Oppervlaktepassivering voor Single-molecule Protein Studies
24 april 2014
We beschrijven een werkwijze voor het passiveren van een glasoppervlak met polyethyleenglycol (PEG). Dit protocol heeft betrekking op oppervlaktereiniging, oppervlakte functionalisering, en PEG-coating. We introduceren een nieuwe strategie voor de behandeling van het oppervlak met PEG-moleculen in twee rondes, die een superieure kwaliteit van passivering oplevert vergeleken met bestaande methoden.
Het algemene doel van deze procedure is om een gekwaliteerd kwarts-diaoppervlak van superieure kwaliteit op te leveren. Dit wordt bereikt door eerst geboord kwarts-dia's en deksels schoon te maken met water en aceton. Vervolgens wordt de dia met kaliumhydroxide en de piranha-oplossing geëtst om de kwaliteit van het oppervlak te verbeteren.
Vervolgens worden de dia's en deksels gefunctionaliseerd met aminegroepen, gevolgd door twee rondes van oppervlaktebehandeling met een polymeer om het glazen oppervlak inert te maken. De laatste stap is het samenstellen van de microfluïdische kamer uit de dia en de dekslip met de met polyethyleenglycol gecoate of gepegylerde oppervlakken tegenover elkaar. Uiteindelijk verbetert een nieuwe strategie van het behandelen van het oppervlak met peg-moleculen gedurende twee rondes de kwaliteit van de passivatie aanzienlijk, zoals waargenomen door enkelvoudige molecuulfluorescentiemicroscopie.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek of de bestaande technieken zoals polymeercoating na kaliumoxide-etsen is dat deze techniek superieure kwaliteit garandeert. Mensen die nieuw zijn met deze methode zullen worstelen, aangezien er meerdere behandelingen moeten worden uitgevoerd. Om te beginnen, moeten de kwarts-dia's worden geboord zoals beschreven in het protocol in de tekst.
Reinig de dia's door deze in een glazen kleuringsvat te plaatsen. Typisch kunnen vijf tot vijftien dia's in een enkele vat worden geplaatst. Spoel vervolgens de dia's met UE-water na het herhalen van de spoeling drie keer, soniseer de dia's met UE-water gedurende vijf minuten om vuil te verwijderen, gooi het water weg en spoel de dia's nog drie keer met UE-water.
Vervolgens vervangt u het UE-water door aceton en soniseert u de dia's met aceton gedurende 20 minuten of langer, gooit u het aceton weg en spoelt u de dia's met Milli Q-water om eventuele acetonresten te verwijderen. Vervolgens vervangt u het water door één molair kaliumhydroxide en soniseert u de dia's gedurende 20 minuten of langer. Overmatig etsen zal de kwaliteit van het oppervlak verbeteren, maar zal krassen introduceren die interfereren met fluorescentiebeeldvorming.
Spoel de dia's drie keer met Milli Q-water om sporen van kaliumhydroxide te verwijderen om piranha-etsen uit te voeren. Breng de dia's over naar een Duran-diahouder of een op maat gemaakte Teflon-houder en plaats ze in een liter beker die zich in een chemische afzuigkap bevindt. Vul de beker met 450 milliliter zwavelzuur.
Voeg vervolgens 150 milliliter waterstofperoxide toe voor een verhouding van drie tot één tussen zwavelzuur en waterstofperoxide. Roer de oplossing om goed te mengen en laat de beker 20 minuten ongestoord staan. Haal de dia's uit de piranha-oplossing en leg ze in een diahouder met milieuwater.
Ondertussen gooit u de piranha-oplossing in een aangewezen afvalfles. Zodra het de kamertemperatuur bereikt, spoelt u de dia's drie keer met UE-water na het schoonmaken van de dekslips. Vervang het UE-water in de kleuringsvaatjes met methanol. Houd de dia's en deksels in methanol.
Bereid ondertussen de amino-islandisatieoplossing voor door 100 milliliter methanol in de kolf te gieten. Voeg vervolgens vijf milliliter azijnzuur en drie milliliter drie-amino-propyl, trimethyl toe en meng voorzichtig door te schudden. Vervang het methanol in de kleuringsvaatjes met de dia's en deksels met het amino-siloziëringsreactiemengsel.
Incubeer gedurende 20 tot 30 minuten gedurende de incubatie soniseer eenmaal gedurende één minuut. Vervolgens vervangt u de amino-islandisatiereactie door methanol. Gooi vervolgens het methanol weg en voeg een verse methanoloplossing toe.
Herhaal deze procedure drie keer voor de eerste ronde van oppervlaktebehandeling. Gebruik eerst polymeer, droog de dia's en deksels met stikstofgas. Plaats ze vervolgens in schone pipettendozen die gedeeltelijk gevuld zijn met milli Q-water, zodanig dat de zijde, die gepegyleerd moet worden, naar boven gericht is. Voeg vervolgens 64 microliter van de vers bereide reactiebuffer toe aan een voorbereide peg-oplossing.
Pipetteer het mengsel op en neer om het volledig op te lossen. Centrifugeer vervolgens gedurende één minuut bij 16.100 G. Om luchtbellen te verwijderen, druppelt u 70 microliter van het pegyleringsmengsel op een gedroogd kwarts-oppervlak.
Leg voorzichtig een gedroogd deksel over de oplossing, incubeer de dia's in een donkere en vochtige omgeving gedurende twee uur tot een nacht om de gepegyleerde dia's en deksels op te slaan. Demonteer voorzichtig de dia en het deksel door het deksel naar zijn zijde te schuiven en ze met UE-water te spoelen voordat ze worden gedroogd met stikstofgas. Plaats een paar dia en dekslip in een 50 milliliter buis zodanig dat de gepegyleerde oppervlakken van elkaar af staan.
Sluit de buis gedeeltelijk en vacuüm hem voordat u hem vult met stikstofgas en de dop er stevig op schroevt. Bewaar het op min 20 graden Celsius. Deze stappen helpen het gepegyleerde oppervlak gedurende een lange periode te bewaren.
Voer een tweede ronde van pegylering uit zoals beschreven in het tekstprotocol onmiddellijk voordat u de dia gebruikt om een microfluïdische kamer samen te stellen. Leg een kwarts-dia op een vlakke ondergrond met de gepegyleerde zijde naar boven. Maak een kanaal diagonaal op het gepegyleerde oppervlak door dubbelzijdig plakband over de dia te leggen.
Zorg ervoor dat de gaten in het midden van het kanaal zijn gepositioneerd. Leg vervolgens voorzichtig een gepegyleerd dekslip bovenop om de kamer te voltooien. Met de gepegyleerde zijde naar beneden.
Versluit de kamer door het deksel over de gebieden te drukken waar het dubbelzijdige plakband is geplaatst. Doe het voorzichtig maar grondig, zodat de kamer waterdicht wordt afgesloten. Sluit ten slotte de randen van de kam
Overzicht
Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor het passieverende oppervlak van glas met behulp van polyethyleenglycol (PEG). Het protocol omvat oppervlaktereiniging, functionalisatie en een PEG-coatingstrategie in twee rondes die de kwaliteit van de passivatie verbetert.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Oppervlaktepassivatie
- Microfluidica
- Fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- Passivatie is cruciaal voor het verminderen van niet-specifieke binding in fluorescentiebeeldvorming.
- Traditionele methoden bieden mogelijk niet de optimale oppervlaktekwaliteit.
- PEG staat bekend om zijn inerte eigenschappen, waardoor het geschikt is voor deze toepassing.
- Verbeterde oppervlaktebehandelingen kunnen experimentele resultaten verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het reinigen en passieverende van glasoppervlakken.
- Om de effectiviteit van een PEG-behandeling in twee rondes te demonstreren.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden dat onderzoekers kunnen volgen.
Gebruikte methoden
- Reiniging van kwartsplaten met water en aceton.
- Etsen met kaliumhydroxide en piranha-oplossing.
- Functionalisatie van oppervlakken met aminegroepen.
- Toepassing van PEG in twee rondes om een hoogwaardige passivatie te garanderen.
Belangrijkste resultaten
- De PEG-behandeling in twee rondes verbetert de oppervlaktepassivatie aanzienlijk.
- Fluorescentiemicroscopie op enkele moleculen toont verminderde niet-specifieke binding.
- Juiste uitvoering van het protocol levert optimale resultaten op.
- Niet volgen van de stappen kan leiden tot verhoogde niet-specifieke eiwitabsorptie.
Conclusies
- De beschreven methode biedt een superieur alternatief voor passivatie van glasoppervlakken.
- Onderzoekers kunnen betere beeldvormingsresultaten behalen met dit protocol.
- Aandacht voor detail in het reinigings- en behandelingsproces is essentieel.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Surface passivation is a critical enabler for reliable single-molecule protein studies, directly impacting data quality in target interaction assays. Inadequate surface treatment introduces confounding non-specific binding, undermining mechanistic interpretation and increasing false-positive rates in early discovery. This protocol addresses a key technical bottleneck by delivering a robust, reproducible method to generate inert surfaces, thereby improving predictive confidence in downstream screening and validation workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables specific observation of protein-protein and protein-nucleic acid interactions by minimizing surface-induced artifacts.
- Operational Value: Provides a standardized surface preparation method that reduces variability across experiments and laboratories.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports assay readiness by ensuring low background (<10 non-specifically absorbed proteins per imaging area) for accurate ligand binding measurements.
- Operational Value: The two-round PEGylation strategy improves coating consistency, enhancing reproducibility in high-content screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by allowing precise quantification of binding kinetics and affinities in disease-relevant systems.
- Operational Value: Enables long-term storage of passivated slides at -20°C, supporting batch preparation and workflow continuity.
Pipeline & Workflow Integration
This surface passivation method fits within the early discovery continuum, specifically supporting target validation and assay development stages by providing a reliable foundation for single-molecule imaging.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing through clean visualization of specific biomolecular interactions without surface interference.
- Screening: Enables quantitative, reproducible readouts essential for comparing compound effects in primary and secondary screens.
- Analytics: Generates low-background fluorescence data that improves signal-to-noise ratio, facilitating accurate statistical analysis of binding events.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by ensuring that observed interactions reflect true biology rather than assay artifacts.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized surface preparation platform applicable across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing false positives from non-specific surface interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through a well-defined, step-by-step protocol with clear quality benchmarks.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by improving data reliability in early-stage target assessment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by providing higher-quality mechanistic data for lead selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry and fluorescence microscopy to execute multi-step treatments correctly.
- Dependent on access to piranha solution handling equipment and nitrogen gas for drying and storage.
- Necessitates standardized training to ensure consistent amine functionalization and double PEGylation across users.
- Must be adapted to different slide materials (e.g., quartz vs. standard glass) while maintaining PEG density and passivation quality.
- Limited by the hazardous nature of piranha solution, requiring strict safety protocols and waste management procedures.
