Name: Onderzoek van Drosophila Larvale Tracheale Terminal cellen door lichtmicroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Leer een snelle warmtefixatiemethode voor lichtmicroscopie van tracheale terminale cellen in Drosophila larven. Deze techniek maakt kwantitatieve analyse van celmorfologie en genetische screening mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Gillian Stanfield voor commentaar op het manuscript. TAJ wordt ondersteund door de Universiteit van Utah Genetics Training Grant T32-GM007464 van NIH NIGMS.

1. Mozaïek Generation <ol><li> Genetische Cross w FRT 19A bad: GAL80 FLP 122 / Y; Btl-GAL4, UAS-GFP (mannetjes) X * FRT 19A / Bal (vrouwtjes), waarbij * de mutant te worden onderzocht. Opmerking: Stel voorafgaand aan experiment ten minste een dag, omdat dit mogelijk maken de dieren adequaat te paren. </li><li> Pre-lay: Transfer kruis te vliegen-food flesjes met een klein uitstrijkje van verse gist pasta geplaatst op de media. Laat leggen gedurende 1 uur bij 25 ° C. </li><li> Lay: Transfer dieren uit de pre-lay flacon een nieuwe flacon met een kleine uitstrijkje van verse gist pasta. Laten leggen voor 6 uur bij 25 ° C. </li><li> Transfer volwassenen terug naar pre-lay flacon voor opslag en gebruik in de volgende experimenten. Onmiddellijk hitteschok de lay flacon met 0-6 uur oud embryo gedurende 45 min bij 38 ° C, in een circulerend waterbad. Opmerking: Het oppervlak van het eten moet worden onder het waterniveau te controleren alleembryo&#39;s op de juiste wijze te verwarmen geschokt. </li><li> Incubeer warmte geschokt flesjes bij 25 ° C gedurende 4-5 dagen tot derde instar larven beginnen te dwalen. </li></ol> 2. Scherm voor Mosaic Dieren <ol><li> Met behulp van fijne tang voorzichtig pick zwerven derde instar larven van de zijkanten van de flacon en plaats ze in gekoelde 100% glycerol in een klein plastic plaat. </li><li> Onderzoeken larven met behulp van een hoge vergroting-dissectiemicroscoop uitgerust met fluorescerende optica. Identificeer larven met mozaïek expressie van fluorescent gelabelde tracheale cellen. Meestal kan dit worden gedaan op 10-20X vergroting. </li></ol> 3. Warmte Fixatie <ol><li> Met behulp van fijne tang zorgvuldig te kiezen mozaïek dieren uit de schotel en plaats in een daling van verse 100% glycerol op een 75x25x1 mm wit glas microscoopglaasje. Opmerking: meerdere dieren kunnen in de drop (figuur 1A) worden geplaatst. Dieren kunnen ook een druppel glycerol geplaatst direct op een dekglaasje,maar zorg moet worden genomen tijdens fixatie (stap 3.2), als de dieren zal zeer snel opwarmen en kan over-vast geworden. </li><li> Plaats glasplaatje op 70 ° C hitte blok totdat de dieren gewoon stoppen met bewegen, niet meer dan 20 seconden voor een dia, en 10 seconden voor een dekglas (Figuur 1B). Dieren zullen kronkelen aanvankelijk maar stoppen en rigide en langwerpig eens dood. Opmerking: te lange blootstelling aan hitte zal terminal takken en lumen beschadigen en maken het GFP-signaal zwak en diffuus. Voor een optimale efficiëntie is het aanbevolen om de warmte-blok hebben in dezelfde ruimte als de microscopen. </li><li> Met behulp van fijne pincet voorzichtig oriënteren alle larven in de daling in een enkele richting, zodanig dat alle larven op de dia zijn evenwijdig aan elkaar (figuur 1C). </li><li> Plaats voorzichtig een 18x18mm micro dekglas op de top van de larven (of keren de dekglaasje op een glasplaatje) en vermijd het vormen van luchtbellen (figuur 1D). Opmerking: dekglaasje kan niet precies liggenplat op larven, dit is geen probleem. </li><li> Afbeelding larven binnen 30 minuten. Warmte vaste terminal cellen zullen degraderen en GFP signaal zal zeer diffuus geworden. </li></ol> 4. In vivo beeldvorming van Tracheale Terminal Cells <ol><li> Plaats dia op het podium van een verbinding stereomicroscoop. Met behulp van een 5X objectieve zoek naar de twee evenwijdige dorsale boomstammen loopt van anterior naar posterior op het dorsale oppervlak van het dier (Figuur 1F). Zoek de twee dorsale terminale cellen, rechtstreeks tussen de twee dorsale stammen. Dit helpt de geschikte segment voor analyse. </li><li> Eenmaal georiënteerd, draai de dieren op de foto om de gewenste aansluiting cellen. Hiervoor Duw het dekglaasje op de rand met de tang loodrecht op de lengteas van de larven, langzaam rollen de larven onder het dekglaasje (Figuren 1E en 1G). </li><li> Het selecteren van de juiste terminal cellen is essentieel voor consistente resultatenen vergelijkingen tussen mutanten. De dikke lichaam tak (FB)-aansluiting cellen zijn gemakkelijk te vinden naast de dorsale stam, lateraal van de middellijn. De laterale groep G terminal cellen (LG) zijn gemakkelijk te vinden en liggen net lateraal van de ventrale middellijn (figuur 1 H). Opmerking: in de meeste anterior (Tr1) en achterste (TR10) segmenten van de opstelling van de terminal cel is divergent van andere segmenten. Wij analyseren enige terminal cellen in segmenten Tr2-TR9. Dorsale terminale cellen hebben een meer stereotiepe takstand dan andere tracheale terminale cellen. Dit kan afhankelijk zijn van aanvullende, niet-cel-autonome signalen, en dit moet worden overwogen bij de beslissing of ze op te nemen in de analyse. </li><li> Zodra een terminale cel van belang is geïdentificeerd, een opname met de gewenste vergroting, meestal 10X of 20X is het beste (Figuur 2A). Opmerking: als gevolg van variabele vertakking patronen, probeer beelden die zo veel takken en takuiteinden mogelijk zijn vast te leggen. </li><li> Zonder het verplaatsen van het podium, schakel de fluorescentie en zet het doorgelaten licht een helderveld beeld van dezelfde cel en focal plane (Figuur 2B) vast te leggen. Het lumen wordt gevisualiseerd als donkere, contrasterende binnen de terminal celruimte. Als plan kwantificeren terminal cel takken en lumen, verzamel meerdere afbeeldingen in meerdere focale vlakken van elke terminal cel. </li></ol> 5. Analyse en kwantificering van Terminal Celmorfologie behulp ImageJ <ol><li> Open de TL-en helderveld beelden met de ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) plug-in NeuronJ ( <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/" target="_blank">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</a> ). </li><li> Behulp van de functie &quot;Add traces&quot;, handmatig de takken en lumen van de gehele terminal cel traceren. </li><li> Functie &quot;Label traces&quot;, hernoemen en reColor aan elke lijn toe te wijzen binnen het trace een specifieke aanduiding. </li><li> Behulp van de functie &quot;Set-parameters&quot;, stel de lijndikte 6-10 pixels (voor 512x512 beelden verkregen van de digitale camera is aangesloten op de samengestelde microscoop. Voor hogere of lagere resolutie camera&#39;s, moet de pixelbreedte passende wijze worden geschaald), met behulp van alle andere standaardinstellingen en kies &quot;OK&quot;. Maak dan gebruik van de functie &quot;Make snapshot&quot; om een ​​beeld te nemen. Kies &quot;Draw trace&quot; om een ​​momentopname van het spoor dat kan worden aangetoond side-by-side met het origineel te krijgen. </li><li> Selecteer de functie &quot;Meet traces&quot; en selecteer het opsporen soort (dwz die takken te meten op basis van de specifieke aanduidingen toegewezen in stap 5.3). Selecteer vervolgens &quot;Toon tracing metingen&quot; en &quot;Clear eerdere metingen&quot; en klik op &quot;RUN&quot;. Dit zal een werkblad met de naam, label, lengte (in pixels), en andere gegevens voor de afbeelding bevat produceren. Deze gegevens kunnen vervolgens worden opgeslagen als een Microsoft Excel-spreadsheet voor verdere statistischeanalyse. </li></ol>

<ol><li>Manning, G., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+Tracheal+System%5BTitle%5D)+AND+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila Tracheal System.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).</li>
<li>Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+regulation+of+airway+branching+in+Drosophila+is+mediated+by+branchless+FGF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF.</a> Cell. 99 (2), 211-220 (1999).</li>
<li>Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+interactions+among+epithelial+cells+during+tracheal+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis.</a> Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).</li>
<li>Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Zpr1+%28Zinc+Finger+Protein+1%29+Is+Required+Downstream+of+Both+EGFR+And+FGFR+Signaling+in+Tracheal+Subcellular+Lumen+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45649(2012).</li>
<li>Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+screen+for+tube+morphogenesis+and+branching+genes+in+the+Drosophila+tracheal+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002087(2011).</li>
<li>Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonal+genetic+screen+for+mutants+causing+defects+in+larval+tracheal+morphogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila.</a> Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).</li>
<li>Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whacked+and+Rab35+polarize+dynein-motor-complex-dependent+seamless+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth.</a> Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).</li>
<li>Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+talin+and+integrin+genes+are+required+for+maintenance+of+tracheal+terminal+branches+and+luminal+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization.</a> Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).</li>
<li>Jones, T. A., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+for+the+PAR+complex+in+subcellular+morphogenesis+of+tracheal+terminal+cells+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).</li>
<li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+GFP%2F%C3%9F-galactosidase+fusion+protein+as+a+marker+for+morphogenesis+in+living+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila.</a> Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).</li>
<li>Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+autonomy+of+HIF+effects+in+Drosophila%3A+tracheal+cells+sense+hypoxia+and+induce+terminal+branch+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting.</a> Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financieel belang.

De thermofixatie hier beschreven techniek is een snel en handig hulpmiddel voor beeldvorming Drosophila larven tracheale terminale cellen. Hier gebruiken we deze techniek de vertakking en lumen patroon van wildtype cellen onderzocht. Tracheale cellen die GFP, gedreven door de tracheale specifieke promotor ademloos, kan eenvoudig worden gevisualiseerd door het larvale cuticula na thermofixatie. De specifieke vertakking patronen van afzonderlijke terminal cellen, evenals die van de met lucht gevulde lume...

Celvorm is cruciaal voor de functie van afzonderlijke cellen in een organisme, alsook cellen die als onderdeel van een weefsel of orgaan. We gebruiken Drosophila tracheale cellen terminal, een component van het insect luchtwegen, de moleculaire mechanismen die aan de controle twee geconserveerde types van cellulaire morfologie onderzoeken: vertakking en buisvorming (lumenogenesis). Terminal cellen zich aan de uiteinden van een netwerk van vertakte buizen die functies zuurstof aan interne weefsels 1 en hebben een uitgebreide vertakte morfologie die afhangt van een FGF signaling pathway die wordt bestuurd door de lokale zuurstofconcentratie in doelweefsels 2. Terminale cel takken zijn dunne buisjes, met een gasgevulde subcellulaire lumen loopt door elke tak. De van cellulaire architectuur van terminale cellen, samen met het gemak waarmee genetische analyse kan worden uitgevoerd in Drosophila, maken deze cellen een uitstekend model fof onderzoeken van mechanismen van cellulaire uitgroei, vertakking, en intracellulaire buis formatie. Terminale cellen hebben een bruikbaar model voor het begrijpen van een aantal van de signaalwegen die leiden tot vertakte celdifferentiatie, uitgroei en rijping 2-4 bewezen. Met behulp van dit systeem onpartijdige, zijn forward genetische schermen voor mobiele morfogenese mutanten uitgevoerd, waardoor inzicht in mechanismen die de cel vorm 5,6. Zo hebben deze schermen gebleken dat een bepaald RabGAP vereist voor cytoskelet polariteit en vesicle handel in lumen vorming en positionering 7, dat integrine-gemedieerde hechting vereist voor branch stabiliteit 8, en die PAR-epitheliale polariteit eiwitten reguleren gepolariseerde membraantransport vereist zowel vertakking en lumen vorming 9. Andere studies in terminal cellen hebben aangetoond dat asymmetrische actine accumulatie en microtubuli organisatie is nodig voor cel-rek en lumenogenesis <sup&gt; 10. Zo divers, geconserveerde celbiologische mechanismen bijdragen tot terminale cel morfogenese. Hier beschrijven we een methode om snel te repareren intact derde instar Drosophila larven voor de analyse van de terminal cel vertakking en lumen vorming. Dit protocol kan ook worden uitgevoerd op zowel eerste als tweede instar dieren. Sleutel tot deze techniek is de mogelijkheid om terminal cellen die genetisch gemerkt door fluorescerend eiwit expressie rechtstreeks via de larvale cuticula van intacte dieren te visualiseren. Aangezien deze procedure vereist geen post-fixatie manipulaties, zoals antilichaam kleuring, de cellen nemen, is het geschikt voor hoge doorvoer analyse, waaronder genetische of drug screening. Fluorescent eiwitexpressie toont de structuur van het cytoplasmatisch gevulde takken. De buisvorming kan worden gecontroleerd parallel met helderveld microscopie gas gevulde lumen, die afwijkt van de omringende vloeistof-vul identificerened weefsels. Inbegrepen in dit protocol is de methode voor het genereren van genetische mozaïeken gebaseerd op het marcm systeem 11, om homozygote mutant terminal cellen gelabeld met fluorescerende eiwitten in andere niet-gemerkte dieren produceren. Dit is nodig, omdat terminal cellen alleen werken hun complexe structuren relatief laat in de ontwikkeling; genetische mozaïeken zorgen voor bypass van gen-eisen in andere weefsels eerder in ontwikkeling. . Om marcm klonen te genereren, zijn luchtpijp geëtiketteerd met de tracheale-specifieke driver ademloos (BTL) 12 Beschreven hier is het protocol voor de Drosophila X-chromosoom, voor andere chromosomen, kan een soortgelijke procedure worden toegepast, met genetische reagentia geschikt om het chromosoom zijn onderzocht. Hier trachea worden gelabeld door expressie van een cytoplasmatisch gelokaliseerde GFP, maar de procedure werkt even goed met de expressie van andere fluorescerende eiwitten, zoals DsRed. Daarnaast hebben we een methode vertakkingspatronen en vorming lumen kwantificeren terminal cellen, gebaseerd op technieken ontwikkeld voor de karakterisering van neuronale branch patronen 13. Dit soort van kwantitatieve data kan kritisch zijn in het onderscheiden van de precieze rol van genen in de vertakking of lumenogenesis proces evenals waardoor directe vergelijkingen tussen verschillende mutanten 9.

<table><tbody><tr><td>Student Dumont #5 forceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Leica MZ16 Dissecting microscope (of equivalent)</td><td>Leica</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td>AxioImager M1 compound microscope (of equivalent)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Uitgerust met AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE</td></tr><tr><td>100% Glycerol</td><td>BioExpress</td><td>M152-4L</td><td></td></tr><tr><td>Fly stock</td><td></td><td></td><td>Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A</td></tr><tr><td>Fly stock</td><td></td><td></td><td>Genotype: y w FRT19A</td></tr></tbody></table>

onderzoek van<em&gt; drosophila</em&gt; larvale tracheale terminal cellen door lichtmicroscopie

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Cel vorm is van cruciaal belang voor de celfunctie. Echter, ondanks het belang van de cel morfologie, is weinig bekend over hoe individuele cellen te genereren specifieke vormen. Drosophila tracheale terminal cellen een krachtig genetisch model te identificeren en verhelderen van de rollen van genen die nodig zijn voor het genereren van cellulaire morfologie zijn geworden. Terminal cellen zijn een onderdeel van een vertakte buisvormige netwerk, de tracheale systeem dat functioneert zuurstof naar interne weefsels. Terminale cellen zijn een uitstekend model voor het onderzoeken van de vragen van de cel vorm als ze beschikken over twee verschillende cellulaire architecturen. Eerste, terminale cellen hebben een uitgebreid vertakte morfologie, vergelijkbaar met complexe neuronen, ten tweede, zijn terminal cel takken gevormd als dunne buizen en bevatten een membraan-gebonden intracellulaire lumen. Kwantitatieve analyse van terminale cellen filiaalnummer, branch organisatie als filialen vorm, kan worden gebruikt om informatie over de rol van specifieke genetische mech biedennismen in het maken van een vertakte cel. Analyse van buisvorming in deze cellen kan onthullen geconserveerde mechanismen tubulogenesis bij andere buisvormige netwerken, zoals de vertebraat vaatstelsel. Hier beschrijven we technieken die kunnen worden gebruikt om snel oplossen, beeld en analyseren zowel vertakkingspatronen en vaatvorming in terminal cellen in Drosophila larven. Deze technieken kunnen worden gebruikt om cellen te analyseren terminal in wild-type en mutante dieren of genetische mozaïeken. Vanwege het hoge rendement van dit protocol, is het ook zeer geschikt voor genetische, RNAi-gebaseerde, of drug-schermen in het Drosophila tracheale systeem.

Resultaten worden getoond in Figuur 2. Een laterale groep (LG) terminal cel geeft uitgebreide subcellulair vertakking (gevisualiseerd door GFP, A) en een gas-gevulde subcellulaire lumen die door elk van de takken (gevisualiseerd door helderveld microscopie, B). Deze beelden werden verzameld uit een mozaïek L3 larve, gegenereerd met behulp van het marcm systeem in de paragrafen 1 en 2 beschreven, en de warmte vast en afgebeeld, zoals beschreven in de hoofdstukken 3 en 4. Panelen C &amp; D tonen een Neuro...

Hier presenteren we een methode voor lichtmicroscopie analyse van tracheale terminal cellen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven. Deze methode zorgt voor een snelle behandeling van de tak en lumen morfologie in hele dieren en bruikbaar voor de analyse van individuele mutanten of schermen voor mutaties die terminale cel ontwikkeling zou zijn.

Onderzoek van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Tracheale Terminal cellen door lichtmicroscopie

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

Het algemene doel van deze procedure is om intacte drosophila-larven snel te fixeren om de morfologie van vertakkingen en buisjes in tracheale terminale cellen te kunnen beelden. Dit wordt bereikt door eerst homozygote, met fluorescent eiwit gelabelde terminale cellen te genereren in genetisch mozaïekdieren. De tweede stap van de procedure is het verzamelen van mozaïeklarven en deze te fixeren met behulp van hitte.De derde stap is het in beeld brengen van gelabelde terminale cellen in gefixeerde dieren met behulp van GFP-expressie om vertakkingen te observeren en lichtveldmicroscopie om buisjes te observeren. De laatste stap is het kwantificeren van de morfologie van de terminale cellen. Uiteindelijk kunnen de resultaten worden gebruikt om verschillende cellulaire morfologieën van wild-type en mutante terminale cellen te onderscheiden en te categoriseren.Het enkele voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken, zoals chemische fixatie, is dat deze techniek extreem snel is, waardoor deze kan worden gebruikt voor high-throughput analyse van tracheale terminale cellen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat het selecteren van L3-larven en het snel fixeren ervan om hun morfologie te behouden, aandacht en zorgvuldigheid vereist. Om mozaïekvliegen te maken.Gebruik de Mark M-techniek bij vrouwtjes die de te onderzoeken mutatie dragen. Zet de kruisingen op in pre-lay flesjes met een laagje verse gistpasta en laat de vliegen gedurende één uur eieren leggen bij 25 °C. Verplaats de vliegen vervolgens van het pre-lay flesje naar een nieuw flesje met verse gistpasta en laat ze zes uur lang eieren leggen bij 25 °C.Breng de volwassenen na zes uur onmiddellijk terug naar de pre-leg vials voor opslag en gebruik in daaropvolgende experimenten. Geef de verzamelde leg vials een hittestoot in een circulerend waterbad gedurende 45 minuten bij 38 °C; het oppervlak van het voedingsmedium moet onder het waterniveau liggen om te garanderen dat alle embryo's op de juiste wijze een hittestoot ondergaan. Incubeer de vials na de hittestoot vervolgens vier tot vijf dagen bij 25 °C tot de derde instar-larven zijn bereikt.Laat de larven beginnen te dwalen met behulp van een fijne pincet. Pak de dwalende larven in het derde stadium voorzichtig op van de wanden van het vial en plaats ze in een klein plastic plaatje met gekoeld 100% glycerol. Onderzoek de larven met een dissectiemicroscoop met hoge vergroting, uitgerust met fluorescentie-optiek bij een vergroting van 10 x of 20 x.Identificeer de larven met mozaïekexpressie van fluorescent gelabelde tracheaalcellen. Pak deze dieren vervolgens voorzichtig op met een fijne pincet en plaats ze in een druppel verse 100% glycerol op een wit glazen microscoopglaasje. Meerdere dieren kunnen in de druppel worden geplaatst in dezelfde ruimte als de microscoop.Plaats het glazen objectglas op een warmteblok van 70 °C totdat de dieren net stoppen met bewegen, wat binnen 20 seconden gebeurt. Aanvankelijk kronkelen de dieren, maar ze worden daarna rigide en langgerekt. Een te lange blootstelling na de dood leidt tot hittebeschadiging van de terminale takken alsmede schade aan de lumina.Het GFP-signaal wordt zwak en diffuus. De timing van de hittefixatie is cruciaal, omdat overfixatie de cellen kan beschadigen, wat leidt tot misleidende of problematische analyses. De monsters moeten daarom in het hitteblok worden geplaatst en worden gefixeerd tot ze net stoppen met bewegen, maar niet langer.Gebruik nu een fijne pincet om alle gefixeerde larven zorgvuldig parallel aan elkaar te plaatsen. Plaats vervolgens voorzichtig een micro-dekglaasje op de larven en voorkom dat er luchtbellen ontstaan. Het dekglaasje is mogelijk niet geheel vlak, maar dit vormt geen probleem.Maak binnen de volgende 30 minuten beelden van de larven, aangezien de hittegefixeerde terminale cellen snel degraderen en de GFP-signalen zeer diffuus worden. Plaats vervolgens het preparaat op de tafel van een compound stereomicroscoop.Lokaliseer met een 5x objectief de twee parallelle dorsale stammen die van anterieur naar posterieur over het dorsale oppervlak van het dier lopen. Lokaliseer vervolgens de twee dorsale terminale cellen die zich direct tussen de twee dorsale stammen bevinden. Dit helpt bij het identificeren van het juiste segment voor analyse.Zodra de oriëntatie is bepaald, roteert u de dieren om de gewenste terminale cellen in beeld te brengen door voorzichtig met een pincet tegen de rand van het dekglas te duwen. Door dit loodrecht op de lengteas van het dier te doen, rollen de larven langzaam. Het selecteren van de juiste terminale cellen is cruciaal voor consistente resultaten en vergelijkingen tussen mutanten.De terminale cellen van de vetlichaamtakken zijn eenvoudig te vinden naast de dorsale stam, lateraal van de middellijn. De terminale cellen van de laterale groep G zijn eenvoudig te vinden en bevinden zich net lateraal van de ventrale middellijn in de meest anterieure en posterieure segmenten. De rangschikking van de terminale cel wijkt af van die in andere segmenten.Deze segmenten moeten niet worden onderzocht; richt u in plaats daarvan op de cellen en segmenten. De dorsale terminale cellen van TR twee tot negen vertonen een meer stereotiep vertakkingspatroon dan andere tracheale terminale cellen. Dit kan afhangen van aanvullende niet-celautonome signalen, en dit moet in overweging worden genomen bij de beslissing of ze in de analyse moeten worden opgenomen.Zodra een terminale cel van belang is geïdentificeerd, maakt u een afbeelding met een vergroting van 10 x of 20 x vanwege de variabele vertakkingspatronen. Probeer afbeeldingen vast te leggen die zoveel mogelijk takken en takuiteinden bevatten zonder de tafel te verplaatsen. Schakel de fluorescentie uit en zet het doorgelaten licht aan.Om een brightfield-afbeelding van dezelfde cel en hetzelfde brandvlak vast te leggen, wordt het lumen sterk gecontrasteerd binnen de terminale celruimte. Om de terminale celvertakkingen en lumen te kwantificeren, worden meerdere afbeeldingen in meerdere brandvlakken van elke terminale cel verzameld. Sommige cellen vereisen slechts één afbeelding om voldoende gegevens te verzamelen, terwijl andere tot wel drie afzonderlijke afbeeldingen op verschillende brandvlakken kunnen vereisen.Om alle vertakkingen vast te leggen, opent u de fluorescentie-eind brightfield-afbeeldingen in ImageJ met de geïnstalleerde NeuronJ-plugin. Gebruik de 'add tracings'-tool om handmatig de vertakkingen en het lumen van de gehele terminale cel te traceren; gebruik vervolgens de 'label tracings'-tool om deze te hernoemen en van kleur te veranderen, zodat elke lijn binnen de tracering een specifieke aanduiding krijgt voor afbeeldingen van 512 bij 512 pixels. Gebruik de 'set parameters'-tool om de lijnbreedte aan te passen van 6 naar 10 pixels.Schaal afbeeldingen met een hogere of lagere resolutie dienovereenkomstig. Laat de overige instellingen op hun standaardwaarden staan en klik op ok. Gebruik vervolgens de tool voor het maken van een snapshot.Om een afbeelding te maken, kiest u voor 'draw Trace' om een momentopname van het spoor te krijgen die naast het originele beeld kan worden weergegeven. Selecteer de tool 'measure tracings' en selecteer het spoor. Typ de vertakkingen die gemeten moeten worden op basis van de specifieke aanduidingen.Select vervolgens de optie voor het weergeven van tracing-metingen. Wis daarna de vorige metingen en klik op run. Er wordt dan een spreadsheet gegenereerd met de naam, het label, de lengte in pixels en andere gegevens van de afbeelding, die kan worden opgeslagen voor statistische analyse.Het beschreven protocol werd gevolgd om gemuteerde tracheale cellen in Mosaic L3-larven te analyseren, gevisualiseerd met GFP. De enkelvoudige laterale groepsterminale cel, aangeduid als LG, vertoont uitgebreide subcellulaire vertakkingen onder helderveldmicroscopie. Met behulp van Neuron J is een met gas gevuld subcellulair lumen zichtbaar dat door elke vertakking loopt. Er werd een trace van de vertakkingen gemaakt, evenals een trace van het lumen. In dit niet-mozaïekdier is de vetlijf-terminale cel, aangeduid als FB, geïdentificeerd.Let op dat GFP tot expressie komt in het gehele tracheaal systeem. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u beelden snel kunt fixeren en kwantitatieve analyses kunt uitvoeren op tracheale terminale cellen in intacte dieren na hun ontwikkeling. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers om tracheale terminale cellen te gebruiken als een cruciaal model voor het begrijpen van aspecten van celmorfogenese met behulp van tracheale terminale cellen.

examination-drosophila-larval-tracheal-terminal-cells-light

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een proces voor fixatie, inbedden, snijden, en de beeldvorming van laat...

De voorbereiding van embryo&#39;s voor Elektronenmicroscopie van de Drosophila Embryonale hart buis

Dissectie en Imaging van Active Zones in de Drosophila Neuromusculaire Junction

Om te begrijpen hoe complex cel vormen, zoals neuronale dendrieten, worden bereikt tijdens de ontwikkeling, is het belangrijk om nauwkeurig te kunnen assay microtubuli organisatie. Hier beschrijven we een robuuste immunohistologische etikettering methode om microtubule organisatie van de dendritische arborization neuron zintuiglijke dendrieten, de luchtpijp, spier-onderzoeken en...

Immunohistologische Etikettering van microtubuli in Sensory Neuron Dendrieten, luchtpijp, en de spieren in de Drosophila Larve Body Muur

Deze video beschrijft de Drosophila-lymfklier - de primaire plaats van hematopoiese in de vlieglarve - en toont een voorbeeldprotocol om het orgaan te ontleden en te monteren voor immunohistochmie en fluorescerende beeldvorming.

Larvale lymfklierdissectie: het isoleren van het Drosophila Hemocyt-producerende orgaan

Deze video beschrijft de Drosophila ringklier, een complexe endocriene structuur die belangrijk is voor biosynthese en afscheiding van ecdysteroïden en andere hormonen. Het aanbevolen protocol demonstreert de dissectie, fixatie en immunostaining.

Larvale ringklierdissectie: isolatie van ontwikkelingsedocriene organen van Drosophila

Source: Jeong, S. Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the visualization of axonal projections in Drosophila embryos. Immunolabeling of motor neurons, precise dissection to expose neuronal structures, and differential interference contrast microscopy collectively reveal detailed neuronal architecture, emphasizing the axonal projection patterns.

Visualization of Axonal Projection Patterns of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Een eenvoudige en betrouwbare techniek voor het visualiseren en kwantificeren luchtwegen trilharen beweeglijkheid en trilharen gegenereerde stroom met behulp van de muis luchtpijp wordt beschreven. Deze techniek kan worden aangepast om te bepalen hoe een groot aantal factoren beïnvloeden cilia motiliteit, zoals farmacologische agentia, genetische factoren, omgevingsfactoren blootstelling en / of mechanische factoren zoals slijm belasting.

Ex vivo methode voor High Resolution Imaging van Cilia Motility in Knaagdieren luchtwegepithelen

Immuunkleuring is een effectieve techniek voor het visualiseren van specifieke celtypen en eiwitten in weefsels. Door het gebruik van sonicatie vermindert het hier beschreven protocol de noodzaak om Drosophila melanogaster weefsels van laat-stadium embryo's en larven te dissekeren voordat immunokleuring wordt uitgevoerd. We bieden een efficiënte methodologie voor de immunokleuring van formaldehyde-gefixeerde hele larven.

-Sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van Late-fase embryonale en larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Weefsels<em&gt; In Situ</em

Drosophila en zoogdieren hematopoietische systemen hebben veel gemeenschappelijke kenmerken, waardoor Drosophila een aantrekkelijke genetische model om hematopoiese te bestuderen. Hier laten we dissectie en montage van grote larvale hematopoëtische organen voor immunohistochemie. We beschrijven ook werkwijzen om verschillende larvale hematopoietische compartimenten waaronder circulerende hemocytes sessiele kristalcellen testen.

Methoden om Onderzoek de lymfeklier en Hemocytes in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

We beschrijven een methode voor het retrograde traceren van de Drosophila embryonale motorneuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen.

Retrograde tracing van Drosophila embryonale motor neuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen

Leer een snelle warmtefixatiemethode voor lichtmicroscopie van tracheale terminale cellen in Drosophila larven. Deze techniek maakt kwantitatieve analyse van celmorfologie en genetische screening mogelijk.

Onderzoek van

Meer video's verkennen