Test Monsters voor het optimaliseren van STORM superresolutietechnieken

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe hoogwaardige STORM-superresolutiebeelden kunnen worden verkregen. Dit wordt bereikt door eerst een fluorescent gelabeld testmonster voor te bereiden. De tweede stap is het bereiden van een switchingbuffer, waarna de beeldvormingskamer met deze buffer wordt gevuld.

Vervolgens worden de ruwe gegevens verzameld met een STORM-microscoop. De laatste stap is het reconstrueren van superresolutiebeelden uit de ruwe gegevens met behulp van Rainstorm-verwerkingssoftware. Uiteindelijk worden de testmonsters gebruikt om aan te tonen hoe hoogwaardige ruwe gegevens kunnen worden verzameld, die vervolgens kunnen worden verwerkt om STORM-superresolutiebeelden in cellen te genereren met resoluties tussen 30 en 50 nanometers, wat een vijf tot tienvoudige resolutieverbetering betekent ten opzichte van traditionele fluorescentiemicroscopietechnieken, waaronder TIRF en confocale microscopie.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat ze het belang niet beseffen van het verzamelen van veel kwalitatief hoogwaardige sparse links. Dit wordt veel eenvoudiger door Alexa 6 4 7-kleurstof in de juiste schakelbuffer te gebruiken. Een visuele demonstratie van deze techniek is essentieel, omdat het verkrijgen van hoogwaardige ruwe data cruciaal is voor het produceren van SPR-resolutiebeelden.

De ruwe videosequenties van deze techniek zien er volledig anders uit dan bij elke andere vorm van fluorescentiemicroscopie. Begin de procedure voor het coaten van glas met fluorescerende dextrine door 200 µL van een 0,01% polylysine-oplossing in elke put van een coverglass met acht kamers aan te brengen en 10 minuten te incuberen. Verwijder na 10 minuten de polylysine-oplossing met een pipet om er zeker van te zijn dat er geen vloeistof is achtergebleven.

Voeg 0,25 µL van een stockoplossing van dextrine-Alexa 647 met een concentratie van 2 mg/mL toe aan 25 µL gedeïoniseerd water om een oplossing van 20 µg/mL te maken voor het aanbrengen van een coating met een hoge dichtheid van dextrine-Alexa 647.

Verdun 20 µL van de 20 µg/mL oplossing tot een totaalvolume van 200 µL gedeïoniseerd water. Voor een oplossing met gemiddelde dichtheid worden twee µL verdund in 200 µL gedeïoniseerd water. Voor een oplossing met lage dichtheid wordt 0,2 µL verdund.

Voeg in 200 µL gedeïoniseerd water aan elke well 200 µL van de verdunde dextrine Alexis X 47-oplossingen toe en laat dit 10 minuten incuberen. Langere incubatietijden kunnen worden gebruikt, wat kan leiden tot een dichtere dextrinecoating. Verwijder tot slot de Dexter Xis X 47-oplossingen en was drie keer met water.

Om fluorescerende actinefilamenten op glas voor te bereiden, voegt u eerst 200 µL 0,01% polylysine-oplossing toe aan elke put van een achtkamers-glasplaatje. Dek het glas af en laat het 10 minuten incuberen. Verwijder de vloeistof met een pipet om er zeker van te zijn dat er geen vloeistof achterblijft.

Voeg aan elke kamer 90 µL algemene actinebuffer toe die vooraf is gereconstitueerd volgens de instructies van de fabrikant. Voeg vervolgens 10 µL van een 10 µM vooraf gevormde actinefilament-oplossing en één µL foid en Alexa 6 47 toe en pipetteer dit voorzichtig op en neer om te mengen. Incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur om fluorescentie-microsferen als fiduciaire markers voor te bereiden door één µL tepec-beads te verdunnen in 200 µL PBS en te mengen. Voeg de verdunde beads toe aan de beeldvormingskamer en wacht 15 minuten.

Verwijder na 15 minuten de oplossing en was drie keer met PBS voordat de cellen worden geïmaged; cellen die zijn gekweekt tot ongeveer 80% confluentie worden in dit experiment gebruikt. Verwijder het kweekmedium en was met PBS. Voeg vervolgens 500 microliters van een 4% formaldehydeloplossing toe gedurende 10 minuten.

Verwijder het formaldehyde en was drie keer met PBS. Laat de cellen niet uitdrogen en gebruik altijd PBS-gebufferde oplossingen. Om hypotone stress te voorkomen, voegt u 2 µL van een EGF Alexa, 6 47-stamoplossing van 50 µg/mL toe aan 200 µL van een 0,1% BSA-oplossing, en voegt u deze oplossing vervolgens toe aan de HeLa-cellen.

Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de oplossing en was drie keer met PBS. Voeg een blokkeringsoplossing van 0,1% BSA toe en laat dit 15 minuten inwerken bij kamertemperatuur.

Verwijder daarna de blokkeringsoplossing en was nog drie keer met PBS vóór de beeldvorming. Bereid vlak voor de beeldvorming de switchbuffer door de voorraadoplossingen van het enzym glucose en het reductiemiddel met elkaar te mengen in een verhouding van 50 µL, 400 µL en 100 µL; voeg PBS toe om het uiteindelijke volume aan te vullen tot 1 mL. Verwijder de PBS uit de beeldvormingskamer en vul deze vervolgens tot de rand met de switchbuffer.

Plaats voorzichtig een dekglas bovenop de kamer, waarbij u ervoor zorgt dat er absoluut geen luchtbellen aanwezig zijn en de volledige kamer is bedekt. Vul bij met extra buffer of PBS als er luchtbellen zichtbaar zijn. Anders kan de werking van de buffer afnemen.

Het verzamelen van hoogwaardige, spaarzame koppelingsgegevens is essentieel voor het succes van deze procedure, dus zorg ervoor dat de microscopen correct zijn gefocust en dat de juiste acquisitie-instellingen worden gebruikt. Lokaliseer een fluorescerende structuur van belang die moet worden afgebeeld. Selecteer de gewenste belichtingshoek.

In dit geval wordt een turf- of sterk schuine hoek aanbevolen, aangezien dit de signaal-ruisverhouding verbetert door out-of-focus licht te minimaliseren, wat met name voordelig is voor celmonsters. Maak een referentiebeeld met een beperkte fractie van de structuur voorafgaand aan de STORM-imaging. Verhoog de excitatielaser naar een hoog vermogen van ongeveer 2 kW/cm², terwijl er wordt gefotografeerd met camerainstellingen van 10 ms belichtingstijd en een cyclustijd van ongeveer 50 Hz of beelden per seconde.

Zodra de flora fours zijn overgegaan in een schaars knipperpatroon, verzamelt u 10.000 frames. Om deze reconstructie te starten, opent u het RAINSTORM M-bestand in MATLAB en voert u dit uit in het Rainstorm-venster.

Selecteer met de blader-knop het te analyseren afbeeldingsbestand. Dit moet een TIF-bestand zijn. Pas de pixelbreedte aan zodat deze overeenkomt met de ruwe gegevens van het microscoopsysteem dat is gebruikt voor de gegevensverwerving.

Laat de overige waarden op de standaardinstellingen staan. Klik op de knop 'process images' en wacht tot er een voorlopige afbeelding verschijnt. De duur van de verwerking is afhankelijk van de bestandsgrootte, de computerspecificaties en het aantal kandidaatkoppelingen binnen de ruwe data.

Om een bijgewerkte superresolutie-afbeelding te genereren, drukt u op de knop 'open reviewer', waarna er een tweede venster verschijnt. Druk op de knop 'adjust contrast' om de weergave van de afbeelding naar wens aan te passen. In sommige gevallen waarin de afbeelding erg donker is, moet de maximale waarde worden verlaagd.

Gebruik het reviewer-venster om nuttige kwaliteitsmetrieken voor beelden te genereren en het superresolutiebeeld verder te verfijnen. Laat de eerste drie parameters voor kwaliteitscontrole op de standaardwaarden van 5.000, 0,1 en 0,8 tot 3,5 staan. Werk de waarde voor counts per photon bij.

Pas de afkapwaarde voor de lokalisatieprecisie aan om een balans te vinden tussen het optimaliseren van de gemiddelde lokalisatie en precisie tegenover het aantal lokalisaties. In het uiteindelijke beeld worden waarden van 30 tot 50 nanometers aanbevolen, afhankelijk van de kwaliteit van de gegevens en het monster. De standaard schaalfactor voor de reconstructie is vijf, wat superresolutiepixels van 32 nanometers zal genereren, ervan uitgaande dat de pixel in de originele beelden 160 nanometers is.

Als de ruwe afbeeldingen een pixelgrootte van 100 nanometers hebben, resulteert dit in superresolutie-afbeeldingen met pixels van 20 nanometers. Verhoog de schaalfactor om kleinere superresolutie-pixels te genereren. Druk bij de definitieve afbeelding op de knop 'run reviewer' om een bijgewerkte superresolutie-afbeelding te genereren.

Druk op de knop 'view histograms' om de metrieken voor beeldkwaliteit weer te geven. Druk tot slot op de knop 'save image' in de reviewer om al deze gegevens op te slaan. Begin deze procedure door een afbeelding te genereren op dezelfde manier als eerder gedemonstreerd.

Druk in de reviewer op de knop voor box-tracking en klik en sleep een kader over de fiduciale markering op de beoordeelde afbeelding. Wacht tot er een nieuwe afbeelding verschijnt, waarop de posities van de kaders worden weergegeven. Sla deze afbeelding eventueel op als het object van interesse een fiduciale markering is.

Voer, zoals hier het geval is, de driftcorrectie uit door op de knop set anchor te klikken, gevolgd door de knop subtract drift. Klik ten slotte opnieuw op run reviewer om een nieuw STORM-beeld te genereren. Een succesvolle coating van dextrine zou een fluorescerende monolaag moeten produceren; typische dextrinegegevens worden in deze figuur getoond.

De diffractiebeperkte beelden tonen verschillende concentraties dextrine voorafgaand aan STORM-imaging. Superresolutie-reconstructies hebben een pixelgrootte van 25 nanometers. Er zijn 10.000 beelden verzameld met een framegrootte van 128 bij 128 pixels, waarvan individuele frames uit die sequentie worden getoond.

Bij een hoge dextrineconcentratie. De fluorescerende monolaag zou er relatief uniform uit moeten zien, zoals geïllustreerd in deze afbeeldingen en dit videosegment. Bij lagere concentraties zullen de knipperende signalen schaarser en in focus verschijnen.

Aangezien er tijdens deze fase van beeldverwerving bij constante laserilluminatie geen duidelijke achtergrond is, zal het aantal blinks in de loop van de tijd afnemen, zoals geïllustreerd door een vergelijking tussen frame 2000 en frame 8.000 in het monster met een hoge dichtheid. Het belangrijkste verschil tussen de superresolutiebeelden van de hoge, medium en lage dextrineconcentraties is het afnemende aantal lokalisaties. Deze grafiek toont een gemiddelde van drie sequenties van 10.000 frames voor elke dextrineconcentratie, waarbij de foutenbalken de standaarddeviatie aangeven.

Deze proportionele relatie tussen de concentratie van de fluorescerende moleculen, het aantal knipperingen in de ruwe gegevens en het aantal lokalisaties is echter niet eenvoudig lineair, zoals blijkt uit deze grafiek van het aantal geaccepteerde lokalisaties per frame. Bij het gebruik van een voortschrijdend gemiddelde van 100 frames bij zeer hoge molecuuldichtheden is de software niet in staat om moleculen succesvol te lokaliseren bij het afbeelden van elk monster. Een veelvoorkomend probleem kan de aanwezigheid zijn van een heldere maar onscherpe fluorescerende waas over het beeld, veroorzaakt door fluoroforen die door het medium diffunderen.

Deze losgekoppelde fluorescerende moleculen kunnen worden voorkomen of verwijderd door het aantal wasstappen met PBS te verhogen voordat de schakelbuffer wordt toegevoegd, of door verse schakelbuffer aan de kamer toe te voegen; het verwerken en vergelijken van de gegevens van elke beeldreeks resulteert in zeer verschillende superresolutiebeelden. Panelen C en D zijn superresolutiebeeldconstructies die respectievelijk overeenkomen met de gegevens verzameld in panelen A en B. Deze grafiek zet het aantal geaccepteerde lokalisaties per frame uit met behulp van een voortschrijdend gemiddelde over 100 frames.

De rode lijn komt overeen met storm-sequentie A en C waarbij er sprake is van een hoge achtergrond, de blauwe lijn komt overeen met B en D waarbij de achtergrond laag is. Het geaccepteerde lokalisatiegetal voor de beelden die overeenkomen met data met hoge en lage achtergrond wordt getoond in de tweede grafiek. Deze drie diffractiebeperkte beelden tonen typische data van vooraf gevormde actinefilamenten die aan het glasoppervlak kleven vóór de toevoeging van de switching-buffer en storm-imaging.

Er zijn filamenten van variabele lengtes zichtbaar. Zeer heldere filamenten zijn vaak meerdere filamenten die met elkaar verstrengeld zijn. Het selecteren van enkele, relatief heldere filamenten in plaats van verstrengelde gebieden resulteert in beelden van betere kwaliteit tijdens de acquisitiefase.

Langs de gehele lengte van de filament moeten heldere, gefocuste knipperingen zichtbaar zijn. Tijdens de acquisitiefase en vervolgens in de procesgegevens moet een geringe hoeveelheid knipperen waarneembaar zijn. Er moet een dun, continu filament aanwezig zijn; de lokalisaties per frame moeten een geleidelijke afname vertonen.

Typisch wordt de breedte op halve hoogte, of FWHM, van een filament gegeven als een empirische schatting van de resolutie door een rechte lijn te trekken door een ingezoomd gebied van het actinefilament met de plot-profielfunctie in ImageJ en vervolgens een Gaussische fit uit te voeren. De FWHM wordt berekend op 43.2 nanometers. Een probleem met mislokalisatie kan optreden wanneer een aantal actinefilamenten vertakken en/of elkaar kruisen; dit kan worden geanalyseerd door subsets van frames te verwerken en de eerste en laatste 5.000 frames met elkaar te vergelijken.

Een ander beeld wordt geproduceerd in de superresolutie-opname waarbij de eerste 5.000 frames worden gebruikt. In het midden van het beeld zijn veel lokalisaties te zien. Echter, bij gebruik van de laatste 5.000 frames zijn zeer weinig van deze lokalisaties zichtbaar en blijven alleen de filamenten over, zij het enigszins discontinu vanwege het lage aantal lokalisaties in het beeld.

Wanneer er een vermoeden is van een te hoge knipperdichtheid, kan een vergelijking van de beelden met de lokalisatiegegevens per frame sterk erop wijzen dat dit probleem zich voordoet tijdens de eerste reeks frames. Er is een gemiddeld aantal lokalisaties per frame van meer dan 10, vergeleken met de laatste reeks frames waar dit ongeveer vier is. Een ander potentieel probleem bij STORM-microscopie is drift, wat optreedt wanneer het monster beweegt ten opzichte van het objectief tijdens de fase van data-acquisitie; hoewel dit zeer moeilijk te detecteren is tijdens de beeldacquisitiefase, kan drift worden vastgesteld in de superresolutiebeelden van bekende structuren zoals actinefilamenten.

Het eerste teken dat er laterale drift is opgetreden, is dat de structuur groter is dan verwacht. Bijvoorbeeld, met een relatief grote halfwaardebreedte vergeleken met de precisielimietgegevens van rainstorm, in dit geval 90 nanometers vergeleken met 67 nanometers. Een betere manier om drift te detecteren is door de lokalisaties als functie van de tijd te vergelijken, oftewel kijken of de lokalisaties in de latere frames zijn verschoven ten opzichte van die in de vroege frames.

Dit is duidelijk te zien in het geval van actinefilamenten wanneer deze met een kleurcode worden weergegeven. Met de box tracking-functie in rainstorm, zoals getoond in panelen B en C, worden lokalisaties weergegeven met een kleur die correspondeert met het framenummer van het moment waarop ze werden verkregen. Zo zijn lokalisaties uit het begin van de acquisitiesequentie blauw, terwijl lokalisaties uit het einde van de acquisitiesequentie rood zijn.

De verschoven kleuren geven aan dat er drift is opgetreden die gemeten en gecorrigeerd moet worden. Voor drift kunnen fluorescerende beads met een diameter van 100 nanometer als referentiemarkers worden gebruikt; nummers één tot en met vier tonen afzonderlijk uitgesneden en ingezoomde beads. In een voorbeeld waarbij relatief ernstige drift van ongeveer 100 nanometers optreedt gedurende drie minuten en 10 seconden tijdens de acquisitiefase, kan dezelfde box-trackingfunctie worden gebruikt om de drift met kleurcodes te markeren en te bevestigen. Aangezien alle vier de beads in dit voorbeeld een vrijwel identieke drift vertonen, is het mogelijk om er één van hen, in dit geval bead twee, te selecteren als referentie om de drift van de andere beads af te trekken.

Een vergelijking met paneel E laat zien dat de laterale drift is gecorrigeerd. Ten slotte kunnen met epidermal growth factor gekleurde HeLa-cellen worden gebruikt om een realistisch voorbeeld van de beeldresolutie te geven. In cellen toont paneel A een diffractiebeperkt beeld van een deel van een HeLa-cel, gefocust op het basale celoppervlak, waarbij de gele kaders ingezoomde regio's van interesse aangeven die worden getoond in panelen B en C, in tegenstelling tot de onduidelijke ingezoomde regio's van interesse in het diffractiebeperkte beeld.

De superresolutiebeelden moeten een mengsel van clusters en incidenteel geïsoleerde enkele pixels tonen. De clusters zullen ongeveer 100 nanometers in diameter zijn en komen waarschijnlijk overeen met vormende putjes en blaasjes. De route waarlangs EGF hoofdzakelijk wordt gedownreguleerd en endocytose-lokalisaties per frame-gegevens uit Paneel D worden gepresenteerd in grafiek G. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u enkele eenvoudige testmonsters maakt, gegevens verkrijgt en hoogwaardige STORM-superresolutiebeelden reconstrueert.

Deze methoden helpen om enkele veelvoorkomende valkuilen bij het fitten, zoals drift, te vermijden en helpen bij het optimaliseren van uw storm. Zie de resolutie-experimenten.