Cel dood in verband met abnormale Mitosis Waargenomen door confocale Imaging Live kankercellen

Het algemene doel van het volgende experiment is om het cytotoxische effect van het anthracycline-derivaat PJ 34 tijdens de mitose in centrosomale menselijke kankercellen te observeren. Dit wordt bereikt door centrosomen te labelen met GFP gamma-tubuline en chromosomen met H2B-rood via transfectie. Het doel van de transfectie is om het mogelijk te maken de migratie en clustering van centrosomen en de rangschikking van chromosomen tijdens de mitose in levende centrosomale kankercellen te volgen.

Als tweede stap worden sommige van de getransfecteerde cellen blootgesteld aan PJ 34, een molecuul dat fungeert als een extra middel voor het opruimen van centrosomen. Vervolgens worden de getransfecteerde levende kankercellen gescand met confocale microscopie om gebeurtenissen tijdens de mitose vast te leggen die geassocieerd zijn met de migratie van centrosomen en chromosomen. De herschikking of clustering van de opeenvolgende verkregen beelden toont de opruimende en cytotoxische effecten van de behandeling met PJ 34 in kankercellen tijdens de mitose, gebaseerd op confocale beeldvorming van levende cellen.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot een gerichte kankertherapie die uitsluitend autosomale kankercellen tijdens de mitose elimineert. Deze techniek wordt gedemonstreerd door onze samenwerkingspartners, Dr. Asher Castillo van het Cancer Research Center in het Sheba Medical Center, en Dr. Leonid Middleman van de imaging unit van de Sacko School of Medicine aan de Tel Aviv University. Om MDA-MB-231 borstkankercellen voor te bereiden voor live confocale imaging, zaai je 2 × 10⁵ cellen in glazen kweekschalen met een diameter van 35 mm die zijn gecoat met poly-D-lysine in 2 mL compleet medium en incubeer deze in 5% CO₂ bij 37 °C.

De celcultuur is klaar voor transfectie wanneer deze een confluentie van 60 tot 70% bereikt. De cellen worden getransfecteerd met twee plasmiden: één die gamma tubuline codeert en GFP voor fluorescente detectie van centrosomen, en één die histon rood codeert voor fluorescente detectie van chromosomen. De transfectie wordt uitgevoerd met het liposomale transfectiereagens Jet PI volgens het protocol van de fabrikant. Was de cellen één keer met PBS en vervang vervolgens het celmedium door twee milliliters warme DMEM zonder supplementen. Voeg het transfectiemengsel voorzichtig toe aan de cellen in DMEM en plaats de cellen vervolgens gedurende acht uur terug in de incubator.

Vervang het DMEM door twee milliliter volledig medium en incubeer de cellen in de incubator gedurende 24 uur. Na transfectie wordt het medium vervangen door twee milliliter volledig medium met 20 micromolair PGA 34.

Incubeer de cellen nog eens 18 uur vóór de live confocale imaging. Hieronder volgen de technische parameters van de instellingen van de live confocale imagingscanner. Scanmodus XYZT pinhole, airy 1.00 zoom 3.5 resolutie acht bits, laser DPSS 561 nanometers argon zichtbare laser 488 nanometers heliumneon zichtbare laser 633 nanometers.

Objectief H-C-X-P-L-A-P-O-C-S 63× 1.40 Oil UV numerieke apertuur 1.4. Scansnelheid 700 hertz en brekingsindex 1.52. Onderwerp de cellen aan live confocale imaging gedurende ten minste 16 uur in een imagingkamer, waarbij de cellen worden gehouden bij 5% carbon dioxide en 37 °C.

De transfectie-efficiëntie zal worden onderzocht via fluorescentiemicroscopie. Begin deze procedure door 2 × 10⁵ MDA MB 231-cellen uit te platen in een zeswellplaat, met één dekglasje per well, in 2 mL compleet medium. Transfecteer de cellen op dezelfde wijze als voorheen met behulp van het liposomale transfectiereagens jet PE volgens het protocol van de fabrikant.

36 uur na transfectie. Verwijder het medium uit elke put nadat de getransfecteerde cellen op een dekglas zijn gewassen met PBS. Fixeer de cellen door incubatie in een koude oplossing van methanol en aceton in een verhouding van één op één gedurende zeven minuten bij -20 °C.

Zuig na zeven minuten de fixatieoplossing af en laat het dekglas met de gemonteerde cellen 30 minuten drogen in een zuurkast. Breng vervolgens prolonged gold anti-fade reagens met DPI aan en laat het dekglas zes uur in het donker drogen. Onderzoek de slide onder een fluorescentiemicroscoop en bereken het percentage getransfecteerde cellen met rode en groene signalen.

Van de totale celpopulatie is het gewenste transfectiepercentage ongeveer 20 tot 40% wanneer er 100 tot 200 cellen worden geteld. Om met deze procedure te beginnen, zaai 2 × 10⁵ MDA-MB-231 borstkankercellen uit op glasdekglasjes in een plaat met zes putjes in 2 mL compleet medium. Voeg PJ 34 toe aan het medium en incubeer de cellen gedurende de vereiste periode.

Na voltooiing van de incubatieperiode worden de dekglasjes één keer gewassen met PBS en worden de cellen gefixeerd door incubatie in een oplossing van ijskoud methanol en aceton in een verhouding van één-op-één gedurende zeven minuten bij -20 °C. Aspireer vervolgens de fixatie-oplossing en laat de dekglasjes 30 minuten drogen in een zuurkast. Was de dekglasjes één keer met PBST om de celmembranen te permeabiliseren en blokkeer de cellen vervolgens met 10% normaal ezelsserum in PBST gedurende één uur bij kamertemperatuur.

Maak het eerste antilichaamsmengsel door primaire antifa-tubuline- en anti-gamma-tubuline-antilichamen aan de blokkeringsoplossing toe te voegen en te vortexen. Breng vervolgens 100 µL van het antilichaamsmengsel aan voor elk dekglas op een zeswellsplaatdeksel. Keer het dekglas om en plaats het voorzichtig op de antilichaamsdruppel; incubeer gedurende twee uur.

Voeg toe bij kamertemperatuur. Dit zal de spoelen en centrosomen kleuren. Plaats de dekglasjes terug in de putjes en was de cellen drie keer met PBST.

Voeg vervolgens de secundaire antilichamen, LOR 488 en LOR 568, toe (1 druppel per dekglas op een zes-wells plaatdeksel). Plaats de dekglazen vervolgens met de beeldzijde naar beneden op de antilichaamdruppels en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker. Na voltooiing van de incubatie met de secundaire antilichamen plaatst u de dekglazen terug in de wells en wast u de cellen drie keer met PBST.

Monteer tot slot de dekglasjes met Prolong Gold anti-fade reagens en incubeer deze een nacht bij kamertemperatuur in het donker om te laten drogen, alvorens de gefixeerde cellen te visualiseren met confocale microscopie. PJ 34 is een stabiele, wateroplosbare phantrodine waarvan eerder werd waargenomen dat het uitsluitend kankercellen met multicentrosomen elimineert, zonder normale cellen in mitose met twee centrosomen en bifocale spoelen aan te tasten. In deze studie werd de cytotoxische activiteit van PJ 34 onderzocht met levende menselijke borstkankercellen van het type M-D-A-M-B 231, die een hoge incidentie van extra centrosomen vertonen.

De cellen werden getransfecteerd met gamma tubuline GFP om de gamma tubuline-foci te labelen en histon H2B rood om de chromosomen te labelen. Scanning van de MDA-MB-231-cellen gedurende ten minste 16 uur met confocale imaging onthulde bifocale clustering van centrosomen, wat wijst op extra centrosomale bifocale clustering in de meerderheid van de cellen in mitose, zoals geïllustreerd in de volgende videoclips. Deze eerste video toont een willekeurig geselecteerde levende cel tijdens de mitose, waarbij de centrosomen groen zijn gelabeld door gamma tubuline.

GFP in de tweede video; chromosoomreorganisatie tijdens de mitose wordt gevisualiseerd in een willekeurig geselecteerde M-D-A-M-B 231-cel getransfecteerd met histon H twee B rood. Deze derde video is van een MDA MB 231-cel die mitose ondergaat, waarbij bifocale geclusterde extrisoomfoci groen zijn gelabeld en chromosomen rood zijn gelabeld. In tegenstelling hiermee werden niet-geclusterde centrosomen en een aberrante rangschikking van chromosomen gedetecteerd in levende getransfecteerde M-D-A-M-B 231-cellen geïncubeerd met 20 µM PJ 34, en de mitose in deze cellen eindigde in celdood, zoals afgebeeld in deze film.

Deze real-time documentatie van celdood tijdens de mitose ondersteunt sterk een eerder gedefinieerde positieve correlatie tussen het aantal menselijke maligne cellen met multipolaire spoelen in de mitose en het percentage celdood in cellen die zijn geïncubeerd met PJ 34. Aangezien PJ 34 fungeert als een potente PARP one-remmer, is de mogelijkheid onderzocht of PARP one-remming celdood veroorzaakt in verband met mitotisch falen. De cytotoxische activiteit van toenemende concentraties PJ 34 werd getest in normale en PARP one-deficiënte embryonale fibroblasten van muizen, en de resultaten worden hier getoond.

De grafiek links toont het percentage multifocale spoelen berekend in normale embryonale fibroblasten van muizen, weergegeven door de zwarte lijn, en PARP1-deficiënte fibroblasten, weergegeven door de grijze lijn, geïncubeerd gedurende 48 uur met PJ 34 bij de aangegeven concentraties. Deze percentages zijn berekend op basis van in totaal 20 gedetecteerde spoelen in drie verschillende experimenten. De grafiek rechts toont de overleving van normale en PARP1-deficiënte embryonale fibroblasten van muizen geïncubeerd gedurende 72 uur met 20 µM.

De overleving van PJ 34-cellen werd bepaald door de productie van A TP in de cellen te analyseren. De gemiddelde waarden van vier metingen voor elke cellijn in drie verschillende experimenten worden gepresenteerd. Deze resultaten tonen aan dat PJ 34 dosisafhankelijk vervormde spoelfiguren en celdood veroorzaakte in PARP one-deficiënte embryonale fibroblasten van muizen, maar niet in normale fibroblasten.

Het feit dat PJ 34 PARP1-deficiënte cellen elimineerde ondanks hun PARP1-deficiëntie, en de correlatie tussen de vorming van multifocale spoeltjes en celeliminatie in PARP1-deficiënte embryonale muis fibroblasten die werden geïncubeerd met PJ 34 bij concentraties hoger dan vereist voor PARP1-inhibitie, is niet consistent met een causaal verband tussen het opruimen van centrosomen in PARP1-deficiënte embryonale muis fibroblasten en PARP1-inhibitie. Deze confocale beelden tonen normale en PARP1-deficiënte embryonale muis fibroblasten in mitose, gefixeerd, gepermeabiliseerd en immunogelabeld voor alfa- en gamma-tubuline, waarbij hun spoeltjes respectievelijk groen en hun centrosomen rood zijn gelabeld. Chromosomen werden blauw gelabeld met DPI-reagens.

De cellen bleven onbehandeld of werden gedurende 48 uur geïncubeerd met PJ 34 in de aangegeven concentraties. Niet-geclusterde gamma-tubuline-foci, vervormde spoelvorming en celdood werden waargenomen in PARP1-deficiënte muizembryonale fibroblasten behandeld met PJ 34, maar niet in normale muizembryonale fibroblasten behandeld met PJ 34. Sommige van de onderzochte celculturen werden behandeld met twee potente niet-nicotinamide PARP1-remmers, BT 888 en G 01469, die de enzymatische activiteit van PARP1 remmen.

Geen van de geteste PARP1-remmers beïnvloedde normale embryonale muis fibroblasten bij concentraties die de PARP1-activiteit remden. Deze PARP1-remmers hadden bovendien geen effect op de centrosoomclustering in PARP1-deficiënte embryonale muis fibroblasten. Deze resultaten geven aan dat de cytotoxische activiteit van PJ 34 op cellen met multicentrosomen niet werd gedeeld door andere potente PARP1-remmers zodra deze beheerst waren.

Deze techniek kan worden toegepast in andere levende celtypen voor uiteenlopende doeleinden.