Eiwitzuivering-vrij bindwijze affiniteit Bepaling door Microschaal thermophoresis

Het algemene doel van deze procedure is het bepalen van de bindingsaffiniteit van een proteïne-ligandinteractie zonder het eiwit uit een cellysaat te zuiveren. Dit wordt bereikt door eerst het GFP-gefuseerde eiwit van belang tot expressie te brengen in een willekeurige adherente cellijn. Na de bereiding van het cellysaat en de ligandverdunningen worden mengsels van cellysaat en ligand bereid en in capillairen geladen.

Vervolgens wordt de thermophorese van het GFP-fusieprotein gemeten in de aanwezigheid van variërende ligandconcentraties. De laatste stap is de data-analyse van de microscale thermophorese- of MST-metingen. Uiteindelijk wordt microscale thermophorese gebruikt om de bindingsaffiniteiten van interacties tussen GFP-fusieproteins en verschillende liganden te bepalen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals titratie, calorimetrie of oppervlakteplasmonresonantie, is dat eiwitzuivering wordt vermeden, wat de kwantitatieve karakterisering van binaire interacties aanzienlijk vereenvoudigt en versnelt. Deze methode biedt aanzienlijke voordelen bij het werken met eiwitten die moeilijk tot expressie te brengen en te zuiveren zijn, zoals membraaneiwitten en transcriptiefactoren. Een van de grootste voordelen van microscale thermophoresis is dat het werkt in diverse buffers en de aanwezigheid van detergentia en cellen in het systeem tolereert. De techniek zal worden gedemonstreerd door Karen Stefka, een bioloog uit mijn laboratorium. Begin met het kort wassen van de cellen met ijskoud fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS, waarbij 10 milliliters buffer per T 75-fles wordt gebruikt.

Houd de cellen vijf minuten op ijs of totdat ze beginnen los te laten van de kolf. Schraap de cellen indien nodig met de celscraper om ze los te maken. Resuspendeer de cellen in 10 milliliters ijskoud PBS en breng ze over naar een vooraf gekoelde 14 milliliter centrifugebuis met ronde bodem.

Pellet de cellen door centrifugatie bij 400 tot 600 Gs en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 200 µL ijskoude lysisbuffer. Breng de suspensie over naar een vooraf gekoelde 1,5 ml eppendorfbuis voor extractie van cytosolische eiwitten.

Plaats de cellen op ijs om lokale oververhitting te minimaliseren en lyseer de cellen met drie pulsen sonicatie van tien seconden bij 30% amplitude. Gebruik een vooraf gekoelde tip van twee tot drie millimeter en houd de tip onder het oppervlak om schuimvorming te minimaliseren. Sla deze stap over bij gebruik van een buffer die detergent bevat en incubeer 30 minuten op ijs.

Corrigeer in plaats daarvan, indien nodig, de lysaatoplossing zodat deze een fysiologische zoutconcentratie van 100 millimol natriumchloride bevat, gebruikmakend van een stamoplossing van vijf mol natriumchloride. Verzamel tenslotte de lysaten door centrifugatie bij ongeveer 25 000 G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Selecteer op het MST-instrument de lichtemitterende diode of LED-excitatiebron met een golflengte van 470 nanometer.

Vul de capillairen met cel-extract dat twee- en tienvoudig is verdund met MST-buffer en plaats deze in het MST-instrument. Voer de bewerking 'find capillaries' uit in de besturingssoftware van het MST-instrument. Het optimale fluorescentiebereik in het verdunde lysaat ligt tussen de 400 en 1500 fluorescentie-eenheden.

Bepaal vervolgens het optimale concentratiebereik van het ligand zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats een buisjesrek met het benodigde aantal 0,5 milliliter low bind centrifugebuisjes op ijs. Pipetteer 25 microliters MST-buffer in de bodem van elk buisje. Voeg 25 microliters van de ligand-stockoplossing toe aan het eerste buisje en voer een seriële tweevoudige verdunning van het ligand uit met behulp van de overige buisjes. Bewaar het rek met ligandmonsters op ijs.

Bereken de verdunning van het cellysaat om het optimale niveau van het fluorescente doeleiwit in de bindingsreacties te verkrijgen. De uiteindelijke eiwitconcentratie moet dicht bij of lager liggen dan de verwachte bindingsdissociatieconstante en moet worden aangepast om het benodigde aantal fluorescentietellingen te verkrijgen. Verdun vervolgens het cellysaat in de uiteindelijke oplossing met MST-buffer.

Plaats 0,5 milliliter low bind buisjes in het buisjesrek tegenover de buisjes met de seriële verdunningsstappen van het ligand. Voeg voorzichtig 15 microliters van het cellysaat toe aan de bodem van elk buisje. Probeer de wanden van de buisjes niet aan te raken om monsterverlies te voorkomen.

Voeg 15 µL van het ligandmonster met de hoogste concentratie toe aan de overeenkomstige buis. Nummer één, met het cellysaat. Meng goed en vervang de pipetpunt.

Herhaal deze stap met de overige buisjes, behalve het laatste buisje, waarin geen ligand aanwezig mag zijn. Voeg 15 µL MST-buffer toe aan het laatste buisje en meng dit. Vul de eerste capillair voor ongeveer twee derde met het bindingsmengsel uit buisje nummer één.

Kantel het buisje om de oplossing naar het midden te bewegen en plaats de capillair op de juiste positie op het capillairrek. Nummer één, herhaal deze stap met de rest van de capillairs. De uiteinden van de capillairs kunnen met was worden afgesloten voor langere experimenten.

Plaats het plateau in het MST-instrument en sluit de deur van het instrument. Selecteer vervolgens de LED-excitatiebron met een golflengte van 470 nanometers. Voer op het MST-instrument het commando 'find capillaries' uit, zodat het instrument de exacte posities van de capillairen kan bepalen en de fluorescentie van de monsters kan meten op basis van de fluorescentie-signaalintensiteit.

Pas het LED-vermogen aan om het binnen het interval van 400 tot 1500 eenheden te brengen. Klik op de startknop om het Thermo Resis Experiment uit te voeren. Voor het experiment kan er uit meer dan één infraroodlaservermogen worden gekozen.

Om de optimale temperatuurgradiënt voor het specifieke systeem te bepalen, duurt het 10 tot 12 minuten om één set van 16 capillairen te analyseren. Verzamel gegevens van twee tot drie runs voor dezelfde set capillairen om de reproduceerbaarheid van de metingen te waarborgen. Open de analysesoftware en laad de projectmap om te beginnen met de data-analyse.

Select in de viewer van de weergegeven informatie de thermoretische curven die zijn verzameld bij een specifiek IR-laservermogen. Er was een optie om alle thermoretische sporen die onder verschillende omstandigheden zijn verzameld in één keer te openen, om vervolgens willekeurige curven voor analyse te kiezen door deze aan- of uit te schakelen. Selecteer in het venster van de evaluatiepunten-grafiek de thermoresistentie of thermoforese met de blauwe en rode T-jump lijnen.

Definieer twee regio's van de experimentele curven die handmatig worden geselecteerd voor de analyse door de software. Zorg ervoor dat de blauwe en rode lijnen correct zijn gepositioneerd om de maximale verandering in Thermo Resis te verkrijgen. Om de gemiddelde punten met standaarddeviaties te verkrijgen, selecteert u 'use average' of 'distinguish runs' voor afzonderlijke runs.

Om een fit voor de dissociatieconstante te plotten, selecteert u 'use average', voert u de geconcentreerde waarde van het gelabelde molecuul in, fixeert u deze en fit u de curve. De bindingsdissociatieconstante of KD-waarde met de bijbehorende standaarddeviatie verschijnt in een apart informatievenster. Sla de gemiddelde fitgegevens op in een tekstbestand en importeer deze in Excel.Heck.

2 9 3 cellen die STAT 3G FP tot expressie brachten, werden gebruikt als bron van fluorescentielabelled stat three. Voor A DNA-bindingsassay resulteerde de binding van sterk geladen oligonucleotiden in significante veranderingen in de mobiliteit van STAT three. In de temperatuurgradiënt.

Het thermoretische signaal is uitgezet als functie van de oligonucleotideconcentratie. Elk datapunt vertegenwoordigt het gemiddelde van drie metingen. Nano temporal analysis software werd gebruikt voor de fit en om de schijnbare KD-waarden te bepalen.

De schijnbare dissociatieconstanten waren 37,9 plus of minus 1,0 µM voor binding aan het GAS-motief, en 23,3 plus of minus 0,6 µM voor binding aan het AT-rijke oligonucleotide s+100. Verrassend genoeg vertoonden s+100-sequenties een iets sterkere binding dan GAS. In drie meetherhalingen leidde de substitutie van A naar G tot een dramatische afname van de affiniteit van de s+100-mutant één.

Hoewel de s plus 100 mutant twee geen detecteerbare binding vertoonde, wat de sequentie-selectieve binding van STAT drie aan s plus 100 bevestigde, kan deze techniek, eenmaal onder de knie, in minder dan twee uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de optimale omstandigheden voor de extractie van membraaneiwitten per eiwit verschillen en gewoonlijk optimalisatie vereisen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de bindingsaffiniteit van een eiwit aan een ligand kunt bepalen zonder het eiwit uit het cellysaat te zuiveren.