwelijks nog debris in het water aanwezig is. Over het algemeen is het verwijderen van al het niet-vasculaire weefsel het meest complexe deel van de procedure. De volgende technieken kunnen opeenvolgend of afzonderlijk worden toegepast. Een belangrijke tip om de isolatie van het vasculaire netwerk te vergemakkelijken, is om alle instrumenten en de trypsine in de oplossing te dopen voordat het netvlies wordt gemanipuleerd.

Dit kan helpen om te voorkomen dat weefsel aan de apparatuur hecht. Coat de punt van een 200 µL micropipet met gereserveerde trypsine en pipetteer vervolgens voorzichtig water op en neer, naast en in de richting van de retinale vaten, om een zachte agitatie te veroorzaken. Als het niet-vasculaire weefsel in het centrum nog steeds resistent is, positioneer dan een met trypsine gecoate micropipetpunt bij de oogzenuw en pipetteer voorzichtig het gehele vatnetwerk op en neer om het afbreken van het niet-vasculaire weefsel te bevorderen.

Ten slotte kunnen fijne pincetten worden gebruikt om het vaatstelsel voorzichtig uit het water te tillen, zodat eventuele aanhechtende niet-vasculaire componenten kunnen worden verwijderd. Het eindresultaat moet een intact, vrij van debris retinalen vaatnetwerk zijn.

Om de vatenstructuur te visualiseren, plaatst u eerst een druppel water op een schone objectglas. Draag vervolgens de gedigesteerde vaten onder controle van de microscoop over naar het water. Indien de flap-mount van de vaten gevouwen of ontvouwen is, leiden gevouwen vaten tot een matige zichtbaarheid.

Wanneer het weefsel tijdens het kleuren is gevouwen, voeg dan extra water toe en schud het objectglas voorzichtig om het ontvouwen te vergemakkelijken. Gebruik vervolgens een micropipet om overtollig water langzaam te verwijderen. Het eindproduct van een succesvolle procedure is een flat mount van het gehele netwerk van de retinale vasculatuur van de muis, waarbij de architectuur behouden is gebleven en is gekleurd met hematoxyline, eosine en toïne.

Zoals hier getoond, zoals te zien is op deze afbeelding, kan in het netvlies een duidelijk onderscheid worden waargenomen tussen de endotheelcellen en de pericyten. De kernen van de endotheelcellen, zoals aangegeven door de witte pijl, zijn ovaal of langwerpig en liggen volledig binnen de vaatwand. De parasietkernen, aangegeven door de zwarte pijl, zijn klein, sferisch, kleuren intens en bevinden zich over het algemeen in een uitstulpende positie langs de capillaire wand.

Trypsine-vertering is een gangbare procedure die wordt gebruikt om vasculaire pathologie te analyseren in diabetische diermodellen. Deze afbeelding toont een voorbeeld van capillaire degeneratie, zoals aangegeven door de witte pijl, waargenomen in een DB DB-muis, een model voor diabetes type 2. Hoewel deze procedure is geoptimaliseerd voor muisretina's, kunnen soortgelijke resultaten ook worden verkregen in ratretina's.

Het is belangrijk om op te merken dat ratnetvliezen, zoals getoond in deze afbeeldingen, groter zijn dan muisnetvliezen en 12 in plaats van 24 wells-platen vereisen. Het vasculair netwerk van de ratnetvlies is bovendien minder fragiel dan dat van de muis. Het is uiterst cruciaal om zoveel mogelijk van het niet-vasculaire weefsel te verwijderen.

Eventuele resten zullen leiden tot aspecifieke kleuring en resulteren in een slechte visualisatie van de vaatstructuren. In deze afbeelding is bijvoorbeeld een onvolledige verwijdering van het gehele niet-vasculaire weefsel te zien. Evenzo is het belangrijk dat het netvlies bij het monteren is uitgevouwen om de visualisatie van de vaatstructuren te verbeteren.

Deze afbeelding toont een mislukte ontvouwing van het vasculaire plat preparaat. Nadat men deze technisch moeilijke procedure onder de knie heeft gekregen, kunnen trips en digesties een uiterst waardevolle methode zijn die een gedetailleerde visualisatie van het gehele vasculaire netwerk mogelijk maakt.

Door deze techniek in het muiseneoog te verbeteren, kunnen onderzoekers gebruikmaken van genetisch gemanipuleerde muizen om verschillende pathways te bestuderen die de retinale vasculatuur kunnen beheersen, wat ons in staat stelt de pathofysiologie van diverse retinale ziekten te begrijpen. Hierdoor kunnen we ons begrip van ziektepathologieën, zoals diabetische retinopathie, verbeteren. Door muismodellen zoals de DVDB-muis te bestuderen, kan dit uiteindelijk de mogelijkheid bieden om nieuwe potentiële therapeutische interventies te vinden die gericht zijn op de retinale vasculatuur.