Name: Onderzoek van de synaptische vesikel Recycling FM Kleurstoffen Tijdens Evoked, Spontaan, en Miniature Synaptic Activiteiten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Leer synaptische vesikelrecycling beeldvormen met styryl FM-kleurstoffen in zenuwuiteinden. Dit protocol analyseert zowel geëvoceerde als spontane synaptische activiteiten voor uitgebreid neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs danken de leden van de harata lab voor nuttige discussies tijdens de uitvoering van dit werk. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de American Heart Association, de Dystonie Medical Research Foundation, de Edward Mallinckrodt, Jr Foundation, de National Science Foundation, en de Whitehall Stichting NCH

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

We hebben protocollen beschreven voor het kleuren en ontkleuren synaptische blaasjes in reactie op opgewekte, spontane en miniatuur synaptische activiteit en voor het afbeelden in de ontkleuroplossing fase. Naast de bestaande protocollen, hebben we een nieuw protocol observeren de FM ontkleuroplossing basis van miniatuur synaptische activiteit inbegrepen. Met deze protocollen we eerder geïdentificeerde afwijkingen in gekweekte neuronen van een muismodel van de beweging dystonie. In vergelijking met hun tegenhangers in w...

De functionaliteit van synaptische blaasjes is een belangrijke determinant van synaptische transmissie. Deze blaasjes vrijkomen neurotransmitters als ze fuseren met de presynaptische plasmamembraan (exocytose), en worden ze klaar voor een nieuwe cyclus van vrijlating na wordt geregenereerd uit het plasmamembraan (endocytose) en herladen met neurotransmitter. Onderzoek naar de dynamiek van en de onderliggende mechanismen van synaptische blaasje recycling is sterk versneld door de invoering van styrylkleurstoffen FM kleurstoffen 1. Deze amfipatische moleculen, die positief hebben geladen hydrofiele kopgroepen en hydrofobe staarten (meerdere kleurstoffen in figuur 1A, stereoview van FM1-43 in Figuur 1B), kunnen reversibel invoeren en lipide membranen verlaten zonder doordringt hen. Groepen van FM kleurstoffen onderlinge overeenkomsten vertonen dat het bereik van het licht dat ze uitstralen beïnvloeden. Bijvoorbeeld, FM2-10, FM1-43, en FM1-84 hebben een dubbele binding tussen twee cyclische verbindingen en show groene emissie. Het verschil tussen hen is de lengte van de hydrofobe staart, die haar hydrofobiciteit bepaalt en daarmee de snelheid van uitgang uit het membraan (departitioning). In het geval van FM5-95 en FM4-64, drie dubbele bindingen verbinden de cyclische verbindingen, en ze tonen rode emissie. Deze kleurstoffen verschillen met betrekking tot hun hydrofiele delen. In alle FM kleurstoffen, de fluorescentie-intensiteit toeneemt wanneer ze worden ingebracht in biologische membranen, door een toename in de quantum opbrengst in de hydrofobe omgeving ten opzichte van de hydrofiele omgeving. Dus de veranderingen in de FM-intensiteit geven de veranderingen in de membraan omzet. De verschillende kleuren (emissie spectra) en hydrofobiciteiten maken van de FM-kleurstoffen een veelzijdig onderzoeksinstrument in synaptische blaasje recycling. Op basis van deze eigenschappen worden de FM kleurstoffen meestal gebruikt volgens het volgende schema bij het ​​analyseren synaptische vesikel recycling (figuur 2). Neurons baden in een extracellulaire oplossing die het FM kleurstof, waardoor het worden opgenomen in synaptische blaasjes (SV) aangezien zij via endocytose (kleuring). De kleurstof wordt vervolgens weggewassen door een kleurstof vrij extracellulaire oplossing, dit toont de functionele zenuwuiteinden, namelijk alleen die actief ondergaan endocytose wordt een cluster van synaptische blaasjes die worden geladen met de kleurstof (figuur 2 beneden) bevatten. Na exocytose leidt tot verlies van de FM kleurstof aan de extracellulaire ruimte en een gelijktijdige verlies van fluorescentie (ontkleuren, door zowel de departitioning een hydrofiel milieu en diffusie vanaf de plaats van exocytose). Daarom zijn de veranderingen in de FM-fluorescentie-intensiteit zijn indicatoren van synaptische blaasjes exo-en endocytose. FM kleurstoffen zijn gebruikt om vlekken en Destain de synaptische blaasjes in verschillende organismen en preparaten 2,3. Voorbeelden zijn zoogdieren neuronale culturen 4-9, zoogdierbrein plakjes 10,11, neuromusculaire verbindingen 12,13, retinale bipolaire neuronen 14,15 en haarcellen van slakkenhuis 16. Meestal in dergelijke experimenten, zowel kleuren en ontkleuren worden getriggerd door uitvoerig stimuleren van de neuronen (opgeroepen activiteit). Onlangs echter synaptische vesikel recycling reactie op zwakke stimulatie ook geanalyseerd, evenals recycling in afwezigheid van een externe stimulus (spontane en miniatuur synaptische activiteit) 9,17-19. Spontane en miniatuur synaptische activiteiten worden gedefinieerd als die die in afwezigheid van externe stimuli, met de voormalige waarbij spontane afvuren van actiepotentialen (figuur 3). Deze zwakke synaptische activiteiten geassocieerd met kleinere veranderingen FM signalen dan die veroorzaakt door uitgebreide stimulatie. De meting vereist dat de veranderingen in de FM-tllingen intensiteit nauwkeurig weergeven synaptische vesikel exocytose of endocytose maar niet artefactuele veranderingen in intensiteit. Een oorzaak van het artefact is de aanwezigheid van niet-specifieke kleuring van de plasmamembraan door FM kleurstoffen. Geleidelijke uitspoeling van deze component leidt tot een geleidelijke verandering in de gemeten fluorescentie-intensiteit die ten onrechte wordt toegeschreven aan synaptische activiteiten. Deze factor kan worden verminderd door geschikte methoden (zie Protocol). De meest opvallende oorzaak van het artefact is de photobleaching van FM kleurstof vastgehouden binnen synaptische blaasjes. De photobleaching gerelateerde veranderingen in FM intensiteit moet klein zijn in vergelijking met de biologische (synaptische) veranderingen die worden gemeten. De recente ontwikkeling van gevoelige camera&#39;s, zoals het elektronen vermenigvuldigen ladingsgekoppelde inrichting (EMCCD) camera maakt het mogelijk fotobleken door het verkorten belichtingstijd en verzwakking van de intensiteit van het licht gebruikt om de fluorofoor wekken minimaliseren. Een andere oorzaak van het artefact is een drift in de nadruk niveau van de lichtmicroscoop. De focus drift tijdens een opnamesessie kan worden veroorzaakt door mechanische of thermische effecten, en ten onrechte leiden tot een verandering in de gemeten fluorescentie-intensiteit. Hier beschrijven we protocollen en apparatuur die het mogelijk maken FM kleurstoffen om synaptische vesikel recycling analyseren zelfs in het kader van zwakke of geen stimulatie met name de miniatuur synaptische activiteit. We tonen voorbeelden van de kleuren en ontkleuren van blaasjes tijdens opgewekte en spontane synaptische gebeurtenissen, met behulp van gekweekte knaagdier hippocampus neuronen, en beeldvorming van het ontkleuren fase. We tonen ook hoe de mate van FM kleurstof fotobleking evalueren, bij het ontbreken van een FM-kleurstof verlies als gevolg van synaptische activiteiten.

<table><tbody><tr><td>Pulsgenerator</td><td>AMPI</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/research/stimulators/" target="_blank"&gt;Geïsoleerde stimulator&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Digitimer</a></td><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/research/stimulators/ds3-isolated-constant-current-stimulatorstimulus-isolator/" target="_blank"&gt;DS3&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde microscoop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>Deze wordt gebruikt voor het beoordelen van de celmorfologie bij een lage vergroting.</td></tr><tr><td>Omgekeerde microscoop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TiE</td><td>Deze wordt gebruikt voor fluorescentie- en transmissielichtbeeldvorming met een hoge resolutie en minimale focusdrift.</td></tr><tr><td>Objectief</td><td>Nikon</td><td></td><td>Een waterimmersielens wordt aanbevolen. Een olieimmersielens kan worden gebruikt, tenzij een afgebeelde structuur zich diep onder het oppervlak van het dekglas bevindt (&lt;i&gt;bijv.&lt;/i&gt; &gt;10 &amp;mu;m).</td></tr><tr><td>Filterkubus</td><td>Nikon</td><td>77032509</td><td>490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em voor FM1-43</td></tr><tr><td>Filterkubus</td><td>Nikon</td><td>77032809</td><td>490/420 nm ex, 510 nm dclp, 650 nm LP em voor FM4-64.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EMCCD-camera</td><td>Andor Technology</td><td>iXon EM+ DU-860</td><td>Deze EMCCD-camera wordt gebruikt voor hooggevoelige detectie van fluorescentie.</td></tr><tr><td>Vloeistofrecirculerende koeler</td><td>Solid State Cooling Systems</td><td>Oasis 160</td><td>Deze wordt gebruikt voor het continu perfunderen van de camera met gekoeld water om een temperatuur van -80&amp;deg;C te handhaven, waardoor ruis wordt verminderd.</td></tr><tr><td>LED</td><td>CoolLED-Custom Interconnect</td><td>490 nm</td><td>Deze lichtbron wordt gebruikt voor snelle aan/uit-besturing van fluorescentie-excitatie.</td></tr><tr><td>Beeldacquisitiesoftware</td><td>Andor Technology</td><td>Solis</td><td></td></tr><tr><td>Beeldvormingskamer</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-21BRFS</td><td></td></tr><tr><td>Snel perfusiesysteem</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-77B</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1045</td><td></td></tr><tr><td>D,L-AP5</td><td>Tocris Bioscience</td><td>0106</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxine</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1069</td><td>Waarschuwing: toxisch reagens. Voorzichtig hanteren.</td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Invitrogen</td><td>T35356</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyde-fixeerbare FM1-43 (FM1-43FX)</td><td>Invitrogen</td><td>F35355</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyde-fixeerbare FM4-64 (FM4-64FX)</td><td>Invitrogen</td><td>F34653</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; gebalanceerde zoutoplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td>Deze oplossing bevat geen fenolrood, wat de fluorescentiebeeldvorming zou verstoren.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Waarschuwing: toxisch reagens. Voorzichtig hanteren.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr></tbody></table>

onderzoek van de synaptische vesikel recycling fm kleurstoffen tijdens evoked, spontaan, en miniature synaptic activiteiten

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Synaptische blaasjes in functionele zenuwuiteinden ondergaan exocytose en endocytose. Deze synaptische vesikel recycling effectief kan worden geanalyseerd met behulp FM styryl kleurstoffen, die membraan omzet onthullen. Gebruikelijke protocollen voor het gebruik van FM kleurstoffen zijn ontworpen voor het analyseren neuronen na gestimuleerde (opgeroepen) synaptische activiteit. Onlangs zijn protocollen beschikbaar voor het analyseren van de FM-signalen die zwakker synaptische activiteiten, zoals spontane of miniatuur synaptische gebeurtenissen gevoegd worden. Analyse van deze kleine veranderingen FM signalen vereist dat het beeldvormingssysteem is voldoende gevoelig voor kleine veranderingen in intensiteit detecteren, maar dat kunstmatig veranderingen van grote amplitude worden onderdrukt. Hier beschrijven we een protocol dat kan worden toegepast opgeroepen, spontaan en miniatuur synaptische activiteiten en gebruik gekweekte hippocampale neuronen als voorbeeld. Dit protocol omvat ook een middel bepalen van de omvang van fotobleken FM kleurstoffen, aangezien dit een belangrijkebron van artefacten wanneer beeldvorming kleine veranderingen in de intensiteit.

Als voorbeeld tonen wij representatieve resultaten voor de ontkleuroplossing tijdsverloop van synaptische vesicles (figuur 4). Gekweekte hippocampale neuronen gekleurd met FM4-64 met de spontane synaptische activiteit (stap 2.3) en gewassen met kleurstofvrije oplossing (spoeloplossing 2). De beeldvorming toont de initiële ontkleuroplossing tijdsverloop behulp van spontane activiteit (stap 5.3) (eerste onderdeel van de continue lijn, figuur 4A). Dit wordt gevolgd door de ontkleuroplossin...

We beschrijven het gebruik van styrylkleurstoffen FM kleurstoffen aan het synaptische blaasje recycling in functionele zenuwuiteinden. Dit protocol kan niet alleen opgeroepen, maar ook spontane en miniatuur synaptische activiteiten worden toegepast. Het protocol breidt het aantal synaptische gebeurtenissen die effectief kan worden geëvalueerd.

Onderzoek van de synaptische vesikel Recycling FM Kleurstoffen Tijdens Evoked, Spontaan, en Miniature Synaptic Activiteiten

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

examination-synaptic-vesicle-recycling-using-fm-dyes-during-evoked

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De mogelijkheid om de kinetiek van blaasje los maatregel kan hulp bieden inzicht in een aantal van de basisprincipes van neurotransmissie. Hier gebruikten we real-time beeldvorming van blaasjes gelabeld met de rode fluorescente kleurstof FM 4-64 om de snelheid van presynaptische blaasje release in hippocampale neuronale culturen te meten.

Het meten van exocytose in Neuronen FM-ontvanger voor Labeling

FM kleurstoffen zijn van onschatbare hulp bij het begrijpen van synaptische dynamiek. FMS worden normaal gevolgd onder de fluorescentie microscoop tijdens de verschillende stimulatie omstandigheden. Echter, photoconversion van de FM-kleurstoffen in combinatie met elektronenmicroscopie kan de visualisatie van verschillende synaptische vesicles zwembaden, onder andere ultrastructuur componenten, in de synaptische boutons.

Studeren Synaptic Blaasjes zwembaden met behulp van Photoconversion van styrylkleurstoffen

Een live fluorescentie imaging techniek om de aanvulling en de mobilisatie van specifieke synaptische vesicles (SV) zwembaden in het centrum van zenuwuiteinden te kwantificeren wordt beschreven. Twee rondes van SV recycling worden bewaakt in dezelfde zenuwuiteinden die een interne controle.

Kwantitatieve analyse van synaptische Blaasjes Pool Replenishment in gekweekte Cerebellaire Korrel Neuronen met behulp van FM-kleurstoffen

This video demonstrates a protocol to study synaptic vesicle recycling at neuromuscular junctions in channelrhodopsin-expressing Drosophila larvae using a fluorescent dye. Blue light activates the channelrhodopsins, causing calcium influx and synaptic vesicle exocytosis. The dye integrates into the neuronal membranes and is internalized during endocytosis, resulting in enhanced fluorescence. Further blue light stimulation induces exocytosis and dye release, which is shown by reduced...

Analyzing Synaptic Vesicle Recycling and Fluorescent Dye Uptake in Drosophila Larvae

Dit artikel beschrijft een methode voor het onderzoeken van de dynamica van neurotransmittervesicles in neuroblastoomcellen, met behulp van een synaptobrevin2-pHluorine construct en Total Internal Reflection Fluorescence Microscopie. De strategie die ontwikkeld is voor beeldverwerking en gegevensanalyse wordt ook gerapporteerd.

TIRFM en pH-gevoelige GFP-sondes naar Neurotransmitter Vesicle Dynamics Evalueer in SH-SY5Y Neuroblastoom Cellen: cell imaging en data-analyse

Synaptic vesikel endocytose is gedetecteerd door de lichte microscopie van pHluorin gefuseerd met synaptic vesikel eiwit en elektronenmicroscopie van vesikel opname.

Meten van Synaptic vesikel endocytose in gekweekte Hippocampal neuronen

Synaptic Vesikel (SV) fietsen is het mechanisme van de kern van de intercellulaire communicatie in neuronale synapsen. FM kleurstof opname- en release zijn het belangrijkste middel van kwantitatief onderzoek SV endo- en exocytose. Hier, vergelijken wij alle stimulatie methoden om te rijden FM1-43 fietsen in de Drosophila motorische eindplaat (NMJ) model synaps.

FM kleurstof fietsen in de synaps: vergelijken van hoge kalium depolarisatie, elektrische en Channelrhodopsin stimulatie

We beschrijven een optische assay voor synaptic Vesikel (SV) recycling in gekweekte neuronen. Dit protocol combineert met dubbele transfectie uitspreken een presynaptische marker en proteïne van belang stelt ons in staat te vinden presynaptische sites, hun synaptic vesikel recycling capaciteit bepalen van de rol van de proteïne van belang.

Een optische Assay voor Synaptic vesikel Recycling in gekweekte neuronen Overexpressing presynaptische eiwitten

Twee gerelateerde methoden worden beschreven om subcellulaire gebeurtenissen te visualiseren die nodig zijn voor synaptische transmissie. Deze protocollen maken de real-time monitoring van de dynamiek van presynaptische calciuminstroom en synaptische vesikelmembraanfusie mogelijk met behulp van live-cell imaging van in vitro gekweekte neuronen.

Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

De neuromusculaire overgang van de zebravislarve is een aantrekkelijk model voor het bestuderen van synaptische fysiologie. Het is vatbaar voor vele experimentele technieken, waaronder elektrofysiologie en optische beeldvorming. Hier beschrijven we een protocol voor het in beeld brengen van synaptische transmissie met behulp van een op pHluorin gebaseerde sonde onder een rechtopstaande epifluorescentiemicroscoop.

Live beeldvorming van het recyclen van synaptische blaasjes in de neuromusculaire overgang van ontlede larvale zebravissen

Leer synaptische vesikelrecycling beeldvormen met styryl FM-kleurstoffen in zenuwuiteinden. Dit protocol analyseert zowel geëvoceerde als spontane synaptische activiteiten voor uitgebreid neurowetenschappelijk onderzoek.

Onderzoek van de synaptische vesikel Recycling FM Kleurstoffen Tijdens Evoked, Spontaan, en Miniature Synaptic Activiteiten

Meer video's verkennen