Flowcytometrische analyse van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie: Een High Throughput kwantitatieve methode om eiwit-eiwit interactie Studie

Het algemene doel van deze procedure is het in kaart brengen van de interactieplaatsen van ACAP LBC met PDE four D three. Dit gebeurt door de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van biomoleculaire fluorescentie-complementatie (BC) te meten met behulp van flowcytometrie. Hiervoor worden cellen getransfecteerd met ACAP LBC- en PDE four D three-fragmenten die gefuseerd zijn aan het N- of C-terminale gedeelte van het fluorescerende reportereiwit.

Vervolgens wordt flowcytometrie voor Venus uitgevoerd om de fluorescentie te beoordelen als de eiwitfragmenten interageren; Venus is voltooid en fluorescentie is waarneembaar. Als de eiwitfragmenten niet interageren, wordt er geen fluorescentie gedetecteerd. Er wordt een aanvullende western blot-analyse uitgevoerd om de relatieve eiwitexpressieniveaus te bepalen.

De sterkte van de eiwit-eiwitinteracties wordt vervolgens berekend door de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van YFP te normaliseren met de eiwitexpressieniveaus. De resulterende gegevens geven aan dat de binding van PDE 43 aan ACAP LBC wordt gemedieerd door meerdere regio's binnen PDE 43, voornamelijk via de upstream conserved region one of UCR one. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals co-immunoprecipitatie en BRET met behulp van een microscoop zijn dat deze relatief eenvoudig is, sensitief is en de snelle screening van een groot aantal cellen faciliteert.

Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in eiwit-eiwitinteracties, kan deze ook worden gebruikt om te screenen op factoren die eiwit-eiwitinteracties reguleren voor geneesmiddelenonderzoek. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat een lineaire B-respons moet worden bepaald. De expressie van het construct moet vergelijkbaar zijn, zodat resultaten met verschillende eiwitfragmenten met elkaar vergeleken kunnen worden.

In de hier beschreven experimenten worden de cellen gecotransfecteerd met het N-terminale fragment van het YFP-derivaat Venus gefuseerd aan full-length ACAP LBC en het C-terminale fragment van Venus gefuseerd aan een van de volgende componenten: full-length PDE E 43, de upstream conserved region one UCR one van PDE E 43 of de upstream conserved region two plus catalytic region UCR R two plus CAT van PDE 43. Zaai de dag voor transfectie in zes-wells weefselkweekplaten 1,2 × 10⁵ HEC 2 9 3 T-cellen per well in 2 mL compleet groeimedium. Zaai drie controlewells plus drie wells voor elk van de tests.

Incubeer de cellen overnight bij 5% koolstofdioxide bij 37 graden Celsius. Bereid de volgende dag de transfectie van de BC plasma DNA-constructen en de CFP-vector voor, die samen met de BS C-constructen wordt getransfecteerd als marker. Voeg voor elke conditie de juiste hoeveelheid DNA toe aan 250 microliters Optum M1 serumvrij medium.

In een steriele buis, waarbij één buis voldoende is om drie wells te transfecteren, worden drie microliter TransIT-L1-reagens per microgram toegevoegd aan het verdunde DNA-mengsel. Meng dit voorzichtig met een pipet en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na de incubatie 250 microliter van het transfectiemengsel druppelsgewijs toe aan de cellen en incubeer vervolgens gedurende 24 uur bij 37 °C in 5% CO₂.

Controleer na transfectie de fluorescentie onder een epifluorescentiemicroscoop; de cellen moeten gele fluorescentie vertonen voor het BC-signaal en CFP-fluorescentie voor de rapportage van de transfectie-efficiëntie. Om de cellen voorly voor flowcytometrische analyse voor te bereiden, was ze eerst met twee milliliter ijskoude PBS en detach vervolgens de cellen door 250 microliters 0,05% Trypsine toe te voegen; incubeer dit gedurende twee tot vijf minuten bij 37 graden Celsius. Controleer daarna met een microscoop of de cellen zijn gedetacheerd.

Zodra de cellen zijn losgekomen, neutraliseert u de trypsine met 1 mL DMEM. Breng vervolgens 1 mL cellen over naar een microcentrifugebuisje en breng daarna 0,25 mL cellen over naar een tweede microcentrifugebuisje. Centrifugeer de buisjes 5 minuten lang bij 500 g.

Het monster van 250 µL zal verder worden verwerkt voor flowcytometrie. Zet het monster van 1 mL op ijs apart voor western blot-analyse, die parallel moet worden uitgevoerd na de resuspensie na centrifugatie. Suspendeer de cellen in 250 µL FACS-buffer en plaats ze op ijs; cellen kunnen ook worden gefixeerd in 1% paraformaldehyde in PBS. Indien de flowcytometrie-analyse niet onmiddellijk plaatsvindt. Flowcytometrie wordt uitgevoerd met een Beckman Coulter CytoFLEX uitgerust met 488 nm, 405 nm en 642 nm solid-state lasers. Summit-software wordt gebruikt voor acquisitie en analyse. Na het kalibreren van de flowcytometer met standaard beads, wordt de forward scatter (FSC) uitgezet tegen de sideward scatter (SSC) op een lineaire schaal, waarna wordt gegated op de populatie levende cellen.

Zet vervolgens de SSC uit tegen de spanningspulsbreedte en gate op de populatie niet-geaggregeerde levende cellen. Zet daarna FSC op een lineaire schaal uit tegen CFP-fluorescentie bij 405 FL zes op dit instrument op een logaritmische schaal en gate op de niet-geaggregeerde levende CFP-positieve cellen. Zet tot slot FSC op een lineaire schaal uit tegen YFP-fluorescentie bij 488 nanometers FL één op dit instrument op een logaritmische schaal om de BC-intensiteit te visualiseren.

Run vervolgens het Y-F-P-C-F-P dubbel negatieve monster en pas de spanning van de F-S-C-S-S-C FL one en FL six fotomultiplicatierbuis of PMT aan om de drempelwaarde voor elk signaal in te stellen. Run daarna beide YFP- en CFP-enkel positieve monsters voor toekomstige offline compensatie. Zorg ervoor dat er ten minste 10 000 gegatede events worden geregistreerd.

Verzamel tot slot de gegevens voor de experimentele monsters na de gegevensverzameling. Stel het analyseprotocol in conform de acquisitie door gate één in de FS CSC dotplot te propageren voor levende cellen. Gate twee in de FSC-puls met dotplot van gate één voor niet-geaggregeerde levende cellen en gate drie in de ccfp FSC dotplot van gate twee voor niet-geaggregeerde ccfp-positieve levende cellen.

Na correctie voor het YFP- en CCFP-signaal in het YFP/CFP-dotplot met behulp van YFP- en CFP-enkelpositieve cellen, bepalen we de afkaplijnen voor CFP- en YFP-positieve cellen. Exporteer de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van YFP van de CFP-positieve cellen naar Excel voor het plotten van de gegevens; normaliseer vervolgens in Excel de YFP-MFI ten opzichte van het expressieniveau van ACAP LBC PDE E 43 en de ladingscontrole alfa-tubuline, zoals bepaald via western blotting, om het lineaire bereik van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van YFP vast te stellen. CFP werd gecotransfecteerd met VN ACAP L BBC en variërende hoeveelheden VC PDE E 43 in HEK 293-cellen, en de interactie werd beoordeeld met behulp van biflowcytometrie zoals beschreven in deze video; deze grafiek toont de relatieve fold change in expressie van VC PDE E 43 als functie van de getransfecteerde VC PDE E 43.

De gemiddelde fluorescentie-intensiteit van Venus in CFP-positieve cellen, aangegeven door de blauwe vierkantjes, correleerde met de expressie van VCDE 43 en was consistent met de expressieniveaus bepaald door beeldanalyse van een western blot, wat wordt aangegeven door de rode driehoekjes. Een vergelijkbare gemiddelde CFP-fluorescentie-intensiteit werd waargenomen tussen de monsters, zoals aangegeven door de groene vierkantjes, en werd gebruikt als negatieve controle om celvariaties te beperken. Deze resultaten valideren het gebruik van flowcytometrie om de ACAB LB C PDE 43-interactie te kwantificeren door de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van BS e te meten, terwijl gelijktijdig de juiste hoeveelheid BIC-constructen wordt bepaald die worden gebruikt voor screening om ACAP LBC-bindingsplaatsen binnen PDE E 43 in kaart te brengen via BIC-analyse van de ACAP LBC-interactie met full-length PDE E 43 fl.

De UCR one-regio van PDE 43 en de UCR two- en CAT-regio's van PDE 43 werden met deze methode beoordeeld, zoals hier te zien is. Expressie van vn ACAP LBC en VC PDE 43 UCR two plus CAT resulteert in een lager BC-signaal vergeleken met VC PDE 43 FL en VC PDE 43 UCR one; een vergelijkbare eiwitexpressie werd waargenomen in alle flow-monsters en de gemiddelde fluorescentie werd genormaliseerd ten opzichte van de relatieve expressieniveaus van ACAP LBC PDE 43 en alpha tubulin. Daarom geeft de genormaliseerde B-C-M-F-I aan dat er geen verschil is in fluorescentie-intensiteit tussen ACAP LBC PDE 43 FL en ACAP LBC PDE 43 UCR R one, maar een veel lager signaal voor de interactie van ACAP LBC PDE 43 UCR two plus CAT.

Deze resultaten suggereren dat er meerdere regio's in PDE 43 zijn die interageren met ACAP LBC en dat PDE 43 UCR R one de primaire interactieregio is met ACAP LBC. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe eiwit-eiwitinteracties kunnen worden bestudeerd via flowcytometrie-analyse van BP C. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de juiste hoeveelheid BP C-construct te bepalen om een vergelijkbare eiwitexpressie en een lineaire BP C-respons te verkrijgen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals peptide- of riskanalyse, worden uitgevoerd om te bepalen welke aminozuren binnen PDE 40 D drie hiervoor verantwoordelijk zijn.

De interacties van ACAP met RBC's.