Het meten van groei en genexpressie Dynamiek van Tumor-Gerichte

Het algemene doel van dit experiment is om de in vivo genexpressiedynamiek van S tyrian-bacteriën die in tumoren groeien te bestuderen. Eerst worden bacteriën in een muizenxenograft-kankermodel intraveneus via de staartader geïnjecteerd. De bacteriën koloniseren de tumor en groeien exponentieel, terwijl de genexpressie wordt gevisualiseerd met behulp van luminescente reporters.

Bioluminescentie-imaging van het gehele dier wordt uitgevoerd met behulp van het IVUS spectrum imaging-systeem. Over een periode van 24 tot 48 uur wordt een tijdreeks van IVUS-beelden vastgelegd. Deze beeldserie wordt gecorreleerd met kolonietellingen die zijn verkregen door tumoren te homogeniseren en uit te platen.

Samen stellen deze gegevens ons in staat om de genexpressie en populatiedynamiek van tumor-gerichte bacteriën in vivo in real-time kwantitatief te meten voor celpreparatie-passage, cellijnen met behulp van standaard celkweektechnieken. In dit experiment gebruikten we ocar acht cellen gross cellen tot een doelsamenvloeiing van 80 tot 100%. Oogst en tel de cellen op een hemocytometer, resuspendeer in phenolrood-vrij DMEM bij een doelconcentratie van 5 × 10⁷ cellen per milliliter, of ongeveer 200 µL per fles. Voeg 15% reduced growth factor Matrigel toe en bewaar de celsuspensie op ijs tot aan de tumorimplantatie.

Anestheseer vier weken oude vrouwelijke naaktmuizen met 3% isofluraan. Laad de cellen in een spuit van 1 ml, 100 µL per tumor, en bevestig een naald van 27,5 gauge voor elk van de twee bilaterale injectieplaatsen in de achterflanken. Til de huid voorzichtig op met een pincet om een tentje te vormen en injecteer de cellen aan de basis.

Zorg ervoor dat u niet te diep penetreert om bloedingen te voorkomen. Gebruik een pincet om de spuit voorzichtig te verwijderen zonder spatten te veroorzaken. Controleer de tumorgroei dagelijks gedurende 10 tot 20 dagen totdat een tumordiameter van twee tot vier millimeter is bereikt.

Voorbereiding van de bacteriën: start een overnachtcultuur van bacteriën in drie ml LB-medium plus antibiotica vanuit een voorraad bij -80 °C of een gekoelde plaat. In dit experiment gebruikten we de s tyer-stam ELH vier 30. Verdun de cultuur in de ochtend 1:100 in gefilterd LB en laat deze groeien tot een OD 600 van 0,4 tot 0,6.

Centrifuge en was drie keer in fosfaatgebufferde zoutoplossing en resuspendeer tot een uiteindelijke OD 600 van 0,1 of ongeveer 1 × 10⁷ cellen per ml. Voor de injectie van bacteriën: anestheteer de dieren en positioneer ze zodanig dat de staart naar uw dominante hand wijst. Lokaliseer de staartvene en dilateer deze met warm water of een warmtelamp.

Laad de bacteriën in een spuit van 1 ml in een hoeveelheid van 100 µL per muis en buig de chip tot net minder dan 90 graden. Lijn de spuitpunt uit met de staartвена, penetreer op geringe diepte zonder weerstand te voelen en injecteer de bacteriën. Observeer de verplaatsing van de bloedstroom om een succesvolle injectie te bevestigen.

Wacht ongeveer 12 tot 18 uur voor de beeldvorming zodat kolonisatie kan plaatsvinden. Narcoseer de dieren in de inductiekamer voor de beeldvorming van de muizen. Plaats vervolgens elke muis op het beeldvormingsplatform.

Handhaaf een nauwkeurige positionering om kwantitatieve resultaten tussen de tijdspunten te waarborgen; beeld de dieren in met het Ibis Spectrum imaging-systeem. Plaats bij het beelden van meerdere dieren lichtbarrières tussen hen om kruisbestuiving van licht te voorkomen. Voer de dissectie van het dier uit door de tumor met een pincet vast te houden. Verwijder de huid met een omgekeerde schaarbeweging.

Zodra het grootste deel van de huid is gescheiden, wordt de tumor volledig verwijderd met een pincet. Plaats de organen in vooraf gewogen microcentrifugebuisjes. Aangezien de massa van deze buisjes aanzienlijk kan variëren, is het belangrijk om ze vooraf te wegen voor kwantitatieve resultaten.

Kwantificering van de bacteriële biodistributie voor elk tijdstip: verwijder en weeg de tumoren, voeg 500 µL PBS plus 15% glycerol toe en homogeniseer met een weefselmolen, maak seriële verdunningen en zaai deze uit voor het tellen van bacteriële koloniën; representatieve resultaten. Met dit protocol zijn we in staat om gegevens te genereren over de in vivo groei en de dynamiek van genexpressie van tumor-gerichte bacteriën. De algehele workflow is hier samengevat.

In de eerste fase injecteerden we bacteriën en beeldden we het dier in beeld met ivus om de genexpressie te meten met luminescentie als reporter. Vervolgens hebben we in de tweede fase tumoren weggenomen, gehomogeniseerd en uitgeplaat voor kolonietellingen om het aantal bacteriën dat in de tumor groeide te bepalen. Bioluminescentie gegenereerd door bacteriële stammen wordt gevisualiseerd met ivus; het signaal neemt toe met de geïnjecteerde dosis, waarbij de minimale kolonisatiedosis in alle gevallen rond de 5 × 10⁵ ligt vanwege attenuatie.

De bacteriën koloniseren ofwel specifiek de tumoren of groeien niet significant in de muizen. Het signaal wordt gekwantificeerd met radiantie-eenheden om te normaliseren voor de belichtingstijd; typische waarden van 10⁶ of hoger zijn indicatief voor kolonisatie voor een bepaalde infectie. Het signaal neemt in de loop van 24 tot 48 uur toe. Het piekpunt ligt hier rond 36 uur na injectie, maar de timing kan variëren afhankelijk van de gebruikte stam en het plasmide. Zorg ervoor dat de muis elke keer exact op dezelfde manier wordt gepositioneerd om kwantitatieve resultaten in de volgende reeks experimenten te garanderen.

De bacteriële biodistributie wordt gekwantificeerd om de groei van bacteriën in verschillende organen over tijd te meten; levensvatbare bacteriën in tumoren worden gekwantificeerd door de tumor uit te snijden, te homogeniseren en een seriële verdunning ervan uit te platen. Andere organen kunnen op soortgelijke wijze worden gekwantificeerd. In dit experiment is de milt gebruikt, aangezien de tumor-miltverhouding een typische maat is voor de bacteriële specificiteit na herberekening aan de hand van de verdunningsfactor.

Deze tellingen stellen ons in staat om de specifieke bacteriële populatie in de loop van de tijd te meten. Aan de linkerzijde is te zien dat het aantal bacteriën gedurende de duur van het experiment gestaag toeneemt. Met een verdubbelingstijd tussen één en drie uur is dit aanzienlijk lager dan bij experimenten in batchcultuur.

Dit is waarschijnlijk te wijten aan de slechte voedingsomstandigheden in de tumoromgeving. Rechts hebben we de tumor-miltverhouding gekwantificeerd en waargenomen dat deze gedurende het experiment toeneemt. Het doel van deze experimenten is om de dynamiek van de groei en genexpressie van bacteriën en tumoromgevingen kwantitatief te monitoren met behulp van IVUS-beeldvorming en technieken voor kolonievorming.

We hebben aangetoond dat bacteriepopulaties in vivo in tumoromgevingen gekarakteriseerd kunnen worden. In de toekomst kunnen complexere genexpressieprogramma's worden ontworpen en ontwikkeld om geavanceerde therapeutische afgiftesystemen in bacteriën op te bouwen.I.