Karakterisering van inflammatoire reacties tijdens intranasale kolonisatie met Streptococcus pneumoniae

Deze procedure omvat kolonisatie van de murn nasopharynx met streptococcus pneumonia en de daaropvolgende extractie van koloniserende bacteriën evenals aanhechtende of gerecruteerd cellen. Dit wordt bereikt door eerst een bacterieel inoculum van de S pneumonia. Te interesseren stam voor te bereiden.

De levende bacteriën worden vervolgens intranasaal toegediend aan geanesthetiseerde muizen terwijl ze in een beperkingsapparaat zitten Na de gewenste lengte van kolonisatie worden muizen vervolgens geëuthanaseerd en nasale lavages worden uitgevoerd door hun blootgestelde luchtpijp te canuleren en de inhoud eruit te spoelen via de nas. Bacterieaantal dat aanwezig is in nasale lavages kan worden gekwantificeerd met behulp van microbiologische technieken. Als alternatief kunnen immuunreacties worden onderzocht met behulp van flowcytometrietechnieken om gerecruteerd cellen te phenotyperen of kwantitatieve PCR-technieken.

Om de niveaus van geëxpremeerd mRNA van interesse te meten voordat je begint, moet je muisbeperkingsapparaatjes voorbereiden voor het intranasale kolonisatiegedeelte van de procedure en canuleerde naalden voor de nasale lavages. Een muisbeperkingsapparaatje kan eenvoudig worden voorbereid door de taps toelopende punt van een 50 milliliter falconbuis af te snijden. Zorg ervoor om schaar te gebruiken om eventuele scherpe uiteinden glad te maken.

Voor de bereiding van canuleerde naalden heb je de volgende PE 20 polyethyleenbuis met een binnendiameter van 0,38 millimeter nodig. Een mililiter spuit wordt afgesloten met 26 en drie acht gauge vernauwde naalden, een paar scherpe, fijne iris schaar, en een paar pincetten. Snijd de PE 20 buis met de fijne schaar in stukken van ongeveer 2,5 centimeter of een inch lengte, ervoor zorgen dat elk uiteinde een vernauwd punt heeft.

Gebruik de pincetten om een van deze stukken voorzichtig op de punt van je naald te schuiven. Vermijd het puncteren van de buiszijde, canuleerde naalden kunnen in 70%ethanol worden bewaard tot ze nodig zijn en worden gespoeld met PBS direct voor gebruik. Voor intranasale kolonisatie van muizen met S pmo, raden we aan een concentratie van 10 tot de negen kolonievormingseenheden per mili te gebruiken, afgeleverd in 10 microliters.

Voor een laatste dosis van 10 tot de zeven CFU, houd het inoculum op ijs tot net voor gebruik en zorg ervoor dat je tussen elke kolonisatie door agiteert. Naast het inoculum heb je ook een P 10 of P 20 pijp met gesteriliseerde pipettenpunten en je muisbeperkingsapparaat nodig. Isoleer een individuele muis aan zijn staart en beperk hem door hem in je eerder voorbereide muisbeperkingsapparaat te plaatsen.

Als je moeite hebt om de muis in de beperkinger te richten, kan het helpen om hem voor en boven de muis te plaatsen, waardoor het dier naar boven kan kruipen. Zodra de muis in de beperkinger zit, bevestig hem aan de basis van zijn lichaam door voorzichtig omhoog te duwen zodat zijn neus uit het taps toelopende uiteinde van de beperkinger komt. Gebruik een P 10 of P 20 pijp om elke muis te inoculeren door 10 microliters van de bereide cultuur te deponeren en deze gelijkmatig tussen beide te verdelen.Nares.

Laat het inoculum in de neus druppelen door de inoculatie te pulseren en neem de tijd die nodig is voor de muis om het inoculum in te ademen. De muis kan een deel van het inoculum uit zijn neus snuiven, wat verwacht wordt. Merk op dat muizen geanesthetiseerd moeten worden voor deze procedure om ervoor te zorgen dat de bacteriën gelokaliseerd blijven in de nasopharynx en niet zich verspreiden naar de lagere luchtwegen.

Voor de doeleinden van deze demonstratie inoculeren we met PBS, maar zorg ervoor dat je de procedure volgens goedgekeurde richtlijnen van het instituut uitvoert wanneer je met levende bacteriën werkt. Bijvoorbeeld, de meeste instellingen zullen vereisen dat kolonisatie wordt uitgevoerd in een bioveiligheidsniveau twee kap. Als je gewichtindicatoren gebruikt als onderdeel van je eindpuntenmonitoring, monitor dan de muizen direct na kolonisatie elke 12 tot 24 uur op klinische symptomen inclusief lethargie, krullend haar en gewichtsverlies.

Zodra muizen zijn gekoloniseerd, houd ze voor de gewenste lengte van de tijd. Aan het einde van deze periode zullen muizen worden geëuthanaseerd en nasale lavage wordt uitgevoerd aangezien cervicale dislocatie de luchtpijp mogelijk kan beschadigen. Deze methode van euthanasie moet worden vermeden.

Voordat je nasale lavages uitvoert, zorg ervoor dat je het volgende bij de hand hebt. Eerder bereide canuleerde naalden, 70% aqueus ethanol, een paar pincetten, een paar scherpe fijne iris schaar, fosfaat, gebufferde zoutoplossing, RNA-lysebuffer, en een mil ijnor buisjes. Zodra je klaar bent om te beginnen, leg het dier plat op zijn rug, en gebruik 70% aqueus ethanol om de voorkant van zijn vacht, met name het nekgebied, te steriliseren.

Zorg ervoor dat ethanol niet toegang heeft tot de nare. Maak een enkele longitudinale snede langs de middellijn van de nek van het dier, waardoor je een opening kunt creëren om de luchtpijp te zien. Pel voorzichtig de huid terug aan beide kanten om het nekweefsel eronder te onthullen.

Op dit punt zou de luchtpijp zichtbaar moeten zijn, omgeven door longitudinale spieren aan weerszijden. Snijd deze voorzichtig af om een duidelijk zicht op de luchtpijp zelf te krijgen, zorg ervoor dat je het omringende vaatweefsel niet doorsnijdt. Als je per ongeluk het vaatweefsel snijdt en er bloed aanwezig is in de regio voordat je verder gaat.

Laat het bloeden stoppen en reinig het gebied vervolgens meerdere keren door steriele PBS te doseren en steriele gaas te gebruiken om overtollig vocht zachtjes op te nemen. Zodra de luchtpijp goed is blootgelegd, maak een transversale halfmaanvormige snede in de luchtpijp ongeveer halverwege. Laat steriele PBS in een canuleerde spuit vallen.

Plaats de canule in de luchtpijp richting de neus, houd de vernauwde rand naar beneden wijzend voor gemakkelijke inbrenging. Zodra de canule op zijn