Name: Eiwitzuivering-vrij bindwijze affiniteit Bepaling door Microschaal thermophoresis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Leer microschaal thermoforese (MST) voor het bepalen van bindingsaffiniteiten tussen GFP-gefuseerde eiwitten en liganden direct uit cellysaten. Deze methode vereist geen eiwitzuivering en versnelt kwantitatieve karakterisering van eiwit-ligand interacties aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Intramurale Research Program van de NIH, National Cancer Institute, Center for Cancer Research; Collaborative Research Overeenkomst tussen NCI en Calidris Therapeutics; American Cancer Society subsidie ​​IRG 97-152-17 om OT, en federale fondsen van de National Cancer Institute, NIH, onder contract HHSN26120080001E.

1. Bereiding van cellysaat Dit protocol is bedoeld voor hechtende cellen die geen GFP-gefuseerd eiwit. Benodigd aantal cellen kan variëren van zo laag als 10 6 tot wel 20 x 10 6 cellen, afhankelijk van het niveau van eiwitexpressie. Bijvoorbeeld lysaat van HEK overexpressie GFP-STAT3 werd bereid door cellen gekweekt in T75 kolven 10 tot bijna 70% confluentie met 1 ml lysis buffer. Echter lysaat moest worden verdund 150-voudig tot optimaal niveau van fluorescentie voorzien MST experiment. Cell lysis protocol sterk afhankelijk van de eigenschappen en intracellulaire lokalisatie van het eiwit onderzocht. Bij gebruik van reinigingsmiddelen is ongewenst vanwege eiwit instabiliteit, sonicatie hieronder beschreven, zou de beste keuze zijn. Verschillende additieven kunnen worden toegevoegd aan de lysis buffer eiwitmodificatie reacties te voorkomen EDTA voorkomt fosforylering natriumvanadaat remt tyrosine proteïne fosfatasen, zodatdium fluoride is een remmer van Ser / Thr fosfatasen. <ol><li> Bereid lysebuffer. Om gemakkelijk te extraheren cytoplasmatische eiwitten de volgende samenstelling werkt goed: 25 mM Tris HCl, pH 8,0, en proteaseremmercocktail 100 maal verdund (Sigma-Aldrich P2714, bestaande uit 2 mM AEBSF, 0,3 uM aprotinine, 130 uM bestatine, 1 mM EDTA, 14 uM E-64, 1 uM leupeptine). Als alternatief voor minder oplosbare eiwitten, een commercieel kunnen RIPA buffer gebruiken proteaseremmers cocktail en niet-denaturerende detergenten. Houd de buffer op ijs. </li><li> Was de cellen kort met ijskoude PBS met behulp van 10 ml buffer per T75 fles. Blijf cellen op ijs gedurende 5 minuten of totdat cellenbegin los van de fles. Schraap cellen met celschraper te halen als dat nodig is. </li><li> Resuspendeer cellen in 10 ml ijskoude PBS en overbrengen in een voorgekoeld 14 ml ronde bodem centrifugebuis. </li><li> Pellet cellen door centrifugeren bij 400-600 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Combineer cellen van meerdere kolven op dit punt if nodig. </li><li> Verwijder PBS supernatant en resuspendeer pellet in 200 pl ijskoude lysis buffer, suspensie overbrengen naar een vooraf gekoelde 1,5 ml Eppendorf buisje. </li><li> Houd cellen op ijs plaatselijke oververhitting te minimaliseren. Lyse cellen met 3x 10 sec pulsen van ultrasoonapparaat op 30% amplitude, met een 2-3 mm pre-gekoelde tip. Houd de punt onder de oppervlakte te minimaliseren schuimen. Sla deze stap over wanneer u een afwasmiddel-bevattende buffer en incubeer op ijs gedurende 30 minuten plaats. </li><li> Corrigeer de lysaatoplossing aan fysiologische zoutconcentratie (100 mM NaCl), indien nodig met behulp van 5 M NaCl bevatten. </li><li> Verzamel lysaten door centrifugatie bij 26.000 xg bij 4 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Bepaal de optimale lysaat verdunning (zoals beschreven in paragraaf 3 hieronder) en de hoeveelheid lysaat nodig is voor een titratie (meestal rond de 300 pi van pre-verdund lysaat). </li><li> Aliquot het lysaat en bewaar bij geschikte temperatuur voor het onderzochte eiwit (-80 ° C, in de meeste gevallen). </li> &lt;/ Ol&gt; 2. MST Buffer en voorbereiding <ol><li> Aangezien het eiwit-ligand interacties zijn afhankelijk buffer omstandigheden wordt MST buffersamenstelling gekozen op basis van de eigenschappen van een bepaald systeem. Het is in het algemeen voordelig om ten minste twee verschillende buffers testen. </li><li> Bereid 2 5x MST buffers. We hadden goede ervaringen met deze twee samenstellingen: HEPES (250 mM HEPES, pH 7,4, 25 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 0,25% NP-40) en Tris HCl (250 mM Tris HCl, pH 7,4, 750 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 0,05% Tween-20). Toevoeging van BSA (5% in het uiteindelijke mengsel binding) kan helpen adhesie van eiwitten op kunststof buizen en glazen capillairen te voorkomen. NaN3 (0,5 mM) zijn mogelijk om de groei van micro-organismen te voorkomen. </li></ol> 3. Bepaling van de optimale verdunning lysaat <ol><li> Selecteer de LED excitatie lichtbron met de golflengte λ = 470 nm van de MST instrument. </li><li> Laad capillairen met de cell extract verdund 2 en 10x met MST buffer. </li><li> Presteren &quot;Zoek Haarvaten&quot; operatie op Control Software van MST instrument. De optimale fluorescentie assortiment in verdunde lysaat is van 400 tot 1500 fluorescentie-eenheden. </li></ol> 4. Het bepalen van de optimale Ligand Concentratiebereik <ol><li> De hoogste concentratie van het ligand moet minstens 20x hoger dan de verwachte dissociatieconstante. </li><li> De laagste concentratie ligand moet lager zijn dan de molaire concentratie van het fluorescerende eiwit. </li></ol> Raadpleeg de NanoTemper Technologies Concentratie Finder tool voor het ligand concentratiegebied schatting. 5. Bereiding van cellysaat en Ligand Verdunningen <ol><li> Plaats een buis rek met een benodigde aantal (meestal 10-16) van 0,5 ml LoBind centrifuge buizen op ijs. Pipetteer 25 ul MST buffer naar de bodem van elke buis. Voeg 25 ul van de ligand stockoplossing aan de eerste kuipe (# 1, ligand hoogste concentratie) en voer seriële tweevoudige verdunning van de ligand met de overige buizen. Houd het rek met ligand monsters op ijs. </li><li> Dooi cellysaat langzaam op ijs. </li><li> Verdun cellysaat met MST buffer om het optimale niveau van het fluorescente doeleiwit in de bindingsreacties verschaffen. Uiteindelijke eiwitconcentratie te dicht bij verwachte K D of lager. Het moet worden aangepast om benodigde aantal fluorescentie tellingen vinden in de uiteindelijke oplossing. Voor de bepaling van GFP-concentratie STAT3 in het lysaat werd het instrument gekalibreerd met behulp van fluoresceïne. De molaire concentratie van GFP in het lysaat werd bepaald met de verhouding van fluoresceïne en EGFP kwantumopbrengsten, 0,85 en 0,61 respectievelijk. 15 </li></ol> 6. Microschaal thermophoresis Binding Studies <ol><li> Selecteer de LED excitatiebron met λ = 470 nm van de MST instrument. </li><li> Plaats 0,5 ml LoBind buizen in de tube rack tegenover buizen met ligand seriële verdunning monsters. Voeg voorzichtig 15 ul cellysaat van de aan de bodem van elke buis. Probeer niet te pijpwanden raken om te proeven verlies te voorkomen. </li><li> Voeg 15 ul van de ligand monster met de hoogste concentratie (nr. 1) op de overeenkomstige buis # 1 met het cellysaat. Meng goed en wijzigen van een pipet tip. Herhaal deze stap voor de overige buizen behalve de laatste, waarbij geen ligand bevatten. </li><li> Voeg 15 ul van buffer MST de laatste buis en meng. </li><li> Vul ongeveer 2/3 van de eerste capillair met bindende mengsel van buis # 1, kantelen om de oplossing te verplaatsen naar het midden, en plaats het capillair op de capillaire lade om de positie # 1 (de dichtst mogelijke positie van de opening tray) . Herhaal deze stap met de rest haarvaten. Capillair uiteinden kunnen worden aangesloten met wax voor langere experimenten. </li><li> Plaats de lade in de MST-instrument en de deur van het instrument te sluiten. </li><li> Presteren &quot;Zoek Haarvaten&quot;commando te laten het instrument te vinden exacte posities van de haarvaten en meet de fluorescentie van de monsters. </li><li> Op basis van de fluorescentie-intensiteit van het signaal, passen de LED-vermogen (10-100%) om het in 400-1,500 eenheden interval brengen. </li><li> Klik op de knop &quot;Start&quot; om de thermophoresis experiment uit te voeren. Meer dan een IR-laservermogen kan het experiment worden gekozen om de optimale temperatuurgradiënt voor het specifieke systeem. Gegevensverzameling 2-3 runs voor dezelfde set van capillairen om de reproduceerbaarheid van metingen te garanderen. Het duurt 10-12 minuten om een ​​set van 16 capillairen lopen. </li></ol> 7. Microschaal thermophoresis Data Analysis <ol><li> Open de Analysis software. </li><li> Laad de projectmap. In het verschenen Information Run Viewer selecteren verzameld op een bepaald IR laservermogen thermophoretic bochten. Er is een optie van het openen van alle thermophoretic sporen onder verschillende omstandigheden, zoals IR-laser macht verzameld, LED-power, temperatuur, concentratie, etc. in een keer en dan te kiezen voor alle curves voor analyse door het inschakelen hen aan en uit (klik op de naam van het experiment). </li><li> In de Evaluatie Points grafiek venster selecteert u de thermophoresis of thermophoresis met T-sprong. Zorgen dat blauwe en rode lijnen juist gepositioneerd zijn. Om de gemiddelde punten met standaarddeviaties te verkrijgen, selecteert u &quot;Gemiddeld&quot; of &quot;Onderscheiden loopt&quot; voor afzonderlijke runs. </li><li> Om een ​​dissociatie constante pasvorm plot, selecteer &quot;Gebruik Gemiddeld&quot;, voer en bevestig de gelabelde molecuul concentratie waarde (controleer de &quot;concentratie&quot; plein in een vlaag venster menu), en past de curve. De K D-waarde met zijn standaardafwijking verschijnt in een apart informatie pop-up venster. Om een ​​fit met Hill-methode plot, selecteer &quot;Gemiddeld&quot;, Hill-methode, en dan past de curve. De EC 50 waarde affiniteit met standaardafwijking wordt in dit geval. Het kenmerk van KD of Hill &quot;border&quot; kan ook worden gebruikt bij verzadigingin een gebonden toestand niet wordt bereikt. </li><li> Sla de gemiddelde fit data in een tekstbestand en overbrengen naar Excel. </li><li> Plot F norm (genormaliseerde fluorescentie), AF norm (verschil in genormaliseerde fluorescentie als verschillende experimenten worden vergeleken) of gebonden fractie (zie onderstaande formule) als functie van de gemerkte (getitreerd) molecuul concentratie. </li></ol> Fraction Bound (fractie van moleculen in een complex) = (Therm (C)-gebonden) / (bound-gebonden), waarbij Therm (C) is thermophoresis gemeten voor de concentratie C, ongebonden is thermophoresis de ongebonden toestand (wanneer moleculen niet in een complex), en gebonden is thermophoresis voor het volledig gebonden toestand.

<ol><li>Lea, W. A., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+polarization+assays+in+small+molecule+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Fluorescence polarization assays in small molecule screening.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).</li>
<li>Willander, M., Al-Hilli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+biomolecules+using+surface+plasmons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of biomolecules using surface plasmons.</a> Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).</li>
<li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+binding+assays+at+equilibrium%3A+validation+and+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).</li>
<li>Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+isothermal+titration+calorimetry+in+pure+and+applied+research--survey+of+the+literature+from+2010%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010.</a> J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).</li>
<li>Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-protein+binding%3A+a+critical+review+of+analytical+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Drug-protein binding: a critical review of analytical tools.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 398-3953 (2010).</li>
<li>Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+analytical+ultracentrifugation+in+protein+science%3A+a+tutorial+review%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review.</a> Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).</li>
<li>Duhr, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+molecules+move+along+a+temperature+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Why molecules move along a temperature gradient.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).</li>
<li>Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+thermophoresis+as+a+sensitive+method+to+quantify+protein%3A+nucleic+acid+interactions+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution.</a> Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).</li>
<li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat. Commun. 1, 100(2010).</li>
<li>Stark, G. R., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAK-STAT+pathway+at+twenty%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The JAK-STAT pathway at twenty.</a> Immunity. 36, 503-514 (2012).</li>
<li>Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+binding+specificity+of+different+STAT+proteins.+Comparison+of+in+vitro+specificity+with+natural+target+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites.</a> J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).</li>
<li>Yang, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+unphosphorylated+STATs+in+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Roles of unphosphorylated STATs in signaling.</a> Cell Res. 18, 443-451 (2008).</li>
<li>Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+unphosphorylated+STAT3+transcription+factor+binding+to+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA.</a> J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).</li>
<li>Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li>
<li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen. De inhoud van deze publicatie geeft niet noodzakelijk de mening of het beleid van het ministerie van Volksgezondheid en Human Services, noch vermelding van handelsnamen, commerciële producten, of organisaties enkele wijze de goedkeuring door de Amerikaanse regering.

Eiwit expressie en zuivering is een omslachtige en dure stap, die echter noodzakelijk voor het bepalen van interactie &quot;K D op meest gebruikelijke methode. Toepassing van MST maakt het vermijden eiwitreiniging dus aanzienlijk vereenvoudigen en te versnellen kwantitatieve karakterisering van interacties. Het presenteert bijzonder belangrijk voordeel bij moeilijk te drukken en te zuiveren eiwitten zoals membraaneiwitten en transcriptiefactoren. De belangrijkste beperking en eise...

Kwantitatieve karakterisering van affiniteit van intermoleculaire interacties is belangrijk in veel gebieden van het biomedisch onderzoek. Binding dissociatieconstante (KD) is niet alleen noodzakelijk drug discovery, maar is ook een belangrijke parameter in de karakterisering van een binaire interactie in een biologisch systeem. Biochemische methoden voor detectie van eiwit-eiwit interacties, zoals immunoprecipitatie en gist twee-hybride-screening, niet aan ons van hoe strak zijn die interacties, terwijl affiniteit bepaald of dit complex bestaat onder bepaalde omstandigheden in vivo. In drug discovery proces, bindingassay ontwikkeling is een van de noodzakelijke en vaak het meest tijdrovende stappen. Meest gebruikte methoden van Kd bepaling omvatten fluorescentiepolarisatie, 1 surface plasmon resonance (SPR) technologie, 2 radioligand binding, 3 isothermische titratie calorimetrie 4 Equilibrium dialyse (ED), 5 ultrafiltratie (UF), 5 en ultracentrifuge (UC). 6 Allemaal vereisen aanzienlijke hoeveelheden gezuiverd doelwit eiwit. Microschaal thermophoresis (MST) is een zich snel ontwikkelende methode die gerichte beweging van moleculen in een microscopische temperatuurgradiënt detecteert. Eventuele wijzigingen van de hydratatie schil van biomoleculen resultaat in een relatieve verandering van beweging langs de temperatuurgradiënt. 7 MST wordt gebruikt om bindende affiniteiten te bepalen en is aangevraagd voor het bestuderen van ligand binding aan fluorescent gelabelde eiwitten of fluorescerende liganden aan een doelwit eiwit. 8, 9 MST maakt meting van interacties direct in oplossing zonder immobilisatie op een oppervlak (immobilisatie-vrije technologie). Praktisch wordt bindende gepaard met een verandering in het signaal MST, hoewel de grootte van de verandering verschilt van systeem tot systeem sterk. Voor de detectie molecuul verzoek van MST, zij moet fluorescerennt. Deze belangrijke beperking van de methode kan worden omgezet in een voordeel. Wanneer een eiwit tot expressie als een GFP-fusie in een systeem, zal de enige fluorescent molecuul zijn en dus kunnen worden bestudeerd zonder isolatie van het cellysaat of celvrij expressiesysteem. Generatie van cellysaten die het mogelijk maken voor bindende voorwaarden met minimale artefacten is de grote uitdaging. Hier een protocol cellysaat preparaat en MST experiment dat kan worden gebruikt voor vele oplosbare en membraaneiwitten beschrijven we. STAT eiwitten latente cytoplasmische transcriptiefactor geactiveerd door tyrosine fosforylering in respons op extracellulaire signalen en zijn betrokken bij vele biologische processen zoals immuniteit, hematopoiese, ontsteking en ontwikkeling. 10 In zoogdieren, de STAT STAT familie bestaat uit 1, 2, 3, 4 , 5A, 5B en 6. Alle geactiveerde STAT&#39;s zijn bekend te binden aan dezelfde DNA-sequentie, zogenaamde GAS motief, IFN-gamma geactiveerd sequentie. De transcriptioneel effecten van verschillende STAT&#39;s zijn zeer verschillend. 11 Ondanks betrokkenheid bij vele pathologische processen en uitgebreide studies waarbij meer dan 17.000 publicaties hebben de KD van STAT interacties met andere DNA-sequenties niet vastgesteld. Slechts relatieve affiniteit van verschillende statistieken tot varianten van GAS motief werd gekenmerkt. 11 Moeilijkheden in eiwit expressie en zuivering zijn de belangrijkste belemmeringen in de karakterisering van STAT &#39;DNA-binding selectiviteit. Hoewel de meeste studies zijn gericht op de rol van &quot;geactiveerde&quot; STAT, die synoniem geworden aan Tyr-gefosforyleerde transcriptiefactor, de rol van niet-gefosforyleerde STAT (U-STAT) in regulatie van transcriptie snel opkomende. 12 echter deze mechanismen worden slecht begrepen, en het was niet duidelijk of U-STAT daadwerkelijk binden aan DNA of optreden via interacties met andere transcriptiefactoren. We hebben onlangs aangetoond dat de U-STAT3 kan binden aan DNA sequences verschillend van GAS motieven met een nog hogere affiniteit. 13 De bevinding heeft belangrijke implicaties voor ons begrip van de biologische functies van deze belangrijke proteïne. We hebben microschaal thermophoresis relatieve affiniteiten van STAT3 bepalen GAS toegepast en AT-rijke oligonucleotide S 100 (figuur 4). Bijna identieke protocol is gebruikt KD bepaling voor binding van een ander ligand STAT3, een lipopeptide inhibitor. Nr. 14 binding aan een verbonden transcriptiefactor GFP-STAT1 die werd gebruikt als een negatieve controle worden gedetecteerd hetgeen bevestigt selectiviteit van interactie. 14

<table><tbody><tr><td>RIPA buffer</td><td>Millipore</td><td>20-188</td><td>Buffers van andere fabrikanten werken ook</td></tr><tr><td>Protease inhibitors cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714</td><td></td></tr><tr><td>Monolith NT.115</td><td>NanoTemper Technologies GmbH</td><td>G008</td><td></td></tr><tr><td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td><td>NanoTemper Technologies GmbH</td><td>T001</td><td></td></tr><tr><td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td><td>NanoTemper Technologies GmbH</td><td>K002</td><td></td></tr><tr><td>NT Control software</td><td>NanoTemper Technologies GmbH</td><td>2.0.2.29</td><td></td></tr><tr><td>NT Analysis software</td><td>NanoTemper Technologies GmbH</td><td>1.4.27</td><td></td></tr><tr><td>Table-top refrigerated centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Andere microtube gekoelde centrifuges bieden </td></tr><tr><td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431064</td><td></td></tr></tbody></table>

eiwitzuivering-vrij bindwijze affiniteit bepaling door microschaal thermophoresis

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Kwantitatieve karakterisering van eiwit interacties is essentieel in vrijwel elk gebied van life sciences, met name drug discovery. De meeste momenteel beschikbare methoden Kd bepaling is toegang tot gezuiverde eiwit van belang, generatie die kan tijdrovend en duur. We hebben een protocol dat het mogelijk maakt voor de bepaling van de bindingsaffiniteit door microschaal thermophoresis (MST) zonder zuivering van het doelwit eiwit uit cellysaten ontwikkeld. De werkwijze omvat overexpressie van GFP gefuseerde eiwit en cellysis in niet-denaturerende omstandigheden. Toepassing van de methode STAT3-GFP transiënt tot expressie in HEK293 cellen zelf te bepalen voor de eerste maal de affiniteit van de goed onderzochte transcriptiefactor aan oligonucleotiden met verschillende sequenties. Het protocol is eenvoudig en kan een verscheidenheid aan applicatie voor het bestuderen van interacties van eiwitten met kleine moleculen, peptiden, DNA, RNA, en proteins.

Het meten van de affiniteit van de niet-gefosforyleerde STAT3 eiwit binding aan oligonucleotiden. HEK293 cellen die STAT3-GFP werden gebruikt als een bron van fluorescent gelabelde STAT3 voor DNA-bindingstest. Cellysaten werden bereid met RIPA buffer (20x10 6 cellen / ml). Bij bindingsstudies werden de lysaten verdund 150x MST DNA-binding buffer om het optimale niveau van het fluorescente eiwit in de bindingsreactie (ongeveer 20 nM) verschaffen. Niet-getransfecteerde...

Microschaal thermophoresis (MST) op grote schaal kunnen worden gebruikt voor de bepaling van de bindingsaffiniteit zonder zuivering van het doelwit eiwit uit cellysaten. Het protocol omvat overexpressie van GFP-gefuseerde eiwit, cellyse in niet-denaturerende omstandigheden en detectie van MST signaal in de aanwezigheid van variërende concentraties van het ligand.

Eiwitzuivering-vrij bindwijze affiniteit Bepaling door Microschaal thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Het algemene doel van deze procedure is het bepalen van de bindingsaffiniteit van een proteïne-ligandinteractie zonder het eiwit uit een cellysaat te zuiveren. Dit wordt bereikt door eerst het GFP-gefuseerde eiwit van belang tot expressie te brengen in een willekeurige adherente cellijn. Na de bereiding van het cellysaat en de ligandverdunningen worden mengsels van cellysaat en ligand bereid en in capillairen geladen.Vervolgens wordt de thermophorese van het GFP-fusieprotein gemeten in de aanwezigheid van variërende ligandconcentraties. De laatste stap is de data-analyse van de microscale thermophorese- of MST-metingen. Uiteindelijk wordt microscale thermophorese gebruikt om de bindingsaffiniteiten van interacties tussen GFP-fusieproteins en verschillende liganden te bepalen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals titratie, calorimetrie of oppervlakteplasmonresonantie, is dat eiwitzuivering wordt vermeden, wat de kwantitatieve karakterisering van binaire interacties aanzienlijk vereenvoudigt en versnelt. Deze methode biedt aanzienlijke voordelen bij het werken met eiwitten die moeilijk tot expressie te brengen en te zuiveren zijn, zoals membraaneiwitten en transcriptiefactoren. Een van de grootste voordelen van microscale thermophoresis is dat het werkt in diverse buffers en de aanwezigheid van detergentia en cellen in het systeem tolereert. De techniek zal worden gedemonstreerd door Karen Stefka, een bioloog uit mijn laboratorium. Begin met het kort wassen van de cellen met ijskoud fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS, waarbij 10 milliliters buffer per T 75-fles wordt gebruikt.Houd de cellen vijf minuten op ijs of totdat ze beginnen los te laten van de kolf. Schraap de cellen indien nodig met de celscraper om ze los te maken. Resuspendeer de cellen in 10 milliliters ijskoud PBS en breng ze over naar een vooraf gekoelde 14 milliliter centrifugebuis met ronde bodem.Pellet de cellen door centrifugatie bij 400 tot 600 Gs en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 200 µL ijskoude lysisbuffer. Breng de suspensie over naar een vooraf gekoelde 1,5 ml eppendorfbuis voor extractie van cytosolische eiwitten.Plaats de cellen op ijs om lokale oververhitting te minimaliseren en lyseer de cellen met drie pulsen sonicatie van tien seconden bij 30% amplitude. Gebruik een vooraf gekoelde tip van twee tot drie millimeter en houd de tip onder het oppervlak om schuimvorming te minimaliseren. Sla deze stap over bij gebruik van een buffer die detergent bevat en incubeer 30 minuten op ijs.Corrigeer in plaats daarvan, indien nodig, de lysaatoplossing zodat deze een fysiologische zoutconcentratie van 100 millimol natriumchloride bevat, gebruikmakend van een stamoplossing van vijf mol natriumchloride. Verzamel tenslotte de lysaten door centrifugatie bij ongeveer 25 000 G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Selecteer op het MST-instrument de lichtemitterende diode of LED-excitatiebron met een golflengte van 470 nanometer.Vul de capillairen met cel-extract dat twee- en tienvoudig is verdund met MST-buffer en plaats deze in het MST-instrument. Voer de bewerking 'find capillaries' uit in de besturingssoftware van het MST-instrument. Het optimale fluorescentiebereik in het verdunde lysaat ligt tussen de 400 en 1500 fluorescentie-eenheden.Bepaal vervolgens het optimale concentratiebereik van het ligand zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats een buisjesrek met het benodigde aantal 0,5 milliliter low bind centrifugebuisjes op ijs. Pipetteer 25 microliters MST-buffer in de bodem van elk buisje. Voeg 25 microliters van de ligand-stockoplossing toe aan het eerste buisje en voer een seriële tweevoudige verdunning van het ligand uit met behulp van de overige buisjes. Bewaar het rek met ligandmonsters op ijs.Bereken de verdunning van het cellysaat om het optimale niveau van het fluorescente doeleiwit in de bindingsreacties te verkrijgen. De uiteindelijke eiwitconcentratie moet dicht bij of lager liggen dan de verwachte bindingsdissociatieconstante en moet worden aangepast om het benodigde aantal fluorescentietellingen te verkrijgen. Verdun vervolgens het cellysaat in de uiteindelijke oplossing met MST-buffer.Plaats 0,5 milliliter low bind buisjes in het buisjesrek tegenover de buisjes met de seriële verdunningsstappen van het ligand. Voeg voorzichtig 15 microliters van het cellysaat toe aan de bodem van elk buisje. Probeer de wanden van de buisjes niet aan te raken om monsterverlies te voorkomen.Voeg 15 µL van het ligandmonster met de hoogste concentratie toe aan de overeenkomstige buis. Nummer één, met het cellysaat. Meng goed en vervang de pipetpunt.Herhaal deze stap met de overige buisjes, behalve het laatste buisje, waarin geen ligand aanwezig mag zijn. Voeg 15 µL MST-buffer toe aan het laatste buisje en meng dit. Vul de eerste capillair voor ongeveer twee derde met het bindingsmengsel uit buisje nummer één.Kantel het buisje om de oplossing naar het midden te bewegen en plaats de capillair op de juiste positie op het capillairrek. Nummer één, herhaal deze stap met de rest van de capillairs. De uiteinden van de capillairs kunnen met was worden afgesloten voor langere experimenten.Plaats het plateau in het MST-instrument en sluit de deur van het instrument. Selecteer vervolgens de LED-excitatiebron met een golflengte van 470 nanometers. Voer op het MST-instrument het commando 'find capillaries' uit, zodat het instrument de exacte posities van de capillairen kan bepalen en de fluorescentie van de monsters kan meten op basis van de fluorescentie-signaalintensiteit.Pas het LED-vermogen aan om het binnen het interval van 400 tot 1500 eenheden te brengen. Klik op de startknop om het Thermo Resis Experiment uit te voeren. Voor het experiment kan er uit meer dan één infraroodlaservermogen worden gekozen.Om de optimale temperatuurgradiënt voor het specifieke systeem te bepalen, duurt het 10 tot 12 minuten om één set van 16 capillairen te analyseren. Verzamel gegevens van twee tot drie runs voor dezelfde set capillairen om de reproduceerbaarheid van de metingen te waarborgen. Open de analysesoftware en laad de projectmap om te beginnen met de data-analyse.Select in de viewer van de weergegeven informatie de thermoretische curven die zijn verzameld bij een specifiek IR-laservermogen. Er was een optie om alle thermoretische sporen die onder verschillende omstandigheden zijn verzameld in één keer te openen, om vervolgens willekeurige curven voor analyse te kiezen door deze aan- of uit te schakelen. Selecteer in het venster van de evaluatiepunten-grafiek de thermoresistentie of thermoforese met de blauwe en rode T-jump lijnen.Definieer twee regio's van de experimentele curven die handmatig worden geselecteerd voor de analyse door de software. Zorg ervoor dat de blauwe en rode lijnen correct zijn gepositioneerd om de maximale verandering in Thermo Resis te verkrijgen. Om de gemiddelde punten met standaarddeviaties te verkrijgen, selecteert u 'use average' of 'distinguish runs' voor afzonderlijke runs.Om een fit voor de dissociatieconstante te plotten, selecteert u 'use average', voert u de geconcentreerde waarde van het gelabelde molecuul in, fixeert u deze en fit u de curve. De bindingsdissociatieconstante of KD-waarde met de bijbehorende standaarddeviatie verschijnt in een apart informatievenster. Sla de gemiddelde fitgegevens op in een tekstbestand en importeer deze in Excel.Heck.2 9 3 cellen die STAT 3G FP tot expressie brachten, werden gebruikt als bron van fluorescentielabelled stat three. Voor A DNA-bindingsassay resulteerde de binding van sterk geladen oligonucleotiden in significante veranderingen in de mobiliteit van STAT three. In de temperatuurgradiënt.Het thermoretische signaal is uitgezet als functie van de oligonucleotideconcentratie. Elk datapunt vertegenwoordigt het gemiddelde van drie metingen. Nano temporal analysis software werd gebruikt voor de fit en om de schijnbare KD-waarden te bepalen.De schijnbare dissociatieconstanten waren 37,9 plus of minus 1,0 µM voor binding aan het GAS-motief, en 23,3 plus of minus 0,6 µM voor binding aan het AT-rijke oligonucleotide s+100. Verrassend genoeg vertoonden s+100-sequenties een iets sterkere binding dan GAS. In drie meetherhalingen leidde de substitutie van A naar G tot een dramatische afname van de affiniteit van de s+100-mutant één.Hoewel de s plus 100 mutant twee geen detecteerbare binding vertoonde, wat de sequentie-selectieve binding van STAT drie aan s plus 100 bevestigde, kan deze techniek, eenmaal onder de knie, in minder dan twee uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de optimale omstandigheden voor de extractie van membraaneiwitten per eiwit verschillen en gewoonlijk optimalisatie vereisen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de bindingsaffiniteit van een eiwit aan een ligand kunt bepalen zonder het eiwit uit het cellysaat te zuiveren.

protein-purification-free-method-binding-affinity-determination

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

ITC is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de binding van een ligand aan zijn gastheer. In complexe systemen kan echter verschillende modellen passen bij de gegevens even goed. De hier beschreven methode is een middel om de passende bindende model voor complexe systemen te helderen en pak de bijbehorende thermodynamische parameters.

Het verzamelen van variabele concentratie Isothermische Titration Calorimetrie Datasets om Binding mechanismen bepalen

Een algemeen protocol voor het gebruik van isotherme titratie calorimetrie de bindende thermodynamica voor biologische systemen te volgen met matige bindingsaffiniteiten wordt gepresenteerd.

Isotherme Titratie Calorimetrie voor het meten van macromolecuul-ligand Affiniteit

In this video, we demonstrate the nickel affinity chromatography technique to purify histidine-tagged pyrophosphokinase enzymes from Clostridium difficile bacteria.

Nickel Affinity Chromatography-Based Protein Purification: A Technique to Purify Polyhistidine-Tagged Recombinant Proteins from Bacterial Cell Lysate

This video demonstrates microscale thermophoresis for studying the protein-lipid interaction. The assay detects the interaction between molecules by quantifying the thermophoretic movement of fluorescent-labeled proteins in response to a temperature gradient. The fluorescent molecule is mixed with different concentrations of the non-fluorescent lipid molecules, and the mixture of molecules in the solution is loaded into capillaries. A temperature gradient is applied to the samples in the...

Microscale Thermophoresis to Study Protein-Lipid Interactions in Solution

Differentiële scannen fluorimetrie is een veelgebruikt methode voor het screenen van bibliotheken van kleine moleculen op interacties met eiwitten. Hier presenteren we een eenvoudige methode om deze analyses uit te breiden om een schatting te geven van de dissociatieconstante tussen een klein molecuul en zijn eiwitpartner.

Bepaling van proteïne-ligand interacties gebruiken Differential Scanning Fluorimetrie

MicroScale Thermoforese (MST) is een gevoelige technologie voor het karakteriseren van aptameer-doelinteracties. Dit manuscript beschrijft een MST-protocol voor het karakteriseren van aptameer-kleine molecuulinteracties.

In kaart brengen van de bindingsplaats van een aptameer op ATP gebruik van microschaal Thermophoresis

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Een procedure wordt gepresenteerd voor het uiteinde van de dCACHE periplasmische ligand bindend domein van Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 van integratie-organen en de zuivering aan opbrengst milligram hoeveelheden eiwit.

Methode voor het efficiënt uiteinde en zuivering van de Chemoreceptor-Ligand bindend domein

Hier presenteren we een protocol voor de productie en zuivering van eiwitten die zijn gemarkeerd met stabiele isotopen, en verdere karakterisering van eiwit-eiwitinteractie met behulp nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie en MicroScale Thermophoresis (MST) experimenten.

Meten van interacties van bolvormige en filamenteuze eiwitten door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR) en Microscale Thermophoresis (MST)

Thermoforese op microschaal verkrijgt snel bindingsconstanten tegen lage materiaalkosten. Gelabelde of labelvrije thermoforese op microschaal is in de handel verkrijgbaar; labelvrije thermoforese is echter niet in staat tot de diversiteit aan interactiemetingen die kunnen worden uitgevoerd met behulp van fluorescerende labels. Wij bieden een protocol voor gelabelde thermoforesemetingen.

Gebruik van thermoforese op microschaal om eiwit-lipide-interacties te meten

Een multi-kolom plaatadapter maakt het mogelijk om chromatografiekolommen te koppelen aan multi-well verzamelplaten voor parallelle affiniteit of ionenuitwisselingszuivering, wat een economische eiwitzuiveringsmethode met hoge doorvoer biedt. Het kan worden gebruikt onder zwaartekracht of vacuüm het leveren van milligram hoeveelheden eiwit via betaalbare instrumentatie.

Een economisch en veelzijdig eiwitzuiveringssysteem met hoge doorvoer met behulp van een plaatadapter met meerdere kolommen

Leer microschaal thermoforese (MST) voor het bepalen van bindingsaffiniteiten tussen GFP-gefuseerde eiwitten en liganden direct uit cellysaten. Deze methode vereist geen eiwitzuivering en versnelt kwantitatieve karakterisering van eiwit-ligand interacties aanzienlijk.

Eiwitzuivering-vrij bindwijze affiniteit Bepaling door Microschaal thermophoresis

Meer video's verkennen