Karakterisering van inflammatoire reacties tijdens intranasale kolonisatie met Streptococcus pneumoniae

Deze procedure omvat de kolonisatie van de nasofarynx van de muis met Streptococcus pneumoniae en de daaropvolgende extractie van koloniserende bacteriën, evenals adherente of gerekruteerde cellen. Dit wordt bereikt door eerst een bacterieel inoculum voor te bereiden van de relevante S. pneumoniae-stam.

De levende bacteriën worden vervolgens intranasaal toegediend aan geanestheseerde muizen terwijl deze zich in een fixatieapparaat bevinden. Na de gewenste kolonisatieduur worden de muizen geëuthanaseerd en worden nasale spoelingen uitgevoerd door hun blootgelegde tracheae te canuleren en de inhoud via de neus uit te spoelen. De bacteriële aantallen in de nasale spoelingen kunnen worden gekwantificeerd met microbiologische technieken. Alternatief kunnen immuunresponsen worden geanalyseerd met behulp van flowcytometrie-technieken om de gerekruteerde cellen te fenotyperen of via kwantitatieve PCR-technieken.

Om de niveaus van het tot ons interesse behorende tot expressie gebrachte mRNA te meten voordat u begint, moet u muisfixateurs voorbereiden voor het intranasale kolonisatiegedeelte van de procedure en gecannuleerde naalden voor de nasale spoelingen. Een muisfixateur kan eenvoudig worden gemaakt door de taps toelopende tip van een 50 milliliter falcon tube af te snijden. Zodra u de opening heeft gemaakt, dient u een schaar te gebruiken om eventuele scherpe randen glad te maken.

Voor de bereiding van gecannuleerde naalden heeft u de volgende materialen nodig: PE 20 polyethyleenbuisjes met een binnendiameter van 0,38 millimeter, een spuit van 1 ml voorzien van schuingeslepen naalden met een gauge van 26 en 3/8, een scherp, fijn irisschaartje en een pincet. Knip de PE 20-buisjes met het fijne schaartje in stukken van ongeveer 2,5 centimeter of één inch, waarbij u ervoor zorgt dat elk uiteinde een schuingeslepen punt heeft.

Schuif met de pincet voorzichtig een van deze stukjes op de punt van de naald. Gecanneleerde naalden kunnen, mits de zijde van de slangetjes niet wordt doorboord, bewaard worden in 70% ethanol tot aan het gebruik en direct daarvoor worden gespoeld met PBS. Voor intranasale kolonisatie van muizen met S pmo raden wij een concentratie aan van 10⁹ colony forming units per ml, toegediend in 10 µL.

Voor een uiteindelijke dosis van 10⁷ CFU houdt u het inoculum op ijs tot vlak voor gebruik en zorg ervoor dat u tussen elke kolonisatie door mengt. Naast het inoculum heeft u ook een P10- of P20-pipet, gesteriliseerde pipetpunten en uw muizenfixateur nodig. Isoleer een individuele muis bij de staart en fixeer deze door hem in het eerder klaargezette fixatieapparaat voor muizen te plaatsen.

Als u problemen ondervindt bij het leiden van de muis in de fixatiebuis, kan het helpen om deze voor en boven de muis te positioneren, zodat het dier naar boven kan klimmen. Zodra de muis in de fixatiebuis zit, zet u deze vast bij de basis van het lichaam door deze voorzichtig omhoog te duwen, zodat de neus uit het taps toelopende uiteinde van de fixatiebuis steekt. Inoculeer elke muis met een P 10 of P 20 pipette door 10 µL van de bereide cultuur aan te brengen, waarbij u dit gelijkmatig over beide neusgaten verdeelt.

Laat het inoculum in de neus druppelen door de inoculatie geleidelijk te pulseren, waarbij voldoende tijd wordt genomen zodat de muis het inoculum kan inademen. Het is te verwachten dat de muis een deel van het inoculum uit de neus niest. Let op dat muizen voor deze procedure onder narcose moeten zijn gebracht om ervoor te zorgen dat de bacteriën gelokaliseerd blijven in de nasofarynx en zich niet verspreiden naar de onderste luchtwegen.

Voor de doeleinden van deze demonstratie inoculeren we met PBS, maar zorg er bij het werken met levende bacteriën altijd voor dat de procedure wordt uitgevoerd volgens de door het instituut goedgekeurde richtlijnen. Zo vereisen de meeste instellingen dat kolonisatie wordt uitgevoerd in een biosafety level twee-kast. Indien gewichtsindicatoren als onderdeel van uw endpointmonitoring worden gebruikt, weeg de muizen dan direct na kolonisatie en controleer de muizen elke 12 tot 24 uur op klinische symptomen, waaronder lethargie, verstoorde vacht en gewichtsverlies.

Zodra de muizen zijn gekoloniseerd, worden ze gedurende de gewenste periode gehouden. Aan het einde van deze periode worden de muizen geëuthanaseerd en wordt er een nasale lavage uitgevoerd, aangezien cervicale dislocatie de trachea potentieel kan beschadigen. Deze methode van euthanasie moet worden vermeden.

Zorg ervoor dat u het volgende bij de hand heeft voordat u overgaat tot de neusspoelingen. Vooraf geprepareerde gecanneleerde naalden, 70% aqueous ethanol, een pincet, een scherp fijn irisschaartje, fosfaatgebufferde zoutoplossing, RNA-lysebuffer en 1 ml eppendorfbuisjes. Wanneer u klaar bent om te beginnen, legt u het dier plat op zijn rug en steriliseert u met 70% aqueous ethanol de voorkant van de vacht, in het bijzonder het nekgebied.

Zorg ervoor dat er geen ethanol in de neusgaten terechtkomt. Maak een enkele longitudinale incisie langs de middellijn van de nek van het dier, zodat er een opening ontstaat waardoor de trachea zichtbaar wordt. Pel de huid voorzichtig naar beide zijden weg om het onderliggende nekweefsel bloot te leggen.

Op dit punt moet de trachea zichtbaar zijn, omringd door longitudinale spieren aan weerszijden. Knip deze voorzichtig door om een vrij uitzicht op de trachea zelf te verkrijgen, waarbij u er op moet letten dat u de omliggende vaatstructuren niet doorsnijdt. Mocht u per ongeluk de vaten doorsnijden en is er bloed aanwezig in het gebied voordat u verdergaat.

Laat het bloeden stoppen en reinig vervolgens het gebied meerdere keren door steriele PBS te toedienen en steriel gaas te gebruiken om overtollig vocht voorzichtig op te nemen. Zodra de trachea correct is blootgelegd, wordt er een transversale halcirkelvormige incisie in de trachea gemaakt, ongeveer halverwege. Doe steriele PBS in een gecannuleerde spuit.

Voer de canule richting de neus in de trachea in, waarbij de schuine zijde naar beneden is gericht om de insertie te vergemakkelijken. Zodra de canule op zijn plaats zit, draait u deze 180 graden en sondeert u voorzichtig naar boven totdat u lichte weerstand voelt. Plaats de EEND DPH-buis die is bestemd voor monstername vlak onder de neus van de muis.

Test de juiste plaatsing van de canule door een minimale hoeveelheid PBS-spoelvloeistof toe te dienen. Als de canule correct is geplaatst, moet er vervolgens een druppel vloeistof rond de NAS van de muis ontstaan. Indien de test-PBS direct uit de bek van het dier komt, trek de canule dan terug en positioneer deze opnieuw door voorzichtig naar voren te tasten tot er een zeer lichte weerstand wordt gevoeld.

Zorg ervoor dat de canule niet te ver voorbij deze weerstand wordt geduwd, anders beweegt u deze voorbij het neuspalatum en door naar de mondholte. Zodra u heeft bevestigd dat de canule correct is geplaatst, dispenseert u snel 200 µL PBS om te helpen bij het verplaatsen en verzamelen van de maximale hoeveelheid cellen. De inhoud moet via de neusgaten van de muis in de opvangbuis stromen.

Plaats het monster onmiddellijk op ijs. Deze monsters kunnen vervolgens worden geanalyseerd op bacteriële belasting en cellulaire rekrutering. Gebruik voor het verzamelen van monsters voor RNA-analyse een aparte gecannuleerde naald met 500 µL RNA-lysebuffer om een tweede nasale lavage uit te voeren.

Houd er rekening mee dat de RNA-lysisbuffer het epitheel zal ontdoen en het omringende weefsel zal vernietigen. Daarom moet er voorzichtigheid in acht worden genomen om contact met organen zoals de longen te vermijden. Indien behoud van deze weefsels gewenst is om de bacteriële belasting in de nasofarynx te kwantificeren, heeft u het volgende nodig.

Epicor-buizen, microbiologische platen met triptische soja-ei-agar aangevuld met 5% schapenbloed. Een vortexmixer, steriele PBS-pipetpunten en P 20- en P 200-pipetten. Werk eerst in een BSL-2-kast en bereid een seriële verdunningsreeks voor elk monster van de nasale lavage van muizen.

Over het algemeen kan worden verwacht dat de concentraties van S pneumoniae in de nasofarynx tussen nul en 10⁴ CFU liggen. Voer daarom drie opeenvolgende tienvoudige verdunningen uit: voeg 10 µL van het onverdunde nasale lavage-monster toe aan de eerste buis tot een concentratie van 10⁻¹ CFU per ml, en ga verder naar beneden tot u drie monsters overmatig heeft verdund. Vortex elke verdunning tussentijds grondig. Let op dat deze video uitsluitend voor demonstratieve doeleinden is.

Correcte laboratoriumtechnieken, waaronder het vervangen van pipetpunten tussen verdunningen, moeten altijd worden nageleefd. Verdeel met een stift uw logische plaat in kwadranten en label de kwadranten met de bijbehorende verdunning die op elke sectie moet worden geplaatst. Breng drie druppels van 10 µL van elke verdunning aan op de agarplaat. Laat deze 15 tot 30 minuten onafgedekt drogen, dek daarna de platen af en plaats ze ondersteboven in een bacteriële incubator met optimale condities voor de groei van pneumokokken, doorgaans 37 °C en 5% CO2.

Incubeer deze platen gedurende 24 tot 48 uur. Verwijder na deze periode de platen en bepaal het aantal koloniserende bacteriën door het gemiddelde te nemen van de op de plaat gevormde kolonies. Voor elke verdunning kunnen animo-kolonies worden geïdentificeerd aan hun kenmerkende beige kleur en hun zones van alfahémolyse, wat kleine halo's rond elke kolonie zijn, veroorzaakt door bacteriële vertering van het bloedsupplement in de agar.

En ten slotte door kleine depressies in het centrum van elke kolonie, waardoor deze het uiterlijk van een erytrocyt krijgt. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een nasofaryngeale kolonisatie bij een muis tot stand brengt, hoe u bacteriën en cellen uit de nasofarynx van een muis isoleert na kolonisatie met behulp van een neusspoeling, en hoe u de bijbehorende bacteriële belasting kwantificeert met microbiologische technieken. We hopen dat de in deze video beschreven methoden u aanmoedigen om een intranasaal kolonisatiemodel te gebruiken om gastheerresponsen op pathogenen te bestuderen in de context van deze onderbelichte regio.