Test Monsters voor het optimaliseren van STORM superresolutietechnieken

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe hoogwaardige storm-superresolutiebeelden kunnen worden verkregen. Dit wordt bereikt door eerst een fluorescent gelabeld testmonster voor te bereiden. De tweede stap is om een wisselbuffer voor te bereiden en vervolgens de beeldvormingskamer met de buffer te vullen.

Vervolgens worden de ruwe gegevens verkregen op een stormmicroscoop. De laatste stap is om superresolutiebeelden te reconstrueren van ruwe gegevens met behulp van rainstorm-verwerkingssoftware. Uiteindelijk worden de testmonsters gebruikt om te laten zien hoe hoogwaardige ruwe gegevens kunnen worden verkregen, die vervolgens kunnen worden verwerkt om storm-superresolutiebeelden in cellen te genereren met resoluties tussen de 30 en 50 nanometer, wat een verbetering van vijf tot tien keer de resolutie betekent ten opzichte van traditionele fluorescencmicroscopietechnieken, inclusief turf en confocale.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat ze niet inzien hoe belangrijk het is om veel hoogwaardige schaarse links te verzamelen. Dit wordt veel eenvoudiger gemaakt door Alexa 6 4 7-kleurstof in de juiste wisselbuffer te gebruiken. Een visuele demonstratie van deze techniek is essentieel omdat het verkrijgen van hoogwaardige ruwe gegevens cruciaal is voor het produceren van SPR-resolutiebeelden.

De ruwe videosequenties van deze techniek zien er compleet anders uit dan enige andere vorm van fluorescencmicroscopie. Om de procedure voor het coaten van glas met fluorescent gelabelde dextrine te beginnen, 200 microliters van een 0,01%-polylysine-oplossing in elk putje van een achtkamerige dekglazen en incuberen gedurende 10 minuten. Na 10 minuten, verwijder de polylysine-oplossing met een pipet om ervoor te zorgen dat er geen vloeistof overblijft.

0,25 microliters van een twee milligram per milliliter stockoplossing van dextrine. Alexa 6 47 in 25 microliters gedeïoniseerd water om een ​​20 microgram per milliliter oplossing te maken om een ​​dichte coating van dextrine te creëren. Alexa 6 47-oplossing.

Verdun 20 microliters van de 20 microgram per milliliter oplossing in een totaal van 200 microliters gedeïoniseerd water. Voor een oplossing met gemiddelde dichtheid, verdun twee microliters in 200 microliters gedeïoniseerd water. Voor een oplossing met lage dichtheid, verdun 0,2 microliters.

In 200 microliters gedeïoniseerd water, voeg 200 microliters van de verdunde dextrine Alexis X 47-oplossingen toe aan elk putje en incubeer gedurende 10 minuten. Langere incubatietijden kunnen worden gebruikt, wat kan resulteren in een dichtere dextrinecoating. Verwijder ten slotte Dexter Xis X 47-oplossingen en was drie keer met water.

Om fluorescente actinefilamenten op glas voor te bereiden, voeg eerst 200 microliters van een 0,01%-polylysine-oplossing toe aan elk putje van een achtkamerige. Dekglazen en incubeer gedurende 10 minuten. Verwijder met een pipet om ervoor te zorgen dat er geen vloeistof overblijft.

Voeg aan elk kamer 90 microliters van algemene actinebuffer toe die eerder is gereconstitueerd volgens de instructies van de fabrikant. Voeg vervolgens 10 microliters van een 10 micromolaire voorgevormde actinefilamentoplossing toe en één microliter foid en Alexa 6 47 en pipet voorzichtig omhoog en omlaag om te mengen. Incubereer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om fluorescerende parelbeaderingen als fiducialmarkers te bereiden om één microliter tepec-pareltjes te verdunnen in 200 microliters PBS en meng. Voeg de verdunde pareltjes toe aan de beeldvormingskamer en wacht 15 minuten.

Na 15 minuten, verwijder de oplossing en was drie keer met PBS voorafgaand aan beeldvorming. Het worden cellen gebruikt die zijn gekweekt tot ongeveer 80% confluency in dit experiment. Verwijder het kweekmedium en was met PBS. Voeg vervolgens 500 microliters 4%-formaldehyde-oplossing toe gedurende 10 minuten.

Verwijder de formaldehyde en was drie keer met PBS. Laat de cellen niet droog blijven en gebruik altijd PBS-gebufferde oplossingen. Om hypotone stress te voorkomen, voeg twee microliters van een 50 microgram per milliliter stockoplossing van EGF Alexa, 6 47 toe aan 200 microliters 0,1% BSA-oplossing en voeg vervolgens deze oplossing toe aan de hela-cellen.

Incuber gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de oplossing en was drie keer met PBS. Voeg een blokkeringsoplossing van 0,1% BSA toe en laat gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder daarna de blokkeringsoplossing en was nog eens drie keer met PBS voorafgaand aan beeldvorming. Vlak voor het beeldvormen, bereid de wisselbuffer voor door de enzymglucose- en reducerende middelstockoplossingen samen te mengen. In een verhouding van 50 microliters, 400 microliters en 100 microliters, voeg PBS toe om het eindvolume tot één milliliter aan te vullen. Verwijder de PBS uit de beeldvormingskamer en vul deze vervolgens tot aan de bovenkant met de wisselbuffer.

Leg voorzichtig een dekglas op de bovenkant van de kamer en zorg ervoor dat er helemaal geen luchtbellen zijn en dat de hele kamer bedekt is. Als er luchtbellen worden gezien, vul aan met extra buffer of PBS. Anders kan de bufferprestatie afnemen.

Het verzamelen van hoogwaardige, schaarse linkgegevens is essentieel voor het succes van deze procedure, dus zorg ervoor dat de microscopen goed zijn gericht en dat de juiste verwervingsinstellingen worden gebruikt. Zoek een fluorescente structuur van belang die moet worden afgebeeld. Selecteer de gewenste hoek van verlichting.

In dit geval wordt een turf of sterk hellende hoek aanbevolen, omdat dit de signaal-ruisverhouding verbetert door uitscherpte licht te minimaliseren, wat vooral gunstig is voor celmonsters. Neem een ​​referentie naar een fractiebeperkt beeld van de structuur voorafgaand aan storm-beeldvorming. Verhoog de excitatielaser tot een hoog vermogen dat overeenkomt met ongeveer twee