Lokalisatie en relatieve kwantificering van koolstofnanobuizen in cellen met multispectrale beeldvorming en doorstromende cytometrie
12 december 2013
In deze studie was het belangrijkste doel om de cellulaire opname en uiteindelijke exocytose van koolstofnanobuizen (CNT's) te monitoren. Vanuit dit perspectief stelden we hier een unieke methode voor die gebruikmaakt van multispectrale beeldvorming en stromende cytometrie, waardoor een kwantificering en lokalisatie van CNT's in een statistisch relevant aantal cellen mogelijk is.
Het algemene doel van het volgende experiment is om een nanometrologische methode te bieden voor het monitoren en kwantificeren van de cellulaire opname van koolstofnanobuizen in een statistisch relevant aantal cellen. Dit wordt bereikt door de cellen eerst te behandelen met in water dispergeerbare, koolstofnanobuizen, die op concentratieafhankelijke wijze de cellen binnengaan. Deze koolstofnanobuizen worden uiteindelijk gelabeld met een fluorescerende marker.
Daarna wordt elke cel, na fixatie, geïmaged in de heldere veld-, donkere veld- en fluorescentiekanalen van een multispectrale beeldstromende flowcytometer. Om de verdeling van de koolstofnanobuizen en het niveau van lichtabsorptie, verstrooid licht en fluorescentie te visualiseren, die de nanobuislabeling in elke cel op pixelbasis veroorzaakt, stelt de intrinsieke lichtabsorptie en verstrooiing in de cellen de lokalisatie en kwantificering van de koolstofnanobuizen mogelijk.
Deze methode kan dus helpen om nieuwe vragen te beantwoorden op het gebied van nanotoxicologie en nanogeneeskunde, zoals de impact en het lot van op koolstof gebaseerde materialen in levende cellen, en ook het potentieel van koolstofnanobuizen als een systeem voor geneesmiddelafgifte. Begin door de koolstofnanobuizen, uiteindelijk gekoppeld aan een fluorescerende marker, te dispergeren in cellenkwetsing water. Bewerk vervolgens de nanobuizen in een badwatersonicator gedurende 20 minuten bij 20 graden Celsius. Verdun vervolgens de nanobuizen in 0, 10, 20 en 50 microgram per milliliter concentraties in compleet medium, en incubeer vervolgens twee milliliter van elke verdunning met de cellen van belang in 1 25 vierkante centimeter plaat per verdunning bij 37 graden Celsius na 20 uur, verwijder het incubatiemedium van elke plaat en spoel de koolstofnanobuis gelabelde cellen af met PBS.
Na het wassen, trypsiniseer de cellen op elke plaat en resuspendeer ze vervolgens in compleet DMEM-medium. Breng vervolgens elk monster over naar individuele einor 15 milliliter falconbuisjes en centrifugeer vervolgens de cellen vijf minuten bij 200 keer G en kamertemperatuur. Resuspendeer elk pellet in 4% paraformaldehyde bij vier graden Celsius gedurende een uur.
Na fixatie, centrifugeer de cellen opnieuw en resuspendeer elk gepelleteerd monster bij 15 keer 10 tot de vijfde cellen in 150 microliter PBS. Filter vervolgens de monsters door individuele 50 micron gaasfilters om beelden van de cellen te verkrijgen met een beeldstroom. Multispectrale beeldstromende flowcytometer.
Selecteer eerst een aangepaste vergroting en beeld vervolgens monsters van belang. Gebruik een 685 nanometer laser om donker veld te beeld en stel de flowcytometer in. Kanaal nummer zes om de donker veld emissie te verzamelen bij een bandpass van 745 tot 800 nanometer.
Beeld de monsters in het nummer een helderveld en nummer zes donkerveld kanalen voor beeldanalyse. Maak eerst een door parametrische stipplot met een breedte door hoogte aspectverhouding versus de celafmeting. Dit maakt onderscheid mogelijk van de enkele cellen die een standaard afmeting en aspectverhouding dicht bij een hebben van de meercellige gebeurtenissen, die een grote afmeting en een kleine aspectverhouding hebben, en het puin dat een extreem kleine afmeting vertoont.
Nadat de celafbeeldingen zijn gebruikt om te verifiëren dat de enkele cellen correct zijn geselecteerd, stelt u een biparametrische stipplot in voor hoog gecontrasteerde koolstofnanobuis gelabelde cellen door de contrast te plotten tegen de wortelgemiddelde kwadratische gradiënt om de exclusie van de lage wortelgemiddelde kwadratische gradiënt, laag contrast ongefocuste cellen mogelijk te maken, en de selectie van de cellen in het gefocuste vlak. Gebruik vervolgens de zoekfunctie voor de beste functie om de parameter te bepalen die de beste statistische scheiding tussen de gelabelde en niet-gelabelde cellen biedt. Voor dit representatieve experiment is bijvoorbeeld het gemiddelde pixelobjectfunctie de meest geschikte.
Plot vervolgens deze parameter tegen de genormaliseerde frequentie om een histogram te traceren voor kwantificering van de nanobuizen die door de cellen worden opgenomen bij elke experimentele concentratie. Plot nu een biparametrische grafiek voor het gemiddelde pixelobject op helder veld versus de intensiteit op donker veld. Om de correlatie tussen deze twee parameters te controleren, wordt nanobuis kwantificering ook beoordeeld door op de celafbeeldingen te creëren omdat de koolstofnanobuizen als intense donkere vlekken verschijnen. Selecteer een beperkt bereik van pixels met een lage intensiteit, bijvoorbeeld tussen nul en 533, om de drempelmasker te creëren, een die precies bij de donkere nanobuizen past om een tweede masker aan te duiden, masker twee, voor het visualiseren van de nanobuizen die helder verschijnen in het donkerveldkanaal.
Selecteer een bereik van pixels met een hoge intensiteit. Voor dit experiment werd bijvoorbeeld een bereik van 150 tot 4.095 gekozen. Gebruik vervolgens het gebied van de helderveldmasker één of het donkerveldmasker twee om een stipplot op te zetten om de relatieve internalisatie van de nanobuizen te kwantificeren.
Plot bijvoorbeeld het gebied op kanaal zes dat overeenkomt met het donker veld met masker twee tegen het gebied op kanaal één, overeenkomend met het helder veld met masker één. Na het bepalen van de lineaire correlatie tussen masker één en masker twee, visualiseer de nanobuizen binnen het cytoplasma door eerst een masker van de hele cel te maken en vervolgens het masker te eroderen. Aangeduid erodeer M 0 1 7 met zeven pixels om het interieur van de cel te bekijken.
Gebruik de Booleaanse vergelijking M nul één en niet eroderen M 0 1 7 om de koolstofnanobuizen binnen de celmembraan te visualiseren. Dat is het masker van de hele cel, afgetrokken van het interieur van de cel om een masker van alleen de membraan te maken om de donkere pixels op het membraan te evalueren. Pas het helderveldmasker één toe op het membraanmasker.
Pas al deze maskers toe op meerdere cellen tegelijk om een onderscheid te bevestigen tussen de gelabelde en niet-gelabelde monsters. Selecteer vervolgens de zwarte pixels op het membraan met de functiegebiedtool om de koolstofnanobuizen op het celmembraan te kwantificeren. Ten slotte om de kool
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe methode voor het monitoren van de cellulaire opname en exocytose van koolstofnanobuisjes (CNTs) met behulp van multispectrale imaging flowcytometrie. Deze benadering maakt kwantificering en lokalisatie van CNTs mogelijk in een statistisch significant aantal cellen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Nanotechnologie
- Celbiologie
- Nanotoxicologie
Achtergrond
- Koolstofnanobuisjes hebben potentiële toepassingen in systemen voor geneesmiddelentoediening.
- Het begrijpen van hun cellulaire interacties is cruciaal voor het beoordelen van hun veiligheid en effectiviteit.
- Bestaande methoden voor het monitoren van CNT's missen statistische relevantie.
- Multispectrale imaging flowcytometrie biedt een oplossing voor gedetailleerde analyse.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het kwantificeren van de CNT-opname in cellen.
- Om de distributie en lokalisatie van CNT's binnen cellen te visualiseren.
- Om de implicaties van CNT's in de nanotoxicologie en nanogeneeskunde te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- De cellen werden behandeld met waterdispergeerbare CNT's in verschillende concentraties.
- De CNT's werden gelabeld met een fluorescente marker voor visualisatie.
- De cellen werden afgebeeld met een multispectrale imaging flowcytometer.
- De data-analyse omvatte het maken van dot plots en histogrammen voor kwantificering.
Belangrijkste resultaten
- De methode heeft de opname van CNT's op een statistisch relevante wijze succesvol gekwantificeerd.
- Afzonderlijke beeldvormingskanalen maakten een gedetailleerde visualisatie van de CNT-distributie mogelijk.
- Internalisatie en membraanabsorptie van CNT's konden effectief van elkaar worden onderscheiden.
Conclusies
- Deze methode vergroot het begrip van de interacties tussen CNT's en cellen.
- Het biedt een kader voor toekomstige studies in de nanotoxicologie.
- De bevindingen ondersteunen het potentiële gebruik van CNT's in toepassingen voor geneesmiddelentoediening.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het kwantificeren van de opname van nanomaterialen in levende cellen blijft een kritieke uitdaging in de nanotoxicologie en nanogeneeskunde vanwege interferentie door endogene, koolstofrijke structuren. Deze methode maakt statistisch robuuste detectie en lokalisatie van koolstofnanobuisjes mogelijk op basis van intrinsieke optische eigenschappen, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie bij vroege veiligheidsbeoordelingen van nanomaterialen. Het biedt een schaalbare, op beeldvorming gebaseerde benadering om nanomateriaal-celinteracties te evalueren met een voorspellende betrouwbaarheid voor downstream translationele beslissingen.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar interacties tussen nanomaterialen en cellen mogelijk door specifieke opname te onderscheiden van aspecifieke binding via colokalisatie van absorptie- en scatteringsignalen.
- Operationele waarde: Levert kwantitatieve gegevens met resolutie op enkelcelniveau over duizenden cellen ter ondersteuning van hypothesen over target engagement bij het screenen van nanomaterialen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde fluorescentie-, brightfield- en darkfield-uitlezingen voor assay-normalisatie over nanomateriaalbibliotheken.
- Operationele waarde: Faciliteert gereedheid voor high-throughput screening door beeldvorming en flowcytometrie te integreren voor reproduceerbare, statistisch relevante kwantificering.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt systeemmodellering die relevant is voor ziekten door longitudinale tracking van het lot van nanomaterialen in cellen onder fysiologisch relevante omstandigheden mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Levert kwantitatieve internalisatiemetrieken die dienen als basis voor risico-gecorrigeerde beslissingen bij de verdere ontwikkeling van nanomedicijnen in de preklinische fase.
Integratie van Pipeline en Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege screening van nanomaterialen tot preklinische validatie, en biedt een brug tussen studies naar moleculaire interacties en beoordelingen van functionele uitkomsten.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door de opname van nanomaterialen en de subcellulaire lokalisatie te kwantificeren als functionele read-outs van cellulaire interactie.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie mogelijk via masker-gebaseerde kwantificering van absorptie- en scatteringsignalen over verschillende experimentele condities.
- Analytics: Levert histogrammen en dot plots die een vergelijkende analyse mogelijk maken van de dosis-responskarakteristieken en de internalisatie-efficiëntie van nanomaterialen.
- Translational Research: Sluit aan op preklinische continuïteit door gegevens te leveren over de retentie en distributie van nanomaterialen die relevant zijn voor biodistributiestudies.
- Enterprise Reuse: Creëert een herbruikbaar platform voor het evalueren van diverse nanomaterialen op basis van hun intrinsieke lichtabsorptie- en scatteringeigenschappen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij interacties tussen nanomaterialen en cellen door correlatieve data van brightfield- en darkfield-signalen te leveren.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde beeldvormingsprotocollen en maskergebaseerde analyse die toepasbaar zijn op verschillende celtypen en nanomaterialen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door kwantitatieve opnamedata te leveren, waardoor het risico bij de selectie van nanomaterialen voor toepassingen in geneesmiddelafgifte wordt verlaagd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door vergelijking mogelijk te maken van internalisatieprofielen van nanomaterialen over diverse leidende kandidaten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in flowcytometrie, beeldanalyse en de omgang met nanomaterialen.
- Afhankelijk van toegang tot een multispectrale imaging flowcytometer met mogelijkheden voor brightfield, darkfield en fluorescentie.
- Noodzaakt standaardisatie van masking-protocollen voor een consistente kwantificering over laboratoria en experimenten heen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie voor verschillende nanomaterialen op basis van hun lichtabsorptie- en verstrooiingsdrempels.
- Beperkt tot nanomaterialen met voldoende intrinsiek optisch contrast om te worden onderscheiden van cellulaire achtergrondsignalen.
