Het verbeteren van de slaagkans van eiwitkristallisatie door Random Microseed Matrix Screening
31 augustus 2013
Hier beschrijven we een algemene methode voor willekeurige microseed matrix screening. Deze techniek is een significante toename van de slaagkans van eiwitkristallisatie screeningsexperimenten, de behoefte aan optimalisatie en een betrouwbare aanvoer van kristallen voor gegevensverzameling en ligand-inweken experimenten.
Het algemene doel van deze procedure is om het aantal en de diffractiekwaliteit van eiwitkristallen die zijn verkregen uit een kristallisatiescreeningexperiment te verbeteren. Om dit te doen, wordt een kristallijn of geprecipiteerd materiaal geïdentificeerd uit een bestaand eiwitkristallisatiescreeningexperiment dat is uitgevoerd met een doeleiwit van belang, het kristallijne of geprecipiteerde materiaal wordt geoogst en vervolgens gebruikt om een kristallzaadvoorraad te genereren. Vervolgens wordt een reeks kristallisatiescreens opgezet die zowel het doeleiwit als de kristallzaden bevatten.
Ten slotte worden de gezaaide kristallisatiescreens gecontroleerd op kristallisatie en worden eventuele nieuwe eiwitkristallen gekarakteriseerd. Uiteindelijk kan de toepassing van deze procedure resulteren in een toename van het aantal, de grootte en de diffractiekwaliteit van eiwitkristallen die zijn verkregen uit kristallisatiescreeningexperimenten. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, bijvoorbeeld traditioneel micro-seeding of macro-seeding, zijn dat het snel kan worden uitgevoerd, zeer schaalbaar is en significant meer kristallisatieruimte bemonstert dan andere zaaimethoden.
Een ander voordeel van deze techniek is dat het niet nodig is om hoogwaardig kristallijn uitgangsmateriaal te gebruiken voor de productie van zaadvoorraad. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat er een aanzienlijke mate van manuele behendigheid vereist is tijdens de kristalloogst en manipulatie stappen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de micro-seeding van willekeurige matrices aanzienlijk afwijkt van andere kristallisatiemethoden.
De subtiliteiten van deze methode zijn cruciaal voor het succes, en een aantal daarvan is moeilijk om nauwkeurig in tekstvorm over te brengen. Begin de procedure alleen met een gezaaide kristallisatiebak met behulp van een binoculaire microscoop of kristallbeeldensysteem. Inspecteer de bak elke dag gedurende de eerste week.
En vervolgens elke week daarna, maak een aantekening van de kristalgrootte. Zodra er geen bewijs is van verdere groei, selecteer een of meer geschikte putten uit de bak waaruit kristallijn materiaal kan worden geoogst. Voor het genereren van zaadvoorraad kan elk materiaal worden gebruikt, inclusief fijne naalden, spiraalvormige lichten, microkristallen en onregelmatige, slecht gevormde kristallen.
Oudere materialen zijn eerder gedeeltelijk gekruist en zijn minder geschikt voor gebruik in zaaiexperimenten. Op de dag van oogst, gebruik een buns ontstoken om een afgeronde sonde te maken van een glazen weidepipet. Om dit te doen, verwarm de pipet in de buurt van het midden tot het zacht wordt.
Verwijder het dan snel uit de vlam en trek het uit door de uiteinden uit elkaar te trekken. Streef ernaar om het glas tot een diameter van minder dan 0,25 millimeter te trekken op het punt waar het ongeveer 0,25 millimeter is. Breek het glas en dompel het gebroken uiteinde kortstondig in de vlam.
Herhaal dit proces tot er een halfrond glas is gevormd aan het uiteinde met een diameter van ongeveer 0,75 millimeter. Plaats een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje met een zaadkraal op ijs. Open vervolgens de geselecteerde kristallisatiebak.
Wel, voor 24-wells hangende druppelbakjes. Gebruik een pincet om het dekglas te verwijderen. Draai vervolgens het dekglas om en plaats het op een stabiele schone oppervlakte.
Voor 96-wells zittende druppelbakjes. Gebruik een scalpel om rond de plastic plafondfolie op de bovenkant van de geselecteerde put te snijden en verwijder vervolgens het uitgesneden deel van de plafondfolie met behulp van een pincet. Verwijder 50 microliter van de reservoiroplossing en breng deze vloeistof over naar het microcentrifugebuisje met de zaadkraal, ervoor zorgen dat het buisje gedurende de gehele tijd op ijs blijft. Het moeilijkste aspect van deze procedure is de voorbereiding van de zaadvoorraad.
Het is belangrijk om dit precies zoals beschreven en zo snel mogelijk uit te voeren. Zorg ervoor om het zaadmateriaal grondig te pletten met de sonde en herstel zoveel mogelijk terwijl u het monster onder een microscoop bekijkt. Gebruik de eerder bereide glazen sonde om de kristallen op het dekglas grondig te pletten.
Druppel kleine kristallen kunnen enkele minuten nodig hebben om grondig te worden geplet. Kristallen die gemakkelijk te pletten zijn, zijn niet gekruist en zijn geen zoutkristallen.
Terwijl zoutkristallen een kenmerkende klik produceren die gehoord en gevoeld kan worden wanneer ze worden geplet. Verwijder vervolgens vijf microliter van de reservoiroplossing van het zaadkraalbuisje en breng dit over naar het equivalente subputje voor een zittende druppelexperiment of dekglas voor een hangende druppelexperiment met behulp van het kristallijne materiaal dat moet worden geoogst. Pipet deze vloeistof vijf tot zes keer op en neer om zoveel mogelijk van de inhoud van het subputje of het dekglas te resuspenderen.
Breng de suspensie terug naar het zaadkraalbuisje en herhaal deze stap nog twee keer, waarbij u ervoor zorgt dat zoveel mogelijk kristallijn materiaal wordt geoogst. Vortex het zaadkraal gedurende twee minuten, met tussenpozen van 30 seconden om het buisje op ijs af te koelen. In 1,5 milliliter buisjes met reservoiroplossing.
Maak een verdunningsreeks om het zaadvoorraad in reservoiroplossing met een factor van vier tot 10 bij elke stap te archiveren. Als het zaad, voorraad en verdunningen niet onmiddellijk worden gebruikt, plaats dan 10 tot 20 microliter aliquots in een negatieve 20 graden Celsius of negatieve 80 graden Celsius vriezer voor opslag. Eenmaal bevroren kunnen de zaadvoorraden onbeperkt worden bewaard totdat ze nodig zijn.
RMMS kristallisatiescreening kan worden uitgevoerd met behulp van 24-wells bakjes met behulp van de hangende druppel dampverspreidingsmethode of 96-wells bakjes met behulp van de zittende druppel dampverspreidingsmethode. Om onze MMS-screening in 24-wells hangende druppelbakjes uit te voeren, gebruikt u een pipet om handmatig 300 microliter
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor willekeurige microseed-matrixscreening, gericht op het verhogen van de succespercentages van eiwitkristallisatie. De techniek minimaliseert de noodzaak voor optimalisatie en garandeert een gestage toevoer van kristallen voor verdere experimenten.
Belangrijke componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Proteïnekristallisatie
- Structurele biologie
- Kristallografische technieken
Achtergrond
- Proteïnekristallisatie is essentieel voor structurele analyse.
- Traditionele methoden vereisen vaak uitgebreide optimalisatie.
- Gezaaide kristallisatie kan de kristalkwaliteit verbeteren.
- Random microseed matrix screening biedt een innovatieve benadering.
Doel van de studie
- Om het aantal verkregen proteinekristallen te verhogen.
- Om de diffractiekwaliteit van de kristallen te verbeteren.
- Om het screeningproces voor kristallisatie te stroomlijnen.
Gebruikte methoden
- Identificatie van kristallijn of geprecipiteerd materiaal uit bestaande experimenten.
- Oogsten van materiaal voor het maken van een voorraad kristalkiemen.
- Opzetten van crystallisatieschermen met doeleiwitten en kristalkiemen.
- Monitoren van gekiemde schermen op kristalvorming en karakterisering.
Belangrijkste resultaten
- Verhoogd aantal en grotere omvang van proteïnekristallen.
- Verbeterde diffractiekwaliteit van de verkregen kristallen.
- Snellere uitvoering in vergelijking met traditionele methoden.
- Schaalbare aanpak die een groter deel van de crystallisatieruimte onderzoekt.
Conclusies
- De methode verbetert de resultaten van proteïnekristallisatie aanzienlijk.
- Het zorgt voor een betrouwbare levering van kristallen voor verdere studies.
- Deze techniek zou in veel toepassingen de traditionele seeding-methoden kunnen vervangen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Eiwitkristallisatie blijft een kritieke flessenhals in de structurele biologie en geneesmiddelenontwikkeling, waarbij lage succespercentages de validatie van targets en structuurgebaseerd ontwerp vertragen. Random microseed matrix screening (rMMS) verhoogt de hit-rates van kristallisatie en de kristalkwaliteit zonder uitgebreide optimalisatie, wat direct bijdraagt aan het vroegtijdig verminderen van risico's bij therapeutische targets. Door een betrouwbare kristalproductie mogelijk te maken voor diffractie- en soaking-experimenten, verbetert rMMS het voorspellende vertrouwen bij de identificatie van lead-verbindingen en de preklinische voortgang.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door verbeterde toegang tot hoogwaardige proteinekristallen voor structurele analyse.
- Operationele waarde: Vermindert de tijd en het materiaalverbruik bij crystallisatiescreening door de succespercentages over diverse conditie-sets te verhogen.
- Predictieve waarde: Verhoogt het vertrouwen in het target door betrouwbare diffractiegegevens te leveren voor structureel gestuurd geneesmiddelonderzoek.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert reproduceerbare kristaloutputs die consistente compound-soaking en fragment-screeningcampagnes mogelijk maken.
- Operationele waarde: Compatibel met vloeistofbehandelingsrobotica en standaard 96-wells of 24-wells formaten, wat schaalbaarheid en standaardisatie van assays garandeert.
- Reproduceerbaarheidswaarde: Levert kwantificeerbare toenames in het aantal en de grootte van kristallen op, wat een robuuste hit-to-lead progressie ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Faciliteert structuurgebaseerde optimalisatie door het leveren van kristallen voor ligand-soaking en karakterisering van de bindingsplaats.
- Preklinische waarde: Maakt mechanische risicoreductie mogelijk via interactiegegevens van target-liganden met een hoge resolutie.
- Continuiteitswaarde: Slaat een brug tussen de ontdekkingsfase en de preklinische stadia door een gestage toevoer van kristallen van diffractiekwaliteit te waarborgen voor iteratieve ontwerpcycli.
Integratie van Pijplijn & Workflow
rMMS wordt geïntegreerd in de workflow voor eiwitkristallografie na de initiële screening en voorafgaand aan de datacollectie, waardoor de betrouwbaarheid van structurele input voor latere besluitvorming bij lead-optimalisatie wordt verbeterd.
- Discovery Biology: Verhoogt de kans op het verkrijgen van kristallen van diffractiekwaliteit, waardoor een nauwkeurige bepaling van de doelstructuur mogelijk wordt voor de validatie van hypothesen.
- Screening: Verbetert de gereedheid van assays door een hogere opbrengst van kristallen te produceren die geschikt zijn voor fragment- of compound-screening.
- Analytics: Levert meetbare resultaten zoals kristalaantal, grootte en diffractieresolutie, die ten grondslag liggen aan go/no-go-beslissingen bij de voortgang van het target.
- Translationeel Onderzoek: Ondersteunt de preklinische continuïteit door structuurgebaseerde verfijning van lead-compounds mogelijk te maken via soaking-experimenten.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare seedbank vanuit kristallijn materiaal van lage kwaliteit, waardoor de afhankelijkheid van uitgebreide optimalisatie per target wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verbetert het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door de toegang tot structurele gegevens met een hoge resolutie te vergroten.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van kristallisatieworkflows over handmatige en geautomatiseerde platforms.
- Strategische waarde: Versnelt de identificatie van lead-verbindingen door knelpunten in de generatie van structurele gegevens te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogestuurde prioritisering van targets mogelijk door snellere en betrouwbaardere kristallisatieresultaten.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van kristallen en microscopie voor een effectieve voorbereiding van de seed stock.
- Is afhankelijk van toegang tot crystallisatie-beeldvormingssystemen en temperatuurgecontroleerde opslag voor het monitoren van de screening.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor zaadgeneratie en verdunning om de reproduceerbaarheid tussen teams te waarborgen.
- Moet rekening houden met variabiliteit in de effectiviteit van het zaad op basis van de kristalkwaliteit en de conditie van het bronmateriaal.
- Profiteert van training in stappen die een hoge handvaardigheid vereisen, zoals de voorbereiding van glazen probes en het verbrijzelen van kristallen.
