Eiwitzuivering-vrij bindwijze affiniteit Bepaling door Microschaal thermophoresis
August 15th, 2013
Microschaal thermophoresis (MST) op grote schaal kunnen worden gebruikt voor de bepaling van de bindingsaffiniteit zonder zuivering van het doelwit eiwit uit cellysaten. Het protocol omvat overexpressie van GFP-gefuseerde eiwit, cellyse in niet-denaturerende omstandigheden en detectie van MST signaal in de aanwezigheid van variërende concentraties van het ligand.
Het algemene doel van deze procedure is om de bindingsaffiniteit van een eiwit-ligande-interactie te bepalen zonder het eiwit uit een cellysaat te zuiveren. Dit wordt bereikt door eerst het GFP-gefusioneerde eiwit van belang in een willekeurige aderente cellijn tot expressie te brengen. Na bereiding van cellysaat en ligandverdunningen worden cellysaat-ligande-mengsels bereid en in capillairen geladen.
Vervolgens wordt de thermo resis van het GFP-gefusioneerde eiwit in aanwezigheid van verschillende ligandconcentraties gemeten. De laatste stap is gegevensanalyse van microschaal-thermoferese of MST-metingen. Uiteindelijk wordt microschaal-thermoferese gebruikt om de bindingsaffiniteiten van interacties tussen GFP-gefusioneerde eiwitten en verschillende liganden te bepalen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals titratie, calorimetrie of oppervlakteplasmamono-isolant is dat het eiwitzuivering vermijdt, wat de kwantitatieve karakterisering van binaire interacties aanzienlijk vereenvoudigt en versnelt. Deze methode biedt aanzienlijke voordelen bij het werken met eiwitten die moeilijk te exprimeren en zuiveren zijn, zoals membraaneiwitten en transcriptiefactoren. Een van de grootste voordelen van microschaal-thermoferese is dat het in een verscheidenheid van buffers werkt en de aanwezigheid van detergenten en mijn cellen in het systeem tolereert. Het demonstreren van de techniek zal worden gedaan door Karen Stefka, een bioloog uit mijn laboratorium Om te beginnen, spoel de cellen kort met ijskoud fosfaat gebufferd zout (PBS) met behulp van 10 milliliter buffer per T 75 flacon.
Houd de cellen vijf minuten op ijs of tot ze beginnen los te komen van de flacon. Schraap de cellen los met de celschraper als dat nodig is. Resuspendeer de cellen in 10 milliliter ijskoud PBS en breng over naar een voorgekoelde 14 milliliter ronde bodemcentrifugeerbuis.
Pellet de cellen door centrifugatie bij 400 tot 600 Gs en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 200 microliter ijskoud lysisbuffer. Breng de suspensie over naar een voorgekoelde 1,5 milliliter einorbuis voor extractie van cytosolische eiwitten.
Plaats de cellen op ijs om lokale oververhitting te minimaliseren en lyseer de cellen met drie keer tien seconden pulsen van sonicatie bij 30% amplitude. Gebruik een twee tot drie millimeter voorgekoelde tip, houd de tip onder het oppervlak om schuimvorming te minimaliseren. Laat deze stap weg bij gebruik van een buffer die detergent bevat en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
Corrigeer in plaats daarvan de lysaaloplossing om een fysiologische zoutconcentratie van 100 millimolair natriumchloride te bevatten, indien nodig uit een voorraadoplossing van vijf molair natriumchloride. Verzamel ten slotte de lysaaloplossingen door centrifugatie bij ongeveer 25.000 Gs en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Selecteer de lichtemitterende diode of LED excitatiebron met de golflengte gelijk aan 470 nanometer op het MST-instrument.
Laad capillairen met cellysaat verdund twee en tien keer met MST-buffer en plaats ze in het MST-instrument. Voer de find capillaries operatie uit op de controlesoftware van het MST-instrument. Het optimale fluorescentiebereik in verdund lysaat is van 400 tot 1500 fluorescentie-eenheden.
Ga door om het optimale ligandconcentratiebereik te bepalen zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats een buisenkast met het nodige aantal 0,5 milliliter lage bindcentrifugebuisjes op ijs, pipetteer 25 microliter MST-buffer naar de bodem van elke buis, 25 microliter van de ligandvoorraadoplossing naar de eerste buis en voer seriële tweevoudige verdunning van de ligand uit met behulp van de rest van de buisjes. Houd de kast met ligandmonsters op ijs.
Bereken de cellysaatverdunning om het optimale niveau van het fluorescente doeleiwit in de bindingsreacties te verkrijgen. De uiteindelijke eiwitconcentratie moet dicht bij de verwachte bindingsdissociatieconstante of lager zijn en moet worden aangepast om het nodige aantal fluorescentietellingen te verkrijgen. In de uiteindelijke oplossing, ga door met het verdunnen van de cellysaat met MST-buffer.
Plaats 0,5 milliliter lage bindbuisjes in de buisenkast tegenover buisjes met ligand seriële verdunning monsters. Voeg voorzichtig 15 microliter van de cellysaat toe aan de bodem van elke buis. Probeer de buiswanden niet aan te raken om monsterverlies te voorkomen.
Voeg 15 microliter van het ligandmonster met de hoogste concentratie toe aan de overeenkomstige buis. Nummer één, met de cellysaat. Meng goed en verwissel de pipettentip.
Herhaal deze stap met de rest van de buisjes behalve de laatste, die geen ligand mag bevatten. Voeg 15 microliter MST-buffer toe aan de laatste buis en meng. Vul ongeveer tweederde van de eerste capillair met het bindingsmengsel uit buis nummer één.
Kanteel het om de oplossing naar het midden te bewegen en plaats de capillair op de capillairendrager op de positie. Nummer één, herhaal deze stap met de rest van de capillairen. Capillaire uiteinden kunnen worden afgesloten met was voor langere experimenten.
Plaats de drager in het MST-instrument en sluit de instrumentdeur. Selecteer vervolgens de LED excitatiebron met golflengte gelijk aan 470 nanometer. Voer op het MST-instrument de find capillaries opdracht uit om het instrument de exacte posities van de capillairen te laten vinden en de fluorescentie van de monsters te meten op basis van de fluorescente signaalintensiteit.
Pas de LED-vermogen aan om het in het interval van 400 tot 1500 eenheden te brengen. Klik op de startknop om het Thermo Resis Experiment uit te voeren. Meer dan één infraroodlaservermogen kan worden gekozen voor het experiment.
Om de optimale temperatuurgradiënt voor het specifieke systeem te vinden, duurt het 10 tot 12 minuten om een set van 16 capillairen te laten draaien. Verzamel gegevens van twee tot drie runs voor dezelfde set capillairen om de reproduceerbaarheid van de metingen te garanderen. Om met gegevensanalyse te beginnen, opent u de analysesoftware en laadt u de projectmap.
Selecteer in
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft het gebruik van microscale thermoforesis (MST) om de bindingsaffiniteit van eiwit-ligande interacties rechtstreeks uit cellysaten te bepalen. De methode omvat het tot expressie brengen van een GFP-gefuseerd eiwit, het bereiden van cellysaten en het meten van MST-signalen met variërende ligandconcentraties.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Eiwit-Ligande Interacties
- Thermoforetische Technieken
Achtergrond
- Microscale thermoforesis is een techniek voor het meten van bindingsaffiniteiten.
- Het maakt analyse mogelijk zonder de noodzaak voor eiwitzuivering.
- Het gebruik van GFP-gefuseerde eiwitten vergemakkelijkt detectie.
- Cellysaten bieden een meer fysiologische context voor interacties.
Doel van de studie
- Om bindingsaffiniteiten van eiwit-ligande interacties te bepalen.
- Om cellysaten te gebruiken voor nauwkeurigere metingen.
- Om het proces te stroomlijnen door eiwitzuivering te vermijden.
Gebruikte methoden
- Overexpressie van GFP-gefuseerde eiwitten in adherente cellijnen.
- Bereiding van cellysaten onder niet-denaturerende omstandigheden.
- Bereiding van ligandverdunningen voor MST-analyse.
- Meting van MST-signalen als reactie op variërende ligandconcentraties.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle bepaling van bindingsaffiniteiten met behulp van MST.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode voor verschillende liganden.
- Validatie van resultaten door middel van data-analyse van MST-metingen.
- Mogelijkheid voor bredere toepassingen in eiwitinteractiestudies.
Conclusies
- MST is een effectieve methode voor het bestuderen van eiwit-ligande interacties.
- Het protocol maakt analyse rechtstreeks uit cellysaten mogelijk.
- Deze aanpak kan de begrip van biochemische interacties verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Determining binding affinity directly from cell lysates eliminates the bottleneck of protein purification, accelerating early-stage target validation and lead identification. This approach enables rapid assessment of protein-ligand interactions in a near-physiological context, improving predictive confidence for downstream screening campaigns. By reducing time and resource investment in protein production, the method supports higher-throughput screening of difficult targets such as transcription factors and membrane proteins.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring binding affinities of GFP-tagged proteins to oligonucleotides, peptides, or small molecules directly from lysates.
- Operational Value: Avoids protein purification steps, reducing timelines and costs associated with expressing and isolating difficult targets like STAT3.
- Predictive Value: Provides quantitative KD measurements that support target prioritization and go/no-go decisions in early discovery.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates reproducible, quantitative binding data from lysate-based systems suitable for hit confirmation and SAR exploration.
- Scalability: Compatible with serial ligand dilution formats and capillary-based MST platforms, enabling medium-throughput affinity profiling.
- Contextual Relevance: Maintains physiological buffer conditions and tolerates detergents, preserving native protein states for more translatable interaction data.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports mechanistic de-risking by validating target engagement in lysate systems that reflect cellular complexity.
- Biomarker Alignment: Enables assessment of how mutations or post-translational modifications affect binding, informing structure-function relationships relevant to disease variants.
- Risk-Adjusted Advancement: Affinity data from native-like environments improves confidence in selecting leads with favorable target interaction profiles.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, offering a lysate-compatible alternative to purified-protein assays for affinity measurement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying binding of GFP-fused transcription factors to DNA or protein ligands without purification.
- Screening: Enables assay readiness through standardized lysate preparation and ligand titration, yielding reproducible MST thermophoresis curves for affinity ranking.
- Analytics: Generates KD values with standard deviations from averaged MST thermophoresis traces, providing statistical outputs for comparing ligand potency and selectivity.
- Translational Research: Connects early binding data to preclinical relevance by using lysates from disease-relevant cell models (e.g., HEK293 expressing STAT3-GFP) to assess target behavior in near-native conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable lysate-based MST workflow applicable across multiple targets and ligand classes, reducing dependency on protein purification bottlenecks.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence through quantitative affinity measurements that reduce mechanistic ambiguity in target-ligand interactions.
- Operational Value: Increases standardization and reproducibility by eliminating variability introduced during protein purification and enabling direct comparison across lysate preparations.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by accelerating hit validation and reducing late-stage attrition due to poor target engagement predictions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on lysate-derived affinity data, supporting better resource allocation in early discovery portfolios.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescent protein tagging, cell culture, and lysate preparation under non-denaturing conditions.
- Dependent on access to an MST instrument with appropriate LED excitation (e.g., 470 nm for GFP) and capillary loading capabilities.
- Necessitates standardization of lysate dilution and ligand titration protocols to maintain fluorescence within the optimal 400–1500 unit range.
- Requires optimization for different protein classes (e.g., membrane proteins may need detergent-containing buffers) and ligand solubility considerations.
- Limited by the need for detectable fluorescence changes upon binding; may require validation for ligands that induce minimal thermophoresis shifts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:43
Preparation of Cell Lysate
4:02
Microscale Thermophoresis Binding Studies
7:05
Microscale Thermophoresis Data Analysis
8:25
Results: Measuring the Affinity of Non-phosphorylated STAT3 Protein Binding to Oligonucleotides
9:40
Conclusion
3:20
Determination of Optimal Lysate Dilution
