Handmatig Isolatie van vetweefsel-afgeleide stamcellen uit menselijke Lipoaspirates
26 september 2013
In 2001, onderzoekers van UCLA beschreef de isolatie van een populatie van volwassen stamcellen, genaamd vet-afgeleide stamcellen of ASC, uit vetweefsel. Dit artikel schetst de isolatie van ASC uit lipoaspirates behulp van een handleiding, enzymatische afbraak protocol met behulp van collagenase.
Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van adipose-afgeleide stamcellen uit vet dat is verkregen in de vorm van een lipo-aspiraat. Dit wordt bereikt door eerst de chirurgische oplossing te verwijderen en het aspiraat te wassen om contaminerende rode bloedcellen te verwijderen. De tweede stap is het vrijmaken van de stamcellen via enzymatische digestie van het gewassen lipo-aspiraat met collagenase.
Vervolgens worden de vrijgekomen cellen in de vorm van een stromale vasculaire fractie of SVF verzameld door centrifugatie. De laatste stap is het verwijderen van het supernatant en het uitplaten van de SVF-cellen voor selectie en kweek van de adherente ASC's. Uiteindelijk vindt er een in vitro inductie van deze gekweekte ASC's plaats richting bot, vet en kraakbeen.
Cellijnen kunnen worden gebruikt om de aanwezigheid van deze cellen binnen de cultuur te bevestigen, naast het bevestigen van hun multipotentie. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de logistiek van het werken met grote volumes liposuctie-aspiraten voorafgaand aan de celwinning. Bereid een steriele collagenase type 1-oplossing en steriel controlemedium voor.
Verzamel het liposuctie-asperaat in een aspiratiecontainer. Giet het liposuctie-asperaat voorzichtig over in een steriele glazen beker van één liter. Wanneer de lagen van het liposuctie-asperaat door zwaartekracht zijn gescheiden, wordt de bovenste olielaag, indien aanwezig, geaspireerd.
Verwijder daarnaast het onderste pellet. Bepaal het volume van de resulterende adiposelaag. Voeg een gelijk volume steriele 1x PBS toe en meng dit met de pipet die voor de aspiratie is gebruikt.
Wanneer de twee lagen zijn gescheiden, wordt het supernatant afgezogen met een serologische pipet van 10 milliliter. Was de fractie adipose weefsel verder met PBS totdat de adiposelaag een geelgouden kleur heeft. Zuig het supernatant voor de laatste keer af, zodat alleen de fractie adipose weefsel overblijft.
In de glazen beker. Laat de lagen van het liposucum-aspiraat vijf minuten bezinken na de laatste wasbeurt en vóór de laatste aspiratie. Bereid in een filterunit een steriele collagenase type 1-oplossing.
Voeg een volume toe dat gelijk is aan dat van de adipose fractie en filter dit steriel. Giet vervolgens voorzichtig de gewassen adipose fractie in de collagenase-oplossing en sluit de fles stevig. Incubeer het collagenase-adipose mengsel vervolgens 30 minuten in een waterbad van 37 °C met voorzichtig zwenken om de vijf tot 10 minuten; controleer of de laag adipose weefsel een gladder uiterlijk krijgt naarmate de digestie vordert en verleng indien nodig de reactietijd om eventuele vaste vetstukken op te lossen.
Steriliseer de filtereenheid die het verteerde collagenase-adipose mengsel bevat met 70% ethanol en plaats deze terug in de veiligheidskast. Pipetteer nu aliquots van 25 milliliter van het inaat dat de stromale vasculaire fractie bevat in steriele centrifugebuizen van 50 milliliter. Voeg 25 milliliter controlemedium toe aan elke buis en laat dit vijf minuten bij kamertemperatuur incuberen om de collagenase te inactiveren.
Centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 1.200 ×g in de veiligheidskabinet om de stromale vasculaire fractie als pellet te verzamelen. Aspireer het supernatant uit elke buis. Zorg ervoor dat de bovenste olielaag en eventuele drijvende adipocyten samen met dit supernatant worden geaspireerd.
Combine vervolgens de SVF-pellets in één centrifugebuis met 30 milliliters geconditioneerd medium en verdeel deze gelijkmatig over twee nieuwe centrifugebuisjes van 50 milliliter. Aspireer na centrifugatie de supernatanten van de twee pellets. Indien RBC-lyse gewenst is, kunnen deze twee pellets elk worden geresuspendeerd in 10 milliliters RBC-lysebuffer en 10 minuten bij kamertemperatuur worden geïncubeerd. Aspireer na centrifugatie de supernatanten om pellets van de stromale vasculaire fractie te verkrijgen.
Combineer deze twee pellets in een nieuwe centrifugebuis. Met gebruik van vijf tot 10 milliliters controlemedium kunnen grote weefseldeeltjes worden gefilterd met een 100 micron meshfilter dat bovenop een nieuwe 50 milliliter centrifugebuis is geplaatst. Verdeel nu de gefilterde fractie die de adipose stamcellen bevat over weefkweekschalen.
Voeg vervolgens aan elke schaal een geschikt volume controle-kweekmedium toe. Kweek de cellen drie tot vier dagen zonder het medium te verversen. Aspireer het kweekmedium en was de cellen één keer met steriel PBS om eventuele contaminerende rode bloedcellen te verwijderen, vul dan het medium weer aan en kweek verder wanneer deze handmatige enzymatische methode wordt gebruikt voor de isolatie van een stroma-vasculaire fractie uit een liposuctie-monster met een groot volume.
De resulterende gecultiveerde A SC-populatie is relatief homogeen van uiterlijk en bestaat uit fibroblast-achtige cellen, wat de meest gebruikte methode voor validatie is. In vitro inductie van de A SC-populatie onder gedefinieerde kweekcondities resulteert in hun differentiatie in mesodermale, ectodermale en endodermale lijnen. Terwijl het in vitro potentieel voor drie kiembladen heeft geleid tot het gebruik van ASC's voor een breed scala aan regeneratieve modelsystemen.
Differentiatie naar adipogene, osteogene en chondrogene cellen is over het algemeen voldoende om de ASC te identificeren en de multipotentie ervan te bevestigen. Daarnaast kunnen ASC's ook worden gedifferentieerd naar skeletmyogene en gladmyogene cellijnen, cellen van de ectodermale lijn of de endodermale hepatische cellijn. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een stromale vasculaire fractie uit liposuctievet isoleert.
Voor de doeleinden van Turing is het een SC-component.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft de isolatie van uit vetweefsel afgeleide stamcellen (ASC's) uit lipoaspiraten met behulp van een handmatig protocol voor enzymatische digestie met collagenase. Het proces omvat het wassen van het aspiraat, enzymatische digestie en het kweken van de cellen voor verder onderzoek.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Stamcelbiologie
- Regeneratieve Geneeskunde
- Tissue Engineering
Achtergrond
- Adipose-afgeleide stamcellen (ASC's) zijn een veelbelovende bron voor regeneratieve therapieën.
- ASC's kunnen differentiëren in verschillende celtypen, waaronder bot, vet en kraakbeen.
- De isolatie van ASC's uit vetweefsel is cruciaal voor hun toepassing in onderzoek en therapie.
- Eerdere studies hebben methoden voor ASC-isolatie vastgesteld, maar de optimalisatie hiervan is gaande.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor het isoleren van ASC's uit lipoaspiraten.
- Om de efficiëntie van ASC-isolatie voor onderzoeksdoeleinden te verhogen.
- Om de studie naar ASC-differentiatie en potentiële therapeutische toepassingen te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Verwijdering van de chirurgische oplossing en wassen van het lipoasperaat.
- Enzymatische digestie van het gewassen lipoasperaat met behulp van collagenase.
- Verzamelen van de stromale vasculaire fractie (SVF) door middel van centrifugatie.
- Uitplaten van SVF-cellen voor selectie en kweek van adherente ASC's.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van ASC's uit lipoaspiraten met behulp van het beschreven protocol.
- Er zijn levensvatbare ASC's verkregen en gekweekt voor verdere differentiatiestudies.
- De methode bleek efficiënt in het verwijderen van contaminanten en het maximaliseren van de celopbrengst.
- ASC's vertoonden potentie voor differentiatie naar meerdere cellijnen in vitro.
Conclusies
- Het beschreven protocol voor enzymatische digestie is effectief voor de isolatie van ASC's.
- Geïsoleerde ASC's kunnen worden gebruikt voor diverse toepassingen binnen de regeneratieve geneeskunde.
- Verdere studies zijn nodig om het volledige potentieel van ASC's in therapeutische contexten te verkennen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
De isolatie van adipose-afgeleide stamcellen (ASC's) uit lipoaspiraten biedt een schaalbare bron van multipotente cellen voor onderzoek naar regeneratieve geneeskunde in een vroeg stadium. Dit protocol maakt doelvalidatie en fenotypische screening in ziekte-relevante systemen mogelijk door adherente ASC-populaties te genereren die in staat zijn tot multi-lineage differentiatie. De methode ondersteunt mechanische risicoreductie en voorspellende betrouwbaarheid in preklinische modellen door homogene cellen afgeleid van de stromale vasculaire fractie te leveren voor downstream-applicaties.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de heterogeniteit van mesenchymale stromale cellen te onderzoeken en de multipotentie van ASC's functioneel te valideren via gedefinieerde differentiatie-assays.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare methode om ASC's uit menselijk vetweefsel te isoleren, waardoor de variabiliteit in de sourcing van primaire cellen voor target-validatiestudies wordt verminderd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert adherente ASC-populaties die geschikt zijn voor high-content screening van verbindingen die adipogene, osteogene of chondrogene pathways moduleren.
- Operationele waarde: Levert stromal vascular fraction (SVF) pellets op die kunnen worden gestandaardiseerd over verschillende lipoasperaatvolumes, wat de schaalbaarheid van assays en de reproduceerbaarheid tussen laboratoria ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Differentiatie naar adipogene, osteogene en chondrogene lijnen bevestigt de functionele potentie, wat gebruik mogelijk maakt in preklinische modellen voor weefselregeneratie.
- Operationele waarde: Schaalbare isolatie uit lipoaspiraten met een groot volume ondersteunt een consistente celtoevoer voor longitudinale preklinische studies en werk ter ondersteuning van een IND-aanvraag.
Integratie van pipeline & workflow
De workflow voor ASC-isolatie past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetidentificatie tot lead-optimalisatie en biedt een hernieuwbare celbron voor mechanistische assays en fenotypische screening voorafgaand aan preklinische validatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van de functie van stromale cellen en padmodulatie in mesenchymale populaties van menselijke oorsprong.
- Screening: Levert adherente ASC-monolagen met een consistente morfologie voor screening van verbindingenbibliotheken en dosis-responsmetingen.
- Analytica: Maakt kwantificering van de differentiatie-efficiëntie mogelijk via lineage-specifieke kleuringen (bijv. Oil Red O, Alizarin Red) als kwantitatieve uitlezing voor de effecten van verbindingen.
- Translationeel onderzoek: Het differentiatievermogen naar mesodermale lineages ondersteunt de continuïteit naar preklinische modellen voor bot-, vet- en kraakbeenherstel.
- Bedrijfsmatige hergebruikbaarheid: De aanpasbaarheid van het protocol aan verschillende volumes lipoaspiraten maakt hergebruik in meerdere projecten en therapeutische gebieden mogelijk zonder heroptimalisatie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindering van mechanische ambiguïteit door middel van een gevalideerde multi-potentiebeoordeling van geïsoleerde ASC's.
- Operationele waarde: Standaardisatie van enzymatische digestie en wasstappen minimaliseert variabiliteit tussen batches in de SVF-opbrengst.
- Strategische waarde: Geïnformeerde go/no-go-beslissingen op basis van differentiatiepotentieel verminderen uitval in een laat stadium van regeneratieve programma's.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van ASC-afgeleide therapieën, mogelijk gemaakt door betrouwbare potentiemetrieken uit in vitro differentiatie.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in primaire celcultuur en steriele technieken om de levensvatbaarheid van ASC's tijdens de isolatie te behouden.
- Afhankelijk van toegang tot steriel collagenase Type I, veiligheidskasten en gekoelde centrifuges voor de verwerking van de SVF.
- Vereist standaardisatie van wasprotocollen om een consistente kleur van het vetweefsel en de verwijdering van rode bloedcellen te bereiken.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten het aanpassen van de collagenaseconcentratie en incubatietijd op basis van de dichtheid van het lipoaspiraat en donorvariabiliteit.
- Praktische beperkingen omvatten variabiliteit in celopbrengst gekoppeld aan donorleeftijd, BMI en liposuctietechniek, zoals vermeld in het bronmateriaal.
