Name: Isolatie van sensorische neuronen van Aplysia californica Voor Patch Clamp Recordings van Glutamaterge Currents (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Leer sensorische neuronen isoleren van Aplysia californica voor patch clamp-opnames. Deze methode met enzymatische digestie en korte-termijnkweek maakt gedetailleerde elektrofysiologische studies van glutamaterge ionstromen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gefinancierd door NIH P40 OD010952, de Korein Foundation, een universiteit van Miami Fellowship naar SLC en een Maytag fellowship aan ATK. De auteurs zeer erkentelijk voor het personeel van de National Resource voor Aplysia, evenals Lauren Simonitis en Hannah Peck, die microfoto van een cijfer voorzien.

1. Cell Preparation <ol><li> Op dag 1, wegen en verdoven van dieren. <ol><li> Weeg 30 g a-1 kg dier. Verdoven van 5-10 dieren volumes 01:01 zeewater: isotone MgClz. 6H 2 0 gedurende 1 uur onder beluchting zoals elektrische aquarium luchtpomp met aangehechte luchtsteentje. </li></ol></li><li> Bereid dissectie benodigdheden. <ol><li> Monteer schone dissectie lade met roestvast stalen rechte pennen, zoals stof pinnen. Monteer meerdere platen met kunstmatig zeewater (ASW; zie tabellen 1 en 3) + penicilline / streptomycine (P / S). </li><li> Heb klaar een laag vermogen microscoop. Hebben schone dissectie instrumenten klaar, zoals geribde neus en fijne chirurgische pincet, en fijne en grote chirurgische schaar. Spray de instrumenten met 70% isopropol alcohol voor gebruik en laten drogen. </li></ol></li><li> Positie dier op dissectie lade. <ol><li> Dier positie ventrale zijde naar beneden in de dissectie lade. Pin dierdoor de randen van het lichaam muur en parapodial grenzen, maar staart en hoofd te vermijden, om het dorsale oppervlak bloot te leggen en de genitale groef </li><li> Spoel het dorsale oppervlak in slow-running koud leidingwater. Breng een lichte stroom van 70% isopropol alcohol uit een knijpfles langs de genitale groove en over de bovenkant van het hoofd. </li></ol></li><li> Maak de eerste incisie. <ol><li> Met behulp van een laag vermogen microscoop (zie tabel 2) en gereflecteerd licht op het punt waar de genitale groef is afkomstig van de voorste schelp marge in acht, strak houden met geribde-neus tang een plooi van weefsel aan de linkerkant van deze oorsprong, terwijl snipping een ondiepe gat helemaal door het gladde, vlakke gebied van het lichaam muur net rechts van de genitale groef met een fijne schuine schaar. </li><li> Hemolymph moeten worden geobserveerd te gieten uit het gat, soms dragen daarmee ook de buik ganglion en maag. </li></ol></li><li> Vouw de incisie. <ol><li> Gebruik grote schaar om th breidene incisie anterieur naar een punt tussen de rhinophores, terwijl boven te trekken met het ondermes voorkomen knikken de darm. De inwendige organen worden nageleefd om morsen van de incisie. </li></ol></li><li> Verwijder de ganglia. <ol><li> Plaats de lade en te heroriënteren de microscoop op het hoofd regio. </li><li> Met behulp van schone tang en fijne schaar, verwijder de kop ganglia door doorsnijden op een gegeven moment de zenuwen die het hoofd ganglia vormen tot een ring rond de slokdarm naar pleura-pedaal en hersenzenuwknopen verwijderen als groep. </li><li> Verwijder de buccale ganglion die voldoet aan de ventrale zijde van de slokdarm. </li><li> Verwijder de buik ganglion door het snijden van de 4 grote zenuw connectieven die kwestie uit deze ganglion. </li></ol></li><li> Isoleer ganglia van belang. <ol><li> Trim hoofd ganglia elkaar, op een lengte van connectoren aan elk ganglion plaats die overeenkomt met ten minste de diameter van de ganglion, dit enzym vertraagt ​​over-digestievan de cellen van belang in de volgende stap. </li><li> Zet elke doelgroep ganglion door 2 spoelingen van ASW + P / S, bewegen tussen spoelingen met schone pincet. </li><li> Indien gericht op de PVC-cellen, laat de rechter pleura hemiganglion aan de rechter pedaal hemiganglion, en op dezelfde wijze laat de linker pleura hemiganglion bevestigd aan de linker pedaal hemiganglion. </li><li> Gooi ongewenste ganglia en de rest van het dier volgens de gangbare onderzoekspraktijk. </li></ol></li><li> Enzymatisch verteren de ganglia. <ol><li> Voor elk ganglion, bereiden 1 ml enzym oplossing bestaande uit 3,75 mg dispase, 1 mg hyaluronidase en 0,3 g collagenase soort XI per ml ASW + P / S in een 15 ml polypropyleen conische buis. </li><li> Plaats gespoeld ganglia in enzymoplossing en bevestig de dop stevig vast. Plaats de buis op zijn kant op een roterende schudder (zie tabel 2) bij een lage snelheid voor 13-5 uur &#39;s nachts bij ongeveer 23 ° C (kamertemperatuur). </li></ol></li><li> Bereid decultuur gerechten. <ol><li> Voordat microdissection (Dag 2), bereiden poly-D-lysine (PDL)-gecoate cultuur gerechten in een weefselkweek kap. Voeg -0,5 ml PDL (0,2 mg / ml steriel water) naar het midden van een 35 mm schotel voor ~ 25 minuten. </li><li> Spoel PDL 3x met steriel water. Laten drogen. UV-steriliseren van de platen. </li></ol></li><li> Dag 2 Isoleer neuronen. <ol><li> Vul het centrum van 35 mm gerechten die PDL-gecoate en UV gesteriliseerd met ongeveer 0,5 ml ASW + P / S om een ​​eiland van media in de anders droge gerecht te creëren waren. Dit kan worden gedaan op de bank, buiten de weefselkweek kap. Een gerecht moet worden opgesteld voor elk cluster cel afkomstig van een hemiganglion. </li><li> Heb klaar een 100 mm diameter dissectie schaal door Sylgard-coating en uitharding een 5 mm diep dissectie oppervlak, uitgerust met fijne dissectie kunnen van verschillende formaten worden gebruikt als pennen en probes (zie tabel 3). Spoel dit gerecht met 70% isopropol alcohol, daarna met ASW + P / S, en tenslotte fill het met ASW + P / S. </li></ol></li><li> Bereid microdissection van verteerd ganglia. <ol><li> Giet het enzym oplossing die de verteerde pleura-pedaal en buccale ganglia in de dissectie schotel. </li><li> Plaats de schotel op het podium van de microscoop tegen een zwarte ondergrond onder gereflecteerd licht. </li><li> Met behulp van de bijgevoegde bindweefsel, vastpinnen elk pleura-pedaal hemiganglion dorsale kant naar boven. De weefsels worden zacht en intolerant stretching. </li></ol></li><li> Microdissect PVC neuronen. <ol><li> Met behulp van 2 paar schone fijne tang, en met een fijne dissectie pin in een pincet als een probe, isoleren van de PVC-cellen van een pleurale hemiganglion. Enzymdigestie zullen verwijderd of gebroken elkaar het bindweefsel mantel die de cluster PVC, maar de cellen aan elkaar hechten. </li><li> Met de probe aan deze cellen los van het pedaal-pleurale verbindende 18, laat de cel cluster vallen op de bodem van de dissectiegerecht. </li></ol></li><li> Overdragen neuronen aan cultuur schotel. <ol><li> Breng de cluster cel om een ​​voorbereide 35 mm cultuur schotel door voorzichtig zuigen de cluster in de punt van een licht vuur gepolijste besteedbaar glas Pasteur pipet, dan doseren het langzaam in de media eiland in een cultuur schotel, en voorzichtig om te voorkomen dat er luchtbellen in de pipet. Herhaal isolatie van de PVC-cluster van de andere hemiganglion en plaats in een aparte cultuur schotel. </li></ol></li><li> Microdissect en overbrengen BSC neuronen. <ol><li> Pin uit de buccale ganglion ventrale zijde naar boven, met zorg om de cellen van belang sparen. Herhaal stap 1.12 met de 2 BSC cel clusters van de buccale ganglion 10. </li><li> Isolatie van pvc en BSC neuronen zal produceren 4 kweekschaaltjes daarin neuron clusters: 2 platen met BSC clusters en 2 schotels met PVC-clusters. Gooi de rest van de ganglia en de vernietiging van het 100 mm dissectie schotel. </li></ol></li><li> DissocIATE de cel clusters. <ol><li> Plaats een cultuur schotel met cellen op het podium van de laag vermogen microscoop en verwijder het deksel. </li><li> Distantiëren de cluster PVC door voorzichtig flicking de bodem van de kweekschaal naast de cluster cel met een fijne dissectie pin gehouden tang. Flicking graaft de punt van de pen in het plastic van de bodem van de schaal, alsof proberen uit te graven een vlek van plastic. Wanneer wrijving met de plastic releases van de pen punt, is een percussie golf geproduceerd door het medium dat uit elkaar breekt de nabijgelegen klompje cellen. </li><li> 5-10 films kan nodig zijn om vrijwel volledig de cellen dissociëren, maar het is beter om kleine clusters van cellen laten plaats van flick teveel opdat de cellen worden vernietigd door mechanische pure. </li><li> Deksel en herhaal met de andere cultuur gerechten. </li></ol></li><li> Slaan celculturen. <ol><li> Plaats de kweekschalen bevattende media eilanden in hun centra met gedissocieerde cellen ineen grote container die luchtcirculatie, zoals een 150 x 25 mm ronde plastic petrischaal maakt, en plaats deze schotel in een incubator ingesteld op 17 ° C. </li><li> Installeer de kamer een open schaal van water als een bron van vocht. Verlaat ongestoord overnachten. De cellen hechten aan de poly-D-lysine coating in het midden van de schotel. </li></ol></li><li> Vloed cultuur gerechten. <ol><li> Op dag 3, voorzichtig overspoelen de gerechten met 2,5 ml van ASW + P / S. Onderzoeken en tel de cellen met behulp van een omgekeerde celcultuur microscoop. Bewaren in de 17 ° C incubator. </li></ol></li></ol> 2. Elektrofysiologie De methode is standaard patch klemmen die is beschreven in talrijke teksten (bijvoorbeeld Neher en Sakmann, 1995) 16. Dit protocol zal werken op cellen ≤ 100 pF condensator, of cellen &lt;60 micrometer diameter tijdens dag 3 en 4 van het protocol. Cellen zonder processen optimaal voor opname. De volgende speciale ONDERZOEKionen van toepassing: <ol><li> Grotere cellen kunnen worden ondergebracht met de configuratie-instelling op de Axopatch 200B versterker ingesteld op β = 0,1. Activering van zeer grote stromen kunnen veroorzaken cellen voltage clamp ontsnappen. ASW oplossingen vervangen zoutgehalte (bijvoorbeeld een fractie van de NaCl gesubstitueerd met ondoorlaatbare N-methyl-D-glucamine chloride) worden gebruikt om hele cellen stroomamplitude verminderen. </li><li> Vezelgevulde borosilicaat patch pipetten trok een pipet trekker en halverwege opgevuld met intracellulaire oplossing (ICS) bestaande uit 450 mM KCl en andere zouten (zie tabel 1) zijn geschikt, en moeten weerstand van 0,5-1 Mohm hebben. Als isolatie van specifieke ionische stromen gewenst is, bijvoorbeeld Na +-stromen in afwezigheid van K stromen, K + in deze oplossing kan worden vervangen door andere ionen zoals Cs +. Cl - vervanging van ICS met een impermeant anion is ook gerechtvaardigd als een meer natuurlijke ICS is gewenst9. </li><li> De cellen zijn robuust bij&gt; 1 uur durende opnamen mogelijk op kamertemperatuur. Opname is optimaal op dag 3 en 4 van het protocol, overeenkomend met 24-48 uur in de cultuur. Na 48 uur is er moeilijkheden die Gigaohm verbindingen, misschien vanwege uitwerking van een glycocalyx op het celoppervlak, en ruimte klem veroorzaakt door proces uitgroei. De cellen zijn echter nuttig voor niet-patch clamp studies, zoals toxicologie, dat &lt;14 d kunnen worden voltooid. </li><li> ASW en andere oplossingen worden vrijgesteld van de zwaartekracht gevoede oplossing apparaat, alsmede intracellulaire oplossing, worden gefiltreerd door een injectiespuit gemonteerde 0,2 um Acrodisk filter (Tabel 3) om fijne deeltjes die interfereren met Gigaohm afdichting vorming elimineren. </li><li> Desensibilisatie treedt bij gebruik van agonisten zoals D-aspartaat (D-Asp), dus ~ 1-2 min tussen toepassingen van agonisten wordt aanbevolen. Omgekeerd wordt potentiëring vaak waargenomen met snelle herhaalde toepassingcatie van agonisten zoals L-glutamaat (L-Glu). </li><li> Agonist geactiveerde stromen zoals L-Glu kan worden onderzocht door toepassing van agonisten met picospritzer pipet. Deze pipet is hetzelfde als de patch pipet getrokken en bevat agonist ASW. Wanneer de punt van de pipet wordt gepositioneerd onder de afvoerpijp van de zwaartekracht gevoede oplossing apparaat en op een 45 ° hoek van de afvoerpijp (figuur 2F), wordt agonist snel weggewassen uit de cel en desensibilisatie wordt geminimaliseerd. De pipet agonist dient een hoek van 90 ° of meer ten opzichte van de patch pipet creëren. </li></ol>

<ol><li>Buttner, N., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+modulation+of+a+hyperpolarization-activated+Cl%28-%29+current+in+Aplysia+sensory+neurons+by+SCP%28B%29+and+FMRFamide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide.</a> J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).</li>
<li>Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+individual+mechanoreceptor+sensory+neurons+to+defensive+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).</li>
<li>Carlson, S. L., Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+evidence+that+D-Aspartate+activates+a+current+distinct+from+ionotropic+glutamate+receptor+currents+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica.</a> J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).</li>
<li>Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+evidence+that+D-Aspartate+activates+a+current+distinct+from+ionotropic+glutamate+receptor+currents+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Behav%22%5BJournal%5D)">Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica.</a> Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).</li>
<li>Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Na%2B+and+Ca2%2B+currents+in+bag+cells+of+sexually+immature+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica.</a> J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).</li>
<li>Fieber, L. .A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+D-Aspartate+ion+currents+in+the+Aplysia+nervous+system+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Res%22%5BJournal%5D)">Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging.</a> Br. Res. 1343, 28-36 (2010).</li>
<li>Glansman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habituation+in+Aplysia%3A+The+Cheshire+Cat+of+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).</li>
<li>Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cellular+Mechanism+of+Classical+Conditioning+in+Aplysia%3A+Activity-Dependent+Amplification+of+Presynaptic+Facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%2C+New%22%5BJournal%5D)">A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation.</a> Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).</li>
<li>Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+acetylcholine+on+ventrocaudal+sensory+neurons+in+the+pleural+ganglia+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia.</a> Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Cellular+basis+of+behavior%22">Cellular basis of behavior</a>. , W.H. Freeman. New York. (1976).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+memory+storage%3A+a+dialog+between+nerves+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses.</a> Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).</li>
<li>Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+correlates+of+habituation+and+habituation+of+the+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).</li>
<li>Magoski, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+an+Aplysia+bag-cell+neuron+cation+channel+by+closely+associated+protein+kinase+A+and+a+protein+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase.</a> J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).</li>
<li>R, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+transcriptome+of+Aplysia%3A+neuronal+compartments+and+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry.</a> Cell. 127, 1453-1467 (2006).</li>
<li>Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+currents+underlying+developmental+regulation+of+repetitive+firing+in+Aplysia+bag+cell+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Single-channel+recording%22">Single-channel recording</a>. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. NY. (1995).</li>
<li>Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+Ca2%2B+current+contributes+to+a+prolonged+depolarization+in+Aplysia+bag+cell+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).</li>
<li>Schacher, S., Proshansky, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+regeneration+by+Aplysia+neurons+in+dissociated+cell+culture%3A+modulation+by+Aplysia+hemolymph+and+the+presence+of+the+initial+axonal+segment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment.</a> J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).</li>
<li>Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanoafferent+neurons+innervating+tail+of+Aplysia.+I.+Response+properties+and+synaptic+connections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections.</a> J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).</li>
<li>Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+Ca%282%2B%29-sensitive+nonspecific+cation+channel+underlying+prolonged+repetitive+firing+in+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons.</a> J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).</li>
<li>White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+regulates+a+vesicular+class+of+calcium+channels+in+the+bag+cell+neurons+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).</li>
<li>Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+a+calcium-sensitive+nonspecific+cation+channel+by+closely+associated+protein+kinase+and+phosphatase+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).</li>
<li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J. Vis. Exp. (28), e1355(2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

De dissociatie hier beschreven technieken opleveren sensorisch neuron kweken die 50-100 geïsoleerde neuronen afgewisseld met kleine aantallen glia en andere niet-geïdentificeerde cellen. De meest kritische stappen in het protocol zijn de tijd de ganglia blijven enzymoplossing en vegen, de dissociatie van de gedigereerde cel clusters splitsen de cluster in individuele cellen. Enzym digestie (stap 1.8) moet worden geoptimaliseerd op beschikbare temperatuur. Bij 23 ° C onder langzaam schudden 13 uur is voldoende voor diges...

De marine opistobranch weekdier, Aplysia, is een nuttig neurobiologische model voor vele decennia. Het is het best bekend als een model van gewenning en klassieke conditionering 7, 8. Studies over leren en geheugen in dit model won de Nobelprijs voor de Fysiologie of Geneeskunde in 2000 voor Eric R. Kandel, in een prijs die hij met Arvid Carlsson en Paul Greengard 10 gedeeld. Deze onderzoeken met elektrische opnames van verminderde preparaten, waarbij elementen van het zenuwstelsel van de invertebrate worden ontleed uit het dier met zenuwen en spieren laat zitten, hebben geholpen verduidelijken de rol van individuele neuronen in Aplysia. Identificatie van precieze moleculaire mechanismen die leren in Aplysia vormen echter vaak gebruikt een andere techniek, langdurige co-kweken van een sensorisch neuron en een motorisch neuron, verkregen een voor een individuele donor dieren mogen een synaps vormen in de kweekschaal 21 . Wij en anderen 1, 3, 6, 14, 15, 16 hebben het gemak waarmee geïdentificeerde neuronen kan worden gericht in dit model en de duurzaamheid op lange termijn experimenten gedissocieerde korte termijn kweken clusters van nominaal homogene neuronen benut waarin bestuderen we ionenstromen onder spanning klem in de patch clamp configuratie. Veel Aplysia neuronen opstaan ​​om herhaalde rondes van patch klemmen om tijd te geven voor een langdurige experimentele manipulaties. De techniek is nuttig voor neuronen zoals neuro-zak cellen van de abdominale ganglion en de sensorische neuronen van de pleurale buccale ganglia waarvan dissociatie hier bedoeld maar niet voor zeer grote neuronen&gt; 60 urn diameter, zoals L7 of R2 van de buik ganglion. We hebben geen gebruik Aplysia serum in onze culturen, in tegenstelling tot de sensorische motoneuron co-kweken elders beschreven. De meeste neuronen verkregen met deze werkwijze zal worden zonder processen thij voor het eerst 48 uur in de cultuur, het vergemakkelijken van whole cell voltage-opname, maar zal dan ontkiemen en uitwerken axonen en andere processen gedurende ongeveer 14 dagen alvorens te sterven door gebrek aan voedingsstoffen en / of groeifactoren. Deze techniek produceert primaire culturen van 50-100 neuronen per gerecht uit fysiologisch gedocumenteerde regio&#39;s van de buccale en pleura ganglia. Dit protocol is nuttig voor onderzoekers bestuderen aspecten van enkele cel fysiologie in experimenten die vereisen talrijke experimentele duplo&#39;s per dier. Het produceert twee dezelfde culturen vanwege de anatomische scheiding van doelcellen in linker en rechter hemiganglia, waardoor studies die profiteren matched behandeling en controle culturen. Het protocol richt buccale S cluster (BSC) neuronen van de buccale ganglion, en pleurale ventrocaudale (PVC) neuronen van de pleura ganglion. Deze cellen zijn een geschikte grootte voor gehele cel spanning opnamen en weergave Robust glutamatergic reacties. De besproken werkwijze is geschikt voor de meeste ganglia in het Aplysia zenuwstelsel.

<table><tbody><tr><td>Artificial seawater ASW</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>assorted</td><td>(mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6</td></tr><tr><td>Intracellular solution</td><td>Sigma</td><td>assorted</td><td>(mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin toegevoegd aan ASW bij 1:100</td><td>Lonzo Walkersville, Inc.</td><td>17-603E</td><td>5.000 eenheden/ml penicilline plus 5.000 mg/ml streptomycine</td></tr><tr><td>Neutral dispase II</td><td>Roche Diagnostics</td><td>10165859001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4272</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>collageenase type XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamaat (L-Glu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49601-100G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-Aspartaat (D-Asp)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11200-10G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N-methyl-D-aspartaat (NMDA)</td><td>Biomol</td><td>100002-268</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Asp</td><td>Sigma</td><td>A6683-25G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazool-propioninezuur (AMPA)</td><td>Sigma</td><td>A6816-5MG</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glu R antagonisten</td><td>various</td><td>various</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>agar</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>kynurenine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61250</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>APV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DL-2-Amino-5-fosfonopentaanzuur (NMDAR antagonist)</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>VWRSP</td><td>BDH1133</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Chlorideringsoplossing</td><td>Sigma</td><td>assorted</td><td>25 g FeCl3 + 25 ml geconcentreerd HCl + 50 ml H2O</td></tr><tr><td>Sylgard siliconen 2-delige polymeer</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>SYL184</td><td>Biedt een pin-out oppervlak voor kleine dissectie schotels</td></tr><tr><td>0-40x zoomvergroting microscoop voor dissecties</td><td>Wild</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator</td><td>Microoptics of Florida</td><td>TQ FOI-150</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RotoMix 50800 orbitale mixer</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nikon Diaphot omgekeerde fase-contrast microscoop met 4x, 20x (optioneel) & 40x objectieven</td><td>SR Research Ltd.</td><td>Eyelink II</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tektronix digitale oscilloscoop</td><td>SR Research Ltd.</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>pClamp 10 data acquisitie en analyse software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PC met Windows XP of hoger besturingssysteem</td><td>PC Solutions</td><td></td><td>Thinkserver met solid state harde schijven (80GB) en low noise monitors</td></tr><tr><td>Flaming/Brown P87 micropipet puller</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Axon Instruments Axopatch 200B clamp versterker met een capaciteitscompensatiebereik van 1-1000 pF; preamp</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Axon instrumenten elektrode houder assembly voor Axopatch 200B preamp</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>CV203BU</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Digidata 1200 A/D converter</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Picospritzer, aangedreven door N2 instelbaar voor druk en duur</td><td>Parker Hannifin, Cleveland, OH</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>TMC Micro-G Trillingsisolatie tafel</td><td>Ametek</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Faraday kooi</td><td></td><td></td><td>op maat gemaakt</td></tr><tr><td>Burleigh Piezoëlektrische Clamshell Micromanipulators</td><td>Burleigh Instruments; Thorlabs</td><td></td><td>momenteel PCS-5000; -6000 serie + montages</td></tr><tr><td>Narishige M-152 handmatige manipulators (voor perfusie systeem en picospritzer)</td><td>Narishige USA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Filament pipet glas, 1,5 mm OD, 0,84 mm ID -</td><td>WPI</td><td>1B150-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>3 inch lengte</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ag/AgCl halve cel</td><td>WPI</td><td>EP4</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml centrifuge buizen, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes</td><td>VWRSP</td><td>21008-918</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Schuine schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006-09</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dumostar Fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>35 mm falcon weefsel kweek schotels</td><td>VWRSP</td><td>25382-064</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>falcon 150 x 25 mm weefsel kweek schotels; 1013</td><td>VWRSP</td><td>1013</td><td>kan ook worden gemaakt in kleine dissectie schotels met sylgard</td></tr><tr><td>sylgard</td><td>WPI</td><td>SYL184</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>dier dissectie bak</td><td>various</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml centrifuge buizen, 35-2097 BD Falcon</td><td>VWRSP</td><td>21008-918</td><td>Voor 6-boring zwaartekracht gevoed perfusie systeem</td></tr><tr><td>Aluminium clips met schroefgat uiteinden</td><td>hardware winkel</td><td></td><td>Voor perfusie systeem</td></tr><tr><td>23 gauge naalden (handmatig de punten af vijlen)</td><td>VWRSP</td><td></td><td>Voor perfusie systeem</td></tr><tr><td>Polyethyleen buis 0.022"ID x 0.042"OD; 427411</td><td>Becton-Dickinson</td><td></td><td>Voor perfusie systeem</td></tr><tr><td>H-7 pipet stand/houder voor microcap perfusie array</td><td>Narishige USA</td><td></td><td>Voor perfusie systeem</td></tr><tr><td>eenrichtingskleppen</td><td></td>

isolatie van sensorische neuronen van<em&gt; aplysia californica</em&gt; voor patch clamp recordings van glutamaterge currents

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

De marine buikpotigeweekdier Aplysia californica heeft een eerbiedwaardige geschiedenis als een model van de werking van het zenuwstelsel, met bijzondere betekenis in studies van leren en geheugen. De typische voorbereidingen voor dergelijke studies zijn die waarin de sensorische en motorische zenuwcellen intact worden gelaten in een minimaal ontleed dier, of een technisch ingewikkelde neuronale co-cultuur van individuele sensorische en motorische zenuwcellen. Minder vaak voorkomende is de geïsoleerde neuronale preparaat waarin kleine clusters van nominaal homogene neuronen kunnen worden gescheiden in afzonderlijke cellen in korte termijn cultuur. Dergelijke geïsoleerde cellen zijn bruikbaar voor de biofysische analyse van ionen stromen met patch clamp technieken en doelgerichte modulatie van deze geleidingen. Een protocol voor het bereiden van dergelijke culturen wordt beschreven. Het protocol maakt gebruik van de gemakkelijk te herkennen glutamatergic sensorische neuronen van de pleura en buccale ganglia, en beschrijft hun dissociatie en minimaal onderhoud in cultuur voor meerdere dagen zonder serum.

De locaties van de sensorische neuronen in de ganglia die bij een dergelijk protocol worden de BSC en PVC neuronen in figuur 1. De BSC neuronen bevinden zich in 2 symmetrische ovale clusters aan de buikzijde van de buccale ganglion, de oppervlakte die is afgekeerd van de buccale massa in de intacte ganglion (Figuur 1A). De PVC-neuronen vormen bilaterale, V-vormige clusters die rond het dorsale oppervlak van de pleura ganglion naar de centrale as (Figuur 1B). Deze sensor...

We beschrijven de ontleding van het zenuwstelsel van het mariene zeehaas<em&gt; Aplysia</em&gt; Na de anesthesie, de isolatie van neuronen voor de korte termijn-weefselkweek, en de opnames van enkele cel ionstromen via de patch clamp techniek.

Isolatie van sensorische neuronen van<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Voor Patch Clamp Recordings van Glutamaterge Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van individuele sensorische neuronen van plegia in een kortetermijnkweek. Voor patchclamp-studies wordt dit bereikt door eerst de ganglia die sensorische cellen bevatten uit een geanesthetiseerd dier te dissekeren. De tweede stap bestaat uit het overnacht digereren van de ganglia in een enzymoplossing.Vervolgens worden de relevante sensorische neuronen gedisseceerd uit de verteerde ganglia. De laatste stap is de dissociatie van de voorbereide kweekschalen om deze gedurende de nacht te laten hechten aan het kweeksubstraat. Uiteindelijk wordt voltage clamping gebruikt om de spannings- en agonist-gestuurde ionenstromen te bestuderen die in deze neuronen tot expressie komen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals in situ celregistratie, is dat het isoleren van de neuronen het gebruik van een voltage-clamptechniek met een enkele elektrode mogelijk maakt. Deze methode kan helpen bij het identificeren van cruciale onbekenden in het vakgebied van de neurobiologie van de appel, zoals de identiteit van ionstromen die worden geactiveerd door neurotransmitters die betrokken zijn bij leren en ge

isolation-sensory-neurons-aplysia-californica-for-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De voorbereiding van Aplysia Sensory-motor Neuronale Cell Cultures

Een techniek is beschreven voor het implanteren van...

Elektrode Fabrication en Implantatie in Aplysia californica Voor Multi-channel Neurale en gespierd Recordings in Intact, Vrij Behaving Dieren

We zien hoe veranderingen in de intracellulaire vrije calciumconcentratie en synaptische werkzaamheid kan gelijktijdig monitoren in een ganglion bereiding...

Volgen van veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie en Synaptic werkzaamheid in de Mollusc<em&gt; Aplysia</em

We beschrijven een techniek om extracellulair op te nemen en te stimuleren van zenuwen, spieren, en individuele geïdentificeerde...

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Voorbereiding voor het uitlokken en opnemen Feeding Motor Programma&#39;s met Fysiologische Mutaties in<em&gt; Aplysia californica</em

De bereiding van acute hersenplakjes van hippocampi geïsoleerd, evenals de gelijktijdige elektrofysiologische opnames van astrocyten en neuronen...

Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices

This video demonstrates the procedure to map synaptic connections by securing a brain slice, positioning pipettes to achieve whole-cell configurations, and stimulating presynaptic neurons to record postsynaptic responses, thereby elucidating neuronal connectivity.

Paired Patch Clamp Recording of the Neuronal Connections in Acute Brain Slices

In dieren met grote geïdentificeerde neuronen...

Extracellulair Het identificeren van Motor Neuronen voor een Muscle Motor Pool in<em&gt; Aplysia californica</em

Zeeslak Aplysia californica is veel gebruikt als een neurobiologisch model voor de studies op cellulaire en moleculaire basis van gedrag. Hier wordt een methodologie beschreven voor het verkennen van het zenuwstelsel van Aplysia voor de elektrofysiologische en moleculaire analyses van enkele neuronen van geïdentificeerde neurale circuits.

Aplysia Ganglia voorbereiding voor elektrofysiologische en moleculaire analyses van enkele neuronen

Het opnemen van Ca2+ stromen op het presynaptische afgiftevlak van het membraan is essentieel voor een nauwkeurig begrip van Ca2+-intrede en neurotransmitterafgifte. We presenteren een acute dissociatie van het rugsmerg van de kaakhaai die functionele geïsoleerde reticulospinale axonen oplevert, waardoor opname direct vanaf het afgiftevlak van het membraan van individuele presynaptische terminalen mogelijk is.

Acute Dissociatie van Lamprey Reticulospinal Axonen naar Opnemen inschakelen van de Release Gezicht Membraan van individuele functionele Presynaptische Terminals

Patch-clamp opnames en gelijktijdige intracellulaire biocytinevulling van synaptisch gekoppelde neuronen in acute herfsneden maken een gecorreleerde analyse van hun structurele en functionele eigenschappen mogelijk. Het doel van dit protocol is om de essentiële technische stappen van elektrofysiologisch opnemen van neuronale microcircuits en hun daaropvolgende morfologische analyse te beschrijven.

Elektrofysiologische en morfologische analyse van neuronale Microschake in Acute Brain Slices Met behulp Paired Patch-Clamp Recordings

Hier beschrijven we de essentiële stappen voor geheel-cel patch-clamp opnamen gemaakt van substantia gelatinosa (SG) neuronen in het ruggenmerg in vitro segment. Met deze methode kunt de eigenschappen van het intrinsieke membraan, synaptische transmissie en morfologische karakterisering van SG neuronen worden bestudeerd.

Voorbereiding van Acute ruggenmerg segmenten geheel-cel Patch-clamp opname in neuronen van de Substantia Gelatinosa

Leer sensorische neuronen isoleren van Aplysia californica voor patch clamp-opnames. Deze methode met enzymatische digestie en korte-termijnkweek maakt gedetailleerde elektrofysiologische studies van glutamaterge ionstromen mogelijk.

Isolatie van sensorische neuronen van

Meer video's verkennen