Flowcytometrische analyse van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie: Een High Throughput kwantitatieve methode om eiwit-eiwit interactie Studie

Het algemene doel van deze procedure is om locaties van ACAP LBC-interactie met PDE vier D drie in kaart te brengen. Dit gebeurt door de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van biomoleculair, fluorescentie, complementatie of BC te meten met behulp van flowcytometrie. Hiervoor worden cellen getransfecteerd met ACAP LBC en PDE vier D drie fragmenten gefuseerd met het N- of C-terminale deel van het fluorescerende reportereiwit.

Vervolgens wordt Venus Flow cytometrie uitgevoerd om de fluorescentie te beoordelen als de eiwitfragmenten interageren, wordt Venus voltooid en wordt fluorescentie gedetecteerd. Als de eiwitfragmenten niet interageren, wordt geen fluorescentie gedetecteerd. Aanvullende westerse bloedanalyse wordt uitgevoerd om de relatieve eiwitexpressieniveaus te bepalen.

De sterkte van de eiwit-eiwitinteracties wordt vervolgens berekend door YFP gemiddelde fluorescentie-intensiteit te normaliseren met eiwitexpressieniveaus. De resulterende gegevens geven aan dat de binding van PDE 43 aan ACAP LBC wordt gemedieerd door meerdere regio's binnen PDE 43, voornamelijk via upstream conserved region one of UCR one. De belangrijkste voordelen van deze techniek boven bestaande methoden zoals co-immunoprecipitatie en BP C met behulp van een microscoop zijn dat het relatief eenvoudig is, gevoelig is en de snelle screening van een groot aantal cellen vergemakkelijkt.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in eiwit-eiwitinteracties, kan deze ook worden gebruikt om factoren te screenen die eiwit-eiwitinteracties reguleren voor medicijnontdekking. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat een lineaire B-respons moet worden bepaald. Een expressie van construct moet vergelijkbaar zijn, zodat resultaten van verschillende eiwitfragmenten met elkaar kunnen worden vergeleken.

In de hier beschreven experimenten worden de cellen gecot-getransfecteerd met het N-terminale fragment van de YFP-afgeleide, Venus gefuseerd met volledige ACAP LBC en het C-terminale fragment van Venus gefuseerd met een van de volgende, volledige lengte PDE E 43, de upstream conserved region one UCR one van PDE E 43 of de upstream conserved region two plus katalytische regio UCR R two plus CAT van PDE 43 de dag vóór transfectie in zes. Wel, weefselkweek platen zaai 1,2 keer 10 tot de vijfde HEC 2 9 3 T-cellen per put in twee milliliters volledige groei. Medium zaai, drie controleputten plus drie putten voor elk van de test.

Cotran incuberen bij 5% koolstofdioxide bij 37 graden Celsius een nacht. De volgende dag bereid voor transfectie van de BC plasma DNA-constructen en CFP-vector, die gecot-getransfecteerd is met BS C-constructen als marker. Voeg voor elke conditie de juiste hoeveelheid DNA toe aan 250 microliters van Optum M1 serumvrij medium.

In een steriele buis, is één buis voldoende om drie putten te transfecteren. Voeg vervolgens drie microliters van transit LT een reagens voor elke microgram toe aan de verdunde DNA-mengsel en pipet voorzichtig om te mengen. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Na de incubatie voegt u 250 microliters van de transfectiemengsel druppelsgewijs toe aan de cellen en incubeer vervolgens bij 5% koolstofdioxide bij 37 graden Celsius, 24 uur.

Controleer na de transfectie fluorescentie onder een epi-fluorescentiemicroscoop, de cellen zouden gele fluorescentie moeten vertonen voor BC-signaal en CFP-fluorescentie voor het rapporteren van transfectie-efficiëntie. Om de cellen voor flowcytometrische analyse voor te bereiden, was ze eerst met twee milliliters ijskoud PBS en los vervolgens de cellen door 250 microliters van 0,05% Trypsin toe te voegen. Incubeer gedurende twee tot vijf minuten bij 37 graden Celsius. Controleer vervolgens onder een microscoop op celloslating.

Zodra de cellen zijn losgelaten, neutraliseer de trypsine met één milliliter DMEM. Breng vervolgens één milliliter cellen over in één microcentrifugebuis en breng 0,25 milliliter cellen over in een tweede microcentrifugebuis. Laat de buizen draaien bij 500 g gedurende vijf minuten.

De 250 microliter-monster wordt verder verwerkt voor flowcytometrie. Zet het één milliliter-monster opzij op ijs voor westerse bloedanalyse, die parallel dient te worden uitgevoerd na de spin Resus. Suspendeer de cellen in 250 microliters fax-buffer en plaats ze op ijs. Cellen kunnen ook worden gefixeerd in 1% Paraform aldehyde in PBS Als flowcytometrie-analyse niet onmiddellijk zal worden uitgevoerd, wordt flowcytometrie uitgevoerd met behulp van een Beckman Coulter cyan a DP uitgerust met 488 nanometer 405 nanometer en 642 nanometer solid-state lasers. Summit-software wordt gebruikt voor acquisitie en analyse na kalibratie van de flowcytometer met behulp van standaardkralen. Plot voorwaartse verstrooiing of FSC tegen zijwaartse verstrooiing SSC op een lineaire schaal en gai op de levende celpopulatie.

Plot vervolgens SSC tegen de voltagepulsbreedte en gai op de niet-geaggregeerde levende celpopulatie. Plot vervolgens FSC op een lineaire schaal tegen CFP-fluorescentie bij 405 FL zes op dit instrument op een logaritmische schaal en gai op de niet-geaggregeerde levende CFP-positieve cellen. Ten slotte plot FSC op een lineaire schaal tegen YFP-fluorescentie bij 488 nanometer FL een op dit instrument op een logaritmische schaal om BC-intensiteit te visualiseren.

Vervolgens draait u het Y-F-P-C-F-P dubbel-negatieve monster en past u de F-S-C-S-S-C FL een en FL zes fotomultiplier tube of PMT-spanning aan om de drempel voor elk signaal in te stellen. Vervolgens draait u zowel YFP- als CFP-enkel positieve monsters voor toekomstige offline compensatie. Zorg ervoor dat u minimaal 10.000 gegatede gebeurtenissen verwerft.

Verzamel ten slotte gegevens voor experimentele monsters na gegevensverzameling. Stel het analyseprotocol in zoals bij acquisitie met propageren met poort één in FS CSC stipplot voor levende cellen. Gate twee in FSC-puls met stipplot van poort één voor niet-geaggregeerde levende cellen en gate drie in ccfp FSC stipplot van poort twee voor niet-geaggregeerde ccfp-positieve levende cellen.

Na compensatie voor YFP-