Name: Metabole Labeling en Membrane Fractionation for Comparative Proteomic analyse van Arabidopsis thaliana Schorsing Celkweken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Leer metabole labeling en membraanfractie voor vergelijkende proteomische analyse van Arabidopsis thaliana. Deze methode scheidt plasma membraan subcompartimenten en identificeert nieuwe signaalcandidaten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li>Alexandersson, E., Saalbach, G., Larsson, C., Kjellbom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+plasma+membrane+proteomics+identifies+components+of+transport%2C+signal+transduction+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking.</a> Plant Cell Physiol. 45, 1543-1556 (2004).</li>
<li>Brown, D. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+of+GPI-anchored+proteins+to+glycolipid-enriched+membrane+subdomains+during+transport+to+the+apical+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sorting of GPI-anchored proteins to glycolipid-enriched membrane subdomains during transport to the apical cell surface.</a> Cell. 68, 533-544 (1992).</li>
<li>Lanquar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((15N-metabolic+labeling+for+comparative+plasma+membrane+proteomics+in+Arabidopsis+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">15N-metabolic labeling for comparative plasma membrane proteomics in Arabidopsis cells.</a> Proteomics. 7, 750-754 (2007).</li>
<li>Kierszniowska, S., Walther, D., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratio-dependent+significance+thresholds+in+reciprocal+15N-labeling+experiments+as+a+robust+tool+in+detection+candidate+proteins+responding+to+biological+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Ratio-dependent significance thresholds in reciprocal 15N-labeling experiments as a robust tool in detection candidate proteins responding to biological treatment.</a> Proteomics. 9, 1916-1924 (2009).</li>
<li>Singer, S. J., Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluid+mosaic+model+of+the+structure+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluid mosaic model of the structure of cell membranes.</a> Science. 175, 720-731 (1972).</li>
<li>Simons, K., Ikonen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+rafts+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional rafts in cell membranes.</a> Nature. 387, 569-5672 (1997).</li>
<li>Baumgart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+fluid%2Ffluid+phase+separation+of+proteins+and+lipids+in+giant+plasma+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 3165-3170 (2007).</li>
<li>Silvius, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+membrane+molecules+between+raft-and+non+raft-domains%3A+insights+from+model+membrane+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Partitioning of membrane molecules between raft-and non raft-domains: insights from model membrane studies.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1746, 193-202 (2005).</li>
<li>Tanner, W., Malinsky, J., Opekarova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+plant+and+animal+cells%2C+detergent-resistant+membranes+do+not+define+functional+membrane+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In plant and animal cells, detergent-resistant membranes do not define functional membrane rafts.</a> Plant Cell. , (2011).</li>
<li>Lauwers, E., Andre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+yeast+transporters+with+detergent-resistant+membranes+correlates+with+their+cell-surface+location%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Association of yeast transporters with detergent-resistant membranes correlates with their cell-surface location.</a> Traffic. 7, 1-15 (2006).</li>
<li>Kierszniowska, S., Seiwert, B., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+Arabidopsis+sterol-rich+membrane+microdomains+by+differential+treatment+with+methyl-%C3%9F-cyclodextrin+and+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Definition of Arabidopsis sterol-rich membrane microdomains by differential treatment with methyl-ß-cyclodextrin and quantitative proteomics.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8, 612-623 (2009).</li>
<li>Simons, K., Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts and signal transduction.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 31-39 (2000).</li>
<li>Maeda, Y., Kinoshita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+remodeling%2C+trafficking+and+functions+of+glycosylphosphatidylinositol-anchored+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Structural remodeling, trafficking and functions of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins.</a> Prog. Lipid Res. 50, (2011).</li>
<li>Keinath, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAMP-induced+changes+in+plasma+membrane+compartmentalization+reveal+novel+components+of+plant+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">PAMP-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity.</a> J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).</li>
<li>Stanislas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+reveals+a+dynamic+association+of+proteins+to+detergent+resistant+membranes+upon+elicitor+signaling+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8, 2186-2198 (2009).</li>
<li>Minami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+detergent-resistant+plasma+membrane+microdomains+in+Arabidopsis+thaliana+during+cold+acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Alterations in detergent-resistant plasma membrane microdomains in Arabidopsis thaliana during cold acclimation.</a> Plant Cell Physiol. 50, 341-359 (2008).</li>
<li>Pauly, M., Eberhard, S., Albersheim, P., Darvill, A., York, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+mur1+mutation+on+xyloglucans+produced+by+suspension-cultured+Arabidopsis+thaliana+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells.</a> Planta. 214, 67-74 (2001).</li>
<li>Jouanneau, J. P., Peaud-Lenoel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+synthesis+of+proteins+in+cell+suspensions+of+a+kinetin+dependent+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Growth and synthesis of proteins in cell suspensions of a kinetin dependent tobacco.</a> Physiol. Plant. 20, 834-850 (1967).</li>
<li>Engelsberger, W. R., Erban, A., Kopka, J., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+plant+cell+cultures+with+K15NO3+as+a+tool+for+quantitative+analysis+of+proteins+and+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of plant cell cultures with K15NO3 as a tool for quantitative analysis of proteins and metabolites.</a> Plant Methods. 2, 1-11 (2006).</li>
<li>Arsova, B., Kierszniowska, S., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+heavy+nitrogen+in+quantitative+proteomics+experiments+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The use of heavy nitrogen in quantitative proteomics experiments in plants.</a> Trends Plant Sci. 17, 102-112 (2012).</li>
<li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stop+And+Go+Extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization%2C+nanoelectrospray%2C+and+LC%2FMS+sample+pretreatment+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stop And Go Extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75, 663-670 (2003).</li>
<li>Olsen, J. V., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+accuracy+mass+spectrometry+in+large-scale+analysis+of+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High accuracy mass spectrometry in large-scale analysis of protein phosphorylation.</a> Methods Mol. Biol. 492, 131-142 (2009).</li>
<li>Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Schwartz, J. C., Hunt, D. F., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neutral+loss+activation+method+for+improved+phosphopeptide+sequence+analysis+by+quadrupole+ion+trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A neutral loss activation method for improved phosphopeptide sequence analysis by quadrupole ion trap mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 76, 3590-3598 (2004).</li>
<li>Frese, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+peptide+identification+by+targeted+fragmentation+using+CID%2C+HCD+and+ETD+on+an+LTQ-Orbitrap+Velos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Protrome+Research%22%5BJournal%5D)">Improved peptide identification by targeted fragmentation using CID, HCD and ETD on an LTQ-Orbitrap Velos.</a> Journal of Protrome Research. 10, 2377-2388 (2011).</li>
<li>van Breukelen, B., vanden Toorn, H. W., Drugan, M. M., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((StatQuant%3A+a+post-quantification+analysis+toolbox+for+improving+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">StatQuant: a post-quantification analysis toolbox for improving quantitative mass spectrometry.</a> Bioinformatics. 25, 1472-1473 (2009).</li>
<li>Zauber, H., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+wants+cRacker%3A+Automated+standardized+data+analysis+of+LC%2FMS+derived+proteomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomics wants cRacker: Automated standardized data analysis of LC/MS derived proteomic data.</a> J. Proteome Res. 11, 5548-5555 (2012).</li>
<li>Raffaele, S., Mongrand, S., Gamas, P., Niebel, A., Ott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+annotation+of+remorins%2C+a+plant-specific+protein+family%3A+Evolutionary+and+functional+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide annotation of remorins, a plant-specific protein family: Evolutionary and functional perspectives.</a> Plant Physiol. 145, 593-600 (2007).</li>
<li>Shah, M. B., Sehgal, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondetergent+isolation+of+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nondetergent isolation of rafts.</a> Methods Mol. Biol. 398, 21-28 (2007).</li>
<li>Persaud-Sawin, D. -A., Lightcap, S., Harry, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rafts+from+mouse+brain+tissue+by+a+detergent-free+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation of rafts from mouse brain tissue by a detergent-free method.</a> Journal of Lipid Research. 50, 759-767 (2009).</li>
<li>Macdonald, L. J., Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+the+preparation+of+detergent-free+lipid+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">A simplified method for the preparation of detergent-free lipid rafts.</a> Journal of Lipid Research. 46, 1061-1067 (2005).</li>
<li>Mühlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+shotgun+proteomics+using+a+uniform+15N-labeled+standard+to+monitor+proteome+dynamics+in+time+course+experiments+reveals+new+insights+into+the+heat+stress+response+of+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative shotgun proteomics using a uniform 15N-labeled standard to monitor proteome dynamics in time course experiments reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell. Proteomics. 10, M110.004739(2011).</li>
<li>Schulze, W., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+in+mass-spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitation in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 61, 491-516 (2010).</li>
<li>Foster, L. J., de Hoog, C., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+quantiative+proteomics+of+lipid+rafts+reveales+high+specificity+for+signaling+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Unbiased quantiative proteomics of lipid rafts reveales high specificity for signaling factors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 5813-5818 (2003).</li>
<li>Lilley, K. S., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+organelle+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plant organelle proteomics.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 10, 594-599 (2007).</li>
<li>Sadowski, P. G., Groen, A. J., Dupree, P., Lilley, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-cellular+localization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sub-cellular localization of membrane proteins.</a> Proteomics. 8, 3991-4011 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen. De auteur, Witold Szymanski, is een medewerker van het Max Planck Instituut voor Moleculaire Plantenfysiologie. De auteur, Waltraud Schulze is een medewerker aan de Universiteit van Hohenheim, Duitsland.

De in dit document protocol bevat vele stappen en ze zijn cruciaal voor zuivere en representatieve fractionering van de plant plasmamembraan in reinigingsmiddelenbestendige membranen en detergent oplosbare fracties te verkrijgen. Daarom is het belangrijk om elke stap te volgen instructies. Behandeling van de plasmamembraan fractie met niet-ionisch detergens (stap 3.2) heeft de sterkste invloed op de kwaliteit van het membraan microdomain fractionering. Om reproduceerbare resultaten te verkri...

In 1972, Jonathan Singer en Garth Nicolson voorgesteld de vloeistof mozaïek model een structuur model van cellulaire membranen, het vervangen van de eiwit-lipide-eiwit sandwich model dat in het algemeen in de vroege jaren 1960 werd aanvaard. Singer en Nicolson gepostuleerd dat het biologische membraan kan worden beschouwd als een tweedimensionale vloeistof waar alle lipiden en eiwitmoleculen vrij en gemakkelijk 5 diffunderen. Sindsdien structuurmodel van het plasmamembraan en kennis van het membraan preparaat werd nog ingewikkelder. Vooral in de plasmamembraan, structuren zoals eiwitcomplexen lipiden / sterol gebaseerd structureel verstoord microdomeinen worden waargenomen. In kunstmatige modelmembranen 6,7, kan sterolen en sphingolipiden zijdelings te scheiden van andere soorten lipiden aan regio&#39;s te vormen met gewijzigde fysieke kenmerken. Deze segregatie binnen het celmembraan wordt voornamelijk veroorzaakt door de zelfassocierende eigenschappen tussen sterolen en zeer saonverzadigde koolwaterstof ketens van phopsho-en sfingolipiden 8. Bijzonder, de starre sterol ringen gunst interacties met stijvere en rechtere verzadigde soorten lipiden en deze interacties dwingen naburige koolwaterstofketens in meer uitgebreide conformaties, toenemende membraandikte en hardheid. Een van de vaak waargenomen kenmerken sterol verrijkte membraan microdomeinen was hun onoplosbaarheid na behandeling met niet-ionische detergentia zoals Triton X-100 en Brij 35. Deze fracties werden verondersteld identiek met membraan microdomeinen te zijn en werden genoemd reinigingsmiddelenbestendige membranen (DRM) op basis van hun biochemische bereidingswijze 2. Het gebruik van niet-ionische detergenten tijdens DRM extractie kreeg kritiek omdat de biochemische DRM preparaat kan niet rechtstreeks overeen met een specifieke membraancompartiment binnen de levende cel 9. Vooral, het wasmiddel aan eiwitverhouding lijkt cruciaal in dergelijke preparaten, eenTussen verschillende detergenten, evenals verschillende hoeveelheden detergens kunnen andere samenstelling van de reinigingsmiddelenbestendige membraanfractie 10 opleveren. Er is bewijs dat bepaalde proteïne species specifiek associëren met deze cellulaire sterol-rijke membraan domeinen, en dat deze eiwitten zijn goed verrijkt biochemische preparaten wasmiddel-resistente membraan fracties 11. De kern van eiwitten die werden gevonden in plantaardige DRM fractie en waarbij de aanwezigheid DRM was sterol afhankelijk waren bijzonder GPI-verankerde eiwitten, zoals fascicline-achtige eiwitten arabinogalactaan (knip) en leden van de SKU eiwitfamilie. Ook enkele signalerende proteïnen, zoals receptor-achtige kinasen of fosfolipase gevonden 11. Deze resultaten zijn consistent met vele proteomische studies voor zoogdieren membraan microdomeinen 12,13. Ook in planten is er steeds meer bewijs voor de rol van membraan microdomeinen in context van stress respons 14 -16. De hier beschreven protocol voorziet in een robuuste methode voor fractionering van plasmamembraan microdomeinen en bijzonder maakt gebruik van een eiwit aan detergent concentratie die ons in staat stelt om stress geïnduceerde veranderingen van de sterol-rijke membraancompartiment 4,11,14 verbeelden.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS </td></tr><tr><td>Chemicals werden besteld bij Sigma-Aldrich, tenzij anders vermeld</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammoniak (voorraad 25 % oplossing)</td><td>WAKO</td><td>010-03166</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 10 &mu;m </td><td>GL-Science</td><td>5020-75010</td><td></td></tr><tr><td>Empore Disk C18</td><td>Varian</td><td>12145004</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleenglycol(PEG 3350)</td><td>Sigma</td><td>88276</td><td></td></tr><tr><td>Dextran T500</td><td>Roth</td><td>9219.2</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>Protease-remmercocktail (PIC)</td><td>Sigma</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>K15NO3</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>NLM-765-PK</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">APPARATUUR </td></tr><tr><td>Optima L-80 XP Ultracentrifuge </td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograaf</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap massaspectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speed Vac RVC 2-25</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker Unimax 2010</td><td>Heidolph</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metabole labeling en membrane fractionation for comparative proteomic analyse van<em&gt; arabidopsis thaliana</em&gt; schorsing celkweken

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasmamembraan microdomeinen zijn functies op basis van de fysische eigenschappen van het lipide en sterol milieu en hebben een specifieke rol bij het signaleren van processen. Extraheren-sterol verrijkte membraan microdomeinen van plantencellen voor proteomics analyse is een moeilijke taak vooral te wijten aan meerdere voorbereidende stappen en de bronnen van verontreinigingen uit andere cellulaire compartimenten. Het plasmamembraan vormt slechts 5-20% van de membranen in een plantencel, en dus isolatie van sterk gezuiverde celmembraan fractie uitdagend. Een veel gebruikte methode bestaat waterige twee-fase verdeling in polyethyleenglycol en dextran, die plasmamembraan vesicles oplevert met een zuiverheid van 95% 1. Sterol-rijke membraan microdomeinen binnen het plasmamembraan onoplosbaar na behandeling met koud ionogene detergentia bij alkalische pH. Dit detergent-resistente membraan fractie kan vanuit de bulk plasmamembraan worden gescheiden door ultracentrifuge in alsucrose gradiënt 2. Vervolgens kunnen eiwitten worden geëxtraheerd uit de lage dichtheid band van de sucrose gradiënt van methanol / chloroform precipitatie. Geëxtraheerd eiwit vervolgens met trypsine worden gedigereerd, ontzout en tenslotte geanalyseerd met LC-MS/MS. De extractie protocol voor sterol-rijke microdomeinen is geoptimaliseerd voor de bereiding van schone detergens resistent membraan fracties uit Arabidopsis thaliana celkweken. We gebruiken volledige metabole kenmerken van Arabidopsis thaliana schorsing celculturen met K 15 NO 3 als de enige bron van stikstof voor kwantitatieve vergelijkende proteomics studies na biologische behandeling van belang 3. Door gelijke verhoudingen van gelabelde en ongelabelde celculturen gezamenlijke eiwitextractie invloed voorbereiding stappen uiteindelijke kwantitatief resultaat wordt minimaal gehouden. Ook verlies van materiaal tijdens de extractie zowel controle en behandeling monsters op dezelfde wijze affectd dus de verhouding van licht en bijdraaien peptide blijft constant. In de voorgestelde werkwijze ofwel gemerkt of ongemerkt celkweek ondergaat een biologische behandeling, terwijl de andere dient als controle 4.

Bij de gepresenteerde protocol met metabolisch gemerkt Arabidopsis celkweken kan men plasmamembranen isoleren van plantenweefsel (stap 2, figuren 2 en 4) en verrijken reinigingsmiddelenbestendige membraanfracties in het plasmamembraan (stap 3, figuren 3 en 5). Vervolgens het protocol maakt extractie van eiwitten uit deze reinigingsmiddelenbestendige membraanfracties (stap 4) en digestie van het eiwit vergelijkende proteoomanalyse (stap 5). Ten slotte is de optionele verrijking ...

Hier beschrijven we een robuuste werkwijze voor de fractionering van plantaardige plasmamembranen in reinigingsmiddelenbestendige en detergent oplosbare membranen gebaseerd op een mengsel van gelabelde en in vivo volledig 15N gemerkt Arabidopsis thaliana celculturen. De procedure wordt toegepast voor vergelijkende proteomics studies om signalering processen te begrijpen.

Metabole Labeling en Membrane Fractionation for Comparative Proteomic analyse van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Schorsing Celkweken

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om verschillende membraansubcompartimenten te scheiden en hun differentiële eiwitsamenstelling te bestuderen. Dit wordt bereikt door stabiele isotopenmarkering van cellen onder verschillende omstandigheden om differentiatie van de behandelingen mogelijk te maken. In de massaspectrometrische analyse als tweede stap wordt celmateriaal van de twee behandelingen gemengd, wat een gezamenlijke verwerking waarborgt en de variatie tussen monsters vermindert.Vervolgens worden subcompartimenten van het plasmamembraan gezuiverd en door middel van sucrosegradiëntcentrifugatie gescheiden in steriele, rijke en steriele, uitgeputte subcompartimenten. De resultaten tonen, op basis van gegevens uit kwantitatieve massaspectrometrie, differentiële eiwitovervloeden in de subcompartimenten onder verschillende behandelingen. Het belangrijkste voordeel van dit protocol ten opzichte van bestaande methoden, zoals Western blotting, is dat we de subcompartimentverdeling van duizenden eiwitten kwantitatief kunnen vastleggen en thereby nieuwe kandidaten voor signaleringsprocessen kunnen ontdekken.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien

metabolic-labeling-membrane-fractionation-for-comparative-proteomic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een methode voor het isoleren van specifieke celtypen uit plantaardig materiaal wordt gedemonstreerd. Deze techniek maakt gebruik van transgene marker lijnen uitdrukken fluorescerende eiwitten in het bijzonder celtypen, cellulaire dissociatie en fluorescentie geactiveerde cel sortering. Daarnaast wordt een groei setup hier vast te staan ​​dat vergemakkelijkt de behandeling...

Fluorescentie geactiveerde celsortering van plantenprotoplasten

De moleculaire basis van ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties wordt onderzocht met behulp van transgene planten die weefsel-en orgaan-specifieke fytochroom gebreken vertonen. De isolatie van specifieke cellen vertonen geïnduceerde fytochroom chromofoor uitputting door middel van fluorescentie-Activated Cell Sorting gevolgd door middel van microarray-analyses wordt gebruikt om genen die betrokken zijn bij de ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties te identificeren.

Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana</em

Cel specifieke analyse van<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Bladeren met fluorescentie-geactiveerde celsortering

De beschreven vergelijkende, kwantitatieve proteomics aanpak is gericht op het verkrijgen van inzicht in de samenstelling van multiprotein complexen onder verschillende omstandigheden en wordt aangetoond door het vergelijken van genetisch verschillende stammen. Voor kwantitatieve analyse gelijke volumes van verschillende fracties van een sucrose dichtheidsgradiënt gemengd en geanalyseerd met massaspectrometrie.

Een nieuwe aanpak voor de Vergelijkende analyse van de multiprotein Complexen Gebaseerd op<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling en kwantitatieve massaspectrometrie

Een protocol voor de uitgebreide extractie van lipiden, metabolieten en eiwitten uit biologische weefsels met behulp van een monster wordt gepresenteerd.

Een eenvoudige gefractieerde extractie methode voor de uitgebreide analyse van metabolieten, lipiden en proteïnen uit een enkele monster

Hier presenteren wij een interactief capture protocol toegepast op Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten. Deze methode berust op in vivo UV-verknoping en staat voor isolatie en identificatie van plantaardige mRNA-bindende eiwitten uit een fysiologische omgeving.

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

Eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet interacties zijn cruciaal voor alle cellulaire functies. Hierin beschrijven we een protocol waarmee parallelle analyse van deze interacties met een eiwit van keuze. Ons protocol is geoptimaliseerd voor de plant celculturen en affiniteit zuivering combineert met massa spectrometrie gebaseerde eiwitten en metaboliet detectie.

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Hier beschrijven we een methode om te zuiveren intact chloroplasten van Arabidopsis bladeren en hun drie belangrijkste sub compartimenten (envelop, stroma en thylakoiden), met behulp van een combinatie van differentiële centrifugations, continue Percoll verlopen, en discontinue sacharose verlopen. De methode is waardevol voor subplastidial en subcellular localisatie van eiwitten door immunoblotting en proteomics.

Voorbereiding van Chloroplast sub compartimenten van Arabidopsis voor de analyse van eiwit lokalisatie door Immunoblotting of Proteomics

Systeembrede analyse van meerdere biomoleules is cruciaal om functionele en mechanistische inzichten in biologische processen te krijgen. Hierbij wordt een uitgebreid protocol beschreven voor een hoge doorvoer extractie van lipiden, metabolieten, eiwitten en zetmeel uit een enkel monster geoogst uit gesynchroniseerde Chlamydomonas-cultuur.

Een multi-omics extractiemethode voor de diepgaande analyse van gesynchroniseerde culturen van de groene Alga Chlamydomonas Chlamydomonas

De haalbaarheid en effectiviteit van high-throughput scRNA-seq-methoden luiden een eencellig tijdperk in plantenonderzoek in. Hier wordt een robuuste en complete procedure gepresenteerd voor het isoleren van specifieke Arabidopsis thaliana wortelceltypen en de daaropvolgende transcriptoombibliotheekconstructie en -analyse.

Isolatie en transcriptoomanalyse van plantenceltypen

Leer metabole labeling en membraanfractie voor vergelijkende proteomische analyse van Arabidopsis thaliana. Deze methode scheidt plasma membraan subcompartimenten en identificeert nieuwe signaalcandidaten.

Metabole Labeling en Membrane Fractionation for Comparative Proteomic analyse van

Meer video's verkennen