Name: Het meten van groei en genexpressie Dynamiek van Tumor-Gerichte S. Typhimurium Bacteriën (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Leer hoe je groei en genexpressie van S. Typhimurium in tumoren meet met bioluminescentiebeeldvorming en kolonie-tellingen. Deze methode helpt bij het ontwikkelen van bacteriële kankertherapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken H. Fleming voor kritisch lezen en bewerken van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een Misrock Postdoctoraal fellowship (TD) en NDSEG graduate fellowship (AP). SNB is een HHMI onderzoeker.

1. Cell Preparation <ol><li> Passage cellijnen met behulp van standaard celkweek technieken. In dit experiment gebruikten we OVCAR-8 cellen (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). Kweek cellen een doel confluentie van 80-100%. </li><li> Incubeer cellen met 5 ml trypsine gedurende 5 min, voeg 5 ml RPMI medium + FBS om trypsine te inactiveren. </li><li> Oogst en tellen cellen op een hemocytometer. Resuspendeer in fenolrood-vrij DMEM bij een doelconcentratie van 5 x 10 7 cellen / ml, of ongeveer 200 ul per kolf. </li><li> Voeg 15% verminderde groeifactor Matrigel (BD Biosciences) en houd de celsuspensie op ijs tot implantatie. </li></ol> 2. Tumor Implantatie <ol><li> Verdoven van 4 weken oude vrouwelijke NCR / nu muizen met 3% isofluraan en wacht ongeveer 5 min tot diepe verdoving zorgen. Gebruik vet zalven ogen droog terwijl onder narcose voorkomen. </li><li> Laad de cellen (100 ul per tumor) in een 1 ml spuit en bevestig een 27 1/ 2 gauge naald. </li><li> Voor elk van de twee bilaterale achterflank injectieplaatsen, til de huid met een tang om een ​​tent te maken en te injecteren cellen aan de basis. Let er niet te diep door te dringen, het produceren van bloed. Gebruik een pincet om voorzichtig spuit te verwijderen zonder spatten. </li><li> Monitor tumorgroei gedurende 10 - 20 dagen totdat een tumor diameter van 2-4 mm wordt bereikt. </li></ol> 3. Bacteriën Voorbereiding <ol><li> Start een nachtelijke kweek van bacteriën in 3 ml LB-medium + ampicilline uit een -80 C vriezer voorraad of gekoelde plaat. In dit experiment gebruikten we S. typhimurium stam ELH430 (SL1344 PhoPQ-aroA-). </li><li> In de ochtend, verdunnen de cultuur 1:100 in gefilterd LB en groeien tot OD600 0,4-0,6. </li><li> Spin down en 3 keer wassen in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en resuspendeer in een uiteindelijke OD600 van 0,1 (ongeveer 1 x 10 7 cellen / ml). </li></ol> 4. Bacteriën Injectie <ol><li> Verdoven van het dier eend positie op zijn kant met de staart wijzend naar uw dominante hand. Gebruik vet zalven ogen droog terwijl onder narcose voorkomen. </li><li> Verwijden de staart ader met behulp van warm water of een warmtelamp. </li><li> Laad de bacteriën (100 pi per muis) in een 1 ml spuit en buig het uiteinde iets minder dan 90 graden. </li><li> Breng de spuit met de staart ader, dringen op een geringe diepte (mag geen weerstand voelen), en injecteer bacteriën. Observeer bloodflow verplaatsing voor een succesvolle injectie. </li></ol> 5. Muis Imaging <ol><li> Verdoven van dieren in de inductie kamer plaats dan elke muis op de imaging platform. Gebruik vet zalven ogen droog terwijl onder narcose voorkomen. Behouden nauwkeurige positionering om kwantitatieve resultaten tussen tijdstippen zorgen. </li><li> Afbeelding dieren met behulp van de IVIS Spectrum imaging-systeem (Remklauw Life Sciences). Als de beeldvorming meer dan 1 dier, plaats licht barrières tussen hen om cross-illu voorkomenminatie. Dieren moet eerst worden afgebeeld op de buikzijde naar lokalisatie van bacteriën te bevestigen. </li><li> Afbeelding dieren dorsaal met IVIS elke 2 uur gedurende de duur van het experiment (36 uur). Genereer een tijdsverloop voor een bepaalde ROI. </li></ol> 6. Kwantificeren van Bacteriële Biodistributie <ol><li> Euthanaseren dieren met behulp van CO 2 en de plaats op de rug op een absorberende luier. </li><li> Draai het dier de twee achterste flank subcutane tumoren bloot. Snijd de omringende huidweefsel te scheiden en te verwijderen van de tumoren. Houden van de tumor met een pincet, verwijder de huid met behulp van een omgekeerde schaar beweging. Wanneer de meerderheid van de huid is gescheiden, volledig te verwijderen van de tumor met een pincet. </li><li> Plaats de organen in gewogen microcentrifugebuizen. Aangezien de massa van deze buizen aanzienlijk variëren is het belangrijk voor een pre-wegen van kwantitatieve resultaten. </li></ol> 7. Kwantificeren van Bacteriële Biodistributie <ol><li> Voor elk tijdstip, accijnzen en wegen van de tumoren. </li><li> Voeg 500 ul PBS + 15% glycerol en homogeniseren met behulp van een Tissue-Tearor (BioSpec). Spoel de homogenisator 3 maal met ethanol tussen de monsters. </li><li> Genereer seriële verdunningen en plaat voor bacteriële kolonie tellen. Tot op het bord meerdere verdunningen op een enkele plaat gebruik pre-coupes platen. </li></ol>

<ol><li>Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+phoP%2FphoQ-deleted%2C+aroA-deleted+live+oral+Salmonella+typhi+vaccine+strain+in+human+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers.</a> Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).</li>
<li>Leschner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Invasion+of+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+Is+Accompanied+by+Strong+Hemorrhage+Promoted+by+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha.</a> Plos One. 4 (8), (2009).</li>
<li>Min, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bioluminescence+imaging+of+tumor-targeting+bacteria+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals.</a> Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).</li>
<li>Min, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+real-time+imaging+of+tumors+and+metastases+using+tumor-targeting+light-emitting+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli.</a> Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).</li>
<li>Choy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+noninvasive+fluorescent+and+bioluminescent+small+animal+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging.</a> Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).</li>
<li>Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-targeted+Salmonella+as+a+novel+anticancer+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector.</a> Cancer Research. 57 (20), 4537-4544 (1997).</li>
<li>Fu, X., Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ovarian+carcinoma+metastatic+models+constructed+in+nude+mice+by+orthotopic+transplantation+of+histologically-intact+patient+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens.</a> Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).</li>
<li>Ozbudak, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).</li>
<li>Elowitz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li>
<li>Toso, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+the+intravenous+administration+of+attenuated+Salmonella+typhimurium+to+patients+with+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma.</a> J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).</li>
<li>Heimann, D. M., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+intravenous+administration+of+live+genetically+modified+salmonella+typhimurium+in+patients+with+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Continuous intravenous administration of live genetically modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma.</a> J. Immunother. 26 (2), 179-180 (2003).</li>
<li>Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+perfect+%28bacterial%29+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor+gene+by+shRNA-expressing+Salmonella-mediated+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi.</a> Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-seeking+Salmonella+amino+acid+auxotrophs%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs.</a> Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).</li>
<li>Nguyen, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+Salmonella+typhimurium+as+an+imageable+therapeutic+probe+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer.</a> Cancer Research. 70 (1), 18-23 (2010).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+therapy+with+a+Salmonella+typhimurium+leucine-arginine+auxotroph+cures+orthotopic+human+breast+tumors+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice.</a> Cancer Research. 66 (15), 7647-7652 (2006).</li>
<li>Danino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synchronized+quorum+of+genetic+clocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synchronized quorum of genetic clocks.</a> Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).</li>
<li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmentally+controlled+invasion+of+cancer+cells+by+engineered+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria.</a> J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).</li>
<li>Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+gene+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered gene circuits.</a> Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).</li>
<li>Prindle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensing+array+of+radically+coupled+genetic+%27biopixels%27%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A sensing array of radically coupled genetic 'biopixels'.</a> Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).</li>
<li>Xu, D. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+delivery+of+siRNAs%3A+a+new+approach+to+solid+tumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy.</a> Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).</li>
<li>Zheng, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+amplified+protein+expression+therapy%3A+Salmonella+as+a+tumor-selective+protein+delivery+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol.+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector.</a> Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+balanced-lethal+host-vector+system+based+on+glmS%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS.</a> Plos One. 8 (3), e60511(2013).</li>
<li>Prindle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Circuits+in+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic Circuits in Salmonella typhimurium.</a> ACS Synthetic Biology. , (2012).</li>
<li>Danino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+expression+dynamics+of+tumor-targeted+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria.</a> ACS Synthetic Biology. , (2012).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial-temporal+imaging+of+bacterial+infection+and+antibiotic+response+in+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Met behulp van deze procedure, zijn we in staat om de tijd cursussen voor de groei en gen dynamiek expressie van bacteriën koloniseren tumoren te genereren. Hoewel deze metingen worden routinematig uitgevoerd in vitro in batch cultuur of microfluïdische apparaten, ze veel moeilijker uit te voeren in vivo. Er zijn verscheidene modificaties kunnen worden toegepast op deze methoden. Terwijl we de OVCAR-8 cellijn onze muismodellen genereren, kan een aantal andere cellijnen geli...

Synthetische biologie is veel vooruitgang geboekt de afgelopen tien jaar en is nu gepositioneerd om belangrijke problemen in de energie en gezondheid beïnvloeden. Echter, heeft uitbreiding in de klinische arena is vertraagd door bezorgdheid over de veiligheid en de afwezigheid van het ontwikkelen van ontwerpcriteria voor in vivo genetische circuits. Versnellen hoge impact medische toepassingen vereisen het gebruik van methoden die rechtstreeks interface met medische infrastructuur, genetische circuits die buiten het gecontroleerde laboratorium omgeving functioneren, en veilig en klinisch-aanvaarde microbiële gastheren. Een aantal stammen werden onderzocht voor de behandeling van kanker vanwege hun vermogen om bij voorkeur groeien in tumoren. Deze zijn opgenomen C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum en S. typhimurium 3-8. S. typhimurium heeft bijzondere belangstelling opgewekt als ze de veiligheid en tolerantie zijn tentoongesteld in een aantal menselijke klinische proeven 9-12. Deze bacteri<html> een aanvankelijk aangetoond dat anti-tumor effecten via stimulatie van het gastheerimmuunsysteem en uitputting van voedingsstoffen die voor kanker celstofwisseling. Productie van therapeutische lading werd later toegevoegd door genetische modificaties. Hoewel deze studies vormen belangrijke vooruitgang in het gebruik van bacteriën voor tumor therapie, hebben de meerderheid van de bestaande inspanningen zich op hoog niveau expressie die doorgaans resulteert in de levering van hoge doseringen, off-target effecten, en de ontwikkeling van resistentie tegen 13-16 . Nu, kan synthetische biologie programmeerbare lading productie toevoegen door gebruik te maken van computer-ontworpen genetische circuits die geavanceerde detectie en levering 17-20 kan uitvoeren. Deze circuits worden ontworpen als systemen die tumor-specifieke stimuli en zelfregulering cargo productie nodig zin. Echter, het bestuderen van de functie van deze schakelingen in vivo tot nu toe uitdagend. ve_content &quot;&gt; Aangezien plasmiden zijn gemeenschappelijk kader voor synthetische circuits beschrijven we een methode om de dynamiek van plasmide-gebaseerde genexpressie karakteriseren in vivo in een muismodel. Deze werkwijzen maken gebruik van time-lapse luminescentie beeldvorming en kwantitatieve meting van biodistributie. Samen deze benaderingen een kader voor het bestuderen plasmide-gebaseerde netwerken in vivo klinische toepassingen.

<table><tbody><tr><td>1 ml spuit</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>3/10 cc Insulinspuit</td><td>BD Biosciences</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide Naald </td><td>BD Biosciences</td><td>301629</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1X), vloeibaar, met L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Broth</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani bouillon</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr></tbody></table>

het meten van groei en genexpressie dynamiek van tumor-gerichte<em&gt; s. typhimurium</em&gt; bacteriën

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

Het doel van deze experimenten is om kwantitatief tijdsverloop gegevens over de groei en gen expressie dynamiek van verzwakte S. genereren typhimurium bacteriële kolonies groeien binnen tumoren. We gegenereerde model xenograft tumoren bij muizen door subcutane injectie van een mens eierstokkanker cellijn, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). We getransformeerde verzwakte stammen van S. typhimurium bacteriën (ELH430: SL1344 PhoPQ-1) met een constitutief tot expressie luciferase (luxCDABE) plasmide voor visualisatie 2. Deze stammen specifiek koloniseren tumoren terwijl hoofdzaak niet-virulent blijven de muis 1. Zodra meetbare tumoren werden vastgesteld, werden bacteriën intraveneus geïnjecteerd via de staartader met wisselende dosering. Tumor-gelokaliseerde werd bacteriële genexpressie in real tijd in de loop van 60 uur met eenin vivo imaging-systeem (IVIS). Op elk tijdspunt werden tumoren uitgesneden, gehomogeniseerd en uitgeplaat op bacteriële kolonies correlatie met genexpressiedata kwantificeren. Tezamen zijn deze gegevens levert een kwantitatieve maat van de in vivo expressie en gen dynamiek van bacteriën groeien binnen tumoren.

Met behulp van dit protocol, zijn we in staat om gegevens over de in vivo groei en gen dynamiek expressie van tumor gerichte bacteriën genereren. De algehele werkstroom wordt samengevat in figuur 1. In de eerste fase, het injecteren we bacteriën (groen) en het dier met behulp van IVIS om genexpressie te meten met luminescentie (blauw) als verslaggever. Daarna, in de tweede fase, we accijnzen, homogeniseren, en plaat tumoren voor koloniet...

Het doel van deze experimenten is om kwantitatief tijdsverloop gegevens over de groei en gen expressie dynamiek van verzwakte genereren<em&gt; S. typhimurium</em&gt; Bacteriële kolonies groeien binnen tumoren. Deze video behandelt tumorcel voorbereiding en de inplanting, bacteriën voorbereiding en injectie, hele-dier luminescentie beeldvorming, tumorexcisie, en bacteriële kolonie tellen.

Het meten van groei en genexpressie Dynamiek van Tumor-Gerichte<em&gt; S. Typhimurium</em&gt; Bacteriën

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium ...

Het algemene doel van dit experiment is om de in vivo genexpressiedynamiek van S tyrian-bacteriën die in tumoren groeien te bestuderen. Eerst worden bacteriën in een muizenxenograft-kankermodel intraveneus via de staartader geïnjecteerd. De bacteriën koloniseren de tumor en groeien exponentieel, terwijl de genexpressie wordt gevisualiseerd met behulp van luminescente reporters.Bioluminescentie-imaging van het gehele dier wordt uitgevoerd met behulp van het IVUS spectrum imaging-systeem. Over een periode van 24 tot 48 uur wordt een tijdreeks van IVUS-beelden vastgelegd. Deze beeldserie wordt gecorreleerd met kolonietellingen die zijn verkregen door tumoren te homogeniseren en uit te platen.Samen stellen deze gegevens ons in staat om de genexpressie en populatiedynamiek van tumor-gerichte bacteriën in vivo in real-time kwantitatief te meten voor celpreparatie-passage, cellijnen met behulp van standaard celkweektechnieken. In dit experiment gebruikten we ocar acht cellen gross cellen tot een doelsamenvloeiing van 80 tot 100%. Oogst en tel de cellen op een hemocytometer, resuspendeer in phenolrood-vrij DMEM bij een doelconcentratie van 5 × 10⁷ cellen per milliliter, of ongeveer 200 µL

measuring-growth-gene-expression-dynamics-tumor-targeted-s

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Liu, P. C., et al. Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a microfluidic chip to visualize and compare the growth and morphology of wild-type and trimethoprim-resistant E. coli strains under trimethoprim antibiotic stress.

Bacterial Growth on a Microfluidic Chip to Study Antibiotic Drug Resistance

We beschrijven een werkwijze voor het volgen van de endomembraan scheuren opgewekt door de intracellulaire...

Single Cell Metingen van vacuole Rupture Veroorzaakt door intracellulaire pathogenen

Deze video artikel beschrijft de high throughput pijpleiding die is met succes tot infectie en analyseren van grote aantallen zebravis embryo's die een nieuw krachtig hulpmiddel voor beproeving en drug discovery met geheel gewerveld organisme.

Oprichting en Optimalisatie van een High Throughput Setup om te studeren<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; En<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infectie als een model voor Drug Discovery

Hier presenteren we fenomisch aanpakken voor de functionele karakterisering van putatieve faaggenen. Technieken omvatten een ontwikkelde test die in staat is om het anabole metabolisme van de gastheer te monitoren, de Multi-fenotype Assay Plates (MAPs), naast de gevestigde methode van metabolomics, die in staat is om effecten op katabool metabolisme te meten.

Faag phenomics: Fysiologische Approaches te karakteriseren Novel virale eiwitten

De rol van het assortiment (ruimtelijke segregatie) in de evolutionaire scenario's kunnen worden onderzocht met behulp van eenvoudige microbiële systemen in het laboratorium die het mogelijk maken gecontroleerde aanpassing van de ruimtelijke verdeling. Door wijziging van de oprichter celdichtheid, kunnen diverse assortiment niveaus worden gevisualiseerd met behulp van fluorescent gelabelde bacteriestammen in de kolonie biofilms van Bacillus subtilis.

Monitoring ruimtelijke segregatie in Surface Kolonisatie microbiële populaties

Kwantitatieve evaluatie van bacteriële groei is van essentieel belang voor het begrip van microbiële fysiologie als een verschijnsel systemen-niveau. Een protocol voor experimentele manipulatie en een analytische aanpak worden ingevoerd, waardoor nauwkeurige, high-throughput analyse van bacteriële groei, die een belangrijke onderwerp van belang in de systeembiologie.

Nauwkeurige, High-throughput analyse van de bacteriële groei

Hier wordt beschreven, is een methode voor het analyseren van bacteriële genexpressie in dierlijke weefsels op een cellulair niveau. Deze methode biedt een bron voor de studie van de fenotypische verscheidenheid die zich voordoen binnen een bacteriële bevolking in antwoord op het milieu weefsel tijdens een infectie.

Een fluorescentie gebaseerde methode om te studeren van bacteriële genregulatie in geïnfecteerde weefsels

De groei van van bacteriële culturen in micro titer gerechten vergemakkelijkt een hoge doorvoer bemonstering die meerdere technische en biologische repliceren assays van nucleotide zwembad overvloed, met inbegrip van die van (p) ppgpp. De effecten van groei overgangen veroorzaakt door bronnen van fysiologische stress en herstel van stress kunnen worden gecontroleerd.

Gebruik van Microtiter schotel Radiolabeling voor meervoudige in vivo metingen van Escherichia coli (p) Ppgpp gevolgd door Dunnelaagchromatografie

Gistgroei fenotypes worden nauwkeurig gemeten door middel van zeer parallelle time-lapse beeldvorming van geïmmobiliseerde cellen die uitgroeien tot microkolonnies. Tegelijkertijd kunnen stresstolerantie, eiwitexpressie en eiwitlokalisatie worden gemonitord, waardoor geïntegreerde datasets worden gegenereerd om te bestuderen hoe omgevings- en genetische verschillen, evenals genexpressie heterogeniteit tussen isogene cellen, de groei moduleren.

Live imaging met hoge doorvoer van microkolonnies om heterogeniteit in groei en genexpressie te meten

Antibioticapersistentie beschrijft het vermogen van kleine subpopulaties binnen een gevoelige isogene populatie om tijdelijk hoge doses bacteriedodende antibiotica te verdragen. Het huidige protocol combineert benaderingen om het fenotype van antibioticapersistentie op moleculair en cellulair niveau te karakteriseren na blootstelling van Escherichia coli aan dodelijke doses ofloxacine.

Populatie- en eencellige analyse van antibioticapersistentie in Escherichia coli

Bacteriofagen (fagen), virussen die bacteriën infecteren, zijn een integraal onderdeel van het darmmicrobioom. Hoewel deze symbiotische bewoners de bacteriële fitheid en populatiedynamiek aansturen, is er weinig bekend over hoe ze de darmhomeostase en ziekte beïnvloeden. Dit protocol bestudeert geïsoleerde T4-fagen in een muismodel, aanpasbaar aan andere faag-bacterieparen.

T4 Bacteriofaag en E. coli Interactie in de Muizendarm: een prototypisch model voor het bestuderen van gastheer-bacteriofaagdynamiek in vivo

Leer hoe je groei en genexpressie van S. Typhimurium in tumoren meet met bioluminescentiebeeldvorming en kolonie-tellingen. Deze methode helpt bij het ontwikkelen van bacteriële kankertherapieën.

Het meten van groei en genexpressie Dynamiek van Tumor-Gerichte

Meer video's verkennen