Metabole Labeling en Membrane Fractionation for Comparative Proteomic analyse van

Het algemene doel van het volgende experiment is om verschillende membraansubcompartimenten te scheiden en hun differentiële eiwitsamenstelling te bestuderen. Dit wordt bereikt door stabiele isotopenmarkering van cellen onder verschillende omstandigheden om differentiatie van de behandelingen mogelijk te maken. In de massaspectrometrische analyse als tweede stap wordt celmateriaal van de twee behandelingen gemengd, wat een gezamenlijke verwerking waarborgt en de variatie tussen monsters vermindert.

Vervolgens worden subcompartimenten van het plasmamembraan gezuiverd en door middel van sucrosegradiëntcentrifugatie gescheiden in steriele, rijke en steriele, uitgeputte subcompartimenten. De resultaten tonen, op basis van gegevens uit kwantitatieve massaspectrometrie, differentiële eiwitovervloeden in de subcompartimenten onder verschillende behandelingen. Het belangrijkste voordeel van dit protocol ten opzichte van bestaande methoden, zoals Western blotting, is dat we de subcompartimentverdeling van duizenden eiwitten kwantitatief kunnen vastleggen en thereby nieuwe kandidaten voor signaleringsprocessen kunnen ontdekken.

Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de zuivering van een tweefasesysteem moeilijk aan te leren is. De reden hiervoor is dat het veel stappen omvat en dat nauwkeurige controle en grondige hantering van groot belang zijn. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van signalering door nieuwe eiwitkandidaten te ontdekken als regulatoren van membraanprocessen. Begin met het kweken van gelabelde en ongelabelde Arabidopsis thaliana cel-suspensieculturen zoals beschreven in het tekstprotocol.

Meng in een bekerglas gelige hoeveelheden gelabelde en ongelabelde bevroren cellen (gehomogeniseerde cellen van ongeveer één liter zevendagoude celstammingsculturen in vloeibare stikstof), gebaseerd op het versgewicht, en voeg twee volumes buffer H toe. Plaats het bekerglas onmiddellijk op een schudmachine en schud tot het materiaal is gesmolten en er geen ijskristallen meer aanwezig zijn. Filtreer het homogenaat door één laag spiegeldoek in centrifugebuizen van 250 milliliter. Nadat de monsters zijn gebalanceerd met buffer H, wordt er gecentrifugeerd bij 10.000 Gs gedurende acht minuten. Laad na centrifugatie het supernatant in vooraf gekoelde ultracentrifugebuizen met een volume van ongeveer 32 milliliter.

Nadat de monsters zijn gebalanceerd met buffer h, worden de microsomen gepellet door middel van centrifugatie bij 100, 000 Gs en vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Verwijder na centrifugatie het supernatant; dit supernatant bevat oplosbare eiwitten. Een kleine hoeveelheid van deze fractie kan worden bewaard voor verdere eiwitprecipitatie en daaropvolgende analyse van de oplosbare eiwitten. Resuspendeer het membraanpellet van elk monster in de respectievelijke hoeveelheid buffer R zoals beschreven in het tekstprotocol en breng dit aan op de bovenkant van het U one two-fasesysteem.

Indien het tweefasensysteem van zes gram wordt gebruikt, breng dan precies twee gram van het geresuspendeerde membraanpellet aan en voeg hetzelfde volume pure buffer R toe als gebruikt voor de resuspensie van het monster in U2. Meng de buizen U1 en U2 langzaam door deze circa 30 keer om te keren met een snelheid van ongeveer één keer per seconde; centrifugeer de monsters vervolgens bij 1500 Gs en 4 °C gedurende 10 minuten. Verwijder na centrifugatie de bovenfase uit U2. Breng de bovenfase van U1 over naar U2 voordat de centrifugatie met dezelfde parameters wordt herhaald. Verplaats vervolgens de bovenfase van U2 naar de ultracentrifugebuizen, verdun deze met vijf volumes buffer R en meng grondig; centrifugeer de monsters bij 200.000 Gs en 4 °C gedurende één uur.

Ten slotte het hergebruik. Suspendeer het membraanpellet in een kleine hoeveelheid T en E-buffer voor de isolatie van detergentresistente membranen. Nadat de concentratie van de plasmamembraanfractie is bepaald met een Bradford-assay, voegt u Triton X 100 toe aan de plasmamembraanfractie met een gewichtsverhouding detergent-proteïne tussen 13 en 15, en een uiteindelijke detergentconcentratie tussen 0,5 en 1%. Schud de monsters gedurende 30 minuten bij ongeveer 100 RPM en vier graden Celsius.

Voeg vervolgens drie volumes 2,4 molar sucrose toe aan één volume van het behandelde plasmamembraan om een uiteindelijke sucroseconcentratie van 1,8 molar te verkrijgen. Bereid de sucrosegradiënt in ultracentrifugebuizen door de respectievelijke sucroseoplossingen bovenop de 1,8 molar fractie te laden. Centrifugeer de monsters bij 250.000 ×g en vier °C gedurende 18 uur. Verwijder de ultracentrifugebuizen voorzichtig uit de rotor om verstoring van de band met lage dichtheid te voorkomen, die zichtbaar kan zijn als een melkachtige ring op de interface van 0,15 molar en 1,4 molar sucrose.

Soms is er niets zichtbaar, maar is de detergentresistente proteïnefractie nog steeds aanwezig. Verwijder een fractie van 0,75 milliliter volume van de bovenkant van de gradiënt, fracties twee en drie, die de volumes van ongeveer 1,5 milliliter boven de interfaseringsring beslaan. En 0,5 milliliter onder de interfaseringsring.

Stel de detergensresistente membraanfractie voor. Verzamel deze fracties in 15 milliliter Falcon-buisjes. Fracties negen en 10 bevatten de detergensoplosbare membraanfractie en kunnen eveneens worden verzameld voor vergelijking.

Om te beginnen met de extractie van eiwitten uit de detergent-resistente fractie, voegt u vier volumes methanol toe aan de verzamelde fracties en vortex deze grondig. Voeg vervolgens één volume chloroform toe voordat u opnieuw grondig vortex'. Voeg tot slot drie volumes water toe, vortex grondig en centrifugeer de monsters bij 2000 Gs gedurende vijf minuten.

Verwijder met een tafelcentrifuge de waterige fase boven de eiwitlaag in de interfase. Voeg vervolgens drie volumes methanol toe en vortex. Verwijder de S-supernatant grondig voordat het pellet wordt opgevangen om de in-solution digestie voor te bereiden.

Begin de in-solution digestie door het monster op te lossen in een klein volume zes molair ureum twee molair thyroid pH 8, afgekort UTU. Gebruik het kleinst mogelijke volume dat compatibel is met het monster. Nadat de monsters zijn gecentrifugeerd en de digestie is uitgevoerd zoals beschreven in het tekstprotocol, wordt het monster verdund met vier volumes 10 millimolair tris HCl pH 8.

Voeg vervolgens één µL trypsine toe per 50 µg eiwit in het monster en laat dit gedurende de nacht incuberen bij kamertemperatuur onder constant schudden bij 700 RPM. Centrifugeer de monsters bij 4.000 ×g gedurende 10 minuten. Maak de monsters tenslotte zuur tot een uiteindelijke concentratie van 0,2% TFA om een pH van 2 te bereiken door ongeveer één tiende volume van 2% trifluorazijnzuur toe te voegen. Om C18 stage tips te vervaardigen, plaatst u een Mour Disc C18 op een vlak, schoon oppervlak, zoals een wegwerpplastic Petri-schaal.

Stans een kleine schijf uit met een stompe hypodermische naald met een diameter van 1,5 millimeter. De schijf blijft in de naald kleven en kan worden overgebracht naar een pipetpunt. Duw de schijf uit de naald en fixeer deze in de taps toelopende zijde van een pipetpunt met een stuk gefuseerd silica of een slangetje dat in de naald past; conditioneer een C 18 stage tip door 50 µL van oplossing B op de voorbereide stage tip aan te brengen.

Centrifugeer de tip gedurende twee minuten bij 2000 RPM. Equilibreer de stage-tip in een tafelcentrifuge met 100 µL van oplossing a. Centrifugeer de tip bij 5.000 ×g in een tafelcentrifuge. Herhaal de equilibratie en het centrifugeren.

Laad het monster op de schijf door het monster voorzichtig met een pipette in de pipetpunt met de schijf erin te pipetteren. Centrifugeer de punten totdat het volledige monstervolume door de C 18-schijf is gegaan. Was de stage-punten twee keer met 100 µL van oplossing A. Verzamel na het centrifugeren van de punten het EIT in een nieuwe reactiebuis van 1,5 mL met 40 µL van oplossing B en centrifugeer.

Concentreer het monster opnieuw in de speed vac onder ideale omstandigheden. Stop het dehydratatieproces wanneer er nog ongeveer één of twee µL vloeistof over is. Voeg als laatste stap een eindvolume van negen µL Resus suspensie-oplossing toe aan het monster en breng het over naar de microtiterplaat voor massaspectrometrie-analyse.

De verrijking van plasmamembraaneiwitten kan worden aangetoond via proteomische analyse van kleine aliquots van het plasmamembraan, fracties en eiwitten in de onderste fase van het tweefasesysteem. De onderste fase bevat de interne membranen van de cel. Zo vertoonden bijvoorbeeld typisch bekende plasmamembraaneiwitten, zoals receptorkinase-eiwitten, een hoge abundantie in de plasmamembraanfractie en een lage abundantie in de onderste fasefractie die de interne membranen bevat.

Op hun beurt vertoonden bekende eiwitten van het endoplasmatisch reticulum een hoge abundantie in de fractie van het binnenmembraan en werden zij niet waargenomen in de fractie van het plasmamembraan. De daaropvolgende verrijking van detergent-resistente membraanfracties zal, in ideale gevallen, leiden tot de vorming van een melkachtige ring van membraanvesikels met een lage dichtheid. Op ongeveer een vijfde van de buishoogte werd, zoals verwacht, de hoogste abundantie van remn-eiwit aangetroffen in de detergent-resistente membraan- of DRM-fracties.

Omgekeerd vertonen eiwitten die niet aanwezig zijn in de membraanmicrodomeinen, zoals een A b, C-transporter, geen verhoogde abundantie in de DRM-fractie. Ook typische contaminanten, zoals een mitochondriaal eiwit van het A TPAs F zero-complex en een ribosomaal eiwit van het 60 s-ribosoom, vertonen geen verrijkte abundantie in de DRM-fractie. Hoewel er na massaspectrometrische analyse nog steeds minimale hoeveelheden kunnen worden geïdentificeerd, kunnen eiwitabundantieverhoudingen van de eiwitfosforyleringsstatus in plasmamembraanfracties van gelabelde en ongelabelde celculturen kwantitatief worden onderscheiden.

Typische resultaten uit het MS-kwantificatievenster zouden voor de meeste geïdentificeerde peptiden een ionintensiteitsverhouding van één-op-één moeten vertonen. Peptiden waarvan de ionintensiteitsverhouding significant afwijkt van één-op-één worden beschouwd als differentieel gereguleerd tussen de gelabelde en ongelabelde celcultuur, en zijn kandidaten voor koppeling aan eiwitten die beïnvloed zijn door de toegepaste behandeling. Een goede kwaliteitscontrole voor een succesvolle metabolische labeling is de co-elutie van zowel de gelabelde als de ongelabelde peptideversies als één enkele piek in de nano-HPLC-scheiding, zoals hier wordt getoond.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in drie dagen worden uitgevoerd, vanaf het begin van de extractie tot het laden van het monster op de massaspectrometer. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals Western Belt, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de suppletie van specifieke doeleiwitten te beantwoorden. Na het bekijken van deze video zouden we dus een goed begrip moeten hebben van hoe stabiel isotoop-gelabelde plantencelculturen moeten worden gemengd, hoe een plasmamembraanpurificatie via een tweefasensysteem moet worden uitgevoerd en hoe steriel-rijke van steriel-uitgeputte membraansubcompartimenten moeten worden gescheiden.