Oppervlaktepassivering voor Single-molecule Protein Studies

Het algemene doel van deze procedure is om een gekwetst kwartsglaasoppervlak van superieure kwaliteit te verkrijgen. Dit wordt bereikt door eerst geboorde kwartsglaasjes en dekglasjes te reinigen met water en aceton. Vervolgens wordt het glaasje geëtst met kaliumhydroxide en de piranha-oplossing om de kwaliteit van het oppervlak te verbeteren.

Vervolgens worden de objectglazen en dekglasjes gefunctionaliseerd met aminegroepen, gevolgd door twee rondes oppervlaktebehandeling met een polymeer om het glasoppervlak inert te maken. De laatste stap is het assembleren van de microfluïdische kamer uit het objectglas en het dekglasje, waarbij de met polyethyleenglycol gecoate of gepegyleerde oppervlakken naar elkaar toe zijn gericht. Uiteindelijk verbetert een nieuwe strategie, waarbij het oppervlak in twee rondes met PEG-moleculen wordt behandeld, de kwaliteit van de passivering aanzienlijk, zoals waargenomen via single-molecule fluorescentiemicroscopie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken, zoals polymeercoating na etsen met kaliumoxide, is dat deze techniek een superieure kwaliteit garandeert. Personen die nieuw zijn met deze methode zullen moeite hebben, aangezien er meerdere servicebehandelingen moeten worden uitgevoerd. Om te beginnen, bereid de kwartsglaasjes voor zoals beschreven in het tekstprotocol.

Reinig de objectglazen door ze in een glazen kleurpot te plaatsen. Gewoonlijk kunnen er vijf tot 15 objectglazen in één pot worden geplaatst. Spoel de objectglazen vervolgens drie keer na met UE-water, sonicer de objectglazen vijf minuten lang met UE-water om vuil te verwijderen, gooi het water weg en spoel de objectglazen nog drie keer na met UE-water.

Vervang vervolgens het UE-water door aceton en Sonicate de slides met aceton gedurende 20 minuten of langer; gooi de aceton weg en spoel de slides af met Milli Q-water om eventuele acetonresten te verwijderen. Vervang daarna het water door één molair kaliumhydroxide en sonicate de slides gedurende 20 minuten of langer. Overmatig etsen zal de kwaliteit van het oppervlak verbeteren, maar kan krassen veroorzaken die de fluorescentiebeeldvorming kunnen verstoren.

Spoel de objectglazen drie keer met Milli Q-water om resten kaliumhydroxide te verwijderen ter voorbereiding op het etsen met piranha-oplossing. Plaats de objectglazen in een Duran-objectglashouder of een op maat gemaakte Teflon-houder en zet deze in een bekerglas van één liter in een zuurkast.

Voeg vervolgens 150 milliliter waterstofperoxide toe voor een verhouding van drie op één tussen zwavelzuur en waterstofperoxide. Roer de oplossing voor een goede menging en laat het bekerglas 20 minuten ongestoord staan. Haal de objectglazen uit de piranha-oplossing en plaats ze in een objectglashouder met milieuwater.

Gooi ondertussen de piranha-oplossing in een daarvoor bestemde afvalfles. Zodra de slides op kamertemperatuur zijn, spoelt u deze drie keer af met UE-water volgens de procedure voor het reinigen van dekglasjes. Vervang het UE-water in de kleuringsbakjes door methanol. Bewaar de slides en de dekglasjes in methanol.

Bereid ondertussen de amino-eilandisatie-oplossing voor door 100 milliliters methanol in de kolf te gieten. Voeg vervolgens vijf milliliters azijnzuur en drie milliliters drie amino propyl, trimethyl toe, en meng dit voorzichtig door te schudden. Vervang de methanol in de kleuringsbakken met de objectglazen en dekglasjes door het amino-siloisatie-reactiemengsel.

Incubeer gedurende 20 tot 30 minuten en voer tijdens de incubatie eenmaal gedurende één minuut sonicatie uit. Vervang vervolgens de amino-eilandisolatiereactie met methanol. Verwijder daarna de methanol en voeg een verse methanoloplossing toe.

Herhaal deze procedure drie keer voor de eerste ronde van oppervlaktefunctionalisatie. Droog de objectglazen en dekglasjes met stikstofgas. Plaats ze vervolgens in schone pipetdozen die gedeeltelijk zijn gevuld met Milli-Q water, zodanig dat de zijde die gepegyleerd moet worden naar boven is gericht. Voeg daarna 64 µL van de vers bereide reactiebuffer toe aan een bereide PEG-oplossing.

Pipetteer het mengsel meerdere keren op en neer om het volledig op te lossen. Centrifugeer vervolgens gedurende één minuut bij 16.100 G. Om luchtbellen te verwijderen, brengt u 70 µL van het pegyleringsmengsel aan op een gedroogde kwartsglasplaat.

Plaats voorzichtig een gedroogd dekglas over de oplossing en incubeer de objectglazen twee uur tot een nacht in een donkere en vochtige omgeving om de gepegyleerde objectglazen en dekglazen te bewaren. Monteer het objectglas en het dekglas voorzichtig door het dekglas opzij te schuiven en spoel ze af met UE-water voordat ze met stikstofgas worden gedroogd. Plaats een set objectglas en dekglas in een buis van 50 milliliter, zodanig dat de gepegyleerde oppervlakken van elkaar af zijn gericht.

Sluit de buis gedeeltelijk en trek deze vacuüm voordat u deze vult met stikstofgas en de dop stevig vastdraait. Bewaar de buis bij -20 °C. Deze stappen helpen om het gepegyleerde oppervlak gedurende een lange periode te behouden.

Voer een tweede ronde van pegylering uit zoals beschreven in het tekstprotocol, direct voordat de slide wordt gebruikt voor het assembleren van een microfluidische kamer. Plaats een kwartsglaasje op een vlak oppervlak met de gepegyleerde zijde naar boven. Maak een kanaal diagonaal op het gepegyleerde oppervlak door dubbelzijdige plakband over het glaasje aan te brengen.

Zorg ervoor dat de gaatjes in het midden van het kanaal zijn gepositioneerd. Plaats vervolgens voorzichtig een gepegyleerd dekglas bovenop om de kamer te voltooien, met de gepegyleerde zijde naar beneden gericht.

Sluit de kamer af door het dekglas op de plaatsen te drukken waar de dubbelzijdige tape is aangebracht. Doe dit voorzichtig maar grondig, zodat de kamer waterdicht wordt afgesloten. Sluit tenslotte de randen van de kamer af met epoxylijm.

Ga over tot het immobiliseren van streptavidine of neutravidin en voeg gebiotineerde biologische moleculen toe voor single-molecule imaging zoals beschreven in het tekstprotocol; als de oppervlaktebehandeling succesvol is verlopen, zijn er minder dan 10 aspecifiek geabsorbeerde eiwitten per waargenomen beeldveld. Wanneer 1 tot 10 nanomolaire fluorescentielabel-eiwitten aan de kamer worden toegevoegd en een van de reinigings- of reactiestappen niet correct is uitgevoerd, neemt het aantal aspecifiek geabsorbeerde eiwitten significant toe. Als bijvoorbeeld het etsen met piranha-oplossing wordt overgeslagen, wordt er 100 keer meer aspecifieke absorptie waargenomen.

De superieure aard van de dubbele pegylering wordt hier duidelijk aangetoond. De achtergrondsignalen van fluorescente moleculen en de oplossing bleken veel zwakker wanneer dubbele pegylering werd gebruikt, zoals te zien is in het linkerpaneel. Dit wijst erop dat eiwitten effectiever worden afgestoten door de dubbel gepegyleerde laag.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in vier uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Houd er rekening mee dat het werken met AYA uiterst gevaarlijk kan zijn; er moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het dragen van geschikte handschoenen, een veiligheidsbril en een schort tijdens het uitvoeren van deze procedure.