Bepaling van de toelaatbare vetzuren en Cholera toxine Concentraties behulp Human Intestinal epitheelcellen en BALB / c muis macrofagen

Het algemene doel van deze procedure is het bepalen van tolereerbare concentraties van vetzuren en choleratoxine die de celoverleving niet negatief beïnvloeden. Dit wordt bereikt door eerst het juiste type cellen te kweken. De tweede stap is het incuberen van de cellen met verschillende concentraties van de drie te testen vetzuren of met het choleratoxine.

Na 24 uur wordt de celoverleving beoordeeld met behulp van een MTT-assay. Uiteindelijk tonen de spectrometriegegevens van de MTT-assay de optimale concentraties van vetzuren en choleratoxine aan waarmee cellen kunnen worden behandeld zonder dat de overleving significant afneemt. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de preventie van cholera-infecties, aangezien vaccinaties niet altijd succesvol zijn.

Voor alle co-toxinebepalingen en voor grootschalige concentratiebepaling van vetzuren worden macrophages van Mus musculus uit bowel C-muizen gebruikt; de cellen worden gekweekt in een van twee media: DMEM met L-glutamine aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% antibioticum-antimycoticum of RPMI 1640 basismedium aangevuld met 10% foetaal runderserum, 5% L-glutamine en 1% antibioticum-antimycoticum. Kweek voor dit protocol de bowel C-cellen in vierkante Corning-flasks van 75 cm met geventileerde doppen bij 37 °C, 95% lucht en 5% koolstofdioxide. Voor fijne concentratiebepaling van vetzuren worden menselijke intestinale epitheelcellen gebruikt, gekweekt in vierkante Corning-flasks van 75 cm met geventileerde doppen in HyperCare-medium aangevuld met 10% FPS en 30 ng/mL.

Gebruik voor menselijke EGF geen antibiotica- of antimycotica-reagentia conform de instructies van de fabrikant; incubeer bij 37 °C, 95% lucht en 5% koolstofdioxide. Subcultiveer alle cellen in een verhouding van één op drie bij een confluentie van ongeveer 70%, afhankelijk van het celtype. Cellen worden doorgaans elke twee tot vijf dagen gesubcultiveerd voorafgaand aan de behandeling met vetzuren. Bereid de vetzuren als volgt voor: overbreng eerst oliezuur, linolzuur en linoleenzuur vanuit de door de leverancier verstrekte glazen ampullen naar gesteriliseerde glazen vials. Breng vervolgens elk vetzuur over naar een aparte gesteriliseerde eppendorfbuis.

Los elk vetzuur op in 100% Ethanol met een verdunningsfactor van één op zes, gevolgd door toevoeging van RPMI 1640 incompletemedium tot een uiteindelijke concentratie van 10 µg per µL. Vortex elke oplossing en breng deze over in glazen vials voor bewaring in de vriezer op -20 °C.

Menselijke intestinale epitheelcellen tegen een dichtheid van 2.500 cellen per put in 96-well weefselkweekplaten; voeg het geschikte complete medium toe om het totale volume van elke put op 200 µL te brengen. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C, 95% lucht en 5% CO₂.

Verwijder na de proliferatieperiode van 24 uur het medium. Voeg de overeenkomstige concentraties van elk te testen vetzuur toe aan de wells als positieve controle. Incubeer de cellen met compleet medium als negatieve controle en incubeer de cellen met 70% ethanol.

Voeg daarna volledig medium toe om het totale volume van elke put op 200 microliters te brengen. Incubeer de behandelde platen 24 uur voordat de MTT-assay wordt gestart om het choleratoxine voor de celbehandelingen voor te bereiden. Los het choleratoxine op in PBS in een concentratie van één milligram per milliliter.

Verdeel de oplossing in cryovials en bewaar deze bij twee tot acht graden Celsius vóór de celbehandelingen. Verdun de toxine één op honderd in steriel PBS of incompleet DMEM voor een uiteindelijke werkconcentratie van één nanogram per microliter plaat. Zaai macrofagen in een 96-wells plaat met 2.500 cellen per well.

Incubeer de weellijsten voor weefselkweek bij 37 °C, 95% lucht en 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur. Verwijder na de proliferatieperiode van 24 uur het medium en voeg de juiste testconcentraties cholera toxine toe aan de wells. Vergelijkbaar met de behandelingen met vetzuren, moeten de cellen voor alle monsters en behandelingen worden geïncubeerd met compleet medium als positieve controle en 70% ethanol als negatieve controle.

Gebruik minimaal drie herhalingen, met meer herhalingen voor de positieve controles. Voeg compleet medium toe om het totale volume van elke well aan te vullen tot 200 µL. Incubeer de met choleratoxine behandelde platen gedurende 24 uur voordat de MTT-assay wordt gestart.

24 uur nadat de cellen zijn behandeld met vetzuren of color toin, wordt de celviabiliteit bepaald met de MTT-assay. Verwijder de oplossing in elke well van de te testen 96-well plaat en vervang deze door 200 µL verse complete mediumoplossing.

Voeg 10 µL van een vers bereide MTT-oplossing van 2,5 mg/mL toe aan elke put. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende drie tot vier uur. Verwijder na drie tot vier uur de mediumoplossing en voeg 100 µL 0,04 M zoutzuur in isopropanol toe aan elke put.

Incubeer de plaat gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Draai vervolgens de oplossing uit elke well in een centrifugebuis centrifugeer bij 20.000 ×g gedurende één minuut of tot er een pellet is gevormd. Breng tussen 20 en 40 µL van elk monster over naar een microplatereader en meet de absorptie bij 570 nm met behulp van een spectrofotometer.

Deze figuur toont de overleving van de meeste macrofagen, weergegeven als functie van de positieve controle voor behandelingen met toenemende concentraties oliezuur, linolzuur en linolzuuren. Het is duidelijk dat de cellen concentraties boven de 100 nanograms per microliter voor geen van de vetzuren tolereren. Het experiment werd herhaald met menselijke epitheelcellen voor concentraties lager dan 100 nanograms per microliter in stappen van 10 nanogram per microliter, tot aan 70 nanograms per microliter.

Deze grafiek toont de celoverleving voor elke concentratie oliezuur. Een eenweg-ANOVA gaf aan dat één of meer van de gemiddelden statistisch verschillend waren. Echter, alleen de behandelingen bij hogere concentraties leverden gemiddelden op die statistisch significant verschilden van die van de positieve controle.

Interessant is dat de waargenomen verschillen te wijten waren aan een toename van de celviabiliteit met een grotere variabiliteit. Vergelijkbare resultaten werden behaald voor linolzuur en linolzuuren. Eén manier.

De ANOVA gaf aan dat geen van de behandelgemiddelden statistisch verschilde van het gemiddelde van de positieve controle, maar de variabiliteit lijkt toe te nemen bij sommige van de hogere concentraties, zoals 60 nanograms per microliter linolzuur of linolzuur op basis van deze resultaten. De optimale vetzuurconcentraties bij gebruik van menselijke intestinale epitheelcellen lijken te liggen tussen één en vijf nanograms per microliter. De effecten van variërende concentraties cholera-toxine op de overleving van de meeste macrofagen werden eveneens getest met behandelingen voor toxineniveaus in relatief grote stappen.

Er werd een dalende trend in de levensvatbaarheid van de cellen waargenomen, aangezien de verwachte celviabiliteit sterk varieerde per behandeling. De grote variabiliteit in levensvatbaarheid resulteerde in geen significant verschil tussen het gemiddelde van de positieve controle en een van de behandelingen, wat leidde tot verder onderzoek met toxineniveaus van 100 nanogram of lager. Deze grafiek toont de celviabiliteit voor de behandelingen met lagere toxineniveaus.

De celviabiliteit is zeer variabel voor bijna alle toxineconcentraties, hoewel er als gevolg van de behandelingen lichte toenames in de viabiliteit werden waargenomen. Deze toenames zijn niet statistisch significant voor enige van de behandelingen in vergelijking met het gemiddelde van de positieve controle. Op basis van deze resultaten.

De aanbevolen concentratie van choleratoxine is minder dan 30 nanogram per behandeling bij gebruik van macrofagen uit de milt van C-muizen na ontwikkeling. Deze techniek maakte het voor onderzoekers in het veld van cholera-onderzoek mogelijk om te verkennen of vetzuren de immuniteit tegen infectie met Vibrio cholerae kunnen verbeteren.