Patch Clamp Recordings van embryonale zebravis Mauthner Cells
10 september 2013
We hebben een intacte hersenen ruggenmerg voorbereiding voor het vastleggen en bewaken elektrische activiteit via patch clamp opname van de Mauthner neuronen en andere reticulospinal cellen in de zebravis embryo's ontwikkeld. Zo zijn wij in staat om prikkelende en remmende synaptische stromen, voltage-gated kanaal activiteit en actiepotentialen opnemen van belangrijke neuronen in een zich ontwikkelende embryo.
Het algemene doel van deze procedure is om de synaptische en excitabiliteitseigenschappen van embryonale zebravismondcellen te registreren. Dit wordt bereikt door eerst het zebravisembryo te disseceren om de ventrale oppervlakte van de achterhersenen bloot te leggen. De tweede stap is om de gedissecteerde voorbereiding op de stage van een patch clamp-microscoop te plaatsen en de mond in hun cellen te identificeren.
Volgende patch. Klem op de M-cellen met behulp van de juiste opnamemodus en registreer synaptische activiteit en excitabiliteitseigenschappen. De laatste stap is om de geregistreerde gegevens te analyseren om synaptische of excitabiliteitseigenschappen vast te stellen.
Uiteindelijk wordt patch clamping van deze cellen gebruikt om de eigenschappen van synaptische receptoren in een zich ontwikkelend organisme te tonen. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode twee hoofdproblemen ondervinden. De eerste is het disseceren.
De tweede vorming van de gig-scène kan een uitdaging zijn. Ik had voor het eerst het idee voor deze methode toen ik besloot om aan een zebravisvoorbereiding te werken waarbij de achterhersenen aan het ruggenmerg waren bevestigd, en demonstreer dat de procedure zal zijn burram Roy, een promovendus in mijn lab, Begin met deze procedure door de dissectieschaal voor te bereiden die bekleed is met Sard. Bevestig eerst de onderlegschijfjes met vet op de schuif.
Voeg vervolgens vloeibare sard toe aan het midden van de onderlegschijfjes. De sard hardt meestal een nacht uit en vormt een kleine cirkelvormige bedding op de glazen plaat, die de basis van de dissectieschaal wordt. Plaats na het plaatsen van een dekglas op de schuif deze in de opnamekamer om als basis voor de dissectie te dienen.
Bereid vervolgens de vereiste oplossingen. De extracellulaire oplossingen moeten op kamertemperatuur worden gelaten, terwijl de intracellulaire oplossingen steriel moeten worden bewaard. Men kan ook 0,1% losse gele kleurstof toevoegen aan de intracellulaire oplossing, zodat visualisatie van de M-celmorfologie kan worden uitgevoerd aan het einde van het experiment om de identiteit van de cel te bevestigen.
Kweek vervolgens de wilde zebravisembryo's op in eierwater bij 28,5 graden Celsius en verzamel en stadia volgens de vorige publicatie. Voor dissectie brengt u de embryo's over naar de dissectieschaal die ook als opnamekamer dient. Vervolgens worden ze gedurende zeven tot 10 minuten verdoofd.
In een verdoovend zout oplossing die fysiologische zoutoplossing benadert, kan men bepalen of ze voldoende verdoofd zijn door de reactie op een zachte staartprik te onderzoeken. Speld vervolgens de embryo's door de no accord en op de SIL-beschermlijn schaal met 0,001 inch wolfraamdraad onder een dissectiemicroscoop met 25 x vergroting. Pas de vergroting op de dissectiescoop aan tot 40 tot 50 x om de dissectie uit te voeren.
Verwijder nu de kaakogen en voorhersenen met behulp van een fijne tang. Schil voorzichtig de achterhersenen los van de onderliggende knoopsnaar door de tang voorzichtig tussen de knoopsnaar en de hersenen te werken. Draai vervolgens voorzichtig de achterhersenen om, zodat de ventrale oppervlakte naar boven wijst.
Deze positionering biedt goede toegang tot de M-cellen, die zich meestal binnen vijf tot tien micrometer van het ventrale oppervlak bij jonge embryo's en 20 tot 50 micrometer bij oudere larven bevinden. Verplaats vervolgens voorzichtig de voorbereiding naar de opnameopstelling waar de patch clamp-experiment kan worden uitgevoerd. De M-cellen worden gevisualiseerd met differentiële interferentiecontrast, hoewel andere beeldvormingsmodi ook kunnen worden gebruikt om voorbereidingen te maken voor patch clamping.
Begin met het trekken van enkele patch CLA-pijpjes met dunne wanden van siliquaatglas. In een horizontaal getrokken pijpje zijn de tipdiameters ongeveer 0,2 tot 0,4 micrometer na vuurpolijsten tot een gladde rand, en de schachtverloop is ongeveer vier millimeter lang. Vul de pijpjetip met intracellulaire oplossing door de tip in de intracellulaire vloeistof te dompelen.
Plaats vervolgens een spuitnaald in het pijpje en verdrijft voorzichtig de intracellulaire oplossing uit de spuit. Om het pijpje te vullen, bevestigt u het pijpje aan de hoofdfase van de versterker. In de elektrofysiologische opstelling is het belangrijk om de hoofdfase ongeveer 45 graden ten opzichte van de horizontale as te houden, omdat dit zorgt voor een ingangshoek van het pijpje die geschikt is voor de vorming van hoge weerstandsafdichtingen met de mond in hun cel. Vlak voordat het pijpje in de badoplossing daalt, brengt u een kleine hoeveelheid positieve druk aan op het pijpje om de kans op het blokkeren van de tip te verkleinen. Ga door met het naderen van de M-cel met een kleine hoeveelheid positieve druk in het pijpje.
De positieve druk duwt de cel voorzichtig van kant naar kant en wanneer het direct boven de cel wordt gepositioneerd, vormt het een kleine kuiltje op het celmembraan. Laat het pijpje nu een paar seconden op zijn plaats liggen om het celoppervlak voorzichtig te reinigen, zodat er een sterke afdichting tussen het pijpje en het membraan kan worden gevormd. Laat vervolgens de positieve druk in het pijpje los om de afdichting te starten.
Een kleine hoeveelheid negatieve druk gekoppeld aan een negatief pijpjepotentiaal resulteert in giga-afdichtingen die binnen enkele seconden worden gevormd. Verander vervolgens het houdpotentiaal in de versterker naar min 60 millivolt. Brek de celmembraan met een reeks korte zuigpulsen.
Neem vervolgens onmiddellijk membraanpotentialen op en minimaliseer condensatorartefacten. Compenseer de celcapaciteit en toegangsweerstand met 70 tot 85%De toegangsweerstand moet elke 30 seconden tot een minuut worden gecontroleerd, en als er een verandering van 20%of meer is, moet het experiment worden afgebroken. Zodra het experiment is afgelopen en er voldoende gegevens zijn verzameld, offert u het embryo op door de achterhersenen te verwijderen met een paar pincetten.
Deze figuur toont de representatieve opnames van excitatoire A MPA en N
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het registreren van elektrische activiteit van Mauthner-neuronen en reticulospinale cellen in zebravissenembryo's met behulp van een intacte hersenen-ruggenmergpreparaat. De techniek maakt analyse mogelijk van synaptische stromen, voltage-afhankelijke kanaalactiviteit en actiepotentialen in ontwikkelende neuronen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Zebravissenembryo's zijn waardevol voor het bestuderen van de neuronale ontwikkeling.
- Mauthner-neuronen spelen een cruciale rol bij de ontsnappingsreactie.
- Patchclamp-technieken zijn essentieel voor het onderzoeken van synaptische eigenschappen.
- Het begrijpen van synaptische activiteit is cruciaal voor inzichten in neurale circuits.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het registreren van neuronale activiteit in zebravissenembryo's.
- Het onderzoeken van de exciterende en inhiberende synaptische stromen in sleutelnueronen.
- Het analyseren van de eigenschappen van synaptische receptoren tijdens de embryonale ontwikkeling.
Gebruikte methoden
- Dissectie van zebravisembryo's om de rhombencephalon bloot te leggen.
- Gebruik van patchclamp-microscopie om registraties te maken van Mauthner-neuronen.
- Toepassing van specifieke oplossingen voor de intracellulaire en extracellulaire omgevingen.
- Data-analyse om synaptische eigenschappen en exciteerbaarheid vast te stellen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle registraties van exciterende en inhiberende synaptische stromen.
- Karakterisering van spanningsafhankelijke kanaalactiviteit in ontwikkelende neuronen.
- Identificatie van synaptische receptoreigenschappen in embryonale zebravis.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methode voor toekomstige elektrofysiologische studies.
Conclusies
- De ontwikkelde methode is effectief voor het bestuderen van neuronale activiteit in zebravissenembryo's.
- De verkregen inzichten kunnen het begrip van de neurale ontwikkeling verbeteren.
- Deze aanpak kan verder onderzoek naar synaptische mechanismen faciliteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Patchclamp-registraties van embryonale Mauthner-cellen van de zebravis maken directe meting van de synaptische receptorfunctie in een ontwikkelend vertebraten zenuwstelsel mogelijk. Deze benadering ondersteunt targetvalidatie door kwantitatieve gegevens te leveren over excitatoire en inhibitoire neurotransmissie tijdens kritieke fasen van de neurodevelopmentale ontwikkeling. De intacte hersen-ruggenmergpreparatie behoudt de natuurlijke circuits, wat het voorspellende vertrouwen in mechanistische studies naar synaptische plasticiteit en receptorfarmacologie vergroot.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoek therapeutische hypothesen door het meten van AMPA- en NMDA-gemedieerde excitatoire stromen en GABA/glycine-gemedieerde inhibitoire stromen in ontwikkelende Mauthner-cellen.
- Operationele waarde: Maak biologische risicoreductie mogelijk via functionele validatie van synaptische receptorexpressie en -activiteit in een natuurlijke cellulaire context.
- Wetenschappelijke waarde: Versterk het voorspellend vertrouwen door synaptische ontwikkeling op single-cell niveau over preparaten heen te volgen, waardoor variabiliteit in mechanistische interpretaties wordt verminderd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereid gevalideerde biologische systemen voor voor downstream workflows door baseline synaptische stroomamplitudes en kinetiek in embryonale neuronen vast te stellen.
- Operationele waarde: Pak assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan via consistente dissectie-, registratie- en analyseprotocollen die functionele synaptische verbindingen behouden.
- Wetenschappelijke waarde: Benadruk de screeningbereidheid en het hergebruik van het platform door het mogelijk te maken om bij verschillende preparaties terug te keren naar hetzelfde celtype (Mauthner-cel) voor longitudinale studies naar synaptische ontwikkeling.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreek de relevantie voor ziekten en de afstemming van translationele biomarkers door synaptische stroommetingen te koppelen aan neuro-ontwikkelingsprocessen die relevant zijn voor modellen van neurologische aandoeningen.
- Operationele waarde: Beschrijf de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door embryonale zebravis te gebruiken als een ziekterelevant systeem voor studies naar target engagement in een vroege fase.
- Wetenschappelijke waarde: Focus op de waarde van predictieve risicovermindering door de activiteit van voltage-afhankelijke kanalen en synaptische receptoreigenschappen te karakteriseren die ten grondslag liggen aan mechanismegebaseerde screening van verbindingen.
Integratie van pipeline en workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm van vroege ontdekking tot lead-identificatie door elektrofysiologische readouts te bieden die inzicht geven in target-engagement en het werkingsmechanisme in ontwikkelende neuronale systemen.
- Ontdekkingsbiologie: Leg uit hoe de methode hypothesetoetsing, pathway-verduidelijking of biologische risicovermindering ondersteunt door het vastleggen van synaptische en exciteerbaarheidseigenschappen van Mauthner-cellen in een intacte preparatie van de achterhersenen en het ruggenmerg.
- Screening: Beschrijf de assay-gereedheid, reproduceerbaarheid of kwantitatieve outputs, indien ondersteund door het artikel, via de meting van spontane en opgewekte excitatoire en inhibitoire postsynaptische stromen onder farmacologische isolatie.
- Analytica: Benadruk metingen, read-outs of statistische outputs die teams helpen om condities te vergelijken door membraanpotentialen, capaciteit, toegangsweerstand en synaptische stroomamplitudes en -kinetiek te analyseren.
- Translationeel onderzoek: Verbind de methode met preklinische continuïteit of biomarker-afstemming enkel wanneer de bron dit ondersteunt door de studie van synaptische ontwikkeling in een gewervde modelorganismen met relevantie voor de menselijke neuro-ontwikkeling mogelijk te maken.
- Bedrijfsmatige hergebruikbaarheid: Presenteer de methode als een herbruikbare capaciteit in plaats van een eenmalige techniek door de nadruk te leggen op het vermogen om voor consistente longitudinale analyse terug te keren naar dezelfde celtype-preparatie (Mauthner-cel).
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen, validatie van targets en vermindering van mechanistische ambiguïteit in de functie van synaptische receptoren tijdens de ontwikkeling.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door gedefinieerde stappen voor dissectie, registratie en analyse die intacte synaptische verbindingen behouden.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium door vroegtijdige beoordeling van compound-effecten op de neuronale exciteerbaarheid en synaptische transmissie tijdens de ontwikkeling mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling via kwantitatieve gegevens over synaptische stromen, waardoor targets betrokken bij neurodevelopmentale pathways minder risicovol worden.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in neurodissectie, patchclamp-elektrofysiologie en farmacologische isolatie van synaptische stromen.
- Behoefte aan instrumentatie en analytische infrastructuur, waaronder een patchclamp-microscoop, versterker, perfusiesysteem en differentieel interferentiecontrast-optiek.
- Eisen voor standaardisatie tussen teams voor embryo-stadiëring, dissectietechniek en criteria voor seal-vorming om de vergelijkbaarheid van gegevens tussen experimenten te waarborgen.
- Overwegingen voor aanpassing over modelsystemen vanwege verschillen in neuronale grootte, toegankelijkheid en synaptische samenstelling tussen embryonale zebravis en andere vertebraten-preparaten.
- Praktische beperkingen ondersteund door bronmateriaal, waaronder de technische uitdaging van dissectie en gigaseal-vorming, met name voor onderzoekers die nieuw zijn met deze methode.
