Name: Het meten van groei en genexpressie Dynamiek van Tumor-Gerichte S. Typhimurium Bacteriën (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Leer hoe je groei en genexpressie van S. Typhimurium in tumoren meet met bioluminescentiebeeldvorming en kolonie-tellingen. Deze methode helpt bij het ontwikkelen van bacteriële kankertherapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken H. Fleming voor kritisch lezen en bewerken van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een Misrock Postdoctoraal fellowship (TD) en NDSEG graduate fellowship (AP). SNB is een HHMI onderzoeker.

1. Cell Preparation <ol><li> Passage cellijnen met behulp van standaard celkweek technieken. In dit experiment gebruikten we OVCAR-8 cellen (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). Kweek cellen een doel confluentie van 80-100%. </li><li> Incubeer cellen met 5 ml trypsine gedurende 5 min, voeg 5 ml RPMI medium + FBS om trypsine te inactiveren. </li><li> Oogst en tellen cellen op een hemocytometer. Resuspendeer in fenolrood-vrij DMEM bij een doelconcentratie van 5 x 10 7 cellen / ml, of ongeveer 200 ul per kolf. </li><li> Voeg 15% verminderde groeifactor Matrigel (BD Biosciences) en houd de celsuspensie op ijs tot implantatie. </li></ol> 2. Tumor Implantatie <ol><li> Verdoven van 4 weken oude vrouwelijke NCR / nu muizen met 3% isofluraan en wacht ongeveer 5 min tot diepe verdoving zorgen. Gebruik vet zalven ogen droog terwijl onder narcose voorkomen. </li><li> Laad de cellen (100 ul per tumor) in een 1 ml spuit en bevestig een 27 1/ 2 gauge naald. </li><li> Voor elk van de twee bilaterale achterflank injectieplaatsen, til de huid met een tang om een ​​tent te maken en te injecteren cellen aan de basis. Let er niet te diep door te dringen, het produceren van bloed. Gebruik een pincet om voorzichtig spuit te verwijderen zonder spatten. </li><li> Monitor tumorgroei gedurende 10 - 20 dagen totdat een tumor diameter van 2-4 mm wordt bereikt. </li></ol> 3. Bacteriën Voorbereiding <ol><li> Start een nachtelijke kweek van bacteriën in 3 ml LB-medium + ampicilline uit een -80 C vriezer voorraad of gekoelde plaat. In dit experiment gebruikten we S. typhimurium stam ELH430 (SL1344 PhoPQ-aroA-). </li><li> In de ochtend, verdunnen de cultuur 1:100 in gefilterd LB en groeien tot OD600 0,4-0,6. </li><li> Spin down en 3 keer wassen in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en resuspendeer in een uiteindelijke OD600 van 0,1 (ongeveer 1 x 10 7 cellen / ml). </li></ol> 4. Bacteriën Injectie <ol><li> Verdoven van het dier eend positie op zijn kant met de staart wijzend naar uw dominante hand. Gebruik vet zalven ogen droog terwijl onder narcose voorkomen. </li><li> Verwijden de staart ader met behulp van warm water of een warmtelamp. </li><li> Laad de bacteriën (100 pi per muis) in een 1 ml spuit en buig het uiteinde iets minder dan 90 graden. </li><li> Breng de spuit met de staart ader, dringen op een geringe diepte (mag geen weerstand voelen), en injecteer bacteriën. Observeer bloodflow verplaatsing voor een succesvolle injectie. </li></ol> 5. Muis Imaging <ol><li> Verdoven van dieren in de inductie kamer plaats dan elke muis op de imaging platform. Gebruik vet zalven ogen droog terwijl onder narcose voorkomen. Behouden nauwkeurige positionering om kwantitatieve resultaten tussen tijdstippen zorgen. </li><li> Afbeelding dieren met behulp van de IVIS Spectrum imaging-systeem (Remklauw Life Sciences). Als de beeldvorming meer dan 1 dier, plaats licht barrières tussen hen om cross-illu voorkomenminatie. Dieren moet eerst worden afgebeeld op de buikzijde naar lokalisatie van bacteriën te bevestigen. </li><li> Afbeelding dieren dorsaal met IVIS elke 2 uur gedurende de duur van het experiment (36 uur). Genereer een tijdsverloop voor een bepaalde ROI. </li></ol> 6. Kwantificeren van Bacteriële Biodistributie <ol><li> Euthanaseren dieren met behulp van CO 2 en de plaats op de rug op een absorberende luier. </li><li> Draai het dier de twee achterste flank subcutane tumoren bloot. Snijd de omringende huidweefsel te scheiden en te verwijderen van de tumoren. Houden van de tumor met een pincet, verwijder de huid met behulp van een omgekeerde schaar beweging. Wanneer de meerderheid van de huid is gescheiden, volledig te verwijderen van de tumor met een pincet. </li><li> Plaats de organen in gewogen microcentrifugebuizen. Aangezien de massa van deze buizen aanzienlijk variëren is het belangrijk voor een pre-wegen van kwantitatieve resultaten. </li></ol> 7. Kwantificeren van Bacteriële Biodistributie <ol><li> Voor elk tijdstip, accijnzen en wegen van de tumoren. </li><li> Voeg 500 ul PBS + 15% glycerol en homogeniseren met behulp van een Tissue-Tearor (BioSpec). Spoel de homogenisator 3 maal met ethanol tussen de monsters. </li><li> Genereer seriële verdunningen en plaat voor bacteriële kolonie tellen. Tot op het bord meerdere verdunningen op een enkele plaat gebruik pre-coupes platen. </li></ol>

<ol><li>Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+phoP%2FphoQ-deleted%2C+aroA-deleted+live+oral+Salmonella+typhi+vaccine+strain+in+human+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers.</a> Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).</li>
<li>Leschner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Invasion+of+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+Is+Accompanied+by+Strong+Hemorrhage+Promoted+by+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha.</a> Plos One. 4 (8), (2009).</li>
<li>Min, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bioluminescence+imaging+of+tumor-targeting+bacteria+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals.</a> Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).</li>
<li>Min, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+real-time+imaging+of+tumors+and+metastases+using+tumor-targeting+light-emitting+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli.</a> Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).</li>
<li>Choy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+noninvasive+fluorescent+and+bioluminescent+small+animal+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging.</a> Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).</li>
<li>Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-targeted+Salmonella+as+a+novel+anticancer+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector.</a> Cancer Research. 57 (20), 4537-4544 (1997).</li>
<li>Fu, X., Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ovarian+carcinoma+metastatic+models+constructed+in+nude+mice+by+orthotopic+transplantation+of+histologically-intact+patient+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens.</a> Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).</li>
<li>Ozbudak, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).</li>
<li>Elowitz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li>
<li>Toso, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+the+intravenous+administration+of+attenuated+Salmonella+typhimurium+to+patients+with+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma.</a> J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).</li>
<li>Heimann, D. M., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+intravenous+administration+of+live+genetically+modified+salmonella+typhimurium+in+patients+with+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Continuous intravenous administration of live genetically modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma.</a> J. Immunother. 26 (2), 179-180 (2003).</li>
<li>Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+perfect+%28bacterial%29+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor+gene+by+shRNA-expressing+Salmonella-mediated+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi.</a> Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-seeking+Salmonella+amino+acid+auxotrophs%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs.</a> Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).</li>
<li>Nguyen, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+Salmonella+typhimurium+as+an+imageable+therapeutic+probe+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer.</a> Cancer Research. 70 (1), 18-23 (2010).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+therapy+with+a+Salmonella+typhimurium+leucine-arginine+auxotroph+cures+orthotopic+human+breast+tumors+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice.</a> Cancer Research. 66 (15), 7647-7652 (2006).</li>
<li>Danino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synchronized+quorum+of+genetic+clocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synchronized quorum of genetic clocks.</a> Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).</li>
<li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmentally+controlled+invasion+of+cancer+cells+by+engineered+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria.</a> J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).</li>
<li>Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+gene+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered gene circuits.</a> Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).</li>
<li>Prindle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensing+array+of+radically+coupled+genetic+%27biopixels%27%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A sensing array of radically coupled genetic 'biopixels'.</a> Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).</li>
<li>Xu, D. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+delivery+of+siRNAs%3A+a+new+approach+to+solid+tumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy.</a> Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).</li>
<li>Zheng, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+amplified+protein+expression+therapy%3A+Salmonella+as+a+tumor-selective+protein+delivery+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol.+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector.</a> Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+balanced-lethal+host-vector+system+based+on+glmS%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS.</a> Plos One. 8 (3), e60511(2013).</li>
<li>Prindle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Circuits+in+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic Circuits in Salmonella typhimurium.</a> ACS Synthetic Biology. , (2012).</li>
<li>Danino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+expression+dynamics+of+tumor-targeted+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria.</a> ACS Synthetic Biology. , (2012).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial-temporal+imaging+of+bacterial+infection+and+antibiotic+response+in+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Met behulp van deze procedure, zijn we in staat om de tijd cursussen voor de groei en gen dynamiek expressie van bacteriën koloniseren tumoren te genereren. Hoewel deze metingen worden routinematig uitgevoerd in vitro in batch cultuur of microfluïdische apparaten, ze veel moeilijker uit te voeren in vivo. Er zijn verscheidene modificaties kunnen worden toegepast op deze methoden. Terwijl we de OVCAR-8 cellijn onze muismodellen genereren, kan een aantal andere cellijnen geli...

Synthetische biologie is veel vooruitgang geboekt de afgelopen tien jaar en is nu gepositioneerd om belangrijke problemen in de energie en gezondheid beïnvloeden. Echter, heeft uitbreiding in de klinische arena is vertraagd door bezorgdheid over de veiligheid en de afwezigheid van het ontwikkelen van ontwerpcriteria voor in vivo genetische circuits. Versnellen hoge impact medische toepassingen vereisen het gebruik van methoden die rechtstreeks interface met medische infrastructuur, genetische circuits die buiten het gecontroleerde laboratorium omgeving functioneren, en veilig en klinisch-aanvaarde microbiële gastheren. Een aantal stammen werden onderzocht voor de behandeling van kanker vanwege hun vermogen om bij voorkeur groeien in tumoren. Deze zijn opgenomen C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum en S. typhimurium 3-8. S. typhimurium heeft bijzondere belangstelling opgewekt als ze de veiligheid en tolerantie zijn tentoongesteld in een aantal menselijke klinische proeven 9-12. Deze bacteri<html> een aanvankelijk aangetoond dat anti-tumor effecten via stimulatie van het gastheerimmuunsysteem en uitputting van voedingsstoffen die voor kanker celstofwisseling. Productie van therapeutische lading werd later toegevoegd door genetische modificaties. Hoewel deze studies vormen belangrijke vooruitgang in het gebruik van bacteriën voor tumor therapie, hebben de meerderheid van de bestaande inspanningen zich op hoog niveau expressie die doorgaans resulteert in de levering van hoge doseringen, off-target effecten, en de ontwikkeling van resistentie tegen 13-16 . Nu, kan synthetische biologie programmeerbare lading productie toevoegen door gebruik te maken van computer-ontworpen genetische circuits die geavanceerde detectie en levering 17-20 kan uitvoeren. Deze circuits worden ontworpen als systemen die tumor-specifieke stimuli en zelfregulering cargo productie nodig zin. Echter, het bestuderen van de functie van deze schakelingen in vivo tot nu toe uitdagend. ve_content &quot;&gt; Aangezien plasmiden zijn gemeenschappelijk kader voor synthetische circuits beschrijven we een methode om de dynamiek van plasmide-gebaseerde genexpressie karakteriseren in vivo in een muismodel. Deze werkwijzen maken gebruik van time-lapse luminescentie beeldvorming en kwantitatieve meting van biodistributie. Samen deze benaderingen een kader voor het bestuderen plasmide-gebaseerde netwerken in vivo klinische toepassingen.

<table><tbody><tr><td>1 ml spuit</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>3/10 cc Insulinspuit</td><td>BD Biosciences</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide Naald </td><td>BD Biosciences</td><td>301629</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1X), vloeibaar, met L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Broth</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani bouillon</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr></tbody></table>

het meten van groei en genexpressie dynamiek van tumor-gerichte<em&gt; s. typhimurium</em&gt; bacteriën

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

Het doel van deze experimenten is om kwantitatief tijdsverloop gegevens over de groei en gen expressie dynamiek van verzwakte S. genereren typhimurium bacteriële kolonies groeien binnen tumoren. We gegenereerde model xenograft tumoren bij muizen door subcutane injectie van een mens eierstokkanker cellijn, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). We getransformeerde verzwakte stammen van S. typhimurium bacteriën (ELH430: SL1344 PhoPQ-1) met een constitutief tot expressie luciferase (luxCDABE) plasmide voor visualisatie 2. Deze stammen specifiek koloniseren tumoren terwijl hoofdzaak niet-virulent blijven de muis 1. Zodra meetbare tumoren werden vastgesteld, werden bacteriën intraveneus geïnjecteerd via de staartader met wisselende dosering. Tumor-gelokaliseerde werd bacteriële genexpressie in real tijd in de loop van 60 uur met eenin vivo imaging-systeem (IVIS). Op elk tijdspunt werden tumoren uitgesneden, gehomogeniseerd en uitgeplaat op bacteriële kolonies correlatie met genexpressiedata kwantificeren. Tezamen zijn deze gegevens levert een kwantitatieve maat van de in vivo expressie en gen dynamiek van bacteriën groeien binnen tumoren.

Met behulp van dit protocol, zijn we in staat om gegevens over de in vivo groei en gen dynamiek expressie van tumor gerichte bacteriën genereren. De algehele werkstroom wordt samengevat in figuur 1. In de eerste fase, het injecteren we bacteriën (groen) en het dier met behulp van IVIS om genexpressie te meten met luminescentie (blauw) als verslaggever. Daarna, in de tweede fase, we accijnzen, homogeniseren, en plaat tumoren voor koloniet...

Het doel van deze experimenten is om kwantitatief tijdsverloop gegevens over de groei en gen expressie dynamiek van verzwakte genereren<em&gt; S. typhimurium</em&gt; Bacteriële kolonies groeien binnen tumoren. Deze video behandelt tumorcel voorbereiding en de inplanting, bacteriën voorbereiding en injectie, hele-dier luminescentie beeldvorming, tumorexcisie, en bacteriële kolonie tellen.

Het meten van groei en genexpressie Dynamiek van Tumor-Gerichte<em&gt; S. Typhimurium</em&gt; Bacteriën

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium ...

Het algemene doel van dit experiment is om de in vivo genexpressiedynamiek van S tyrian-bacteriën die in tumoren groeien te bestuderen. Eerst worden bacteriën in een muizenxenograft-kankermodel intraveneus via de staartader geïnjecteerd. De bacteriën koloniseren de tumor en groeien exponentieel, terwijl de genexpressie wordt gevisualiseerd met behulp van luminescente reporters.Bioluminescentie-imaging van het gehele dier wordt uitgevoerd met behulp van het IVUS spectrum imaging-systeem. Over een periode van 24 tot 48 uur wordt een tijdreeks van IVUS-beelden vastgelegd. Deze beeldserie wordt gecorreleerd met kolonietellingen die zijn verkregen door tumoren te homogeniseren en uit te platen.Samen stellen deze gegevens ons in staat om de genexpressie en populatiedynamiek van tumor-gerichte bacteriën in vivo in real-time kwantitatief te meten voor celpreparatie-passage, cellijnen met behulp van standaard celkweektechnieken. In dit experiment gebruikten we ocar acht cellen gross cellen tot een doelsamenvloeiing van 80 tot 100%. Oogst en tel de cellen op een hemocytometer, resuspendeer in phenolrood-vrij DMEM bij een doelconcentratie van 5 × 10⁷ cellen per milliliter, of ongeveer 200 µL per fles. Voeg 15% reduced growth factor Matrigel toe en bewaar de celsuspensie op ijs tot aan de tumorimplantatie.Anestheseer vier weken oude vrouwelijke naaktmuizen met 3% isofluraan. Laad de cellen in een spuit van 1 ml, 100 µL per tumor, en bevestig een naald van 27,5 gauge voor elk van de twee bilaterale injectieplaatsen in de achterflanken. Til de huid voorzichtig op met een pincet om een tentje te vormen en injecteer de cellen aan de basis.Zorg ervoor dat u niet te diep penetreert om bloedingen te voorkomen. Gebruik een pincet om de spuit voorzichtig te verwijderen zonder spatten te veroorzaken. Controleer de tumorgroei dagelijks gedurende 10 tot 20 dagen totdat een tumordiameter van twee tot vier millimeter is bereikt.Voorbereiding van de bacteriën: start een overnachtcultuur van bacteriën in drie ml LB-medium plus antibiotica vanuit een voorraad bij -80 °C of een gekoelde plaat. In dit experiment gebruikten we de s tyer-stam ELH vier 30. Verdun de cultuur in de ochtend 1:100 in gefilterd LB en laat deze groeien tot een OD 600 van 0,4 tot 0,6.Centrifuge en was drie keer in fosfaatgebufferde zoutoplossing en resuspendeer tot een uiteindelijke OD 600 van 0,1 of ongeveer 1 × 10⁷ cellen per ml. Voor de injectie van bacteriën: anestheteer de dieren en positioneer ze zodanig dat de staart naar uw dominante hand wijst. Lokaliseer de staartvene en dilateer deze met warm water of een warmtelamp.Laad de bacteriën in een spuit van 1 ml in een hoeveelheid van 100 µL per muis en buig de chip tot net minder dan 90 graden. Lijn de spuitpunt uit met de staartвена, penetreer op geringe diepte zonder weerstand te voelen en injecteer de bacteriën. Observeer de verplaatsing van de bloedstroom om een succesvolle injectie te bevestigen.Wacht ongeveer 12 tot 18 uur voor de beeldvorming zodat kolonisatie kan plaatsvinden. Narcoseer de dieren in de inductiekamer voor de beeldvorming van de muizen. Plaats vervolgens elke muis op het beeldvormingsplatform.Handhaaf een nauwkeurige positionering om kwantitatieve resultaten tussen de tijdspunten te waarborgen; beeld de dieren in met het Ibis Spectrum imaging-systeem. Plaats bij het beelden van meerdere dieren lichtbarrières tussen hen om kruisbestuiving van licht te voorkomen. Voer de dissectie van het dier uit door de tumor met een pincet vast te houden. Verwijder de huid met een omgekeerde schaarbeweging.Zodra het grootste deel van de huid is gescheiden, wordt de tumor volledig verwijderd met een pincet. Plaats de organen in vooraf gewogen microcentrifugebuisjes. Aangezien de massa van deze buisjes aanzienlijk kan variëren, is het belangrijk om ze vooraf te wegen voor kwantitatieve resultaten.Kwantificering van de bacteriële biodistributie voor elk tijdstip: verwijder en weeg de tumoren, voeg 500 µL PBS plus 15% glycerol toe en homogeniseer met een weefselmolen, maak seriële verdunningen en zaai deze uit voor het tellen van bacteriële koloniën; representatieve resultaten. Met dit protocol zijn we in staat om gegevens te genereren over de in vivo groei en de dynamiek van genexpressie van tumor-gerichte bacteriën. De algehele workflow is hier samengevat.In de eerste fase injecteerden we bacteriën en beeldden we het dier in beeld met ivus om de genexpressie te meten met luminescentie als reporter. Vervolgens hebben we in de tweede fase tumoren weggenomen, gehomogeniseerd en uitgeplaat voor kolonietellingen om het aantal bacteriën dat in de tumor groeide te bepalen. Bioluminescentie gegenereerd door bacteriële stammen wordt gevisualiseerd met ivus; het signaal neemt toe met de geïnjecteerde dosis, waarbij de minimale kolonisatiedosis in alle gevallen rond de 5 × 10⁵ ligt vanwege attenuatie.De bacteriën koloniseren ofwel specifiek de tumoren of groeien niet significant in de muizen. Het signaal wordt gekwantificeerd met radiantie-eenheden om te normaliseren voor de belichtingstijd; typische waarden van 10⁶ of hoger zijn indicatief voor kolonisatie voor een bepaalde infectie. Het signaal neemt in de loop van 24 tot 48 uur toe. Het piekpunt ligt hier rond 36 uur na injectie, maar de timing kan variëren afhankelijk van de gebruikte stam en het plasmide. Zorg ervoor dat de muis elke keer exact op dezelfde manier wordt gepositioneerd om kwantitatieve resultaten in de volgende reeks experimenten te garanderen.De bacteriële biodistributie wordt gekwantificeerd om de groei van bacteriën in verschillende organen over tijd te meten; levensvatbare bacteriën in tumoren worden gekwantificeerd door de tumor uit te snijden, te homogeniseren en een seriële verdunning ervan uit te platen. Andere organen kunnen op soortgelijke wijze worden gekwantificeerd. In dit experiment is de milt gebruikt, aangezien de tumor-miltverhouding een typische maat is voor de bacteriële specificiteit na herberekening aan de hand van de verdunningsfactor.Deze tellingen stellen ons in staat om de specifieke bacteriële populatie in de loop van de tijd te meten. Aan de linkerzijde is te zien dat het aantal bacteriën gedurende de duur van het experiment gestaag toeneemt. Met een verdubbelingstijd tussen één en drie uur is dit aanzienlijk lager dan bij experimenten in batchcultuur.Dit is waarschijnlijk te wijten aan de slechte voedingsomstandigheden in de tumoromgeving. Rechts hebben we de tumor-miltverhouding gekwantificeerd en waargenomen dat deze gedurende het experiment toeneemt. Het doel van deze experimenten is om de dynamiek van de groei en genexpressie van bacteriën en tumoromgevingen kwantitatief te monitoren met behulp van IVUS-beeldvorming en technieken voor kolonievorming.We hebben aangetoond dat bacteriepopulaties in vivo in tumoromgevingen gekarakteriseerd kunnen worden. In de toekomst kunnen complexere genexpressieprogramma's worden ontworpen en ontwikkeld om geavanceerde therapeutische afgiftesystemen in bacteriën op te bouwen.I.

measuring-growth-gene-expression-dynamics-tumor-targeted-s

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Liu, P. C., et al. Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a microfluidic chip to visualize and compare the growth and morphology of wild-type and trimethoprim-resistant E. coli strains under trimethoprim antibiotic stress.

Bacterial Growth on a Microfluidic Chip to Study Antibiotic Drug Resistance

We beschrijven een werkwijze voor het volgen van de endomembraan scheuren opgewekt door de intracellulaire...

Single Cell Metingen van vacuole Rupture Veroorzaakt door intracellulaire pathogenen

Deze video artikel beschrijft de high throughput pijpleiding die is met succes tot infectie en analyseren van grote aantallen zebravis embryo's die een nieuw krachtig hulpmiddel voor beproeving en drug discovery met geheel gewerveld organisme.

Oprichting en Optimalisatie van een High Throughput Setup om te studeren<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; En<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infectie als een model voor Drug Discovery

Hier presenteren we fenomisch aanpakken voor de functionele karakterisering van putatieve faaggenen. Technieken omvatten een ontwikkelde test die in staat is om het anabole metabolisme van de gastheer te monitoren, de Multi-fenotype Assay Plates (MAPs), naast de gevestigde methode van metabolomics, die in staat is om effecten op katabool metabolisme te meten.

Faag phenomics: Fysiologische Approaches te karakteriseren Novel virale eiwitten

De rol van het assortiment (ruimtelijke segregatie) in de evolutionaire scenario's kunnen worden onderzocht met behulp van eenvoudige microbiële systemen in het laboratorium die het mogelijk maken gecontroleerde aanpassing van de ruimtelijke verdeling. Door wijziging van de oprichter celdichtheid, kunnen diverse assortiment niveaus worden gevisualiseerd met behulp van fluorescent gelabelde bacteriestammen in de kolonie biofilms van Bacillus subtilis.

Monitoring ruimtelijke segregatie in Surface Kolonisatie microbiële populaties

Kwantitatieve evaluatie van bacteriële groei is van essentieel belang voor het begrip van microbiële fysiologie als een verschijnsel systemen-niveau. Een protocol voor experimentele manipulatie en een analytische aanpak worden ingevoerd, waardoor nauwkeurige, high-throughput analyse van bacteriële groei, die een belangrijke onderwerp van belang in de systeembiologie.

Nauwkeurige, High-throughput analyse van de bacteriële groei

Hier wordt beschreven, is een methode voor het analyseren van bacteriële genexpressie in dierlijke weefsels op een cellulair niveau. Deze methode biedt een bron voor de studie van de fenotypische verscheidenheid die zich voordoen binnen een bacteriële bevolking in antwoord op het milieu weefsel tijdens een infectie.

Een fluorescentie gebaseerde methode om te studeren van bacteriële genregulatie in geïnfecteerde weefsels

De groei van van bacteriële culturen in micro titer gerechten vergemakkelijkt een hoge doorvoer bemonstering die meerdere technische en biologische repliceren assays van nucleotide zwembad overvloed, met inbegrip van die van (p) ppgpp. De effecten van groei overgangen veroorzaakt door bronnen van fysiologische stress en herstel van stress kunnen worden gecontroleerd.

Gebruik van Microtiter schotel Radiolabeling voor meervoudige in vivo metingen van Escherichia coli (p) Ppgpp gevolgd door Dunnelaagchromatografie

Gistgroei fenotypes worden nauwkeurig gemeten door middel van zeer parallelle time-lapse beeldvorming van geïmmobiliseerde cellen die uitgroeien tot microkolonnies. Tegelijkertijd kunnen stresstolerantie, eiwitexpressie en eiwitlokalisatie worden gemonitord, waardoor geïntegreerde datasets worden gegenereerd om te bestuderen hoe omgevings- en genetische verschillen, evenals genexpressie heterogeniteit tussen isogene cellen, de groei moduleren.

Live imaging met hoge doorvoer van microkolonnies om heterogeniteit in groei en genexpressie te meten

Antibioticapersistentie beschrijft het vermogen van kleine subpopulaties binnen een gevoelige isogene populatie om tijdelijk hoge doses bacteriedodende antibiotica te verdragen. Het huidige protocol combineert benaderingen om het fenotype van antibioticapersistentie op moleculair en cellulair niveau te karakteriseren na blootstelling van Escherichia coli aan dodelijke doses ofloxacine.

Populatie- en eencellige analyse van antibioticapersistentie in Escherichia coli

Bacteriofagen (fagen), virussen die bacteriën infecteren, zijn een integraal onderdeel van het darmmicrobioom. Hoewel deze symbiotische bewoners de bacteriële fitheid en populatiedynamiek aansturen, is er weinig bekend over hoe ze de darmhomeostase en ziekte beïnvloeden. Dit protocol bestudeert geïsoleerde T4-fagen in een muismodel, aanpasbaar aan andere faag-bacterieparen.

T4 Bacteriofaag en E. coli Interactie in de Muizendarm: een prototypisch model voor het bestuderen van gastheer-bacteriofaagdynamiek in vivo

Leer hoe je groei en genexpressie van S. Typhimurium in tumoren meet met bioluminescentiebeeldvorming en kolonie-tellingen. Deze methode helpt bij het ontwikkelen van bacteriële kankertherapieën.

Het meten van groei en genexpressie Dynamiek van Tumor-Gerichte

Meer video's verkennen