Het meten van groei en genexpressie Dynamiek van Tumor-Gerichte S. Typhimurium Bacteriën

Het algemene doel van dit experiment is om de in vivo genexpressiedynamiek van S tyrische bacteriën die in tumoren groeien, te bestuderen. Eerst in een muis xenograft kankermodel worden bacteriën intraveneus door de staartader geïnjecteerd. Bacteriën koloniseren de tumor en groeien exponentieel terwijl genexpressie wordt gevisualiseerd met behulp van luminescente reporters.

Bioluminescentiebeeldvorming van het hele dier wordt uitgevoerd met behulp van het IVUS spectrumbeeldvormingssysteem. Over een periode van 24 tot 48 uur wordt een tijdsverloop van IVUS-beelden gemaakt. Deze reeks beelden wordt gecorreleerd met kolonietellingen die worden gegenereerd door tumoren te homogeniseren en op te plateren.

Samen laten deze gegevens ons toe om de genexpressie en populatiedynamiek van tumorgerichte bacteriën in vivo in real time te meten bij celvoorbereiding, celpassage, cellijnen met behulp van standaard celkweektechnieken. In dit experiment gebruikten we acht cellen om een doelcofluentie van 80 tot 100% te bereiken. Oogsten en tel cellen op een hemo, cytometer, resus, suspend, en fenol vrij DMEM bij een doelconcentratie van vijf maal 10 tot de zeven cellen per milliliter, of ongeveer 200 microliter per flacon. Voeg 15% gereduceerd groeifactor matrigel toe en houd de celsuspensie op ijs tot implantatie van de tumor.

Anesthetiseer vier weken oude vrouwelijke naakte muizen met 3% isofluriene. Laad de cellen 100 microliter per tumor in een enkele mils spuit en bevestig een 27 en een halve gauge naald voor elk van de twee bilaterale achterflank injectieplaatsen. Til de huid voorzichtig op met een pincet om een tent te maken en injecteer cellen aan de basis.

Zorg ervoor dat je niet te diep doordringt waardoor er bloed ontstaat. Gebruik een pincet om de spuit voorzichtig te verwijderen zonder spatten. Bewaak dagelijks de tumorgroei gedurende 10 tot 20 dagen tot een tumordiameter van twee tot vier millimeter is bereikt.

Bacteriënvoorbereiding, start een overnacht cultuur van bacteriën in drie mils LB-medium plus antibiotica vanuit een min 80 vriezervoorraad of een gekoelde plaat. In dit experiment gebruikten we s tyer stam ELH vier 30 in de ochtend. Verdun de cultuur een op 100 in gefilterde lb en laat groeien tot een OD 600 van 0,4 tot 0,6.

Schenk neer en was drie keer in fosfaat gebufferd zoutoplossing en resuspendeer op een eind OD 600 van 0,1 of ongeveer een maal 10 tot de zeven cellen per mil. Bacteriëninjectie, anesthetiseer dieren en positioneer met de staart naar uw dominante hand. Localiseer de staartader en verwijd deze met warm water of een verwarmingslamp.

Laad de bacteriën 100 microliter per muis in een enkele mils spuit en buig de chip iets minder dan 90 graden. Lijn de spuittip uit met de staartader, penetreer op een ondiepe diepte zonder weerstand te voelen en injecteer bacteriën. Observeer de bloedstroomverplaatsing voor een succesvolle injectie.

Wacht ongeveer 12 tot 18 uur voordat u gaat beeldvormen zodat kolonisatie kan plaatsvinden. Muizenbeeldvorming anesthetiseer dieren in de inductiekamer. Plaats vervolgens elke muis op het beeldvormingsplatform.

Houd een nauwkeurige positionering aan om kwantitatieve resultaten tussen tijdstippen te garanderen, beeldvorm dieren met behulp van het Ibis Spectrum beeldvormingssysteem. Als u meer dan één dier beeldvormt, plaats dan lichtbarrières tussen hen om kruisverlichting te voorkomen. Dissectie van het dier, houd de tumor vast met pincet. Verwijder de huid met behulp van een omgekeerde schaarbeweging.

Beweging Wanneer het grootste deel van de huid is gescheiden, verwijder dan de tumor volledig met behulp van pincet. Plaats de organen en vooraf gewogen microcentrifugebuizen. Aangezien de massa van deze buisjes aanzienlijk kan variëren, is het belangrijk om ze vooraf te wegen voor kwantitatieve resultaten.

Kwantificering van bacteriële biodistributie voor elk tijdstip, verwijder en weeg de tumoren, voeg 500 microliter PBS plus 15% glycerol toe en homogeniseer met behulp van een weefselscheurer, genereert seriële verdunning en plateer voor bacteriële kolonietelling. Representatieve resultaten. Met behulp van dit protocol zijn we in staat om gegevens te genereren over de in vivo groei en genexpressiedynamiek van tumorgerichte bacteriën. De algemene workflow wordt hier samengevat.

In de eerste fase injecteerden we bacteriën en beeldvormden we het dier met behulp van ivus om genexpressie te meten met luminescentie als reporter. Vervolgens hebben we in de tweede fase tumoren verwijderd, gehomogeniseerd en opgeplaat voor kolonietellingen om het aantal bacteriën dat in de tumor groeit te bepalen. Bioluminescentie gegenereerd door bacteriestammen wordt gevisualiseerd met behulp van ivus signaal neemt toe met de geïnjecteerde dosis met een minimale koloniserende dosis van ongeveer vijf maal 10 tot de vijf in alle gevallen vanwege afzwakte signalen.

De bacteriën koloniseren specifiek tumoren of groeien niet significant in de muizen. Het signaal wordt gekwantificeerd met behulp van radiance-eenheden om te normaliseren voor blootstellingstijd of typische waarden boven 10 tot de zes of meer zijn indicatief voor kolonisatie voor een bepaalde infectie. Het signaal neemt toe met de tijd gedurende 24 tot 48 uur. De piekontwikkeling is ongeveer 36 uur na injectie hier, maar de timing kan variëren afhankelijk van de stam en het plasmide dat wordt gebruikt. Zorg ervoor dat u de muis elke keer op dezelfde manier positioneert om kwantitatieve resultaten te garanderen in de volgende reeks experimenten.

De bacteriële biodistributie wordt gekwantificeerd om de groei van bacteriën in de loop van de tijd in verschillende organen te meten, levensvatbare bacteriën en tumoren worden gekwantificeerd door de tumor te verwijderen en te homogeniseren en zijn seriële verdunning op te plateren. Andere organen kunnen worden gekwantificeerd. Hier hebben we milt gebruikt omdat de tumor-milt-ratio een typische maatstaf is voor bacteriële specificiteit na