Name: Patch Clamp Recordings van embryonale zebravis Mauthner Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-10T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Leer patch clamp-opnames van Mauthner-neuronen in embryonale zebrafish voor elektrofysiologisch onderzoek. Deze methode analyseert synaptische stromen en spanningsafhankelijke kanalen in ontwikkelende zenuwcellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Natuurwetenschappen en Engineering Research Council of Canada (NSERC) en de Canadese Stichting voor Innovatie (CFI) aan DWA.

1. Voorbereiding en Dissection <ol><li> Bereid het ontleden schotel bekleed met Sylgard. Opnemen kamers van WPI (Sarasota, Florida, USA; Leveranciers worden in tabel 2) worden gebruikt als het ontleden van gerechten (figuur 1). De kamers zijn ontworpen om glasplaatjes tegemoet en kleine plastic ringen worden gebruikt als mallen voor de Sylgard. De ringen worden eerst bevestigd aan de slede met vet en vloeibare Sylgard wordt toegevoegd aan het midden van de ring. De Sylgard zal nachts genezen en als het dit doet, vormt een kleine, ronde bed op de glasplaatje, die de basis van het ontleden schotel wordt. Het objectglaasje wordt geplaatst in de opname kamer en dient als de basis van de kamer waarop het preparaat is aangebracht (figuur 1). </li><li> Bereid de in tabel 3 opgesomde. Extracellulaire oplossingen moeten op kamertemperatuur gelaten terwijl intracellulaire oplossing steriel moet blijven. Men kan ook Lu toevoegencifer geel (0,1%) aan de intracellulaire oplossing, zodat visualisatie van M-celmorfologie aan het einde van het experiment kan worden uitgevoerd. Dit dient om celidentiteit (figuur 2) bevestigen. </li><li> Verhogen wild type zebravis embryo&#39;s in ei water bij 28,5 ° C, en het verzamelen en het stadium volgens Kimmel et al.. 10. Voor dissecties, transfer embryo&#39;s naar de ontleden gerecht dat ook dienst doet als de opname kamer. Verdoven voor 7-10 min in een verlamming zoutoplossing (0,02% tricaïne; oplossing 1, tabel 3) die nauw benadert fysiologische zoutoplossing. Men kan bepalen of deze voldoende zijn verdoofd door het onderzoeken van de reactie op een zachte staart knijpen. </li><li> Pin het embryo door het notochord en op de Sylgard gevoerde schaal met 0,001 &quot;wolfraamdraad (Scientific Instrument Services. Inc Ringoes, NJ, USA) met 25x vergroting op een dissectie microscoop (Figuur 1). Het wolfraamdraad is gemakkelijk te snijden inom kleine segmenten met fijne ontleden schaar. </li><li> Pas de vergroting op het ontleden scope 40-50X aan de dissectie uitvoeren. Zodra het embryo wordt vastgemaakt aan de schotel, de kaak, ogen en voorhersenen worden verwijderd met behulp van een fijne pincet (Dumont # 5). </li><li> De achterhersenen wordt voorzichtig weg van de onderliggende notochord gepeld door zorgvuldig werken de tang tussen de notochord en de hersenen. De achterhersenen wordt vervolgens voorzichtig omgedraaid zodat het ventrale oppervlak naar boven gericht. Deze positionering biedt een goede toegang tot de M-cellen, die meestal binnen 5-10 micrometer van het ventrale oppervlak in jonge embryo&#39;s en ~ 20-50 micrometer in oudere larven (Figuur 2A). </li><li> Verplaats de voorbereiding zorgvuldig om de opname setup waar de patch clamp experiment kan worden uitgevoerd. De M-cellen worden gevisualiseerd met Nomarski Differentieel Interferentie Contrast (DIC), hoewel andere vormen van beeldvorming (dwz Hoffman modulatie contrast of Dodt Gradient Contrast Imaging uitLuigs en Neumann, Duitsland) kunnen ook worden gebruikt. </li></ol> 2. Patch Clamp Recording (Whole Cell Mode) <ol><li> Alle opnamen worden uitgevoerd in de hele cel patch clamp-modus 11. Opnemen kamers worden op een microscoop podium geplaatst in een elektrofysiologie setup. Onze podia zijn vast en de opstaande patch clamp microscoop is vastgeschroefd aan een beweegbare microscoop platform of een microscoop vertaler. </li><li> Patch clamp pipetten worden getrokken op een horizontale trekker (P-97; Sutter Instruments Co) uit dunwandige, borosilicaat glas verkregen uit WPI. Pipetpunt diameters zijn in de orde van 0,2-0,4 micrometer na brand polijsten tot een gladde rand, en de schacht taper is ~ 4 mm in lengte. </li><li> Bevestig de pipet om de versterker hoofd-fase in de elektrofysiologie setup. Het is belangrijk om het hoofd-fase te houden op ongeveer 45 ° hoek met de horizontale as, omdat dit zorgt voor een inloophoek van de pipet die geschikt is voor de vorming van hoge weerstand afdichtings op de Mauthner cel. </li><li> Vlak voor het bad oplossing, breng een kleine hoeveelheid positieve druk om de pipet om de kans op vervuiling van de tip te verminderen. Bij het ​​opnemen mEPSCs, bad oplossingen omvatten 1 uM TTX om actiepotentialen, 5 uM strychnine om glycine receptoren en 10 uM bicuculline of 100 uM picrotoxine aan GABA A-receptoren blokkeren blokkeren blokkeren. Bij het opnemen mIPSCs, bad oplossingen omvatten 1 uM TTX, kynurenic zuur en ofwel bicuculline of strychnine, afhankelijk van de receptor van belang is. </li><li> Nader de M-cel met een kleine hoeveelheid positieve druk in de pipet. De positieve druk zachtjes duwt de cel van links naar rechts en toen meteen gepositioneerd boven de cel, vormt een klein kuiltje op het celmembraan. Laat de pipet aanwezig voor een paar seconden voorzichtig schoon celoppervlak zodat een sterke afdichting tussen de pipet en het membraan kan worden gevormd. Het loslaten van de positieve druk in de pipetkan de afdichting wordt ingeleid en een kleine hoeveelheid onderdruk in combinatie met negatief pipet potentieel resulteert in GigaΩ verbindingen die binnen enkele seconden. </li><li> Wijzig het bedrijf potentieel van de versterker tot -60 mV. Scheuren het celmembraan een reeks korte pulsen van zuigkracht. Membraanpotentialen onmiddellijk opnemen en minimaliseren capaciteit artefacten. Compenseer cel capacitieve (C m) en toegang (serie) weerstand (R a) met 70-85%. R een moet regelmatig gecontroleerd worden, elke 30 seconden tot een minuut, en als er een verandering van 20% of meer, breek het experiment. </li><li> Nadat het experiment beëindigd en voldoende gegevens zijn verkregen, wordt het preparaat opgeofferd door verwijdering van de achterhersenen met een pincet. Op dit punt kan gegevensanalyse beginnen. </li></ol>

<ol><li>Korn, H., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mauthner+cell+half+a+century+later%3A+a+neurobiological+model+for+decision-making%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Mauthner cell half a century later: a neurobiological model for decision-making.</a> Neuron. 47, 13-28 (2005).</li>
<li>Ali, D. W., Buss, R. R., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+miniature+glutamatergic+EPSCs+in+neurons+of+the+locomotor+regions+of+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Properties of miniature glutamatergic EPSCs in neurons of the locomotor regions of the developing zebrafish.</a> J. Neurophysiol. 83, 181-191 (2000).</li>
<li>Ali, D. W., Drapeau, P., Legendre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+spontaneous+glycinergic+currents+in+the+Mauthner+neuron+of+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Development of spontaneous glycinergic currents in the Mauthner neuron of the zebrafish embryo.</a> J. Neurophysiol. 84, 1726-1736 (2000).</li>
<li>Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+recording+from+identifiable+neurons+of+the+locomotor+network+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).</li>
<li>Patten, S. A., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptors+associated+with+zebrafish+Mauthner+cells+switch+subunits+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development.</a> J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).</li>
<li>Patten, S. A., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKCgamma-induced+trafficking+of+AMPA+receptors+in+embryonic+zebrafish+depends+on+NSF+and+PICK1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S+.A%22%5BJournal%5D)">PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S .A. 106, 6796-6801 (2009).</li>
<li>Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphants%3A+a+new+systematic+vertebrate+functional+genomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Morphants: a new systematic vertebrate functional genomics approach.</a> Yeast. 17, 302-306 (2000).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li>
<li>Tallafuss, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+gene+function+ON+and+OFF+using+sense+and+antisense+photo-morpholinos+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Turning gene function ON and OFF using sense and antisense photo-morpholinos in zebrafish.</a> Development. 139, 1691-1699 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Patten, S. A., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptors+associated+with+zebrafish+Mauthner+cells+switch+subunits+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development.</a> J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. 1, 5, University of oregon Press. (2007).</li>
<li>Patten, S. A., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKCgamma-induced+trafficking+of+AMPA+receptors+in+embryonic+zebrafish+depends+on+NSF+and+PICK1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6796-6801 (2009).</li>
<li>Patten, S. A., Roy, B., Cunningham, M. E., Stafford, J. L., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+Cgamma+is+a+signaling+molecule+required+for+the+developmental+speeding+of+alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate+receptor+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein kinase Cgamma is a signaling molecule required for the developmental speeding of alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate receptor kinetics.</a> The European Journal of Neuroscience. 31, 1561-1573 (2010).</li>
<li>Kinkhabwala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+and+functional+ground+plan+for+neurons+in+the+hindbrain+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1164-1169 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

De hierboven beschreven protocol maakt het mogelijk om klem opnemen patch uit de M-cellen en homologen daarvan. De techniek is uitdagend en zorg moeten worden genomen in een aantal belangrijke gebieden in de hele procedure. We zullen nu bespreken een aantal van deze gebieden en biedt nuttige tips om succes te garanderen. De bouw van het ontleden / opname kamer is een cruciaal aspect van het experiment. De M-cellen zijn moeilijk te zien tenzij differentieel interferentie contrast wordt gebruikt. DIC Nomarski werkt het beste als schone glazen dekglaasjes, maar wij hebben gevonden dat een zeer dunne laag Sylgard (~ 1-2 mm) niet verstoren de DIC zodanig dat het interfereert met de identificatie van de M-cellen. Daarom gebruiken we een opname kamer dat een dunne glazen dekglaasje op de bodem waarop wordt geplaatst een klein plastic ring (~ 5 mm diameter) heeft. We mengen Sylgard 184 in een petrischaal en voorzichtig de vloeistof Sylgard aan de binnenkant van de ring met een Pasteur pipet. De Sylgard kan worden uitgehard bij kamertemperatuur gedurende enkele dagen of kunnen voor een snelle uitharding worden verwarmd. De wasmachine kan worden verwijderd nadat de Sylgard is uitgehard, hoewel dit niet noodzakelijk. Zodra de dissectie / opname kamer is gemaakt, kan het worden gebruikt voor een aantal weken voordat een frisse-Sylgard omzoomde glasplaatje nodig is. De volgende stap in de procedure is om alle documenten op die relevante oplossingen op de dag van het experiment (tabel 3). Intracellulaire oplossingen die alles behalve ATP en GTP zijn worden vooraf opgeslagen in 5 ml porties bij -20 ° C. Op de dag van het opnemen van een monster ontdooid tot kamertemperatuur en vers ATP en GTP toegevoegd. De oplossing wordt op 280 mOsm en pH 7.4. In onze handen, vinden we dat de toevoeging van verse ATP en GTP dagelijks goede resultaten bij opnamen. Alle oplossingen nodig hebben voor de beste kans van slagen steriel worden gehouden. Intracellulaire oplossingen moeten worden gefilterd througha 0,22 pm filter (Sigma) tot kleine deeltjes en puin dat de opname zou kunnen beïnvloeden te verwijderen. Om dit te doen, moeten we eerst de intracellulaire oplossing te trekken in een 1 ml spuit, bevestig de filter aan het einde van de injectiespuit en voeg een plastic pipet tip dat verwarmd was en trok naar fijne punt, tot het einde van het filter. Dit laat ons toe om de gefilterde intracellulaire oplossing rechtstreeks aan op de binnenzijde van het glas patch pipetten. Zodra de oplossingen worden bereid, kan het embryo worden verdoofd en ontleed. Voorafgaand aan de dissectie, moet ervoor worden gezorgd dat de leeftijd van het organisme adequate beoordeling. Elk embryo binnen een koppeling leeftijden op een iets ander tarief. Daarom is bij de beoordeling van de leeftijd van het organisme belangrijke daartoe volgens vastgestelde procedures 10,13, met fenotypische signalen zoals het aantal somieten, de algemene vorm van het lichaam en de tijd ei bevruchting. Alle ontledingen worden uitgevoerd met een Dumont # 5 prima paarforceps. Deze moeten scherp zijn en in goede staat anders zal het erg moeilijk zijn om de huid te bedekken de achterhersenen en eventuele bindweefsel op het ventrale oppervlak van de achterste hersenen te verwijderen. We hebben vaak aan de tang te scherpen na een paar weken gebruik, en doe dit zelf met een slijpsteen. Om de vis vastmaken aan de dunne laag van Sylgard gebruiken we pinnen ouderwets uit fijne wolfraam draad 0,001 inch in diameter. De pennen zijn gesneden met een oude, micro-dissectie schaar onder een dissectie microscoop, en zijn klein genoeg om dwars door de notochord. Pinning de embryo&#39;s op een ander punt hen niet te immobiliseren en maakt dissecties bijna onmogelijk om uit te voeren. Bij de eerste leren de opnamen uit te voeren, kan het moeilijk zijn identiteit M-cel homologen zijn (vooral Mid2 cm dat zich in het naburige rhombomere - rhombomere 5). In sommige embryo beide paren cellen blijken vergelijkbaar in grootte. De otolieten provide een handig herkenningspunt om te helpen bij de identificatie van M-cellen. Op 48 HPF de M-cellen bevinden zich direct naast de otolieten, en hoewel de otolieten tijdens de dissectie worden verwijderd, ze achter een licht beschadigde laterale gebied van de achterhersenen, die dient als een marker voor hun oorspronkelijke positie te verlaten. Transgene vis die GFP of een andere fluorescente marker in de M-cel te uiten, zorgen voor een uitstekende voorbereiding van nieuwe onderzoekers. In onze handen de M-cellen een membraan capaciteit van ongeveer 18-24 pF 48 HPF, terwijl de kleinere homologen dichter bij 12-14 pF. Cellen met groter oppervlak hebben grotere membraancapaciteit waarden (gemeten in pico Farad (pF)) vergeleken met kleinere cellen. Aldus kan membraancapaciteit worden gebruikt als een ruwe indicator voor de celgrootte, waar grotere cellen groter capaciteitswaarden. Deze elektrofysiologische kenmerk dient als een andere eigenschap waarmee de M-cel kan worden geïdentificeerd uit homologen daarvan. Tenslotte gebruiken wij vaak Lucifer geel in onze opname (intracellulair) oplossingen, die ons in staat stelt om een ​​stevige identificatie van het type cel onderzochte gedraging met behulp van fluorescentie beeldvorming eenmaal opnames zijn voltooid. Pipettip weerstanden in de range van 3,5-4,5 MQ zijn het beste compromis tussen tip formaat en lage toegang weerstand, die meestal varieert van 8 tot 15 MQ. Dit is bijzonder belangrijk voor gebeurtenissen met snelle kinetiek, ~ 0,1 msec (20-80%) stijgtijden en ~ 0,5 msec exponentieel verval 12,14,15 (Figuren 3A en 3B). De gegevens worden verkregen tegen een digitalisering snelheid van 50-100 kHz en gefilterd met een low pass frequentie van 5-10 KHz. Wat de patch pipetten hebben wij gevonden dat ze niet hoeven bij brand gepolijst om een ​​opname te verkrijgen, maar anekdotische lijkt iets meer kans voldoend goede afdichting tegen ongepolijste pipetten bieden. Aangezien de pipet tips zijn relatief groot, hebben we niet toe very veel positieve druk aan de pipet voordat de oplossing. Het vergt oefening beslissen over de juiste hoeveelheid positieve druk toe te passen als een overmaat druk zal de cel teveel bewegen en voorkomt afdichting ontstaan. Het kan ook schade synaptische contacten de cel voorzichtig verplaatst vanuit de oorspronkelijke positie. Anderzijds, ofwel te weinig druk resulteert in vuile tips en het oppervlak van de cel en hebben een goede afdichting te vormen reinigen. Een gulden middenweg wordt alleen bereikt door aanzienlijke oefening en ervaring. Seal vorming kan worden uitgebreid met toepassingen van negatieve spanningen aan de pipet. We hebben meestal zegels van 1,2-2 GQ, die uitstekend voor doorbraken in de gehele cel mode zijn. Als farmacologische middelen moeten worden toegepast op de cel cytoplasma, we vermelden in intracellulaire oplossing voor het vullen van de pipet. Zorg moeten worden genomen bij het opstellen van de pipet oplossingen om het verlies van de agenten te voorkomendoordat het binden aan de 0,22 urn filter. Daarom filteren we de intracellulaire medium eerste, en voeg vervolgens voorzichtig de farmacologisch middel om de gefilterde oplossing. Toepassing van verbindingen naar het intracellulaire compartiment heeft zijn eigen unieke reeks van uitdagingen. Bijvoorbeeld, toevoeging van geneesmiddelen aan het intracellulaire medium vermindert doorgaans de kans op het vormen van een afdichting GQ, maar niet tot het punt waar het een belangrijke belemmering voor het experiment. Men moet zich realiseren dat de toepassing van farmacologische middelen op deze wijze niet mogelijk de experimentator om de meest geschikte besturing vastleggen omdat de agent heeft onmiddellijk toegang tot de cel vanaf het begin van de gehele cel configuratie. Daarom, terwijl wij de gegevens in dit type experiment opnemen, moet men zich ervan bewust dat de volgende beste controle is de intracellulaire toepassing van een inactieve vorm van de agent. In veel gevallen neemt dit de vorm van een hitte-geïnactiveerd verbinding, een scrambled peptide or een inactieve isomeer verkregen van de leverancier. We verwerven gegevens in de vorm van synaptische stromen (mPSCs), voltage-gated stromingen en actiepotentialen. Miniatuur stromen kunnen worden geanalyseerd door een paar uitstekende programma (PClamp, Axograph, enz.), hoewel we liever Axograph X (John Clements) gebruikt. Axograph X draait op zowel Windows-als Macintosh-platformen en kan gebruikt worden voor zowel het verwerven en analyseren van elektrofysiologische gegevens. mEPCs worden verkregen met behulp van een sjabloon keuze van de experimentator, verkregen uit de opname zelf. Individuele wedstrijden kunnen worden geanalyseerd voor eigenschappen zoals stijging van de tijd, amplitude, halve breedte en verval tijd, enz. Wij exporteren de spreadsheet van gegevens aan Kaleidagraph (Synergy Software) waar we cijfers, inclusief kopieën van het evenement sporen uit Axograph X. kan produceren Een van de moeilijkste aspecten van het experiment is het bepalen of de opname goed genoeg schoon te bepalen werd uitgevoerd,betrouwbare gegevens. Zo kan de ruimte klemmen problemen ontstaan ​​bij het opnemen mPSCs van M-cellen die grote axonen en uitgebreide dendritische processen. Wanneer spanning klemmen, kan men in het algemeen regelen de spanning aan de punt van de pipet redelijk (vooral als de toegang weerstand (Ra) is laag), maar kan goede beheersing van de membraanpotentiaal niet in dendritische processen of axons die zijn ver weg van de pipet tip. Een werkwijze voor het bepalen of de cel was goed ruimte geklemd is een spreidingsdiagram van de stijgtijd vs de amplitude van de mPSCs die werden opgenomen produceren. Een correlatie tussen de gegevens suggereerden onvoldoende ruimte klemmen. Met andere woorden, als de ruimte klem slecht dan mPSCs die dicht bij de pipet later zal snellere stijgtijden en amplitudes groter dan gebeurtenissen enige afstand van de pipet. Als een correlatie bestaat, worden de gegevens problematisch en kan niet worden gebruikt. Een ander aspectvan elektrofysiologische opnames die moet worden aangepakt, is dat van lekstromen. Dit geldt vooral wanneer de spanning klemmen van een cel om de spanningsafhankelijke stromen zoals Na + of K + stromen nemen. Wanneer de membraanpotentiaal wordt afgeweken van de rest, kan lekstromen worden opgenomen samen met spanningsafhankelijke activiteit. Lekstromen (I L), een combinatie van kalium (K I), natrium (Na I) en chloride (Cl I) stroom via niet-spanningsafhankelijke kanalen zullen de activiteit plaats verhullen en moet worden afgetrokken van de opname. De versterker is in staat om deze functie online tijdens de opname door het uitvoeren van wat typisch zogenaamde P / N protocol. Tijdens een P / N-protocol zal de versterker een aantal kleine depolarisaties (of hyperpolarizations) loopt van rust en zal het resulterende lekstroom die optreedt opnemen. Belangrijk is klein genoeg pulsen die niet spanningsafhankelijke kanalen niet activeert gebruiken. De huidiges die optreden tijdens deze pulsen worden geregistreerd en gemiddeld zodat deze lekstromen kunnen worden afgetrokken van de voltage-gated kanaal activiteit. Tenslotte moet men rekening houden met de mogelijke splitsing, die optreedt bij de punt van de elektrode tussen de intracellulaire en extracellulaire oplossing. Intracellulaire en extracellulaire oplossingen bestaan ​​typisch uit verschillende ionen, met verschillende activiteiten en mobiliteiten. Grotere ionen met een lagere mobiliteiten biedt meer weerstand te ionenbeweging dan kleinere en dit kan leiden tot een kleine maar significante potentiaalverschil op de kruising van de oplossingen. Deze kruising potentieel moet rekening worden gehouden bij het bepalen van de juiste spanningen ervaren door de cel. De hier gepresenteerde techniek is gebruikt door ons labo jaren. Er zijn alternatieve methoden voor het registreren van de M-cellen. Het meest opvallend is, Joseph Fetcho en zijn collega&#39;s ontwikkelened een uitstekende voorbereiding waarin men kan nemen van de M-cellen van oudere larven (4-5 dagen oud) in een minder invasieve manier dan hier, waar het M-cel wordt benaderd vanuit het dorsale oppervlak 16 gepresenteerd. We hadden een soortgelijke techniek geprobeerd maar vond het gemakkelijker om de M-cel benaderen van de ventrale zijde van de achterhersenen, waarbij de cel dichter bij het ​​oppervlak van de hersenen, vooral bij jonge vissen (bijvoorbeeld 24 tot 72 HPF HPF). Voorts is een benadering van het dorsale oppervlak vereist gewoonlijk het gebruik van een transgene lijn die een fluorescerend label uit in de M-cellen, die het potentieel om extra variabelen introduceren in de opname. Dit probleem is niet aanwezig bij het gebruik van wild type vis. Echter, met de hier gepresenteerde techniek worden we beperkt tot het bestuderen jongere dieren (HPF 24 tot 72 HPF). Dus elke benadering heeft zijn voordelen en beperkingen. Student&#39;s t-test kan worden gebruikt om twee groepen gegevens terwijl een analyse van Variance (ANOVA) kan worden gebruikt om meerdere groepen te vergelijken. Er moet worden afgegeven bij een post-hoc test voor parametrische versus niet-parametrische gegevens kiezen.

Een van de onopgeloste kwesties in ontwikkelingsneurobiologie heeft betrekking op de rol van synaptische plasticiteit verschijnselen tijdens synaptische rijping. Ons onderzoek richt zich op het begrijpen van de mechanismen die synaptische plasticiteit ontwikkeling ten grondslag liggen met een algemene doelstelling van het begrijpen van het gedrag van dieren in het kader van synaptische ontwikkeling. Om dit te doen, hebben we een grotendeels intact preparaat in een organisme (zebravis, Danio rerio) dat heeft opgedaan aanzienlijke tractie voor ontwikkelings-studies in de late jaren 1990. De zebravis biedt aantal duidelijke voordelen voor neurologische studies. Zo is het genoom gesequenced en kan men morfolino knockdowns en zinkvinger nuclease knockouts voeren om genactiviteit en eiwitexpressie zwijgen. Men kan ook overexpressie studies uitvoeren en transgene lijnen kunnen worden geconstrueerd 7-9. Embryo&#39;s zijn relatief eenvoudig en overvloedig te verwerven, enhet transparante karakter van het embryo leent zich goed voor beeldvorming en opto-genetische studies. Bovendien kan gedragsanalyse worden uitgevoerd en elektrofysiologische experimenten kunnen worden uitgevoerd op spiervezels, ruggenmerg neuronen en achterhersenen neuronen grotendeels intact organismen, zodat men cellulaire functie in vivo te onderzoeken. Belangrijk is, zijn we in staat om synaptische activiteit onderzoeken niet alleen dezelfde klasse van de cel, maar in de zeer hetzelfde paar neuronen, van de voorbereiding tot de voorbereiding. Met andere woorden, dit is een van de zeldzame gewervelde preparaten waarbij men terugkeert naar dezelfde neuron, in situ, om de ontwikkeling te bestuderen. Om neuronale circuits als levensvatbaar mogelijk te houden, hebben we een preparaat waarin de achterhersenen en ruggenmerg intact bleven, terwijl patch clamping van de M-cellen. In deze voorbereiding, de ogen, kaak en de huid bedekken de hersenen voorzichtig verwijderd en de achterhersenen is peeled weg van de notochord, waardoor de toegang tot het ventrale oppervlak van de achterhersenen. De reticulospinal neuronen bevinden zich enkele micrometers diep en zijn relatief gemakkelijk bereikbaar. Op 48 uur na de bevruchting (HPF, sommige afkortingen in tabel 1) de cellen elektrisch compact en kan getrouw opnemen synaptische activiteit (zowel prikkelende en remmende stromen), spanningsafhankelijke stromingen en actiepotentialen van hen. Onze bevindingen suggereren dat vele aspecten van synaptische ontwikkeling en rijping optreden in de 24 uur voorafgaand aan het uitkomen, en daarom veel van onze aandacht is gericht op organismen, variërend in leeftijd van 24 tot 72 HPF HPF. Echter, door 72 HPF, M-cellen zijn minder elektrisch compact en moeilijk om goed ruimte klem. De techniek kan worden gebruikt om niet alleen het opnemen van M-cellen, maar ook uit de homologen Mid2 cm en MiD3 cm. Theoretisch kan men ook uitvoeren dubbele opnames, van een spinal koord neuron zoals een primaire motorische neuron en van de M-cel, maar dit is moeilijk en het kan worden aangevoerd dat de voordelen van een dergelijke moeilijke techniek niet de buitengewone inspanning die nodig is kan de moeite waard.

<table><tbody><tr><td>Dissecting Dish</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0291</td><td></td></tr><tr><td>0.001" Tungsten Wire</td><td>Scientific Instruments Services Inc.</td><td>W406</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ9.5</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Puller</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige Group</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Upright Patch clamp microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMLFSA</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Siskiyou Inc.</td><td>MX7500</td><td></td></tr><tr><td>Digidata</td><td>Molecular Devices</td><td>1322A</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>200B</td><td></td></tr><tr><td>Acquisition software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp9</td><td></td></tr><tr><td>Axograph X</td><td>Axograph</td><td>Axograph X</td><td></td></tr></tbody></table>

patch clamp recordings van embryonale zebravis mauthner cells

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cellen (M-cellen) zijn groot reticulospinal neuronen gelegen in de achterhersenen van beenvissen. Ze zijn belangrijke neuronen betrokken bij een karakteristiek gedrag bekend als C-starten of escape reactie die optreedt wanneer het organisme neemt een bedreiging. De M-cellen is uitgebreid bestudeerd bij volwassen goudvissen wanneer is aangetoond dat een groot aantal prikkelende, remmende en neuromodulatory signalen ontvangen 1. We hebben onderzocht welke M-cel activiteit in embryonale zebravis om aspecten van synaptische ontwikkeling te bestuderen in een gewerveld dier voorbereiding. In de late jaren 1990 ontwikkeld Ali en collega voorbereiding op patch clamp opnemen van M-cellen in zebravisembryo&#39;s, waarbij de CZS grotendeels intact 2,3,4. Het doel was op dat moment aan synaptische activiteit opnemen hindbrain neuronen, ruggenmerg neuronen en romp skeletspieren met behoud van functionele synaptische verbindingen binnen een intacte hersenen-ruggenmerg voorbereiding.Dit preparaat wordt nog steeds gebruikt in ons laboratorium vandaag. Om de mechanismen van ontwikkelingsstoornissen synaptische plasticiteit onderzoeken, registreren wij prikkelende (AMPA en NMDA-gemedieerde) 5,6 en remmende (GABA en glycine) synaptische stromen uit ontwikkelingslanden M-cellen. Belangrijk is dat deze unieke preparaat kunnen we terugkeren naar dezelfde cel (M-cellen) van bereiding tot bereiding nauwgezet te onderzoeken synaptische plasticiteit en neuro-ontwikkeling in een embryonale organisme. De voordelen van dit preparaat omvat 1) intacte, functionele synaptische verbindingen op de M-cellen, 2) relatief goedkoop preparaten, 3) een grote voorraad beschikbaar embryo 4) de capaciteit om op hetzelfde celtype (dat wil zeggen M- cellen) in elke opstelling, zodat synaptische ontwikkeling op het niveau van een afzonderlijke cel kan worden onderzocht van vis tot vis en 5) beeldvorming van hele preparaten door de transparantie van het embryo.

In dit manuscript presenteren we een werkwijze voor patch-clamp opname in de gehele-cel functie van reticulospinal neuronen in de zebravis, met speciale aandacht voor de M-cellen. Uiteraard is het ook mogelijk om op te nemen in andere patch clamp functies als cel aangesloten, binnenstebuiten en buiten uit. De aard van de gegevens die men kan krijgen is niet beperkt tot wat we hier hebben gepresenteerd, maar we proberen een voorbeeld van beide synaptische activiteit (prikkelende en remmende) in voltage-clamp-modus als actiepotentialen in stroomtang bieden. Als het organisme leeftijden en de M-cellen zich ontwikkelen meer uitgebreide en gedetailleerde dendrieten, is de mogelijkheid om klem en ruimte voldoende spanning klem de cel het gedrang komt en de huidige klem modus wordt de opname van de keuze. Figuur 3 toont representatieve opnamen van prikkelende AMPA en NMDA-receptor-stromen verkregen uit 48 HPF embryo&#39;s in aanwezigheid van TTX (1 uM) en farmacologische agentenblok GABA en glycine-receptoren. Als de M-cellen spanning geklemd bij -60 mV, de synaptische stromen door de activering van AMPA receptoren (Figuur 3A). Acquisitie en analyse van deze gebeurtenissen maakt het mogelijk om parameters zoals stijging van de tijd, decay tijd, amplitude en frequentie op te nemen. AMPA gebeurtenissen hebben meestal een snelle stijging van de tijd (20-80% stijgtijd van ~ 0,1 msec) en verval tijd (~ 0,5 msec), en vertonen een gemiddelde amplitude van ongeveer 25 Pa. Als de M-cellen geklemd bij +40 mV, de verkregen uitgaande stromen door AMPA en NMDA receptoractiviteit (Figuren 3C en 3D). NMDA receptor stromingen vertonen langer tijdsverloop dan AMPA receptor stromingen, en moeten worden opgenomen in positieve mogelijkheden of Mg-vrije oplossing voor de Mg blok van de NMDA-receptoren te verwijderen 2,6. De gemiddelde mEPSC figuur 3D vertegenwoordigt gemengde AMPA en NMDA stromen geregistreerd bij +40 mV. Figuur 4 toont representatieve resultaten tijdens het opnemen mIPSCs van Mauthner cellen. Deze gebeurtenissen in aanwezigheid van TTX (1 uM) en kynurenic zuur (1 mM) tot AMPA en NMDA-receptoren te blokkeren. Deze gebeurtenissen vertonen redelijk snelle opkomst en verval kinetiek van 48 HPF en frequent genoeg om veel van hen verwerven over een 2-3 min. opname 3. Figuur 5 toont actiepotentialen opgenomen als gevolg van het injecteren depolariserende stroom in de cel. M-cellen van 48 HPF embryo meestal vuren een enkele actiepotentiaal (figuur 5B), hoewel ze soms vuren meerdere AP&#39;s wanneer ingespoten met bovendrempelige stimuli (figuur 5A). <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Afkorting </td><td> Volledige Naam </td></tr><tr><td> 1. </td><td> MPSC </td><td> Miniatuur postsynaptische stroom </td></tr><tr><td> 2. </td><td> mEPSC </td><td> Miniatuur prikkelende postsynaptische stroom </td></tr><tr><td> 2 </td><td> mIPSC </td><td> Miniatuur remmende postsynaptische stroom </td></tr><tr><td> 3. </td><td> MQ </td><td> Mega Ohm (eenheid van de weerstand, 10 6 Ohm) </td></tr><tr><td> 4. </td><td> GQ </td><td> Giga Ohm (eenheid van de weerstand, 10 9 Ohm) </td></tr><tr><td> 4. </td><td> Mosm </td><td> Milli osmolaire (eenheid van osmolariteit; 10 -3 osmoles) </td></tr><tr><td> 4. </td><td> TTX </td><td> tetrodotoxin </td></tr><tr><td> 5. </td><td> ATP </td><td> adenosinetrifosfaat </td></tr><tr><td> 6. </td><td> GTP </td><td> guanosine trifosfaat </td></tr><tr><td> 7. </td><td> GFP </td><td> Groene fluorescerende eiwit </td></tr></tbody></table> Tabel 1. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; Equipment Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Ontleden schotel </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0291 </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 0.001 &quot;Tungsten Wire </td><td> Scientific Instruments Services Inc </td><td> W406 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Dissectiemicroscoop </td><td> Leica Microsystems </td><td> MZ9.5 </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Pipet Puller </td><td> Sutter Instruments Co </td><td> P-97 </td></tr><tr><td> 4. </td><td> Microforge </td><td> Narishige Group </td><td> MF-900 </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Rechtop Patch clamp microscoop </td><td> Leica Microsystems </td><td> DMLFSA </td></tr><tr><td> 6. </td><td> Micromanipulator </td><td> Siskiyou Inc </td><td> MX7500 </td></tr><tr><td> 7. </td><td> Digidata </td><td> Molecular Devices </td><td> 1322A </td&gt; </tr><tr><td> 8. </td><td> Versterker </td><td> Molecular Devices </td><td> 200B </td></tr><tr><td> 9. </td><td> Acquisitie software </td><td> Molecular Devices </td><td> pClamp9 </td></tr><tr><td> 10. </td><td> Axograph X </td><td> Axograph </td><td> Axograph X </td></tr></tbody></table> Tabel 2. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Oplossing Naam </td><td> Reagens en concentratie (mM) </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Ontleden oplossing </td><td> 134 NaCl, 2,9 KCI, 2,1 CaCl2, 1,2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose en 0,02% tricaïne </td></tr><tr><td> 2. </td><td> MPSC extracellulaire oplossing </td><td> 134 NaCl, 2,9 KCI, 2,1 CaCl2, 1,2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose en 0,001 TTX </td></tr><tr><td> 3. </td><td> MPSC Intracellular oplossingtie </td><td> 134 CsCl, 2 MgCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 4 Na2-ATP, 0,4 Li-GTP </td></tr><tr><td> 4. </td><td> Actiepotentiaal extracellulaire oplossing </td><td> 137 NaCl, 2,9 KCI, 2,1 CaCl2, 1,2 MgCl2, 10 HEPES en 10 Glucose (met 10 uM D-tubocurarine) </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Actiepotentiaal Intracellular oplossing </td><td> 130 KCl, 2 NaCl, 10 EGTA, 10 HEPES, 4 mg-ATP en 0.4 Li-GTP. </td></tr></tbody></table> Tabel 3. Alle extracellulaire oplossingen zijn aangepast aan 290 mOsm en pH 7,8. Alle intracellulaire oplossingen worden aangepast tot 280 mOsm en pH 7.4. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig1.jpg" /> Figuur 1. Ontleden schotel en intact achterhersenen-ruggenmerg voorbereiding. (A) Ontleden en opnemen gerecht verkregen van WPI. Een dunne ring wordt zorgvuldig verzegeld op thij glasplaatje onderaan de schaal en Sylgard wordt toegepast op de bron. (B) 48 HPF achterhersenen-ruggenmerg preparaat. Het ventrale oppervlak van de achterhersenen naar boven is gericht en de M-cel ligt net onder het oppervlak van het weefsel op het niveau van de pijlpunt. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig2.jpg" /> Figuur 2. (A) Nomarski differentieel interferentie contrast beeld van een M-cel verkregen uit een 2 DPF embryo kort na het uitkomen. Het beeld werd genomen nadat de opname spontane prikkelende synaptische activiteit van de M-cel. (B) De cel werd gevuld met Lucifer geel tijdens het experiment. Aangepast van 12 met toestemming. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig3.jpg" /> Figuur 3. (A) Spontane AMPA mEPSCs opgenomen vanaf een M-cel<html> bij een bedrijf potentieel van -60 mV. (B) Gemiddeld verkregen uit de opname (A) mEPSCs. (C) Spontane AMPA en NMDA (pijlpunten) mEPSCs opgenomen met een M-cel bij een bedrijf potentiaal van +40 mV. (D) Gemiddeld verkregen uit de opname mEPSCs (C). Glutamaat mEPSCs werden in aanwezigheid van TTX (1 uM) tot actiepotentialen blokkeren, strychnine (5 uM) en picrotoxine (100 uM) aan glycine en GABA stroming blokkeren. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig4.jpg" /> Figuur 4. (A) Spontane mIPSCs opgenomen vanaf een M-cel bij een bedrijf potentieel van -60 mV. (B) Gemiddeld verkregen uit de opname in (A) mEPSCs. mIPSCs werden in aanwezigheid van TTX (1 uM) aan actiepotentialen, kynurenic zuur (1 mM) blokkeren glutamaat receptor activiteit en bicuculline (10 uM) blokkeert GABA stromen blokkeren. nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; altijd &quot;&gt; <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig5.jpg" /> Figuur 5. Actiepotentialen opgenomen vanaf een M-cellen. In bepaalde cel een suprathreshold stimulus (0,48 nA) veroorzaakte verscheidene actiepotentialen (A), maar een stimulus drempelwaarden slechts leidt tot de productie van een actiepotentiaal (B). (C) De huidige protocollen voor de in A en B sporen.

We hebben een intacte hersenen ruggenmerg voorbereiding voor het vastleggen en bewaken elektrische activiteit via patch clamp opname van de Mauthner neuronen en andere reticulospinal cellen in de zebravis embryo&#39;s ontwikkeld. Zo zijn wij in staat om prikkelende en remmende synaptische stromen, voltage-gated kanaal activiteit en actiepotentialen opnemen van belangrijke neuronen in een zich ontwikkelende embryo.

Patch Clamp Recordings van embryonale zebravis Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Het algemene doel van deze procedure is om de synaptische eigenschappen en de exciteerbaarheid van de Mauthner-cellen in zebravisembryo's vast te leggen. Dit wordt bereikt door eerst het zebravisembryo te dissecteren om het ventrale oppervlak van de rhomencephalon bloot te leggen. De tweede stap is om het gedissecteerde preparaat op de tafel van een patchclamp-microscoop te plaatsen en de Mauthner-cellen te identificeren.Volgende patch. Klem aan de M-cellen met behulp van de juiste registratiemodus en registreer de synaptische activiteit en de exciteerbaarheidseigenschappen. De laatste stap is het analyseren van de geregistreerde gegevens om de synaptische eigenschappen of de exciteerbaarheid vast te stellen.Uiteindelijk wordt patch-clampregistratie van deze cellen gebruikt om de eigenschappen van synaptische receptoren in een ontwikkelend organisme aan te tonen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode op twee hoofdgebieden problemen ondervinden. Het eerste is de dissectie.De tweede vorming van de gig-scène kan uitdagend zijn. Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methode toen ik besloot te werken aan een zebravis-preparaat waarin de achterhersenen aan het ruggenmerg waren bevestigd; de procedure wordt gedemonstreerd door Burram Roy, een promovendus in mijn laboratorium. Begin deze procedure door de dissectieschaal klaar te maken en deze te bekleden met Sard. Bevestig vervolgens de ringetjes met vet aan het objectglas.Voeg vervolgens vloeibare sard toe aan het midden van de washer. De sard hardt gewoonlijk gedurende de nacht uit en vormt een klein cirkelvormig bedje op het glazen objectglas, dat de basis van de dissectieschaal wordt. Plaats een dekglas op het objectglas en plaats het objectglas vervolgens in de registratiekamer om als basis voor de dissectie te dienen.Bereid vervolgens de benodigde oplossingen. De extracellulaire oplossingen moeten op kamertemperatuur blijven, terwijl de intracellulaire oplossingen steriel bewaard moeten worden. Men kan ook 0,1%loose for yellow aan de intracellulaire oplossing toevoegen, zodat de morfologie van de M-cel aan het einde van het experiment gevisualiseerd kan worden om de celidentiteit te bevestigen.Kweek vervolgens de wildtype zebravisembryo's in eiwater bij 28,5 °C en verzamel en bepaal het stadium volgens de eerdere publicatie. Breng de embryo's voor de dissectie over naar de dissectieschaal, die tevens als opnamekamer dient. Anestheseer ze vervolgens gedurende zeven tot 10 minuten.In een anesthetiserende zoutoplossing die sterk lijkt op fysiologisch saline, kan men bepalen of ze voldoende zijn geanesthetiseerd door de reactie op een zachte kneep in de staart te onderzoeken. Zet de embryo's vervolgens door de no accord vast op de SIL guard line schaal met 0,001 inch wolfraamdraad onder een dissectiemicroscoop met een vergroting van 25 x. Pas de vergroting op de dissectiemicroscoop aan naar 40 tot 50 x om de dissectie uit te voeren.Verwijder nu de kaken, de ogen en de voorhersenen met een fijn pincet. Pel de achterhersenen voorzichtig los van het onderliggende knopenstreng door het pincet behoedzaam tussen de knopenstreng en de hersenen te manoeuvreren. Draai de achterhersenen vervolgens voorzichtig om, zodat het ventrale oppervlak naar boven is gericht.Deze positionering biedt een goede toegang tot de M-cellen, die zich bij jonge embryo's gewoonlijk binnen vijf tot 10 µm van het ventrale oppervlak bevinden en bij oudere larven op 20 tot 50 µm. Verplaats vervolgens voorzichtig de preparatie naar de registratie-opstelling waar het patchclamp-experiment kan worden uitgevoerd. De M-cellen worden gevisualiseerd met differentieële interferentiecontrast, hoewel ook andere beeldvormingsmodi kunnen worden gebruikt ter voorbereiding op de patchclamping.Begin met het trekken van enkele patch-CLA-pipetten met dunwandig borosilicaatglas. Bij een horizontale trekking zijn de diameters van de pipetpunten ongeveer 0,2 tot 0,4 µm na vlampolijsten tot een gladde rand, en is de tapsheid van de schacht ongeveer vier millimeter lang. Vul de pipetpunt met intracellulaire oplossing door de punt in de intracellulaire vloeistof te dopen.Plaats vervolgens een injectienaald in de pipet en pers voorzichtig intracellulaire oplossing uit de spuit. Om de pipet volledig te vullen, wordt deze bevestigd aan de headstage van de versterker. In de elektrofysiologische opstelling is het belangrijk om de headstage in een hoek van ongeveer 45 graden ten opzichte van de horizontale as te houden; dit garandeert een insteekhoek van de pipet die geschikt is voor de vorming van hoogresistente seals met de mond van de cel. Pas vlak voordat de pipet in de badoplossing wordt gelaten een kleine hoeveelheid positieve druk op de pipet toe om de kans op verstopping van de tip te verkleinen. Ga verder met het naderen van de M-cel met een kleine hoeveelheid positieve druk in de pipet.De positieve druk duwt de cel voorzichtig van zijde naar zijde, en wanneer de pipet zich direct boven de cel bevindt, vormt dit een kleine inkeping in het celmembraan. Laat de pipet nu enkele seconden op zijn plaats om het celoppervlak voorzichtig te reinigen, zodat er een sterke afsluiting tussen de pipet en het membraan kan worden gevormd. Laat vervolgens de positieve druk in de pipet los om de afsluiting te initiëren.Een kleine hoeveelheid negatieve druk in combinatie met een negatief pipetpotentiaal resulteert in de vorming van giga seals binnen enkele seconden. Wijzig vervolgens het houdpotentiaal in de versterker naar min 60 millivolt. Ruptureer het celmembraan met een reeks korte zuigpulsen.Registreer vervolgens onmiddellijk de membraanpotentialen en minimaliseer capaciteitsartefacten. Compenseer de celcapaciteit en de toegangsweerstand met 70 tot 85%. De toegangsweerstand moet elke 30 seconden tot een minuut worden gemonitord; bij een verandering van 20% of meer moet het experiment worden afgebroken. Zodra het experiment is beëindigd en er voldoende gegevens zijn verzameld, wordt het embryo geofferd door met een pincet de achterhersenen te verwijderen.Deze figuur toont de representatieve opnames van excitatoire AMPA- en NMDA-receptorstromen verkregen uit embryo's van 48 HPF. Hier zijn de spontane AMPA mEPSC's geregistreerd van een M-cel bij een holdingpotentiaal van minus 60 millivolt. En dit zijn de gemiddelde mEPSC's.Hier zijn de spontane AMPA- en NMDA-mEPSCs opgenomen van een M-cel bij een holdpotentiaal van 40 millivolt. En dit zijn de gemiddelde mEPSCs. Glutamaat-mEPSCs werden opgenomen in aanwezigheid van 1 µM TTX om actiepotentialen te blokkeren, 5 µM strychnine en 100 µM ritoxin om glycine- en GABA-occurrenties te blokkeren. Hier zijn de spontane mIPSCs opgenomen van een M-cel bij een holdpotentiaal van -60 millivolt.En de gemiddelde MI PSC's werden geregistreerd in de aanwezigheid van 1 µM TTX om actiepotentialen te blokkeren, 1 mM chimeerzuur om de glutamaatreceptoractiviteit te blokkeren en 10 µM bicuculline om GABA-occurentie te blokkeren. Dit zijn de actiepotentialen geregistreerd van een M-cel in deze specifieke cel.Een SRA-drempelstimulus van 0,48 nano amps riep verschillende actiepotentialen op, maar een stimulus tot aan de drempelwaarde resulteert slechts in de productie van een enkel actiepotentiaal. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in twee tot vier uur worden voltooid indien correct uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe patch clamp-registraties worden uitgevoerd bij M-cellen en andere reticulaire spinale neuronen in zebravissenembryo's.

patch-clamp-recordings-from-embryonic-zebrafish-mauthner-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Larvale zebravis vormen de eerste gewervelde modelsysteem om gelijktijdig patch clamp opnamen toestaan ​​van een spinale motor-neuron en target skeletspieren. Deze video toont de microscopische methoden die worden gebruikt om een ​​segmentale CaP motor-neuron en doel spiercellen, alsook de methodologieën voor het opnemen van elk celtype te identificeren.

Gepaarde Patch Clamp Recordings van Motor-neuron en Target Skeletal Muscle in de zebravis

Het doel van deze video aan te tonen procedures voor het verkrijgen van gezonde, intacte haarcellen van het binnenoor organen van volwassen zebravissen en gebruik voor patch clamp studies gericht op het karakteriseren van de biofysische eigenschappen van de voltage-gated kanalen.

Patch Clamp Opnamen in Binnen-oorhaar cellen geïsoleerd uit zebravis

Dit protocol beschrijft een techniek genaamd whole-cell patch clamp electrophysiology, een methode om elektrische eigenschappen van Mauthner neuronen en andere reticulospinale cellen in zebravisembryo's te bestuderen.

Whole-Cell Patch Clamp Electrophysiology: een methode om elektrische eigenschappen van neuronen te bestuderen

This video demonstrates the recording of electrical signals from the afferent neurons in a paralyzed zebrafish larva by positioning a micropipette near the lateral line ganglion and forming a loose seal for signal capture. The extracellular solution maintains neuronal viability during this process.

Monitoring Electrical Signals from the Afferent Neurons in an Immobilized Zebrafish Larva

Een eenvoudige methode om extracellulaire veldpotentialen opnemen in het larvale zebravis voorhersenen beschreven. De methode omvat een...

Voorhersenen Elektrofysiologische Opname in larvale zebravis

In deze video laten we zien hoe de elektrische activiteit van de geïdentificeerde enkele neuronen in een hele brein voorbereiding, waarin complexe neurale circuits behoudt opnemen. We maken gebruik van transgene vissen waarbij gonadotropin-releasing hormoon (GnRH) neuronen genetisch worden gelabeld met een fluorescerend eiwit voor identificatie in de intacte voorbereiding hersenen.

Opnemen van elektrische activiteit van geïdentificeerde neuronen in de intacte hersenen van transgene Fish

Processen als proliferatie, patroon, differentiatie en axon begeleiding kan gemakkelijk worden gemodelleerd in de zebravis ruggenmerg. In dit artikel beschrijven we een montageprocedure voor zebravis embryo's die visualisatie van deze gebeurtenissen optimaliseert.

Dissectie en horizontale bevestiging van de zebravis embryo&#39;s: Analyse van Spinal Cord Development

Dit document beschrijft hoe een volwassen zebravissen kunnen worden geïmmobiliseerd, geïntubeerd, en gebruikt voor in vivo elektrofysiologische experimenten opnamen en manipulatie van neurale activiteit in een intact dier mogelijk maken.

Elektrofysiologische opname in de hersenen van Intact Adult zebravis

Dit manuscript beschrijft werkwijzen voor elektrofysiologische opnames van spinale neuronen van zebravis embryo's en larven. Het preparaat handhaaft neuronen in situ en vaak gaat om minimale dissectie. Deze werkwijzen maken het elektrofysiologisch onderzoek van verschillende spinale neuronen van de initiële elektrische prikkelbaarheid overname door de vroege larvale stadia.

zebravis<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Voorbereiding voor elektrofysiologische registraties van Spinal sensorische en motorische neuronen

Het huidige protocol beschrijft de acute isolatie van levensvatbare cardiale en vasculaire gladde spiercellen van volwassen, juveniele, larvale en embryonale zebravissen (Danio rerio), geschikt voor elektrofysiologische studies.

Isolatie van cardiale en vasculaire gladde spiercellen van volwassen, juveniele, larvale en embryonale zebravissen voor elektrofysiologische studies

Leer patch clamp-opnames van Mauthner-neuronen in embryonale zebrafish voor elektrofysiologisch onderzoek. Deze methode analyseert synaptische stromen en spanningsafhankelijke kanalen in ontwikkelende zenuwcellen.

Patch Clamp Recordings van embryonale zebravis Mauthner Cells

Meer video's verkennen