Name: Test Monsters voor het optimaliseren van STORM superresolutietechnieken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 52 s
Description: Leer hoe je testmonsters voorbereidt om STORM-superresolutiemicroscopie te optimaliseren met resoluties van 30-50 nm. Deze methode helpt onderzoekers hoogwaardige beelden te verkrijgen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij erkennen financiering uit de chemische en biologische Metrologie programma van de Britse National Measurement Office. Wij danken Sebastian van de Linde, Miklos Erdelyi en Eric Rees voor technisch advies en suggesties. Wij danken Miklos Erdelyi, Eric Rees en Max Ryadnov voor nuttige reacties en discussies over dit manuscript.

Opmerking: In dit protocol, worden tips en suggesties gevonden volgen van bepaalde stappen. De notatie &quot;* 1&quot; geeft aan dat aantekening 1 is deze specifieke stap relevant, enzovoort. 1. Fluorescerende Dextraan Coating van Glas <ol><li> Voeg 200 ul van 0,01% poly-L-lysine oplossing in elk putje van een 8-kamer dekglaasje en incubeer gedurende 10 minuten. Verwijder met een pipet om ervoor te zorgen dat er geen vloeistof is overgebleven. </li><li> Reconstitutie dextran-Alexa 647 * 1 volgens de instructies van een 2 mg / ml voorraad oplossing. Hieruit verdunnen 0,25 pi in 25 ui gedeïoniseerd water om een ​​20 ug / ml oplossing. </li><li> Een hoge dichtheid bekleding van dextran-Alexa 647 verdunde oplossing te maken 20 pl van de 20 ug / ml oplossing in een totaal van 200 pl gedeïoniseerd water. Voor een gemiddelde dichtheid oplossing verdund 2 pl in 200 pl gedeïoniseerd water (1:10.000 verdunning van de oorspronkelijke voorraadoplossing). Voor een lagedichtheid oplossing verdund in 0,2 pl 200 pl gedeïoniseerd water (1:100.000 verdunning van de oorspronkelijke voorraadoplossing). </li><li> Voeg 200 ul van de verdunde dextran-Alexa 647 oplossing in elk putje en incubeer gedurende 10 minuten. Langere incubatietijden worden gebruikt die kan resulteren in een dichtere coating dextran. Verwijder en was met H2O driemaal * 2 </li></ol> Noot 1: Andere dextran kleurstof conjugaten kunnen worden gebruikt. Geconjugeerde dextran kan ook worden geconjugeerd aan kleurstoffen desgewenst combinaties zijn niet commercieel beschikbaar. Noot 2: Dezelfde dextran kamers kunnen reimaged gedurende weken, hoewel de uniformiteit van de fluorescentie kan afnemen. Opslag bij 4 ° C in afwezigheid van een buffer aanbevolen. 2. Fluorescerende actinefilamenten op glas <ol><li> Voeg 200 ul van 0,01% poly-L-lysine oplossing in elk putje van de kamer en incubeer gedurende 10 min * 3. Rebewegen met een pipet om ervoor te zorgen dat er geen vloeistof is overgebleven. </li><li> Voeg 90 ul van algemene actine buffer (gereconstitueerd volgens instructies van de fabrikant) aan elke kamer. Voeg 10 ul van 10 uM voorgevormde actine filament oplossing en 1 pi phalloidin-Alexa 647 (0,2 eenheden, wanneer opgelost in 1,5 ml methanol volgens instructies van de fabrikant) en voorzichtig pipet op en neer te mengen. Incubeer gedurende 30 min * 4. </li></ol> Noot 3: verhoging van de gloeidraad oplossing in de kamer hoe minder filamenten binding aan de poly-L-lysine gecoate glas. Opmerking 4: incubatietijden tot 48 uur bij 4 ° C werden getest met goede resultaten. Image actinefilamenten kwaliteit verslechtert zodra een kamer is blootgesteld aan het schakelen buffer dus het is niet aan te raden om hetzelfde monster te gebruiken voor meer dan een dag. 3. Microsphere Fluorescent Beads als ijkmarkeringen <ol><li&gt; Verdun 1 ul van TetraSpeck kralen in 200 ul PBS en meng. </li><li> Voeg de verdunde kralen in een beeldvorming kamer en wacht u 15 min * 5. Verwijder de oplossing en was 3 maal met PBS voorafgaand aan beeldvorming. </li></ol> Toelichting 5 - de verdunning en incubatietijd kan worden aangepast aan verschillende dichtheden van kralen te verkrijgen. Dit protocol resulteert typisch in tussen 3-10 kralen per 20,5 micrometer x 20.5 micrometer field-of-view. 4. Epidermale groeifactor celkleuring <ol><li> Kweek HeLa cellen beeldvorming kamers tot ongeveer 80% confluentie in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine-oplossing. </li><li> Verwijder het kweekmedium en was met PBS. Voeg vervolgens 500 ui 4% formaldehyde-oplossing (4 ml 10% formaldehyde-oplossing, 1 ml 10X PBS, 5 ml water) gedurende 10 minuten. Verwijder de formaldehyde en was 3 maal met PBS. Sta niet toe dat de cellen om d blijvenry en gebruik altijd PBS gebufferde oplossingen voor hypotonic stress te vermijden. </li></ol> LET OP - formaldehyde is uiterst giftig. Zorg ervoor dat de juiste handschoenen, oogbescherming en lab jassen zijn versleten. Controleer de lokale richtlijnen voor het verwijderen van formaldehyde. <ol start="3"><li> Reconstitutie EGF-Alexa 647 volgens de instructies van een 50 ug / ml voorraad oplossing. Voeg 2 pi van deze voorraadoplossing aan 200 gl 0,1% BSA-oplossing (in PBS). Verwijder de PBS uit de cellen, voeg de EGF-oplossing en incubeer gedurende 30 minuten. </li><li> Verwijder de oplossing en was 3 maal met PBS voor het toevoegen van een blokkerende oplossing van 0,1% BSA (in PBS) gedurende 15 minuten. Verwijder deze en was nog eens 3 maal met PBS voorafgaand aan beeldvorming. </li></ol> 5. Schakelen Buffer Voorbereiding <ol><li> Een enzym voorraadoplossing (A) met 10 pl catalase (20 ug / ml), 20 pl 1 M Tris (2-carboxyelthyl) fosfine hydrochloride (4 mM), 2,5 ml glycerol (50%), 125 glvan 1 M KCl (25 mM), 100 ul 1 M pH 7,5 Tris-HCl (20 mM), 5 mg glucose oxidase (1 mg / ml) en vul tot 5 ml volume met diH20. Dit is voldoende om 100 x 50 ul aliquots, die kan worden opgeslagen bij -20 ° C en gebruikt voor maximaal 1 jaar. </li><li> ) Voeg een glucose-voorraadoplossing (B) met 4 g glucose (100 mg / ml), 4 ml glycerol (10%) en 36 ml diH20. Dit is voldoende voor 100 x 400 ul aliquots die worden bewaard bij maken - 20 ° C en gebruikt voor maximaal 1 jaar. </li><li> Voeg een reductiemiddel voorraadoplossing (C) met 113,6 mg MEA-HCl (1M) en 1 ml DiH 2 0. Gebruik verse of maak 10 x 100 ul aliquots die worden bewaard bij -20 ° C en gebruikt voor maximaal 1 maand (niet porties invriezen). </li><li> Net voor imaging, meng het enzym (A), glucose (B) en reductiemiddel (C) voorraad oplossingen samen in de verhouding 50 pi, 400 ul, 100 ul en vul aan met PBS * 6 1 ml. Deze buffer zal nu scharrelen zuurstof en hebben een reducerende omgeving (100 mM MEA-HCl) * 7. De uiteindelijke pH moet in het bereik 6,0-8,5 (aanpassing is niet vereist) * 8. </li></ol> Noot 6 - deze buffer is geschikt voor carbocyanine-gebaseerde kleurstoffen zoals Cy5 en Alexa 647. Opmerking 7 - de uiteindelijke enzympreparaat concentraties 50 ug / ml (5 eenheden / ml) glucose oxidase en 1 ug / ml (40-60 eenheden / ml) van katalase. De enzymatische activiteit (eenheden) wordt gegeven door de leveranciers en kan variëren. De berekeningen voor catalase nemen dat 1 ug / ml eindconcentratie na stap 5.4 50 eenheden enzym bevat. Diverse buffer samenstellingen die vergelijkbaar zuurstofwegvangende componenten kunnen worden gevonden 21,30,40. Voor een overzicht van buffer en kleurstof combinaties zie referenties 28,29. Glycerine en TCEP vereist voor langdurige opslag bij -20 ° C. Toelichting 8 - als beeldvorming actinefilamenten voeg 2 mM MgCl2 en 0,2 mM ATP te helpen stabiliseren thij gloeidraden. 6. Microscoop Overname van STORM gegevens (met behulp van Alexa 647 kleurstof) <ol><li> Schakel de STORM / PALM microscoop, bij voorkeur ten minste 3 uur voor beeldvorming om een ​​thermisch evenwicht te bereiken. Imaging voordat deze heeft een verhoogde kans op drift. </li><li> Plaats de beeldvorming kamer in de microscoop podium monsterhouder. Zorg ervoor dat het monster stevig in de houder en is vlak. </li><li> Verwijder de PBS uit de beeldvorming kamer en vul aan de top met het schakelen buffer. Plaats voorzichtig een dekglaasje over de bovenkant van de kamer, zorg ervoor dat er geen luchtbellen bij allen en dat de hele kamer wordt behandeld. Bijvullen met extra buffer of PBS eventuele luchtbellen worden gezien anders buffer prestaties kunnen dalen. </li></ol> VOORZICHTIG - de kans op laterale en axiale afwijking van het monster ten opzichte van de objectieflens minimaliseren wordt aanbevolen het monster en de buffer worden overgelaten equilibrerentot kamertemperatuur gedurende ten minste 15 min voor beeldvorming. <ol start="4"><li> Zoek een fluorescerende structuur van belang af te beelden. Selecteer de gewenste belichtingshoek, in dit geval, een TIRF of sterk hellende hoek wordt aanbevolen, omdat dit verbetert de signaal-ruisverhouding door het minimaliseren out-of-focus licht, wat vooral van voordeel voor celmonsters. Neem een ​​referentie buigingsbegrensde beeld van de structuur voorafgaand aan STORM beeldvorming. </li><li> Verhoog de ​​excitatie laser (met een geschikte golflengte van ongeveer 640 nm) een hoog vermogen, overeenkomend met ongeveer 2 kW / cm 2 tijdens beeldvorming instelmogelijkheden van 10 msec positie en een cyclustijd van ongeveer 50 Hz (frames per seconde) . Zodra de fluoroforen zijn overgegaan in een schaars knipperpatroon (waarschijnlijk binnen 10 seconden voor de meeste monsters) verzamelen 10.000 frames * 9. </li></ol> Opmerking 9 - 10.000 frames voor de hier beschreven voorbeeldenmaar het kan nodig zijn om het framenummer verhogen tot 50.000 of meer andere monsters. 7. Reconstructie van Super-Resolution Beelden uit onbewerkte gegevens (met behulp regenbui) <ol><li> Open het rainSTORM.m bestand vanuit MATLAB en uitvoeren (figuur 1A). </li><li> In de Rainstorm venster (Figuur 1B) selecteert u het beeldbestand te analyseren met behulp van de knop Bladeren. Dit moet een. Tif-bestand (ImageJ kan worden gebruikt om andere bestandstypen converteren naar een tif) zijn. Verander de pixelbreedte de ruwe gegevens van de microscoop wordt gebruikt om de gegevens te verkrijgen * 10 passen. De andere waarden op standaard. </li></ol> Toelichting 10 - Een typische EMCCD camera heeft een pixelgrootte van 16 micrometer dus op een systeem met een 100x objectief de pixelgrootte op de afbeelding 160 nm zal zijn. Op commerciële systemen de pixelgrootte wordt meestal weergegeven in de software. Pixelgroottes variëren tussen 100 nm en 160 nm voor de meeste lokalisatie microscopen.<ol start="3"><li> Druk op de knop &#39;Proces Images&#39; en wacht tot een voorlopige afbeelding verschijnt. De duur van de behandeling is afhankelijk van de bestandsgrootte, computer specificaties en het aantal kandidaat knippert in de ruwe gegevens * 11. </li></ol> Toelichting 11 - 10.000 framereeksen van actine en EGF gegevens duurde 23 sec en 25 sec tot respectievelijk te verwerken met behulp van een PC met een Intel Xeon E5420 CPU. Met behulp van dezelfde computer zonder een parallelle verwerking toolbox in MATLAB, of met een computer zonder multiple core processing, tijden waren 66 sec en 81 sec respectievelijk. <ol start="4"><li> Om een bijgewerkte super-resolutie afbeelding drukt u op de knop &#39;Openen Recensent&#39; genereren en een tweede venster verschijnt (figuur 1C). Druk op de knop &#39;Aanpassen Contrast&#39; om de beeldweergave te wijzigen naar wens (figuur 1D). In sommige gevallen, waar het beeld is erg donker de maximale waarde worden verlaagd. </li><li> Gebruik de reviewer venster (figuur 1C) naar bruikbare beeldkwaliteit metrics genereren en het imago van de super-resolutie verder verfijnen. Stel de eerste drie parameters voor kwaliteitscontrole te waarden van 4000, 0,1 en 0,8-2,0 respectievelijk * 12. Werk de tellingen per foton waarde die moet ofwel gebaseerd op een foton ijkmeting of met foton-curve ijkkromme waarden door de fabrikant voor een bepaalde camera EM versterkingsinstelling. Dit is essentieel voor het verkrijgen van nauwkeurige precisie en resolutie metingen * 13. </li></ol> Toelichting 12 - Signaal Tellingen verwerpt knippert op basis van helderheid criteria. Hoe hoger de waarde, hoe helderder het knipperen moet zijn aanvaard als een lokalisatie in het uiteindelijke beeld geworden. Dit kan nodig worden aangepast afhankelijk van de foton uitgang van de kleurstof en belichtingstijd en de gevoeligheid van de camera. Tolerantie verwerpt knippert als er significante kwadratische fout tussen het signaal en de gemonteerde Gauss ie double pieken. PSF Sigma Range verwerpt knippert als de gemonteerde breedte van de PSF ligt buiten deze zone, kan dus een kleiner bereik worden gebruikt om out-of-focus signalen en grote geaggregeerde klodders constante fluorescentie verwerpen. Met een breder bereik kan resulteren in mislocalization artefacten verschijnen in het uiteindelijke beeld. In de praktijk is het raadzaam om de eerste kwaliteitscontrole uit te voeren met behulp van de parameter lokalisatie precisie cutoff. Toelichting 13 - voor meer informatie over resolutie metrics zie referenties 23,27. Kortom door te weten het aantal fotonen die door elk knipperen is het mogelijk om de lokalisatie nauwkeurigheid van elke lokalisatie berekenen en daardoor afleiden algehele gemiddelde betrouwbaarheidsschattingen voor het hele beeld. Met behulp van een Andor ixon DU-897E met een gain-instelling van 200 de graven per Photon waarde is 9,04. <ol start="6"><li> Verander de lokalisatie precisie cutoff (figuur 1C) te afweging tussen het optimaliseren van de gemiddelde lokalisatie precision tegen lokalisatie nummer in het uiteindelijke beeld. Waarden van 30-50 nm aanbevolen afhankelijk van de kwaliteit van de gegevens en het monster. Zowel de histogrammen en de info.txt bestanden kunnen worden gebruikt om deze beslissing (figuren 1F en 1G) informeren. </li><li> De reconstructie schaalfactor (figuur 1C) standaard is 5, wat zal leiden tot super-resolutie pixels van 32 nm in de veronderstelling dat de pixel breedte in de originele beelden is 160 nm. Als de ruwe beelden hebben een pixelgrootte van 100 nm dit zal produceren super-resolutie beelden met pixels van 20 nm. Verhoog de ​​schaalfactor om kleinere super-resolution pixels te produceren in het uiteindelijke beeld * 14. </li></ol> Opmerking 14 - Resolutie van lokalisatie microscopie afhankelijk van het vloeiend vereist voor visualisatie (dwz de pixelgrootte van een eenvoudige histogram reconstructie) en de lokalisatie precisie. In de praktijk zou de reconstructie pixelgrootte algemeen kleiner dan de lokalisatieprecisie (zie de Mean Precision Schatting metriek in de info tekstbestand - stappen 6.11 en 6.12). In dit geval is het verlies van de resolutie toe te schrijven aan de wederopbouw pixelgrootte zal klein 23,27 zijn. Bijvoorbeeld de gemiddelde betrouwbaarheidsschattingen in de rij-en kolomrichting van fig. 4E is 16,1 nm en 16,2 nm. Een pixelgrootte van 16 nm werd gebruikt om deze gegevens te visualiseren (reconstructie schaalfactor van 10 met een oorspronkelijke pixel breedte van 160 nm). <ol start="8"><li> Wijzig de limiet reeks beelden (figuur 1C) aan de wederopbouw te beperken tot subsets van de ruwe data, bijvoorbeeld [2001-inf] zou de eerste 2000 frames van ruwe data uit te sluiten. </li><li> Op de knop &#39;bijdrager&#39; knop (figuur 1C) een geactualiseerd beeld super-resolutie (figuur 1E) te genereren. </li><li> Druk op de knop &#39;Bekijk Histograms&#39; (figuur 1C), met het oog op de beeldkwaliteit metrics (Figuur 1F) * 15 weer te geven. </li></ol&gt; Toelichting 15 - De grafiek rechtsboven beeltenis van het aantal aanvaarde lokalisaties tegen camera framenummer en de Thompson Lokalisatie Precisions histogram in de rechterbenedenhoek (Figuur 1F) kan worden gebruikt om de lokalisatie precisie cutoff beoordeling optie informeren. Bijvoorbeeld met behulp van een 50 nm cutoff zou uitsluiten alle lokalisaties met slechtere precisie van wordt opgenomen in het uiteindelijke super-resolutie. <ol start="11"><li> Druk op de &#39;Afbeelding opslaan&#39; knop in de reviewer (figuur 1C) om al deze gegevens * 16 slaan. </li></ol> Toelichting 16 - Tussen 3 en 5 bestanden kunnen worden opgeslagen, afhankelijk van de gekozen (afbeelding som, STORMdataImage, STORMprocessed, info &amp; hists) opties, zie figuur 1G. De STORM bewerkte beeld wordt weergegeven met een aangepaste contrast en kleur kaarten. De STORMdataImage is een beeld in grijstinten, waarbij de grijswaarde van elke pixel gelijk aan het verdovener van lokalisaties die werden geïdentificeerd binnen het. <ol start="12"><li> Na bestudering van de gegevens (bijvoorbeeld Info.txt bestand en histogrammen) terug naar stap 7.6 en herhaal de volgende stappen met verschillende recensent parameters indien gewenst. Door op &#39;Afbeelding opslaan&#39; in stap 7.11 zal de eerder opgeslagen gegevens te overschrijven. </li></ol> 8. Box Tracking en Tijdafwijkingscorrectie (met behulp regenbui) <ol><li> Volg de stappen 7,1-7,9 om een ​​beeld te genereren op de normale manier. </li><li> Druk op de knop &#39;Box Tracking&#39; in de reviewer (figuur 1C) en klik en sleep een vak over de referentiemerkteken of de structuur van de rente op de afbeelding beoordeeld. </li><li> Wacht tot een nieuw beeld verschijnt, waarin de &#39;Boxed Positions&#39; (zie de figuren 6B, 6C en 6F voor voorbeelden) wordt weergegeven. Sla deze afbeelding indien gewenst. </li><li> Als het object van belang is een referentiemerkteken dan drift correctie kan worden uitgevoerd door te klikken op de &#39;Set Anker&#39; knop, gevolgd door de &#39;Subdarmkanaal Drift &#39;te klikken. Tenslotte klikt u nogmaals op &#39;Uitvoeren Recensent&#39; om een ​​nieuw plaatje STORM, die nu zal moeten alle lokalisaties gecorrigeerd volgens de referentiemerkteken posities te genereren. De kraal posities uit de laatste beoordeeld afbeelding verwijderd. </li><li> Als er andere ijkmarkeringen binnen het beeld laatste drift gecorrigeerd, kan deze worden verwijderd door op &#39;Box Tracking&#39;, &#39;Verwijder Boxed&#39; en vervolgens zo vaak &#39;Run Recensent&#39; zoals gewenst. </li></ol>

We hebben niets te onthullen.

We tonen met een aantal eenvoudige proefmonsters en de vrij verkrijgbare grafische software regenbui is het mogelijk om STORM super-resolutie beeldvorming te optimaliseren. Deze tools en methoden zullen bruikbare aanknopingspunten voor nieuwe gebruikers en manieren voor ervaren gebruikers om het vertrouwen in hun microscopen en hun gebruik van hen om biologische en cellulaire structuren bestuderen met ongekend detail te verhogen. Door een combinatie van monsters met bekende of welbegrepen structuren en een algoritme dat een aantal nuttige beeldkwaliteit statistieken, zoals gemiddelde betrouwbaarheidsschattingen, lokalisatie nummer en histogrammen tonen is het mogelijk om de beeldkwaliteit te verbeteren en meer vertrouwen hebben produceren in het STORM imaging proces. Er is geen one size fits all benadering verwerven van de gegevens als er een aantal verschillende commerciële en zelfgebouwde microscoop configuraties die kunnen worden gebruikt. Bovendien zijn er vele monstervoorbereiding en beeldaanwinst stappen die kunnen beïnlingen het uiteindelijke beeld dat zij daarom softwaretools en proefmonsters is van cruciaal belang voor het begrijpen en optimaliseren van STORM beeldkwaliteit. Daarnaast kunnen deze protocollen nuttige en minder dubbelzinnige manier van het oplossen van eventuele problemen die zich kunnen voordoen. Bijvoorbeeld de dextran monster een zeer nuttige manier om te identificeren of er een laserstraal uitlijning of ongelijkmatige verlichting van het monster. Als er bezorgdheid dat de omschakeling buffer niet kan werken een zeer eenvoudige visuele test om te zien of er sprake is van &#39;knipperen&#39; zal helpen. Actinefilamenten zijn een nuttige manier van meten resolutie met behulp FWHM vergelijkingen evenals markeren drift en mislocalization artefacten. Er dient echter te worden opgemerkt dat als-lokalisatie gebaseerd super-resolutie methoden fluorofoor dichtheid gevoelig kan zijn, niettegenstaande de andere factoren, zoals blootstelling tijden, frame rates, laser bevoegdheden en de manier waarop de afbeelding wordt verwerkt, is het onmogelijk om te wijzen een besluit totbijzondere microscoop en gaan ervan uit dat alle afbeeldingen die resolutie zal hebben. Wat echter wel mogelijk is om verschillende aspecten van de resolutie als gemiddelde lokalisatie precisie, lokalisatie aantal meten en drift 27. Zelfs als markeerders niet in elk experiment ze kunnen worden opgenomen, tenminste, worden gebruikt om een ​​microscoop systeem zijn omgeving karakteriseren en beter begrip operationele overwegingen zoals hoeveel tijd nodig is om thermisch evenwicht te bereiken na het opstarten. Naast het corrigeren van laterale afwijking kunnen markeerders worden gebruikt karakteriseren en correcte axiale afwijking, maar dit vereist het gebruik van een astigmatische lens en een feedbackmechanisme om het monster te corrigeren terwijl de beelden worden verkregen 43. Commerciële super-resolutie systemen omvat meestal een soort van stabiliteit controle of focus-lock mechanisme, dat een meer praktische oplossing voor het corrigeren nadruk drift kan zijn. Er eenre alternatieven voor niet specifiek coating het glas met dextran, zoals het gebruik van kleurstoffen rechtstreeks of andere geconjugeerde moleculen, zoals secundaire antilichamen. Een beperking van deze benadering is dat het aantal moleculen gebonden aan het glas niet bekend. Alternatieve draadvormige structuren die zijn gebruikt omvatten microtubuli 28 en DNA 21. De combinatie van zeer kleine omvang en handige handel verkrijgbare middelen maken actine een aantrekkelijk alternatief, vooral omdat de afstand van uiteenlopende of vertakte filamenten ook een bruikbare meting van de systeemprestaties 27 kan zijn. Er is ruimte voor verdere ontwikkeling van de monsters, ondanks recente vooruitgang op dit gebied 28,29,46,47. In het bijzonder, multi-color beeldvorming presenteert een aantal uitdagingen in alle 3 belangrijke aspecten van de beeldvorming, monster etikettering, beeldopname (hardware) en software (beeldverwerking en uitlijning). Er zijn een geweesteen aantal publicaties het aanpakken van deze aspecten 4-6 en het is dus duidelijk dat geschikte test samples en methoden zijn cruciaal voor het genereren en betrouwbaar interpreteren van dit soort beelden. Inderdaad, onlangs werd aangetoond dat dSTORM kunnen worden gebruikt om twee kleurenbeelden aannemen en lossen de zeer symmetrische aard van de nucleaire porie complex en de auteurs gesuggereerd dat dit een ideale manier om de prestaties van chromatische aberratie correctie 45 beoordelen zijn. Een andere interessante benadering is het gebruik van DNA origami een nanoruler, waarbij de mogelijkheid van plaatsing fluoroforen creëert op specifieke sub-diffractie afstand van elkaar 46 maken. Dit biedt een manier van beoordelen van de resolutie en het doen van metingen op afstand. Echter, het uiteindelijke doel is om deze super-resolutie technieken toe te passen op niet-geïdealiseerde monsters, zoals cellen, die complexe driedimensionale structuren. In dit geval, een combinatie van beter begrip van de thij techniek in combinatie met software tools die de gebruiker te helpen bij het ​​verwerven van gegevens, verwerken op passende wijze, en het verstrekken van imago metrics is waarschijnlijk het ultieme antwoord. 28,29,47,48

Onlangs zijn ontwikkeld een reeks optische microscopie technieken, typisch aangeduid als superresolutietechnieken of nanoscopy die de diffractie limiet kan omzeilen en genereren beelden met een resolutie van 100 nm of beter 1,2. Sinds de aankondiging van de super-resolutie microscopie als de Nature Methods methode van het jaar in 2008, is er een groot deel van de ontwikkeling van lokalisatie gebaseerde microscopen. Zo zijn er veelkleurige toepassingen 3-6, 3D implementaties 7-12 en zelfs levende cellen toepassingen 5,13-17. Bovendien, omdat deze systemen worden gecommercialiseerd en maken nu hun weg naar buiten van de optica laboratoria in de handen van celbiologen is er waarschijnlijk een verdere toename van het gebruik en de toepassing van biomedische vragen zijn. Een tak van deze familie is de lokalisatie-gebaseerde methoden die werken door het opbouwen van een beeld molecuul-by-molecuul. IkTen einde dit te doen, moet de meerderheid van fluorescerende moleculen in het monster worden uitgeschakeld, zodat slechts enkele ruimtelijk gescheiden moleculen actief tegelijk. Deze moleculen worden dan snel en uitgeschakeld en vele beelden worden genomen, zodat een aanzienlijk deel van de bevolking wordt afgebeeld op de onderliggende structuur met sub-diffractie nauwkeurig weerspiegelen. Een aantal benaderingen zijn gepubliceerd inclusief GSDIM 18, PALM 19, fPALM 20, STORM 21 en RESOLFT 22. Algoritmen die de positie van een enkel molecuul detectie meten kan dan worden gebruikt om de actuele positie van het molecuul te lokaliseren met precisie beter dan 20 nm Gaussian fitting 23, bijvoorbeeld rapidSTORM 24,25 QuickPALM 26, palm3d 12 en 27 regenbui. Bij beeldvorming cel of andere biologische monsters, die een hoge molecuul dichtheid hebben, is het daarom noodzakelijk om vele duizenden frames van te nemendeze knippert, ruimtelijk gescheiden, signaal zijn om het imago van een aanzienlijk deel van de gelabelde moleculen. Stochastische optische reconstructie microscopie (STORM) en sterk verwante dSTORM en GSDIM methoden lokalisatie-gebaseerde superresolutie methoden die zijn aangetoond om met commercieel beschikbare organische kleurstoffen 21. Ze zijn sindsdien is aangetoond voor een aantal verschillende kleurstoffen 28-30, waarbij de methode bijzonder aantrekkelijk vanwege de specificiteit en relatieve gemak van gevestigde immunokleuring benaderingen fluorescentie microscopie maakt zijn. Bijgevolg is er een gemakkelijke toegang tot een scala van kleurstof-antilichaam en dye-biomolecuul conjugaten, die het potentieel om gebruikt te worden in-lokalisatie gebaseerde super-resolutie beeldvorming hebben. Hoewel de algemene beginselen van STORM en soortgelijke benaderingen zijn relatief eenvoudig, en op het eerste gezicht de hardware en monstervoorbereiding lijken relatief straightforward, zijn er een aantal stappen in het proces dat stelligen van hoge kwaliteit, artefactvrij, super-resolutie beelden zijn. Zoals met alle microscopische technieken het proces kan worden gezien in 3 stappen: eerst, monstervoorbereiding, tweede, beeldacquisitie en ten derde, beeldverwerking en / of beeldanalyse en interpretatie. De extra oplossend vermogen en de methode voor het genereren super-resolutie beelden met behulp van een lokalisatie aanpak introduceert een aantal nieuwe problemen en overwegingen 31-33. Vanaf monstervoorbereiding, bij het uitvoeren immunokleuring, met name indirecte immunofluorescentie wanneer een primair en secundair antilichaam combinatie wordt gebruikt, moet worden opgemerkt dat de fluorescente kleurstof tot 20 nm van het molecuul van belang kan zijn. Bij microtubuli, resulteert dit in diameters van 35-50 nm vergeleken met een verwachte microtubule diameter van 25 nm 28,30. Ook moet de etikettering dichtheid mEet de Nyquist criteria om een hoge beeldkwaliteit 14 genereren. Bijvoorbeeld voor een verwachte beeldresolutie van 20 nm langs een filamenteuze structuur moet er een kleurstof molecuul ten minste elke 10 nm 27 zijn. Hoewel veel kleurstoffen zijn gepubliceerd werken voor lokalisatie gebaseerde nadert de algemene prestaties van de kleurstof is een mengsel van ten minste vier belangrijke criteria, namelijk gedetecteerde fotonen per schakelen gebeurtenis (de helderheid per blink - helderder is beter), het evenwicht op -off duty cycle (de contrast ratio van kleurstoffen in de off versus op de staatstelevisie - meer off is over het algemeen beter), de overleving fractie (een laag bleken tarief is beter) en het aantal schakelingen (het aantal knipperingen per fluorofor - meer is beter voor hoge resolutie, hoewel 1 knipperen per fluorophore een voordeel voor molecuul tellen doeleinden kan zijn). De situatie wordt verder gecompliceerd door het feit dat deze eigenschappen voor een bepaalde kleurstof kan variëren in verschillende bufferomstandigheden enmet laservermogen 28,29. Bovendien, en deze unieke STORM overwegingen beeldkwaliteit kan worden verbeterd door het optimaliseren monstervoorbereiding op dezelfde wijze als traditionele fluorescentie microscopie technieken bijvoorbeeld door het minimaliseren autofluorescentie door modificatie van fixatie omstandigheden en het gebruik van quenching reagentia. Ook minimaliseert niet-specifiek gebonden fluoroforen is belangrijk, dat kan worden gedaan door het aanpassen label concentraties incubatietijden en blokkeren en wasstappen. De tweede stap van het beeld overname is ook kritisch. De optimale instellingen van de microscoop afhankelijk van de kleurstof, bufferomstandigheden, etikettering dichtheid en monster type, bijvoorbeeld monolagen op glas, cellen of weefselmonsters. De belangrijkste overwegingen zijn camera belichtingstijd, framenummer, verlichting hoek (TIRF, Hilo, Epi) en laservermogen. Het doel is om zoveel mogelijk helder ruimtelijk gescheiden knippert zo snel mogelijk te verzamelen. Als de achtergrond is zeer hoge of knippert niet erg helder, dus de signaal-ruisverhouding is slecht, het reconstructie-algoritme niet in staat om de posities nauwkeurig lokaliseren. Naast maximaliseren van de lokalisatie precisie, dus de nauwkeurigheid elk molecuul positie kan worden gemeten, de beeldkwaliteit ook afhankelijk van een groot aantal lokalisaties. Indien het aantal van de moleculen van belang zijn afgebeeld, hetzij als gevolg van slechte labelingsefficiëntie, overmatige fotobleking of een inadequate framenummer beeld om vervolgens de resulterende super-resolutie zal punctata en discontinue als Nyquist criteria niet zal zijn voldaan 14,27 . En ten derde stap beeldverwerking is vooral belangrijk in vergelijking met conventionele fluorescentiemicroscopie technieken. Er is een reeks van vrij en commercieel beschikbare algoritmen, die zowel een voordeel in termen van keuze, en een nadeel, omdat het kan verwarrend weten waarin het meest geschikt is om te gebruiken. Als bijvoorbeeld de ruwe data is goed gespreid ruimtelijk onderscheiden knippert dan een single-molecule fitting algoritme kan zeer nauwkeurig en efficiënt, bijvoorbeeld door de spaarzame montage algoritmes beschikbaar in Stortbui 27 rapidSTORM 24,25, palm3d 12 en QuickPALM 26 software . Als de ruwe gegevens bevat veel overlappende signalen dan algoritmes geschikter kunnen zijn omvatten DAOSTORM 34, 3B en 35 deconSTORM 36. Bovendien zijn deze algoritmen bevatten drempels voor verschillende criteria zoals signaal telt of fotonen per knipperen, alsmede diverse beeldweergaveopties zoals visualiseren met afgevlakte Gaussische functies of histogrammen met pixel roosters, waarbij de superresolutie pixelgrootte kan geselecteerd door de gebruiker. Al deze opties veranderen het uiterlijk van het uiteindelijke beeld en hebben gevolgen voor het interpretatie en analyse. <p class="jove_content"&gt; Daarom presenteren we 3 proefmonsters die de nieuwe gebruiker zal voorzien van een uitgangspunt voor dye-based-lokalisatie gebaseerde super-resolutie experimenten, die ter wille van de duidelijkheid zullen we aanduiden als STORM, en meer ervaren gebruikers de mogelijkheid om verder optimaliseren hun experimenten. Ten eerste is het mogelijk te bekleden glazen oppervlak met een fluorescerende laag dextran-kleurstof-conjugaat. Dit zorgt voor een snelle en eenvoudige manier om vast te stellen dat de microscoop, kleurstof en buffer werken aan het genereren van knipperende tl-signaal. De methode kan dan worden verlengd door het vergelijken van de gemiddelde lokalisatie precisie en het aantal metrics gegenereerd door regenbui om buffer te optimaliseren, beeldacquisitie instellingen en test verschillende kleurstoffen. Ten tweede presenteren we een eenvoudig protocol voor het bereiden van actine filamenten op glas dat gemakkelijk kan worden geëtiketteerd met phalloidin-kleurstof conjugaten. Deze bieden de ideale structuren om metingen van resolutie 27 en meestal de volle breedte half maximum (FWHM) nemenvan een gloeidraad wordt gegeven als een empirische schatting van resolutie 37. Opgemerkt zij dat de oplossing varieert tussen monsters en tussen afbeeldingen in hetzelfde monster omdat resolutie-gebaseerde lokalisatie superresolutietechnieken is een functie van fluorofoor helderheid achtergrondruis en lokalisatie dichtheid 27 en deze zijn niet noodzakelijk constant gedurende het monster. Actinefilamenten worden gebruikt om potentiële artefacten zoals mislocalizations demonstreren en drift en hoe ze kunnen worden geïdentificeerd met software functies binnen regenbui. Verder beschrijven we het gebruik van fluorescente markeerders zowel meten en corrigeren drift. En ten derde, de kleuring van cellen met epidermale groeifactor (EGF)-kleurstof-conjugaten beschreven. EGF een nuttige indicator van super-resolutie afbeelding prestaties, omdat een deel van de receptor op het celoppervlak ondergaat endocytose via vesicles, welke sub-diffractie gerangschikte structuren van ongeveer 50-150 nm in diameter 27,38,39.

<table><tbody><tr><td>Labtek Imaging chamberglass</td><td>Fisher</td><td>CBR-166-390E</td><td>Staalvoorbereiding</td></tr><tr><td>Inverted Microscope </td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>* Zie hieronder voor alternatieven</td></tr><tr><td>100 X TIRF Objectieflens</td><td>Olympus</td><td>UAPON 100XOTIRF</td><td>* Zie hieronder voor alternatieven</td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Andor</td><td>iXon 897</td><td>* Zie hieronder voor alternatieven</td></tr><tr><td>640 nm laser</td><td>Toptica</td><td>iBEAM-SMART-640-S</td><td>*150 mW - voor het beeldvormen van Alexa 647 of Cy5 kleurstoffen</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>*Acquisitiesoftware (het besturen van hardware)</td></tr><tr><td>PC </td><td>Dell</td><td></td><td>Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Instrument control en beeldverwerking</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Beeldanalyse en verwerking <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td></tr><tr><td>rainSTORM</td><td>Laser Analytics Group (Cambridge) software</td><td></td><td><a href="http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources" target="_blank">http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources</a></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Voor het uitvoeren van rainSTORM</td><td></td><td><a href="http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/" target="_blank">http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/</a></td></tr><tr><td>*Voorbeeld van zelfgebouwde STORM/PALM microscopen</td><td></td><td></td><td>Zie ook referentie 29 <a href="http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope" target="_blank">http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope</a></td></tr><tr><td>*Commerciële STORM/PALM super-resolutie microscopen</td><td></td><td></td><td>Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatieven voor zelfgebouwde microscopen</td></tr><tr><td colspan="4">Tabel 1. Materialen &amp; Uitrusting </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Fisher</td><td>VX70013065</td><td>1; 2; 3; 4</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td>1.1; 2.1</td></tr><tr><td>Dextran-Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>D-22914</td><td>1.2</td></tr><tr><td>Algemeen actin buffer</td><td>Cytoskeleton Inc</td><td>BSA01</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Voorgevormd-actine filamenten</td><td>Cytoskeleton Inc</td><td>AKF99</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Phalloidin-Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>2.2</td></tr><tr><td>TetraSpeck Microspheres (0.1 micron)</td><td>Invitrogen</td><td>T-7279</td><td>3.1</td></tr><tr><td>HeLa cellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>4.1</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher</td><td>VX31966021</td><td>4.1</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher</td><td>VX10500064</td><td>4.1</td></tr><tr><td>Pen/Step</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td>4.1</td></tr><tr><td>Kunststof schalen</td><td>Invitrogen</td><td>734-0006</td><td>4.1</td></tr><tr><td>EGF - Alexa fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>E35351</td><td>4.3</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>4.3, 4.4</td></tr><tr><td>Formaldehyde - 10 % oplossing EM-kwaliteit</td><td>Polysciences</td><td>04018-1</td><td>4.2</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C100</td><td>5.1</td></tr><tr><td>Glucose oxidase</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>5.1</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>5.1</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma</td><td>C4706</td><td>5.1</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>93352</td><td>5.1</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>C7528</td><td>5.2</td></tr><tr><td>MEA-HCl</td><td>Sigma</td><td>M6500</td><td>5.3</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma</td><td>G2289</td><td>5.1; 5.2</td></tr><tr><td colspan="4">Tabel 2. Reagentia</td></tr></tbody></table>

test monsters voor het optimaliseren van storm superresolutietechnieken

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is een recent ontwikkelde super-resolutie microscopie techniek met tot 10 keer betere resolutie dan standaard fluorescentie microscopie technieken. Echter, zoals de afbeelding in een heel andere manier wordt verkregen dan normaal, door het opbouwen van een beeld molecuul-by-molecuul, zijn er enkele belangrijke uitdagingen voor de gebruikers in een poging om hun imago acquisitie optimaliseren. Om dit proces te helpen en meer inzicht krijgen in hoe STORM werkt presenteren we de bereiding van 3 proefmonsters en de methodologie van het verwerven en verwerken van STORM super-resolutie beelden met typische resoluties van tussen 30-50 nm. Door de proefnemingen bij het gebruik van de vrij beschikbare regenbui processing software is het mogelijk om een ​​grote hoeveelheid informatie over de beeldkwaliteit en resolutie te verkrijgen. Met behulp van deze statistieken is het dan mogelijk om de beeldvorming procedure optimaliseren van de optica, de voorbereiding, kleurstof keuze, buffer omstandigheden, en beeldacquisitie instellingen proeven. We eenLSO tonen voorbeelden van een aantal veel voorkomende problemen die resulteren in een slechte beeldkwaliteit, zoals zijdelingse drift, waar het monster beweegt tijdens beeldacquisitie en dichtheid gerelateerde problemen resulterend in de &#39;mislocalization&#39; fenomeen.

We beschrijven de bereiding van drie monsters en hoe ze kunnen worden gebruikt voor het optimaliseren en de prestatie van microscopen STORM beoordelen. Met behulp van deze voorbeelden laten we zien hoe ruwe data te verwerven en vervolgens te verwerken tot super-resolutie beelden te verwerven in cellen van ongeveer 30-50 nm resolutie.

Test Monsters voor het optimaliseren van STORM superresolutietechnieken

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe hoogwaardige STORM-superresolutiebeelden kunnen worden verkregen. Dit wordt bereikt door eerst een fluorescent gelabeld testmonster voor te bereiden. De tweede stap is het bereiden van een switchingbuffer, waarna de beeldvormingskamer met deze buffer wordt gevuld.Vervolgens worden de ruwe gegevens verzameld met een STORM-microscoop. De laatste stap is het reconstrueren van superresolutiebeelden uit de ruwe gegevens met behulp van Rainstorm-verwerkingssoftware. Uiteindelijk worden de testmonsters gebruikt om aan te tonen hoe hoogwaardige ruwe gegevens kunnen worden verzameld, die vervolgens kunnen worden verwerkt om STORM-superresolutiebeelden in cellen te genereren met resoluties tussen 30 en 50 nanometers, wat een vijf tot tienvoudige resolutieverbetering betekent ten opzichte van traditionele fluorescentiemicroscopietechnieken, waaronder TIRF en confocale microscopie.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat ze het belang niet beseffen van het verzamelen van veel kwalitatief hoogwaardige sparse links. Dit wordt veel eenvoudiger door Alexa 6 4 7-kleurstof in de juiste schakelbuffer te gebruiken. Een visuele demonstratie van deze techniek is essentieel, omdat het verkrijgen van hoogwaardige ruwe data cruciaal is voor het produceren van SPR-resolutiebeelden.De ruwe videosequenties van deze techniek zien er volledig anders uit dan bij elke andere vorm van fluorescentiemicroscopie. Begin de procedure voor het coaten van glas met fluorescerende dextrine door 200 µL van een 0,01% polylysine-oplossing in elke put van een coverglass met acht kamers aan te brengen en 10 minuten te incuberen. Verwijder na 10 minuten de polylysine-oplossing met een pipet om er zeker van te zijn dat er geen vloeistof is achtergebleven.Voeg 0,25 µL van een stockoplossing van dextrine-Alexa 647 met een concentratie van 2 mg/mL toe aan 25 µL gedeïoniseerd water om een oplossing van 20 µg/mL te maken voor het aanbrengen van een coating met een hoge dichtheid van dextrine-Alexa 647.Verdun 20 µL van de 20 µg/mL oplossing tot een totaalvolume van 200 µL gedeïoniseerd water. Voor een oplossing met gemiddelde dichtheid worden twee µL verdund in 200 µL gedeïoniseerd water. Voor een oplossing met lage dichtheid wordt 0,2 µL verdund.Voeg in 200 µL gedeïoniseerd water aan elke well 200 µL van de verdunde dextrine Alexis X 47-oplossingen toe en laat dit 10 minuten incuberen. Langere incubatietijden kunnen worden gebruikt, wat kan leiden tot een dichtere dextrinecoating. Verwijder tot slot de Dexter Xis X 47-oplossingen en was drie keer met water.Om fluorescerende actinefilamenten op glas voor te bereiden, voegt u eerst 200 µL 0,01% polylysine-oplossing toe aan elke put van een achtkamers-glasplaatje. Dek het glas af en laat het 10 minuten incuberen. Verwijder de vloeistof met een pipet om er zeker van te zijn dat er geen vloeistof achterblijft.Voeg aan elke kamer 90 µL algemene actinebuffer toe die vooraf is gereconstitueerd volgens de instructies van de fabrikant. Voeg vervolgens 10 µL van een 10 µM vooraf gevormde actinefilament-oplossing en één µL foid en Alexa 6 47 toe en pipetteer dit voorzichtig op en neer om te mengen. Incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur om fluorescentie-microsferen als fiduciaire markers voor te bereiden door één µL tepec-beads te verdunnen in 200 µL PBS en te mengen. Voeg de verdunde beads toe aan de beeldvormingskamer en wacht 15 minuten.Verwijder na 15 minuten de oplossing en was drie keer met PBS voordat de cellen worden geïmaged; cellen die zijn gekweekt tot ongeveer 80% confluentie worden in dit experiment gebruikt. Verwijder het kweekmedium en was met PBS. Voeg vervolgens 500 microliters van een 4% formaldehydeloplossing toe gedurende 10 minuten.Verwijder het formaldehyde en was drie keer met PBS. Laat de cellen niet uitdrogen en gebruik altijd PBS-gebufferde oplossingen. Om hypotone stress te voorkomen, voegt u 2 µL van een EGF Alexa, 6 47-stamoplossing van 50 µg/mL toe aan 200 µL van een 0,1% BSA-oplossing, en voegt u deze oplossing vervolgens toe aan de HeLa-cellen.Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de oplossing en was drie keer met PBS. Voeg een blokkeringsoplossing van 0,1% BSA toe en laat dit 15 minuten inwerken bij kamertemperatuur.Verwijder daarna de blokkeringsoplossing en was nog drie keer met PBS vóór de beeldvorming. Bereid vlak voor de beeldvorming de switchbuffer door de voorraadoplossingen van het enzym glucose en het reductiemiddel met elkaar te mengen in een verhouding van 50 µL, 400 µL en 100 µL; voeg PBS toe om het uiteindelijke volume aan te vullen tot 1 mL. Verwijder de PBS uit de beeldvormingskamer en vul deze vervolgens tot de rand met de switchbuffer.Plaats voorzichtig een dekglas bovenop de kamer, waarbij u ervoor zorgt dat er absoluut geen luchtbellen aanwezig zijn en de volledige kamer is bedekt. Vul bij met extra buffer of PBS als er luchtbellen zichtbaar zijn. Anders kan de werking van de buffer afnemen.Het verzamelen van hoogwaardige, spaarzame koppelingsgegevens is essentieel voor het succes van deze procedure, dus zorg ervoor dat de microscopen correct zijn gefocust en dat de juiste acquisitie-instellingen worden gebruikt. Lokaliseer een fluorescerende structuur van belang die moet worden afgebeeld. Selecteer de gewenste belichtingshoek.In dit geval wordt een turf- of sterk schuine hoek aanbevolen, aangezien dit de signaal-ruisverhouding verbetert door out-of-focus licht te minimaliseren, wat met name voordelig is voor celmonsters. Maak een referentiebeeld met een beperkte fractie van de structuur voorafgaand aan de STORM-imaging. Verhoog de excitatielaser naar een hoog vermogen van ongeveer 2 kW/cm², terwijl er wordt gefotografeerd met camerainstellingen van 10 ms belichtingstijd en een cyclustijd van ongeveer 50 Hz of beelden per seconde.Zodra de flora fours zijn overgegaan in een schaars knipperpatroon, verzamelt u 10.000 frames. Om deze reconstructie te starten, opent u het RAINSTORM M-bestand in MATLAB en voert u dit uit in het Rainstorm-venster.Selecteer met de blader-knop het te analyseren afbeeldingsbestand. Dit moet een TIF-bestand zijn. Pas de pixelbreedte aan zodat deze overeenkomt met de ruwe gegevens van het microscoopsysteem dat is gebruikt voor de gegevensverwerving.Laat de overige waarden op de standaardinstellingen staan. Klik op de knop 'process images' en wacht tot er een voorlopige afbeelding verschijnt. De duur van de verwerking is afhankelijk van de bestandsgrootte, de computerspecificaties en het aantal kandidaatkoppelingen binnen de ruwe data.Om een bijgewerkte superresolutie-afbeelding te genereren, drukt u op de knop 'open reviewer', waarna er een tweede venster verschijnt. Druk op de knop 'adjust contrast' om de weergave van de afbeelding naar wens aan te passen. In sommige gevallen waarin de afbeelding erg donker is, moet de maximale waarde worden verlaagd.Gebruik het reviewer-venster om nuttige kwaliteitsmetrieken voor beelden te genereren en het superresolutiebeeld verder te verfijnen. Laat de eerste drie parameters voor kwaliteitscontrole op de standaardwaarden van 5.000, 0,1 en 0,8 tot 3,5 staan. Werk de waarde voor counts per photon bij.Pas de afkapwaarde voor de lokalisatieprecisie aan om een balans te vinden tussen het optimaliseren van de gemiddelde lokalisatie en precisie tegenover het aantal lokalisaties. In het uiteindelijke beeld worden waarden van 30 tot 50 nanometers aanbevolen, afhankelijk van de kwaliteit van de gegevens en het monster. De standaard schaalfactor voor de reconstructie is vijf, wat superresolutiepixels van 32 nanometers zal genereren, ervan uitgaande dat de pixel in de originele beelden 160 nanometers is.Als de ruwe afbeeldingen een pixelgrootte van 100 nanometers hebben, resulteert dit in superresolutie-afbeeldingen met pixels van 20 nanometers. Verhoog de schaalfactor om kleinere superresolutie-pixels te genereren. Druk bij de definitieve afbeelding op de knop 'run reviewer' om een bijgewerkte superresolutie-afbeelding te genereren.Druk op de knop 'view histograms' om de metrieken voor beeldkwaliteit weer te geven. Druk tot slot op de knop 'save image' in de reviewer om al deze gegevens op te slaan. Begin deze procedure door een afbeelding te genereren op dezelfde manier als eerder gedemonstreerd.Druk in de reviewer op de knop voor box-tracking en klik en sleep een kader over de fiduciale markering op de beoordeelde afbeelding. Wacht tot er een nieuwe afbeelding verschijnt, waarop de posities van de kaders worden weergegeven. Sla deze afbeelding eventueel op als het object van interesse een fiduciale markering is.Voer, zoals hier het geval is, de driftcorrectie uit door op de knop set anchor te klikken, gevolgd door de knop subtract drift. Klik ten slotte opnieuw op run reviewer om een nieuw STORM-beeld te genereren. Een succesvolle coating van dextrine zou een fluorescerende monolaag moeten produceren; typische dextrinegegevens worden in deze figuur getoond.De diffractiebeperkte beelden tonen verschillende concentraties dextrine voorafgaand aan STORM-imaging. Superresolutie-reconstructies hebben een pixelgrootte van 25 nanometers. Er zijn 10.000 beelden verzameld met een framegrootte van 128 bij 128 pixels, waarvan individuele frames uit die sequentie worden getoond.Bij een hoge dextrineconcentratie. De fluorescerende monolaag zou er relatief uniform uit moeten zien, zoals geïllustreerd in deze afbeeldingen en dit videosegment. Bij lagere concentraties zullen de knipperende signalen schaarser en in focus verschijnen.Aangezien er tijdens deze fase van beeldverwerving bij constante laserilluminatie geen duidelijke achtergrond is, zal het aantal blinks in de loop van de tijd afnemen, zoals geïllustreerd door een vergelijking tussen frame 2000 en frame 8.000 in het monster met een hoge dichtheid. Het belangrijkste verschil tussen de superresolutiebeelden van de hoge, medium en lage dextrineconcentraties is het afnemende aantal lokalisaties. Deze grafiek toont een gemiddelde van drie sequenties van 10.000 frames voor elke dextrineconcentratie, waarbij de foutenbalken de standaarddeviatie aangeven.Deze proportionele relatie tussen de concentratie van de fluorescerende moleculen, het aantal knipperingen in de ruwe gegevens en het aantal lokalisaties is echter niet eenvoudig lineair, zoals blijkt uit deze grafiek van het aantal geaccepteerde lokalisaties per frame. Bij het gebruik van een voortschrijdend gemiddelde van 100 frames bij zeer hoge molecuuldichtheden is de software niet in staat om moleculen succesvol te lokaliseren bij het afbeelden van elk monster. Een veelvoorkomend probleem kan de aanwezigheid zijn van een heldere maar onscherpe fluorescerende waas over het beeld, veroorzaakt door fluoroforen die door het medium diffunderen.Deze losgekoppelde fluorescerende moleculen kunnen worden voorkomen of verwijderd door het aantal wasstappen met PBS te verhogen voordat de schakelbuffer wordt toegevoegd, of door verse schakelbuffer aan de kamer toe te voegen; het verwerken en vergelijken van de gegevens van elke beeldreeks resulteert in zeer verschillende superresolutiebeelden. Panelen C en D zijn superresolutiebeeldconstructies die respectievelijk overeenkomen met de gegevens verzameld in panelen A en B. Deze grafiek zet het aantal geaccepteerde lokalisaties per frame uit met behulp van een voortschrijdend gemiddelde over 100 frames.De rode lijn komt overeen met storm-sequentie A en C waarbij er sprake is van een hoge achtergrond, de blauwe lijn komt overeen met B en D waarbij de achtergrond laag is. Het geaccepteerde lokalisatiegetal voor de beelden die overeenkomen met data met hoge en lage achtergrond wordt getoond in de tweede grafiek. Deze drie diffractiebeperkte beelden tonen typische data van vooraf gevormde actinefilamenten die aan het glasoppervlak kleven vóór de toevoeging van de switching-buffer en storm-imaging.Er zijn filamenten van variabele lengtes zichtbaar. Zeer heldere filamenten zijn vaak meerdere filamenten die met elkaar verstrengeld zijn. Het selecteren van enkele, relatief heldere filamenten in plaats van verstrengelde gebieden resulteert in beelden van betere kwaliteit tijdens de acquisitiefase.Langs de gehele lengte van de filament moeten heldere, gefocuste knipperingen zichtbaar zijn. Tijdens de acquisitiefase en vervolgens in de procesgegevens moet een geringe hoeveelheid knipperen waarneembaar zijn. Er moet een dun, continu filament aanwezig zijn; de lokalisaties per frame moeten een geleidelijke afname vertonen.Typisch wordt de breedte op halve hoogte, of FWHM, van een filament gegeven als een empirische schatting van de resolutie door een rechte lijn te trekken door een ingezoomd gebied van het actinefilament met de plot-profielfunctie in ImageJ en vervolgens een Gaussische fit uit te voeren. De FWHM wordt berekend op 43.2 nanometers. Een probleem met mislokalisatie kan optreden wanneer een aantal actinefilamenten vertakken en/of elkaar kruisen; dit kan worden geanalyseerd door subsets van frames te verwerken en de eerste en laatste 5.000 frames met elkaar te vergelijken.Een ander beeld wordt geproduceerd in de superresolutie-opname waarbij de eerste 5.000 frames worden gebruikt. In het midden van het beeld zijn veel lokalisaties te zien. Echter, bij gebruik van de laatste 5.000 frames zijn zeer weinig van deze lokalisaties zichtbaar en blijven alleen de filamenten over, zij het enigszins discontinu vanwege het lage aantal lokalisaties in het beeld.Wanneer er een vermoeden is van een te hoge knipperdichtheid, kan een vergelijking van de beelden met de lokalisatiegegevens per frame sterk erop wijzen dat dit probleem zich voordoet tijdens de eerste reeks frames. Er is een gemiddeld aantal lokalisaties per frame van meer dan 10, vergeleken met de laatste reeks frames waar dit ongeveer vier is. Een ander potentieel probleem bij STORM-microscopie is drift, wat optreedt wanneer het monster beweegt ten opzichte van het objectief tijdens de fase van data-acquisitie; hoewel dit zeer moeilijk te detecteren is tijdens de beeldacquisitiefase, kan drift worden vastgesteld in de superresolutiebeelden van bekende structuren zoals actinefilamenten.Het eerste teken dat er laterale drift is opgetreden, is dat de structuur groter is dan verwacht. Bijvoorbeeld, met een relatief grote halfwaardebreedte vergeleken met de precisielimietgegevens van rainstorm, in dit geval 90 nanometers vergeleken met 67 nanometers. Een betere manier om drift te detecteren is door de lokalisaties als functie van de tijd te vergelijken, oftewel kijken of de lokalisaties in de latere frames zijn verschoven ten opzichte van die in de vroege frames.Dit is duidelijk te zien in het geval van actinefilamenten wanneer deze met een kleurcode worden weergegeven. Met de box tracking-functie in rainstorm, zoals getoond in panelen B en C, worden lokalisaties weergegeven met een kleur die correspondeert met het framenummer van het moment waarop ze werden verkregen. Zo zijn lokalisaties uit het begin van de acquisitiesequentie blauw, terwijl lokalisaties uit het einde van de acquisitiesequentie rood zijn.De verschoven kleuren geven aan dat er drift is opgetreden die gemeten en gecorrigeerd moet worden. Voor drift kunnen fluorescerende beads met een diameter van 100 nanometer als referentiemarkers worden gebruikt; nummers één tot en met vier tonen afzonderlijk uitgesneden en ingezoomde beads. In een voorbeeld waarbij relatief ernstige drift van ongeveer 100 nanometers optreedt gedurende drie minuten en 10 seconden tijdens de acquisitiefase, kan dezelfde box-trackingfunctie worden gebruikt om de drift met kleurcodes te markeren en te bevestigen. Aangezien alle vier de beads in dit voorbeeld een vrijwel identieke drift vertonen, is het mogelijk om er één van hen, in dit geval bead twee, te selecteren als referentie om de drift van de andere beads af te trekken.Een vergelijking met paneel E laat zien dat de laterale drift is gecorrigeerd. Ten slotte kunnen met epidermal growth factor gekleurde HeLa-cellen worden gebruikt om een realistisch voorbeeld van de beeldresolutie te geven. In cellen toont paneel A een diffractiebeperkt beeld van een deel van een HeLa-cel, gefocust op het basale celoppervlak, waarbij de gele kaders ingezoomde regio's van interesse aangeven die worden getoond in panelen B en C, in tegenstelling tot de onduidelijke ingezoomde regio's van interesse in het diffractiebeperkte beeld.De superresolutiebeelden moeten een mengsel van clusters en incidenteel geïsoleerde enkele pixels tonen. De clusters zullen ongeveer 100 nanometers in diameter zijn en komen waarschijnlijk overeen met vormende putjes en blaasjes. De route waarlangs EGF hoofdzakelijk wordt gedownreguleerd en endocytose-lokalisaties per frame-gegevens uit Paneel D worden gepresenteerd in grafiek G. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u enkele eenvoudige testmonsters maakt, gegevens verkrijgt en hoogwaardige STORM-superresolutiebeelden reconstrueert.Deze methoden helpen om enkele veelvoorkomende valkuilen bij het fitten, zoals drift, te vermijden en helpen bij het optimaliseren van uw storm. Zie de resolutie-experimenten.

test-samples-for-optimizing-storm-super-resolution-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We tonen een methode aan om meerdere molecuelen te identificeren binnen heterogene nano-structuren bij nauwkeurige molecuul nauwkeurigheid, met behulp van sequentiële binding en elutie van fluorescent gelabelde antilichamen.

Zeer Multiplexed, Superresolutie Imaging van T-cellen Met behulp van madSTORM

Dit protocol beschrijft het nodige eiwit subcellular localisatie om resultaten te verkrijgen op de zebravis netvlies door correleren super resolutie de lichte microscopie en elektronenmicroscopie afbeeldingen scannen.

Oereenstemming super resolutie en elektronenmicroscopie op te lossen eiwit lokalisatie in Zebrafish Retina

Het algemene doel van deze methodiek is geven de optimale proefomstandigheden van monstervoorbereiding Beeldacquisitie en wederopbouw om uit te voeren van 2D dubbele dSTORM kleurenafbeeldingen van microtubuli en intermediaire filamenten in vaste...

Imaging Intermediaire filamenten en microtubuli met 2-dimensionale directe stochastische optische wederopbouw microscopie

Hier beschrijven we een photobleaching methode ter vermindering van de autofluorescence van cyanobacteriën. Na photobleaching, wordt stochastische optische wederopbouw microscopie gebruikt voor het verkrijgen van driedimensionale Super resolutiebeelden van de cyanobacteriën FtsZ ring.

Photobleaching maakt super resolutie beeldvorming van de FtsZ Ring in de Cyanobacterium Prochlorococcus

Chip-based superresolutie optische microscopie is een nieuwe benadering van fluorescentiemicroscopie en biedt voordelen in kosteneffectiviteit en doorvoer. Hier worden de protocollen voor chip voorbereiding en beeldvorming getoond voor TIRF microscopie en lokalisatie gebaseerde super-resolution microscopie.

High-throughput totale interne reflectie fluorescentie en directe stochastische optische reconstructie microscopie met behulp van een Photonic chip

Dit artikel biedt een eenvoudig en duidelijk protocol om Salmonella-uitgescheiden effectoren te labelen met behulp van genetische code-uitbreiding (GCE) site-specifiek en de subcellulaire lokalisatie van uitgescheiden eiwitten in HeLa-cellen in beeld te brengen met behulp van directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM)...

Superresolutiebeeldvorming van bacteriële uitgescheiden eiwitten met behulp van genetische code-uitbreiding

Dit protocol beschrijft single-antibody labeling (SAL) om de nanoschaal ruimtelijke organisatie van plasmamembraaneiwitten op te lossen. Door cumulatieve antilichaam-epitoopinteracties op het niveau van één molecuul te benutten, brengt membraan SAL (mSAL) lokale epitoopverdelingen in kaart terwijl het tegelijkertijd het bindingsgedrag van antilichamen in de natuurlijke cellulaire omgeving vastlegt.

Single-molecule localisatiemicroscopie van membraaneiwitten met single-antibody labeling

Dit protocol biedt een efficiënte workflow voor single-molecule localisatie microscopiebeeldvorming van geïsoleerde Arabidopsis-kernen, waarbij geoptimaliseerde isolatie, fixatie en labeling wordt gebruikt om betrouwbare nanoschaalvisualisatie van chromatine en RNA Polymerase II te bereiken. Deze benadering kan gemakkelijk worden aangepast aan andere chromatine-geassocieerde eiwitten of histonmodificaties voor beeldvorming met hoge resolutie.

Een gestroomlijnd protocol voor single-molecule localisatiemicroscopie in Arabidopsis-kernen

We beschrijven een super-resolutie beeldvorming methode om de structurele organisatie van de bacteriële FtsZ-ring, een essentieel inrichting voor celdeling sonde. Deze methode is gebaseerd op kwantitatieve analyses van fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) beelden en kan worden toegepast op andere bacteriële cytoskeleteiwitten.

Super-resolution Imaging van de bacteriële Division Machinery

De bevestiging van virionen aan een oppervlak is een vereiste voor enkelvoudige virion imaging door Super-resolution fluorescentie imaging of atomic force microscopie (AFM). Hier demonstreren we een monstervoorbereidingsmethode voor gecontroleerde hechting van virionen op glasoppervlakken die geschikt zijn voor gebruik in AFM- en superresolutiefluorescentiebeeldvorming.

Monstervoorbereiding voor single virion atomic force microscopie en superresolutie fluorescentie beeldvorming

Leer hoe je testmonsters voorbereidt om STORM-superresolutiemicroscopie te optimaliseren met resoluties van 30-50 nm. Deze methode helpt onderzoekers hoogwaardige beelden te verkrijgen.

Test Monsters voor het optimaliseren van STORM superresolutietechnieken

Meer video's verkennen