Name: Lokalisatie en relatieve kwantificering van koolstofnanobuizen in cellen met multispectrale beeldvorming en doorstromende cytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-12T13:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Leer een methode voor kwantificering en lokalisatie van koolstofnanobuizen in cellen met multispectrale beeldvorming en doorstromende cytometrie. Deze aanpak verbetert het begrip van nanotoxicologie en nanomedicijnen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door ANR P2N (Nanother project 2010-NANO-008-04), door de regio Ile de France (contractnr. E539), en door CNRS. Open Access werd betaald door EMD Millipore.

1. Bereiding van in water dispergeerbare koolstofnanobuizen (CNT's)
<ol>
	<li>Disperge eerst CNT's in celcultuurwater, voordat je ze 20 min. soniceert in een waterbad sonicator bij 20 °C. Als CNT's gefunctionaliseerd zijn met een fluorescerende sonde, bescherm ze dan zo veel mogelijk tegen licht gedurende het hele experiment.</li>
</ol>
2. Labels aanbrengen op cellen met CNT's
<ol>
	<li>Laat humane navelstrengveneuze endotheelcellen (HUVEC) (bijvoorbeeld) groeien op platen van 25 cm² in DMEM-medium, dat 10% foetaal bovien serum en 1% penicilline-streptomycine bevat.</li>
	<li>Maak oplossingen van CNT's bij een concentratie van 0, 10, 20 en 50 µg/ml in compleet medium en incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 20 uur of bij 4 ° C gedurende 20 uur (2 ml van CNT-suspensie voor een 25 cm² plaat).</li>
</ol>
3. Celfixatie
<ol>
	<li>Verwijder het incubatiemedium daarna; spoel cellen met PBS, trypsiniseer en suspendeer cellen in compleet DMEM-medium. Centrifugeer gedurende 5 min. bij 1.200 rpm.</li>
	<li>Vervang het medium eerst door paraformaldehyde 4% gedurende 1 uur bij 4 ° C, en vervolgens door PBS om ze te bewaren. Indien nodig, kunnen cellen in dit stadium van het proces gedurende enkele dagen bij 4 ° C worden opgeslagen tot de cytometrie-analyse.</li>
	<li>Elk monster moet ongeveer 106 cellen bevatten, geconcentreerd in 50 µl van PBS. Suspendeer ze correct om aggregaten tijdens de analyse te voorkomen en filter ze door een 50 μm maas zeef. 
	Opmerking: Elke stap moet zeer voorzichtig worden uitgevoerd om cellen te behouden.</li>
</ol>
4. ImageStream-acquisitie
Gebruik de multispectrale beeldstromingscytometer ImageStream om beelden van cellen te verkrijgen. 
Er moet aan een aantal punten worden gedacht:
<ol>
	<li>Selecteer een aangepaste vergroting (hier wordt een 40X objectief gebruikt).</li>
	<li>Indien fluorochromen worden gebruikt: 
	- bereid een controlemonster zonder fluorochroom voor. 
	- bereid cellen voor met een enkele-kleur positieve controle voor elk fluorochroom dat gebruikt wordt naast uw monsters.</li>
	<li>Gebruik de laser 488 nm om de FITC te exciteren en het kanaal 02 om de fluorescentie emissie te verzamelen (band-pass 480-560 nm). Gebruik daarnaast ook de kanalen 01 en 06 voor het heldere veld (BF) en donkere veld (DF) respectievelijk.</li>
</ol>
5. Post-verwerking - IDEAS Analyse Software (Versie 4.0)
<ol>
	<li>Onder alle verkregen gebeurtenissen moet de analyse eerst worden beperkt tot de populatie van enkele cellen: gebruik een biparametrische stipplot die 'aspect ratio' (d.w.z. breedte/hoogte) weergeeft versus 'celgebied' (parameters toegepast op cellen op BF) (Figuur 1). Enkele cellen die zijn opgenomen in het gebied van belang met een standaard oppervlakte en aspect ratio dicht bij 1 worden dan onderscheiden van multicellulaire gebeurtenissen (grote oppervlakte en kleine aspect ratio) en puin (extreem kleine oppervlakte).</li>
	<li>Gebruik een biparametrische stipplot voor gefocuste cellen met een hoog contrast om cellen in het scherpstellen vlak te selecteren: plot de 'contrast' versus de 'RMS gradiënt' (die de scherpte kwaliteit van een beeld meet) op de BF afbeelding - het staat de uitsluiting toe van onscherpe cellen die zowel een lage rms gradiënt en een lage contrast in hun BF beelden laten zien (Figuur 1).</li>
	<li>
	<ol>
		<li>Bepaal de parameter die de beste statistische scheiding tussen gelabelde en niet-gelabelde cellen biedt door 'vind de beste functie' te gebruiken. In onze studie is het gemiddelde pixel object kenmerk de parameter die het meest geschikt is (Figuur 2).</li>
		<li>Traceer een histogram met behulp van deze parameter versus de genormaliseerde frequentie om de hoeveelheid opgenomen CNT's voor geteste concentraties te vergelijken (Figuur 3).</li>
		<li>Traceer de biparametrische grafiek 'gemiddelde pixel object op BF' (Notatie: Gemiddeld Pixel_Object (M01,Ch01,Tight)_Ch01) versus 'intensiteit op DF' (Intensiteit_MC_Ch06), om de correlatie tussen deze twee parameters te bestuderen (Figuur 4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>De kwantificering wordt ook beoordeeld met behulp van maskers:
	<ol>
		<li>Aangezien CNT's zich als sterk absorberende donkere vlekken op BF manifesteren, maak eerst een drempelmasker dat ze precies past door een beperkt bereik van pixels met een lage intensiteit te selecteren, bevat tussen 0-533 in deze studie (Masker 1, notatie: Intensiteit(M01, BF, 0-533)) (Figuur 5). De keuze van de drempelintensiteit wordt gemaakt op gelabelde cellen in vergelijking met de controlecellen.</li>
		<li>Maak daarnaast ook een masker dat past bij de pixels met hoge intensiteit (150-4095 in dit geval) van de DF (Masker 2, notatie: Intensiteit (M06, DF, 150-4095)) (Figuur 6).</li>
		<li>Plot een grafiek met behulp van het gebied van het masker (1 of 2; (notatie: Area_Intensiteit(M01, BF, 0-533) voor masker 1): het zal een relatieve kwantificering van de internalisatie van CNT's bij verschillende concentraties geven (Figuur 7).</li>
		<li>Controleer de mate van correlatie tussen deze twee maskers (dankzij de biparametrische plot 'oppervlakte

<ol><li>Kostarelos, K., Bianco, A., Prato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promises%2C+facts+and+challenges+for+carbon+nanotubes+in+imaging+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Promises, facts and challenges for carbon nanotubes in imaging and therapeutics.</a> Nat. Nano. 4, 627-633 (2009).</li>
<li>De La Zerda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+nanotubes+as+photoacoustic+molecular+imaging+agents+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Carbon nanotubes as photoacoustic molecular imaging agents in living mice.</a> Nat. Nano. 3, 557-562 (2008).</li>
<li>Zavaleta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+Raman+Spectroscopy+in+Living+Mice+for+Evaluation+of+Tumor+Targeting+with+Carbon+Nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Noninvasive Raman Spectroscopy in Living Mice for Evaluation of Tumor Targeting with Carbon Nanotubes.</a> Nano Lett. 8, 2800-2805 (2008).</li>
<li>Tong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+semiconducting+and+metallic+carbon+nanotubes+in+cells+and+mice+using+transient+absorption+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy.</a> Nat. Nano. 7, 56-61 (2012).</li>
<li>Welsher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+route+to+brightly+fluorescent+carbon+nanotubes+for+near-infrared+imaging+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">A route to brightly fluorescent carbon nanotubes for near-infrared imaging in mice.</a> Nat. Nano. 4, 773-780 (2009).</li>
<li>Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+dependent+cellular+uptake+and+expusion+of+single-wall+carbon+nanotubes%3A+single+particle+tracking+and+a+generic+uptake+model+for+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Size dependent cellular uptake and expusion of single-wall carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles.</a> ACS Nano. 3, 149-158 (2009).</li>
<li>Al-Jamal, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+mechanisms+of+functionalised+multi-walled+carbon+nanotubes+by+3D+electron+tomography+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake mechanisms of functionalised multi-walled carbon nanotubes by 3D electron tomography imaging.</a> Nanoscale. 3, 2627-2635 (2011).</li>
<li>Reuel, N. F., Dupont, A., Thouvenin, O., Lamb, D. C., Strano, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Tracking+of+Carbon+Nanotubes+within+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Tracking of Carbon Nanotubes within Living Cells.</a> ACS Nano. 6, 5420-5428 (2012).</li>
<li>Phanse, Y., Ramer-Tait, A. E., Friend, S. L., Carrillo-Conde, B., Lueth, P., Oster, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Cellular+Internalization+of+Nanoparticles+and+Bacteria+by+Multi-spectral+Imaging+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (64), e3884(2012).</li>
<li>Qian, F., Montgomery, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Imaging+of+Lineage-specific+Toll-like+Receptor-mediated+Signaling+in+Monocytes+and+Dendritic+Cells+from+Small+Samples+of+Human+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood.</a> J. Vis. Exp. (62), e3741(2012).</li>
<li>Marangon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+Carbon+Nanotube+Translocation+Assessed+by+Flow+Cytometry+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Intercellular Carbon Nanotube Translocation Assessed by Flow Cytometry Imaging.</a> Nano Lett. 12, 4830-4837 (2012).</li>
<li>Lacerda, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+mechanisms+of+chemically+functionalised+carbon+nanotubes+across+plasma+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Translocation mechanisms of chemically functionalised carbon nanotubes across plasma membranes.</a> Biomaterials. 33, 3334-3343 (2012).</li>
<li>Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAl-Jamal%2C+KT+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Balasubramanian, K., Burghard, M. 625, Humana Press. 123-124 (2010).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+of+Transmembranal+Mechanism+and+Subcellular+Localization+of+Noncovalently+Modified+Single-Walled+Carbon+Nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">New Insights of Transmembranal Mechanism and Subcellular Localization of Noncovalently Modified Single-Walled Carbon Nanotubes.</a> Nano Lett. 10, 1677-1681 (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

1. Wijziging en probleemoplossing
In deze studie was het eerste doel om de hoeveelheid en lokalisatie van CNT's in cellen te evalueren. De confocale microscopie zou a priori de gouden methode kunnen zijn om de intracellulaire verdeling van CNT's gefunctionaliseerd met de fluorescerende marker FITC8,14 te beoordelen. Echter, het grootste nadeel is de beperking tot beeldvorming van enkele cellen en daarom een gebrek aan statistisch relevante gegevens. De ImageStream maakt werk mogelijk buiten deze obstakels: door het screenen van een groot aantal cellen (5.000-10.000) in een korte tijd (<min), levert het statistisch robuuste resultaten op, verbeterd door de hoge resolutie beeldvorming die voor elke cel beelden met een subcellulaire resolutie (0,5 µm) levert. Het maakt dan mogelijk om een grote hoeveelheid gegevens te analyseren op basis van enkele beeldanalyse.
In vergelijking met conventionele flowcytometrie is het unieke voordeel van ImageStream om multispectrale beelden van elke cel te leveren en een pixel per pixel vergelijking van signaalintensiteit. Dus combineert ImageStream de statistische kracht van hoogdoorvoer flowcytometrie met de analytische voordelen van confocale beeldvorming voor elke geanalyseerde cel. Het is cruciaal voor een label-vrije relatieve kwantificering en lokalisatie van CNT's in cellen.
2. Kritische stappen binnen het protocol
De kritieke stap bestaat uit de keuze van de parameters die het meest geschikt zijn voor elke studie. In ons geval was de beste manier om de analyse te baseren op de absorptie- en verstrooiingseigenschappen van de nanobuizen: de goede correlatie tussen de lokalisatie van donkere vlekken op BF en heldere vlekken op DF ondersteunt dat de ontwikkelde methode relevant en betrouwbaar is - en mogelijk niet zou zijn geweest zonder celafbeeldingen.
3. Beperkingen van de techniek
Het moet worden benadrukt dat de visualisatie van CNT's in cellen alleen mogelijk was omdat ze de neiging hebben om zich te accumuleren in endosomale intracellulaire blaasjes, en dan verschijnen als sterke absorberende en verstrooiende vlekken. Individuele nanobuizen mogen niet worden gedetecteerd op basis van deze methode, terwijl het uiteindelijk op fluorescentie zou kunnen worden gedetecteerd, wat een duidelijke beperking vormt. Ten tweede is de kwantificering niet 'absoluut', maar relatief voor verschillende labelconcentraties en in vergelijking met de controle ongelabelde cellen. Sommige kwantitatieve kenmerken (gemiddelde pixel, intensiteit, etc.) zijn absolute parameters, terwijl andere afhankelijk zijn van de keuze van de maskers (drempelmasker, lokalisatiemaskers).
4. Betekenis ten opzichte van bestaande methoden
Met betrekking tot fluorescentie, benadrukt de ImageStream-analyse de slechte colocalisatie van CNT-clusters tussen FITC helder signaal en vlekken op de andere kanalen. Daarom lijkt het erop dat fluorescentie geen betrouwbare indicator was voor de kwantificering en lokalisatie van CNT's. Desondanks, door de beperking van conventionele flowcytometrie, die voornamelijk gebaseerd is op fluorescentie kwantificering, overwint de multispectrale hoogdoorvoer ImageStream de weg voor een statistische label-vrije kwantificering, terwijl het de lokalisatie van koolstofnanobuizen in de cellen biedt.
5. Toekomstige toepassingen
Deze hoogdoorvoer statistische nanometrologie methode zou kunnen worden gegeneraliseerd naar alle nanomaterialen, die een hoge absorptie en verstrooiing van licht vertonen bij interactie met cellen. Daarom kan het belangrijke toepassingen hebben voor onderzoeken naar de nano-bio-interface, nanotoxicologie en nanogeneeskunde.

Gedurende de laatste decennia is de plaats van nanodeeltjes steeds belangrijker geworden in een breed scala aan toepassingen. Met name koolstofnanobuizen (CNT's) worden steeds meer onderzocht als nanotools voor diverse diagnostische en therapeutische toepassingen; dankzij hun specifieke elektrische, thermische en spectroscopische eigenschappen kunnen CNT's fungeren als transportmiddelen voor verschillende medicijnen of contrastmiddelen, of ook betrokken zijn bij weefselengineering1.
Er zijn echter nog steeds zorgen over de mogelijke toxiciteit van dergelijke nanomaterialen, vooral omdat het lot van CNT's in het organisme erg controversieel blijft. Er is inderdaad een gebrek aan geschikte methoden om ze in levende cellen en weefsels te detecteren en te kwantificeren: bijvoorbeeld, technieken zoals Raman-spectroscopie, foto-akoestische en nabij-infrarood fotoluminescentie-beeldvorming zijn voorgesteld, maar elke methode vertoont beperkingen afhankelijk van het type nanobuis en/of hun omgeving2-8.
Hier kan de voorgestelde methode toepasbaar zijn voor de detectie en kwantificering van nanodeeltjes in cellen. Dit werd mogelijk gemaakt door het gebruik van ImageStream, een apparaat dat zowel flowcytometrie als hoogwaardige beeldvorming combineert. Het koppelt de voordelen van het verzamelen van een groot aantal cellen (tot 5000 gebeurtenissen/sec) - en de voordelen van statistische gegevens en hoge resolutiebeelden van elke cel tegelijkertijd (ruimtelijke resolutie van 0,5 μm). Over het algemeen worden beelden verzameld met behulp van een CCD-camera en zijn het een tweedimensionale grijstintweergave van de cel. Het licht wordt gekwantificeerd voor elk pixel in het beeld en identificeert zowel de intensiteit als de locatie van zowel fluorescentie als componenten met een subcellulair formaat (bijvoorbeeld in BF), waardoor een krachtige mogelijkheid ontstaat om cellen te onderscheiden op basis van hun uiterlijk9,10. 
Het doel was hier om een nanometrie-methode te ontwerpen die een kwantitatieve beoordeling van de verdeling en het gedrag van CNT's in cellen mogelijk zou maken. In het bijzonder werd deze methode ontwikkeld om de cellulaire opname, verwerking en exocytose van CNT's door cellen te bestuderen. We hebben eerst het complexe cellulaire verkeer van CNT's aangetoond en ten tweede de overdracht van deze nanomaterialen tussen cellen: cel-geïnternaliseerde CNT's ontsnappen aan hun gastheercellen wanneer ze gestrest zijn, verspreiden zich in de extracellulaire ruimte en worden opnieuw geïnternaliseerd door naïeve cellen, of ze nu homotypisch of heterotypisch zijn11
.
Eerder onderzoek toonde aan dat verschillende mechanismen van celopname, ofwel actieve of passieve, kunnen optreden, afhankelijk van CNT-functionalisatie en aggregatietoestand12. Hier werden de meerwandige CNT's gefunctionaliseerd door middel van 1,3-dipolaire cycloadditie en amidatie en vervolgens gederivatiseerd met een fluorescerende sonde, fluoresceïne isothiocyanate (FITC). Bij transmissie-elektronenmicroscopie lijken ze te worden geïnternaliseerd door cellen, hetzij individueel met cytosolische lokalisatie of als bundels, meestal gevonden in endosomale en lysosomale compartimenten11. Op ImageStream verschijnen de geclusterde CNT's met een hoge correlatie als donkere vlekken op BF en heldere vlekken op DF, waardoor een duidelijk onderscheid mogelijk is tussen CNT-gelabelde cellen en controlecellen. Aan de andere kant was de verdeling van het fluorescente signaal uitgezonden door de fluorescente marker gefunctionaliseerd met CNT's niet zo goed gecolocaliseerd: inderdaad, waarschijnlijk vanwege een quenching-fenomeen, komen de groene fluorescente vlekken niet noodzakelijkerwijs overeen met de vlekken op BF en DF. Dit geeft aan dat, ten eerste, een fluorescente sonde niet verplicht is voor de detectie van CNT's met de ImageStream, en ten tweede - a fortiori - dat het niet volledig representatief is voor zowel kwantificering als lokalisatie van CNT's.
Naast het geven van een statistische relatieve kwantificering van nanodeeltjes, biedt deze methode ook informatie over de lokalisatie van CNT's in cellen, wat betekent dat het onderscheid maakt, bijvoorbeeld, CNT's in het binnenste van de cel versus die welke gebonden zijn aan het plasmamembraan. Het vermogen om CNT's op celbeelden te lokaliseren, overwint duidelijk de beperking van conventionele flowcytometrie-analyse13. De procedure werd hier ontwikkeld via de creatie van maskers die passen bij specifieke regio's van de cel en ook de donkere vlekken selecteren die overeenkomen met geladen CNT's.
Over het algemeen kan deze methode worden toegepast voor een groot aantal experimenten waarbij de visualisatie of kwantificering in cellen noodzakelijk is, op voorwaarde dat de gebruikte nanodeeltjes in staat zijn om het licht sterk te absorberen (en/of te verstrooien).

<table><tbody><tr><td>ImageStream</td><td><a href="https://www.amnis.com/imagestream.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Amnis</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lokalisatie en relatieve kwantificering van koolstofnanobuizen in cellen met multispectrale beeldvorming en doorstromende cytometrie

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Koolstofgebaseerde nanomaterialen, zoals koolstofnanobuizen (CNT's), behoren tot dit type nanodeeltjes dat zeer moeilijk te onderscheiden is van koolstofrijke celstructuren en de facto er is nog steeds geen kwantitatief methode om hun verdeling op cel- en weefselniveau te beoordelen. Wat we hier voorstellen is een innovatieve methode die de detectie en kwantificering van CNT's in cellen mogelijk maakt met behulp van een multispectrale beeldvormende flowcytometer (ImageStream, Amnis). Dit nieuw ontwikkelde apparaat integreert zowel een hoge doorvoer van cellen als hoge resolutie beeldvorming, waardoor beelden voor elke cel direct in stroom worden verkregen en daarom statistisch relevante beeldanalyse mogelijk is. Elke celbeeld wordt verkregen op helderveld (BF), donkerveld (DF) en fluorescente kanalen, die respectievelijk toegang geven tot het niveau en de verdeling van lichtabsorptie, verstrooid licht en fluorescentie voor elke cel. De analyse bestaat vervolgens in een pixel-voor-pixel vergelijking van elk beeld, van de 7.000-10.000 cellen die voor elke conditie van het experiment zijn verkregen. Lokalisatie en kwantificering van CNT's wordt mogelijk gemaakt dankzij enkele bijzondere intrinsieke eigenschappen van CNT's: sterke lichtabsorptie en verstrooiing; inderdaad verschijnen CNT's als sterk geabsorbeerde donkere vlekken op BF en heldere vlekken op DF met een nauwkeurige colocalisatie.
Deze methodologie zou een aanzienlijke impact kunnen hebben op onderzoek naar interacties tussen nanomaterialen en cellen, aangezien dit protocol toepasbaar is voor een breed scala aan nanomaterialen, voor zover ze licht voldoende kunnen absorberen (en/of verstrooien).

Een overzicht van het principe van het ImageStream-apparaat wordt gegeven in Figuur 1. Het produceert meerdere beelden met een hoge resolutie van elke cel in de flow, waaronder bright-field (BF), dark-field (DF of zijwaarts verstrooid licht) en fluorescentiekanalen, zoals geïllustreerd in Figuur 2 met drie verschillende cellen gelabeld met CNT's. De overlays van deze kanalen worden ook getoond, wat in eerste instantie de correlatie illustreert.
Aangezien alle analyses tijdens de post-processing gebaseerd zijn op celbeeldvorming, is de selectie van in focus liggende cellen cruciaal voor de studie (Figuur 3). In feite induceert de aanwezigheid van CNT's veranderingen in zowel het contrast als de gradiënt in vergelijking met niet-gelabelde cellen: cellen in focus, die een aanzienlijke hoeveelheid CNT's hebben geïnternaliseerd, hebben de neiging een lage rms-gradiënt te hebben (wat gewoonlijk de enige parameter is die wordt gebruikt voor het onderscheid tussen cellen in focus versus cellen buiten focus), maar ook een aanzienlijk contrast, wat verklaart waarom een biparametrische plot essentieel is. In Figuur 3 wordt het onderscheid getoond tussen cellen buiten focus (geel gebied) versus cellen in focus (blauw gebied).
In de cel opgenomen CNT's zijn duidelijk te onderscheiden - met name in BF, waar ze verschijnen als sterk absorberende donkere vlekken (zie het effect van diverse labelingsconcentraties, Figuur 4). Bovendien werd het gemiddelde pixelsignaal in BF geanalyseerd, wat een relatieve kwantificering van de opname opleverde: de grafieken in Figuur 5 tonen een significante toename naarmate de CNT-labelingsconcentratie stijgt (resultaten voor ongeveer 7.000 cellen per experimentele conditie).
Ten tweede is kwantificering van CNT's ook mogelijk door het gebruik van maskers, die worden toegepast op ofwel een beperkt bereik van donkere pixels van de BF, of op de pixel met een hoge intensiteit van de DF (zie voorbeelden in Figuur 6), overeenkomend met de vlekken die resulteren uit de aanwezigheid van CNT's. Door het oppervlak van deze maskers uit te zetten, kan zowel de aanwezigheid als de toename van de opname worden gehighlight (geïllustreerd in Figuur 7 met het oppervlak van het masker op BF, waarbij pixels variërend van 0-533 zijn geselecteerd).
Daarnaast kan de correlatie tussen spots op BF en DF worden geëvalueerd door de DF-intensiteit uit te zetten tegen het gemiddelde BF-pixelsignaal (zoals in Figuur 8) (maskeronafhankelijke analyse) of de oppervlakte van het masker op BF (Masker 1) tegenover de oppervlakte op DF (Masker 2).
Wat betreft de procedure die is ontwikkeld voor de lokalisatie van CNT's in de cellen, toont Figuur 9A de verschillende maskers die zijn aangemaakt. Let erop dat de robuustheid van de lokalisatiemaskers (gebaseerd op erosie van het standaard celmasker) visueel moet worden gecontroleerd op een verzameling gelabelde en ongelabelde cellen. Dezelfde maskers worden gebruikt voor alle monsters.
Het uitzetten van het totale oppervlak van zwarte vlekken op het celmembraan tegenover dat op de gehele cel geeft een score voor internalisatie voor cellen die gedurende 20 uur bij 37 °C zijn geïncubeerd in vergelijking met een incubatie van 2 uur bij 4 °C (zie Figuur 9B); dit geeft aan dat CNT's bij 4 °C zich voornamelijk op het membraan bevinden, terwijl CNT's bij 37 °C in meer dan 90% van de cellen zijn geïnternaliseerd.
Ten slotte met betrekking tot de fluorescentie: deze parameter werd niet gebruikt als indicator voor de kwantificering van CNT's vanwege een te lage correlatie tussen fluorescentiepuntjes en puntjes in BF (en DF). In feite geeft de correlatie tussen de FITC-intensiteit en de gemiddelde pixelwaarde van het bright field een Pearson-correlatiecoëfficiënt van -0,2 aan. In Figuur 10 worden twee gevallen geïllustreerd waarin het fluorescentiesignaal wel of niet correct overeenkomt met de zwarte stip in het bright field.
<img alt="Optische lay-out van de ImageStream: diagram dat de flowcytometrie-opstelling met laser-excitatie en detectie laat zien." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1. Overzicht van de algemene werking van de ImageStream.Het multispectrale imaging-systeem legt tot 12 beelden per cel vast in drie verschillende modi: brightfield, darkfield en fluorescentie. De opstelling bestaat uit 5 excitatie-lasers, waaronder 405, 488, 560 en 658 nm. Licht wordt verzameld van de cellen die door de cuvette stromen met verschillende objectieflenzen (in deze studie werd de 40X objectieflens gebruikt) en doorgegeven aan het spectrale decompositie-element, dat bestaat uit een set langpassfilters in een hoekige array. De CCD-camera die celbeelden verzamelt, werkt met een techniek genaamd time-delay-integration om beeldstrepen te voorkomen. Extended depth of field (EDF) is een optie.
<img alt="Celbeeldvorming, fluorescentiemicroscopie, FITC-labeling, helderveld, donkerveld, 2 μm schaal, analyse." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 2"> 
Figuur 2. Beeldengalerij van cellen gelabeld met koolstofnanobuisjes (50 μg/mL) vastgelegd door ImageStream via diverse kanalen (helderveld (BF), donkerveld (DF), fluorescentie (FITC) en hun overlays). CNTs opgesloten in intracellulaire lysosomen verschijnen als grote zwarte stippen op helderveldbeelden. Omgekeerd creëren ze heldere stippen op de donkerveld- en fluorescentiebeelden.
<img alt="Analyse van celbeeldvorming; gradiënt RMS versus contrast-spreidingsdiagrammen; diagram met celmorfologiedata." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 3"> 
Figuur 3. Selectie van cellen in focus. Een bivariate dotplot die de root mean square (rms) gradiënt tegenover het contrast op BF-beelden weergeeft, maakt het mogelijk om onscherpe cellen uit te sluiten. Hier vertegenwoordigt het gele gebied de onscherpe cellen, terwijl de cellen in focus in het blauw zijn weergegeven. De onscherpe cellen worden gekenmerkt door zowel een laag contrast als een lage gradiënt rms op het bright field-beeld. Naast de rms-gradiënt is de contrastkenmerk vereist om cellen in focus te onderscheiden na hun labeling met CNTs.
<img alt="Cellulaire respons op toenemende concentraties; microscoopafbeelding; studie naar veranderingen in celmorfologie." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 4"> 
Figuur 4. Dosisafhankelijke opname van CNT's gevisualiseerd door ImageStream. Het aantal en de oppervlakte van de zwarte stippen op de brightfield-beelden nemen toe met de dosis CNT's tijdens incubatie met cellen (variërend van 0-50 µg/ml). Let op dat de controlecellen geen zwarte stippen vertonen.
<img alt="Grafiek van de gemiddelde pixelintensiteit bij statisch evenwicht; genormaliseerde frequentie; dosisrespons; data-analyse." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 5"> 
Figuur 5. Relatieve kwantificatie van CNT-opname op basis van de brightfield-beelden.Histogrammen van de gemiddelde pixelkenmerken toegepast op het "object"-masker met de gehele cel tonen duidelijk een dosisafhankelijk gedrag, dat gebruikt kan worden voor kwantificatie. Het R9-bereik omsluit de CNT-positieve cellen.
<img alt="Brightfield- en darkfield-microscopiebeelden, analyse van maskerintensiteit, differentiatie van cellulaire structuren." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 6"> 
Figuur 6. Creatie van maskers voor het selecteren van zwarte vlekken op BF-beelden en heldere vlekken op DF-beelden. Aangezien CNT's verschijnen als sterk absorberende donkere vlekken op het BF-beeld, wordt een drempelmasker gemaakt om een beperkt bereik van pixels met een lage intensiteit te selecteren, in deze studie tussen 0-533 (Masker 1, notatie: Intensity(M01, BF, 0-533)). Omgekeerd wordt een masker dat past bij de pixels met een hoge intensiteit (in dit geval 150-4095) op het DF-beeld (Masker 2, notatie: Intensity (M06, DF, 150-4095)) gebruikt om heldere vlekken op DF te selecteren, die overeenkomen met gebieden met een hoge verstrooiing.
<img alt="Frequentieverdelingsgrafiek van gebiedsintensiteit bij verschillende concentraties; controle tot 50 μg/mL." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 7"> 
Figuur 7. Dosisafhankelijke opname van CNT's wordt aangetoond door kwantificatie van het oppervlak van de zwarte vlekken op BF-beelden. Door een drempelmasker (mask 1) toe te passen op de BF-beelden, kan het oppervlak van de zwarte vlekken per cel worden gekwantificeerd, wat een dosisafhankelijke verdeling laat zien.
<img alt="Spreidingsdiagram dat de analyse van pixelintensiteit en objectoppervlakte voor vergelijking van beeldengegevens laat zien." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 8"> 
Figuur 8. CNT-kwantificeringsmethoden op basis van BF- (absorptie) en DF- (verstrooiing) beelden zijn gecorreleerd. Links is de gemiddelde pixel op het BF-beeld versus de intensiteit op het DF-beeld weergegeven, wat een goede correlatie laat zien voor cellen gelabeld met CNT's (50 µg/ml) (Pearson-correlatiecoëfficiënt r = -0,68). Rechts is het oppervlak van het masker dat de donkere vlekken op BF past versus het oppervlak van het masker dat de lichte vlekken op DF past weergegeven voor cellen gelabeld met CNT's (50 µg/ml). De Pearson-correlatiecoëfficiënt is r = -0,83. Waarden van 7.000 cellen zijn uitgezet.
<img alt="Diagram van celanalyse met temperatuureffecten, spreidingsdiagrammen en evaluatie van het membraanoppervlak bij verschillende condities." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 9"> 
Figuur 9. Lokalisatie van CNT in cellen met behulp van specifieke maskers. (A) Er zijn maskers gemaakt die passen bij een specifieke locatie van de cel, namelijk van links naar rechts - de gehele cel, alleen het membraan en het binnenste van de cel. Een ander masker past op zwarte vlekken dankzij een drempelintensiteit (Masker 1, notatie: Intensity(M01, BF, 0-533)). (B) De beoordeling van de lokalisatie van CNTs kan worden verkregen door het oppervlak van de zwarte vlekken op verschillende lokalisaties van de cellen te meten met behulp van de in A beschreven lokalisatiemaskers. Incubatie met CNTs (50 µg/ml) werd uitgevoerd bij zowel 37 °C als bij 4 °C om het internalisatiepad te remmen. De grafiek die het zwarte oppervlak op het membraan tegenover het zwarte oppervlak op de gehele cel weergeeft, toont een dosisafhankelijke absorptie van CNTs op het membraan bij 4 °C, terwijl de volledige internalisatie van CNTs effectief is bij 37 °C.
<img alt="Fluorescentiemicroscopie, celanalyse, FITC-kleuring, brightfield en fluorescentie-overlay." fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 10"> 
Figuur 10. Colocalisatie van door CNT geïnduceerde zwarte stippen op BF met fluorescentie heldere vlekken op de FITC-afbeelding. De heldere fluorescentievlekken zijn niet altijd gecolocaliseerd met de zwarte stippen op BF. Ze komen correct overeen voor de eerste twee getoonde cellen, maar niet voor de laatste twee cellen.

In deze studie was het belangrijkste doel om de cellulaire opname en uiteindelijke exocytose van koolstofnanobuizen (CNT's) te monitoren. Vanuit dit perspectief stelden we hier een unieke methode voor die gebruikmaakt van multispectrale beeldvorming en stromende cytometrie, waardoor een kwantificering en lokalisatie van CNT's in een statistisch relevant aantal cellen mogelijk is.

Lokalisatie en relatieve kwantificering van koolstofnanobuizen in cellen met multispectrale beeldvorming en doorstromende cytometrie

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het leveren van een nanometrologische methode voor het monitoren en kwantificeren van de cellulaire opname van koolstofnanobuisjes in een statistisch relevant aantal cellen. Dit wordt bereikt door de cellen eerst te behandelen met in water disperseerbare koolstofnanobuisjes, die de cellen op een concentratieafhankelijke manier binnendringen. Deze koolstofnanobuisjes worden uiteindelijk gelabeld met een fluorescentiemarker.Na de fixatie wordt elke cel vervolgens afgebeeld in de bright field-, dark field- en fluorescentiekanalen van een multispectrale imaging flowcytometer. Om de distributie van de koolstofnanobuisjes en het niveau van lichtabsorptie, verstrooid licht en fluorescentie te visualiseren, wordt de labeling van de nanobuisjes in elke cel op pixelniveau geanalyseerd. Uiteindelijk maken de intrinsieke lichtabsorptie en verstrooiing binnen de cellen de lokalisatie en kwantificering van de koolstofnanobuisjes mogelijk.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van nieuwe vragen in de velden van de nanotoxicologie en nanogeneeskunde, zoals de impact en het lot van koolstofgebaseerde materialen in levende cellen, en tevens het potentieel van koolstofnanobuisjes als systeem voor medicijnafgifte. Begin met het dispergeren van de koolstofnanobuisjes, die uiteindelijk gekoppeld zijn aan een fluorescent label, in celcultuurwater. Sonicate vervolgens de nanobuisjes in een waterbadsonicator bij 20 °C gedurende 20 minuten. Verdun daarna de nanobuisjes tot concentraties van 0, 10, 20 en 50 µg/mL in compleet medium, en incubeer vervolgens 2 mL van elke verdunning met de betreffende cellen in een plaat van 25 cm² per verdunning bij 37 °C. Verwijder na 20 uur het incubatiemedium uit elke plaat en spoel de met koolstofnanobuisjes gelabelde cellen met PBS.Na het wassen worden de cellen op elke plaat behandeld met trypsine en vervolgens geresuspendeerd in volledig DMEM-medium. Draag vervolgens elk monster over naar individuele 15 milliliter falcon-buizen en centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 200 ×g en kamertemperatuur. Resuspendeer elk pellet in 4% paraformaldehyde bij vier °C gedurende één uur.Na fixatie de cellen opnieuw centrifugeren en elk gepelleteerde monster resuspenderen op 15 x 10⁵ cellen in 150 µL PBS. Filter de monsters vervolgens door individuele zeefjes met een maaswijdte van 50 micron om beelden van de cellen te verkrijgen met een ImageStream multispectrale imaging flowcytometer.Selecteer eerst een geschikte vergroting en beeld beeld vervolgens de monsters van belang. Gebruik een laser van 685 nanometer voor dark field-beeldvorming en stel de flowcytometer in. Gebruik kanaal zes om de dark field-emissie te verzamelen met een banddoorlaatfilter van 745 tot 800 nanometer.Beeld de monsters af in kanaal één voor helderveld en kanaal zes voor donkerveld voor beeldanalyse. Maak vervolgens een parametrische dotplot van de breedte-hoogte-aspectratio tegenover het celoppervlak. Dit maakt het mogelijk om individuele cellen, die een standaardoppervlak en een aspectratio dicht bij één hebben, te onderscheiden van multicellulaire gebeurtenissen, die een groot oppervlak en een kleine aspectratio hebben, en van debris, dat een extreem klein oppervlak vertoont.Nadat de celbeelden zijn gebruikt om te verifiëren dat de enkelvoudige cellen correct zijn geselecteerd, wordt een biparametrische dot plot opgesteld voor cellen met een hoog contrast die zijn gelabeld met koolstofnanobuisjes. Hierbij wordt het contrast uitgezet tegen de root mean square gradient om cellen met een lage root mean square gradient en een laag contrast (niet in focus) uit te sluiten en de cellen in het brandvlak te selecteren. Gebruik vervolgens de tool 'find best feature' om de parameter te bepalen die de beste statistische scheiding biedt tussen de gelabelde en niet-gelabelde cellen. Voor dit representatieve experiment is bijvoorbeeld de feature 'mean pixel object' het meest geschikt.Zet vervolgens deze parameter uit tegen de genormaliseerde frequentie om een histogram te maken voor de kwantificering van de door de cellen opgenomen nanobuisjes bij elke experimentele concentratie. Maak nu een biparametrische grafiek van het gemiddelde pixelobject in het helderveld tegenover de intensiteit in het donkerveld. Om de correlatie tussen deze twee parameters te controleren, wordt de kwantificering van de nanobuisjes ook beoordeeld door maskers te maken op de celbeelden, aangezien de koolstofnanobuisjes verschijnen als intense donkere vlekken in het helderveldkanaal; selecteer een beperkt bereik van pixels met een lage intensiteit, bijvoorbeeld tussen nul en 533, om het drempelmasker te creëren dat precies aansluit op de donkere nanobuisjes, en maak vervolgens een tweede masker, aangeduid als masker twee, voor het visualiseren van de nanobuisjes die helder verschijnen in het donkerveldkanaal.Selecteer een bereik van pixels met een hoge intensiteit. Voor dit experiment is bijvoorbeeld een bereik van 150 tot 4.095 gekozen. Gebruik vervolgens het gebied van óf bright field mask one óf dark field mask two om een dot plot op te stellen om de relatieve internalisatie van de nanotubes te kwantificeren.Zet bijvoorbeeld het gebied op kanaal zes dat overeenkomt met het donkerveld met masker twee uit tegen het gebied op kanaal één, dat overeenkomt met het helderveld met masker één. Nadat de lineaire correlatie tussen masker één en masker twee is bepaald, kunnen de nanobuizen binnen het cytoplasma worden gevisualiseerd door eerst een masker van de gehele cel te maken en vervolgens het masker te eroderen. De nu aangeduide erode M 0 1 7 met zeven pixels om het binnenste van de cel te bekijken.Om de koolstofnanobuisjes binnen het celmembraan te visualiseren, gebruikt u de Booleaanse vergelijking M zero one and not erode M 0 1 7. Dit is het masker van de gehele cel, aftrokken van het binnenste van de cel om een masker van alleen het membraan te creëren, zodat de donkere pixels op het membraan kunnen worden geëvalueerd. Pas het brightfield-masker één toe op het membraanmasker.Pas al deze maskers tegelijkertijd toe op meerdere cellen om het onderscheid tussen de gelabelde en ongelabelde monsters te bevestigen. Selecteer vervolgens de zwarte pixels op het membraan met de tool voor kenmerkgebieden om de koolstofnanobuisjes op het celmembraan te kwantificeren. Maak tot slot onderscheid tussen de koolstofnanobuisjes die geïnternaliseerd zijn en diegenen die aan het membraan zijn geadsorbeerd.Zet het zwarte oppervlak van het membraan uit tegen het zwarte oppervlak van de gehele cel. Zodra alle plots voor één experimentele conditie zijn gemaakt, maakt u een sjabloon voor het statistische rapport. Sla het sjabloon op als een A ST-bestand en verwerk alle databestanden in een batch.Het image stream-apparaat produceert meerdere beelden met een hoge resolutie van elke cel in de flowcytometer, waaronder brightfield-, darkfield- en fluorescentiekanalen, zoals hier wordt gedemonstreerd met drie verschillende met nanobuisjes gelabelde cellen. De overlays van deze kanalen worden ook getoond. De aanwezigheid van koolstofnanobuisjes veroorzaakt veranderingen in zowel het contrast als de gradiënt van gelabelde cellen in vergelijking met niet-gelabelde cellen.Daarom is het maken van een biparametrische dot plot belangrijk voor het selecteren van de focuscellen. Niet-gefocuste cellen in het geel kunnen worden onderscheiden door hun lage contrast en lage root mean square gradiënt, ongeacht de aanwezigheid of afwezigheid van nanotube-labeling. Niet-gelabelde focuscellen vertonen eveneens een laag contrast, maar vertonen een hoge root mean square gradiënt wanneer de focuscellen met nanotubes zijn gelabeld; de cellen vertonen echter een profiel met een hoog contrast en een lage root mean square gradiënt.Geïnternaliseerde koolstofnanobuisjes zijn gemakkelijk te onderscheiden, met name in het Brightfield-kanaal, waar ze verschijnen als intense donkere vlekken waarvan de oppervlakte toeneemt met de concentratie nanobuisjes. Wanneer de gemiddelde pixelsignalen van de brightfield-beelden worden geanalyseerd, kan een relatieve kwantificering van de opname van de nanobuisjes worden bepaald. Deze histogrammen tonen bijvoorbeeld de significante toename in de opname van nanobuisjes die optreedt bij elke verhoging van de labelingsconcentratie van de nanobuisjes; zoals aangetoond is kwantificering van koolstofnanobuisjes ook mogelijk door het gebruik van maskers die worden toegepast op ofwel een beperkt bereik van donkere pixels binnen een brightfield-beeld, ofwel binnen de pixels met een hoge intensiteit in het darkfield, overeenkomend met de gebieden waar de nanobuisjes aanwezig zijn.Door het oppervlak van deze maskers uit te zetten, kan de opname van koolstofnanobuisjes verder worden gekwantificeerd. Daarnaast kan de correlatie tussen de vlekken in de brightfield- en darkfield-beelden worden geëvalueerd door de darkfield-intensiteit uit te zetten tegen het gemiddelde pixelsignaal van het brightfield, of door het oppervlak van het masker in het brightfield uit te zetten tegen het oppervlak in het darkfield. In de volgende twee figuren worden analyses getoond van de koolstofnanobuisjes die gelokaliseerd zijn in het binnenste van de cel.Deze eerste afbeeldingen tonen de verschillende maskers die zijn gemaakt. Let erop dat de robuustheid van de lokalisatiemaskers, gebaseerd op de erosie van het standaardcelmasker, visueel gecontroleerd moet worden op de verzameling gelabelde en ongelabelde cellen. Zoals zojuist in deze dot plots is aangetoond, zijn het totale oppervlak van de zwarte vlekken op het celmembraan versus dat van de gehele cel uitgezet om de internalisatiescore te bepalen.Voor cellen die 20 uur bij 37 °C zijn geïncubeerd, in vergelijking met cellen die twee uur bij 4 °C zijn geïncubeerd, bevindt de meerderheid van de koolstofnanobuisjes zich op het membraan, terwijl de koolstofnanobuisjes bij 37 °C in meer dan 90% van de cellen zijn geïnternaliseerd. Fluorescentie van de koolstofnanobuisjes is geen goede indicator voor de internalisering van de koolstofnanobuisjes vanwege een te lage correlatie tussen de fluorescerende vlekken en de vlekken binnen de brightfield- en darkfield-kanalen. In feite geeft de correlatie tussen de fitzy-intensiteit en de gemiddelde pixel van het brightfield een Pearson-correlatiecoëfficiënt van min 0,2 aan.Zoals in deze afbeeldingen wordt aangetoond, komt het fluorescentiesignaal niet consistent overeen met de zwarte vlekken in het helderveld; koolstofnanobuisjes, opsluiting en aggregatie binnen intracellulaire lysosomen hebben het fluorescentiesignaal gedeeltelijk gedoofd. In contrast hiermee kunnen gedispergeerde nanobuisjes na hun ontwikkeling een betrouwbaarder fluorescentiesignaal geven. Deze techniek baant de weg voor onderzoekers in het veld van de nanotechnologie en nanogeneeskunde om de interactie van levende cellen met op koolstof gebaseerde nanomaterialen, of andere nanomaterialen met een hoge absorptie en verstrooiingscapaciteit, te onderzoeken met behulp van een statistische high-throughput cytometrie-methode.

localization-relative-quantification-carbon-nanotubes-cells-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Lokalisatie en relatieve kwantificering van koolstofnanobuisjes in cellen met multispectrale beeldvorming door middel van flowcytometrie

In dit artikel beschrijven we een methode gebruik te maken van multi-spectraal imaging flowcytometrie om de internalisering van polyanhydride nanodeeltjes of bacteriën door RAW 264.7 cellen te kwantificeren.

Het analyseren van cellulaire internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie

This video demonstrates the labeling of neuronal cells with antibodies for mitochondrial respiratory chain complexes, mitochondrial DNA-associated protein, and mitochondrial outer membrane protein, followed by flow cytometry to quantify their levels.

Measurement of Multiple Mitochondrial Parameters in Neurons using Flow Cytometry

Complex weefsel massa, van organen tumoren, zijn samengesteld uit verschillende cellulaire elementen. We opgehelderd de bijdrage van cellulaire fenotypes binnen een weefsel met behulp van multi-gelabelde fluorescerende transgene muizen in combinatie met multiparameter immunofluorescentiekleuring gevolgd door spectrale unmixing naar cel oorsprong evenals karakteristieken van de cel op basis van eiwit expressie ontcijferen.

Kwantitatieve Multispectral Analyse Na Fluorescent Tissue Transplantatie voor Visualisatie van de Cel Origins, types en interacties

Analyse van nanodeeltjes interactie met gedefinieerde subpopulaties van immune cellen door flowcytometrie.

Detectie van TL Nanoparticle Interacties met Primary Immune celtypes door flowcytometrie

Om stromingssnelheden en directionaliteit van filamenteus-actine bij de T-cel immunologische synaps te onderzoeken, wordt live-cell superresolutie beeldvorming gecombineerd met totale interne reflectiefluorescentie en gekwantificeerd met behulp van ruimte-tijdelijke beeldcorrelatiespectroscopie.

Corticale actine Flow in T-cellen gekwantificeerd door ruimte en tijd Afbeelding Correlatie Spectroscopie van Structured Verlichting Microscopie Gegevens

Hier, multispectrale beeldvormende flowcytometrie met een analytische functie die heldere detailafbeeldingen van 3 autofagie markers vergelijkt en kwantificeert hun co-lokalisatie, samen met LC3 spot counting, werd gebruikt om autofagie op objectieve, kwantitatieve en statistisch robuuste wijze te meten.

Autofagische Flux beoordelen door LC3-, P62- en LAMP1-co-lokalisatie met behulp van Multispectrale Imaging Flow Cytometry

Hier presenteren we een protocol voor Multi-Color lokalisatie van één membraaneiwitten in organellen van levende cellen. Als u wilt koppelen fluorophores, worden zelf labeling eiwitten gebruikt. Eiwitten, gelegen in verschillende membranen compartimenten van de dezelfde organel, kunnen worden gelokaliseerd met een nauwkeurigheid van ~ 18 nm.

Multi-Color lokalisatie microscopie van één membraaneiwitten in organellen van de cellen van levende zoogdieren

Dit artikel illustreert een krachtige methode om te kwantificeren mitochondriën of lysosomen in levende cellen. De combinatie van lysosoom - of mitochondriën-specifieke kleurstoffen met fluorescently geconjugeerde antilichamen tegen oppervlakte markeringen zorgt ervoor dat de kwantificering van deze organellen in gemengde cel populaties, zoals primaire cellen geoogst van weefselmonsters, met behulp van Multicolor stroom cytometry.

Multicolor Stroom Cytometry gebaseerde kwantificering van Mitochondria en lysosomen in T cellen

De in-vitro-micronucleustest is een gevestigde methode voor het evalueren van genotoxiciteit en cytotoxiciteit, maar het scoren van de test met behulp van handmatige microscopie is moeizaam en lijdt onder subjectiviteit en variabiliteit tussen de scorer. Dit artikel beschrijft het protocol dat is ontwikkeld om een volledig geautomatiseerde versie van de test uit te voeren met behulp van multispectrale beeldvormings stroom cytometrie.

Een geautomatiseerde methode voor het uitvoeren van de in-vitro micronucleus assay met behulp van multispectrale beeldvormings stroom Cytometrie

Anodische boogontlading is een van de meest praktische en efficiënte methoden om diverse koolstofnanostructuren synthetiseren. Ter verhoging van de boog beheersbaarheid en flexibiliteit, was een niet-uniform magnetisch veld kennis met de een-staps synthese van grootschalige grafeen vlokken en hoogzuivere single-walled carbon nanotubes proces.

Gelijktijdig Synthese van enkelwandige koolstof nanobuisjes en grafeen in een magnetisch-enhanced Arc Plasma

Leer een methode voor kwantificering en lokalisatie van koolstofnanobuizen in cellen met multispectrale beeldvorming en doorstromende cytometrie. Deze aanpak verbetert het begrip van nanotoxicologie en nanomedicijnen.

Lokalisatie en relatieve kwantificering van koolstofnanobuizen in cellen met multispectrale beeldvorming en doorstromende cytometrie (Video) | JoVE Journal

Lokalisatie en relatieve kwantificering van koolstofnanobuizen in cellen met multispectrale beeldvorming en doorstromende cytometrie

Meer video's verkennen