Name: Handmatig Isolatie van vetweefsel-afgeleide stamcellen uit menselijke Lipoaspirates (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-26T20:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Leer de handmatige isolatie van vetweefsel-afgeleide stamcellen uit menselijke lipoaspirates met behulp van enzymatische vertering met collageenase. Deze methode optimaliseert celopbrengst voor regeneratieve geneeskunde en weefselengineering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen erkennen en dank die aanvullende onderzoek personeel die hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van het protocol beschreven en de isolatie van ASC, waaronder: dr. H. Peter Lorenz, MD, Dr Hiroshi Muzuno, MD, Dr Jerry Huang, MD , Dr Adam Katz, MD, Dr William Futrell, MD, Dr Rong Zhang, DDS, PhD, dr. Larissa Rodriguez, MD, Dr Zeni Alfonso, PhD, en Dr John Fraser, PhD. De gepresenteerde resultaten werden gefinancierd, voor een deel, door onderzoek subsidies van de National Institutes of Health, waaronder de NIAMS en NIDCR Instituten.

<ol><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-lineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-226 (2001).</li>
<li>Rodbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+isolated+fat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolism of isolated fat cells.</a> J. Biol. Chem. 239, 375-380 (1964).</li>
<li>Poznanski, W. J., Waheed, I., Human Van, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fat+cell+precursors.+Morphologic+and+metabolic+differentiation+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">fat cell precursors. Morphologic and metabolic differentiation in culture.</a> Lab Invest. 29 (5), 570-576 (1973).</li>
<li>Zuk, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+Stem+Cells+in+Tissue+Regeneration%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived Stem Cells in Tissue Regeneration: A Review.</a> ISRN Stem Cells. , in press (2012).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).</li>
<li>Mitchell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotype+of+human+adipose-derived+cells%3A+temporal+changes+in+stromal-associated+and+stem+cell-associated+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers.</a> Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).</li>
<li>Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypical+and+functional+characterization+of+freshly+isolated+adipose+tissue-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells.</a> Stem Cells Dev. 16 (1), 91-104 (2007).</li>
<li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+freshly+isolated+and+cultured+cells+derived+from+the+fatty+and+fluid+portions+of+liposuction+aspirates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates.</a> J Cell Physiol. 208 (1), 64-76 (2006).</li>
<li>Zannettino, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotential+human+adipose-derived+stromal+stem+cells+exhibit+a+perivascular+phenotype+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo.</a> J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).</li>
<li>Chung, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD90+%28Thy-1%29+Positive+Selection+Enhances+Osteogenic+Capacity+of+Human+Adipose-Derived+Stromal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells.</a> Tissue Eng Part A. , (2012).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenic+potential+of+adipose+stem+cell+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Adipogenic potential of adipose stem cell subpopulations.</a> Plast Reconstr Surg. 128 (3), 663-672 (2011).</li>
<li>Rada, T., Reis, R. L., Gomes, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stem+cells+subpopulations+isolated+from+human+adipose+tissue+exhibit+different+chondrogenic+and+osteogenic+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential.</a> Stem Cell Rev. 7 (1), 64-76 (2011).</li>
<li>Heydarkhan-Hagvall, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Adipose+Stem+Cells%3A+A+Potential+Cell+Source+for+Cardiovascular+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Human Adipose Stem Cells: A Potential Cell Source for Cardiovascular Tissue Engineering.</a> Cells Tissues Organs. 187 (4), 263-274 (2008).</li>
<li>Jack, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processed+lipoaspirate+cells+for+tissue+engineering+of+the+lower+urinary+tract%3A+implications+for+the+treatment+of+stress+urinary+incontinence+and+bladder+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction.</a> J Urol. 174 (5), 2041-2045 (2005).</li>
<li>Banas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+hepatic+fate+specification+of+adipose-derived+stem+cells+and+their+therapeutic+potential+for+liver+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure.</a> J Gastroenterol Hepatol. 24 (1), 70-77 (2009).</li>
<li>Schreml, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+human+adipose+tissue-derived+adult+stem+cells%3A+resection+versus+liposuction%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection versus liposuction.</a> Cytotherapy. 11 (7), 947-957 (2009).</li>
<li>Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cell+yield+and+growth+characteristics+are+affected+by+the+tissue-harvesting+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure.</a> Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).</li>
<li>Ahmad, J., Eaves, F. F., Rohrich, R. J. 3rd, Kenkel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+American+Society+for+Aesthetic+Plastic+Surgery+%28ASAPS%29+survey%3A+current+trends+in+liposuction%5BTitle%5D)+AND+%22Aesthet+Surg+J%22%5BJournal%5D)">The American Society for Aesthetic Plastic Surgery (ASAPS) survey: current trends in liposuction.</a> Aesthet Surg J. 31 (2), 214-224 (2011).</li>
<li>Tierney, E. P., Kouba, D. J., Hanke, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+of+tumescent+and+laser-assisted+liposuction%3A+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Drugs+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Safety of tumescent and laser-assisted liposuction: review of the literature.</a> J Drugs Dermatol. 10 (12), 1363-1369 (2012).</li>
<li>Mojallal, A., Auxenfans, C., Lequeux, C., Braye, F., Damour, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+negative+pressure+when+harvesting+adipose+tissue+on+cell+yield+of+the+stromal-vascular+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater+Eng%22%5BJournal%5D)">Influence of negative pressure when harvesting adipose tissue on cell yield of the stromal-vascular fraction.</a> Biomed Mater Eng. 18 (4-5), 193-197 (2008).</li>
<li>Matsumoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+of+preservation+at+various+temperatures+on+liposuction+aspirates%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates.</a> Plast Reconstr Surg. 120 (6), 1510-1517 (2007).</li>
<li>Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+from+lipoaspirate+blood+and+saline+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction.</a> Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).</li>
<li>Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+stromal+stem+cells+from+human+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue.</a> Methods Mol Biol. 325, 35-46 (2006).</li>
<li>Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells%3A+isolation%2C+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation.</a> Methods. 45 (2), 115-120 (2008).</li>
<li>Dubois, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+adipose-derived+stem+cells+from+biopsies+and+liposuction+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens.</a> Methods Mol Biol. 449, 69-79 (2008).</li>
<li>Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bone+marrow+and+adipose+tissue+mesenchymal+stem+cells%3A+a+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user's guide.</a> Stem Cells Dev. 19 (10), 1449-1470 (2010).</li>
<li>Zachar, V., Rasmussen, J. G., Fink, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+growth+of+adipose+tissue-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and growth of adipose tissue-derived stem cells.</a> Methods Mol Biol. 698, 37-49 (2011).</li>
<li>Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagenase+lot+selection+and+purification+for+adipose+tissue+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion.</a> Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).</li>
<li>Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+enzymatic+isolation+of+fibroblasts+for+the+creation+of+autologous+skin+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).</li>
<li>Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+highly+defined+proteases+for+the+isolation+of+adipose+tissue-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells.</a> Regen Med. 3 (5), 705-715 (2008).</li>
<li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+of+centrifugation+on+cells+and+tissues+in+liposuction+aspirates%3A+optimized+centrifugation+for+lipotransfer+and+cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Influences of centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation.</a> Plast Reconstr Surg. 121 (3), 1033-1041 (2008).</li>
<li>Poloni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dedifferentiated+adipocytes+show+similar+properties+to+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).</li>
<li>D'Andrea, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+production+of+human+adipose+tissue+from+stem+cells%3A+a+new+tool+for+regenerative+medicine+and+tissue+banking%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Large-scale production of human adipose tissue from stem cells: a new tool for regenerative medicine and tissue banking.</a> Tissue Eng Part C Methods. 14 (3), 233-242 (2008).</li>
<li>Tallone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+adipose+tissue+contains+several+types+of+multipotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Adult human adipose tissue contains several types of multipotent cells.</a> J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 200-210 (2011).</li>
<li>De Francesco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD34%2FCD90+ASCs+are+capable+of+growing+as+sphere+clusters%2C+producing+high+levels+of+VEGF+and+forming+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human CD34/CD90 ASCs are capable of growing as sphere clusters, producing high levels of VEGF and forming capillaries.</a> PLoS One. 4 (8), e6537(2009).</li>
<li>Haasters, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+immunocytochemical+characteristics+indicate+the+yield+of+early+progenitors+and+represent+a+quality+control+for+human+mesenchymal+stem+cell+culturing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing.</a> J Anat. 214 (5), 759-767 (2009).</li>
</ol>

De auteurs van dit manuscript zijn mede-uitvinders op een patent in handen van de Regenten van de Universiteit van Californië en in licentie gegeven aan Cytori Therapeutics.

Vetweefsel voor de isolatie van ASC kan komen in vele vormen: van stevige stukjes weefsel verkregen door middel van resectie of lipoplasty om kleinere stukken verkregen via ofwel spuit extractie of-zuig bijgestaan ​​lipoplasty (dwz liposuctie). Of meer SVF cellen (en daarmee ASC&#39;s) kan worden verkregen bij gereseceerde of weggezogen vet monsters is onduidelijk tegenstrijdige studies zijn gepresenteerd 16, 17. Het is mogelijk dat beide vormen van vetweefsel is meer dan geschikt voor de isolatie va...

In 2001, een vermeende populatie van multipotente stamcellen uit vetweefsel werd beschreven in het tijdschrift Tissue Engineering 1. Deze cellen kregen de naam Verwerkte Lipoaspirate of PLA cellen als gevolg van hun afleiding van verwerkte lipoaspirate weefsel verkregen door middel van cosmetische chirurgie. De isolatiemethode in dit artikel beschreven is gebaseerd op bestaande enzymatische strategieën voor de isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit vetweefsel 2. De SVF is gedefinieerd als een minimaal verwerkt populatie van rode bloedcellen, fibroblasten, endotheelcellen, gladde spiercellen, pericyten en pre-adipocyten die nog moeten voldoen aan een weefselkweek substraat 2, 3. Kweken van deze SVF tijd wordt voorgesteld veel van deze verontreinigende celpopulaties elimineren en resulteren in een hechtende, fibroblastische bevolking. Deze fibroblasten zijn geïdentificeerd in de literatuur voor de laatste 40 jaar als zijnde pre-adipocyten. Echter, onze onderzoeksgroep aangetoond dat deze cellen bezat mesodermale multipotent en omgedoopt tot de adherente SVF bevolking PLA cellen. Latere studies door tal van andere onderzoeksgroepen hebben toegevoegd aan dit potentieel, wat suggereert zowel endodermale en ectodermale potentials (voor review zie 4). Sindsdien talrijke extra termen voor deze cellen zijn verschenen in de literatuur. Om enige vorm van consensus te bieden, werd de term vetweefsel-afgeleide stamcellen of ASC op de 2e jaarlijkse IFATS conferentie aangenomen. Als zodanig zal de term ASC worden gebruikt in dit artikel. De in dit artikel beschreven protocol is een betrekkelijk eenvoudige procedure die standaard laboratorium apparatuur vereist en gebruikt eenvoudige reagentia zoals fosfo-gebufferde zoutoplossing, standaard weefselkweekmedium reagentia en collagenase. Het kan grote aantallen ASC naargelang de hoeveelheid uitgangsmateriaal vetweefsel volume en vervolgens c producerenultuur tijd. Echter, de verwerking van een grote hoeveelheid vetweefsel fysieke problemen die kunnen worden verminderd tot een mate met dit protocol presenteren. Bovendien is dit protocol vereist steriele weefselkweek faciliteiten en goedgekeurd bioveiligheid kappen, waardoor het gebruik van een goedgekeurde weefselkweek faciliteit noodzakelijk. Deze eis kan verminderen de bruikbaarheid van de ASC bevolking in klinische toepassingen tenzij ze worden geïsoleerd goede fabricagepraktijken (GMP)-erkende installaties ontworpen voor de isolatie en expansie van materialen voor klinisch gebruik. Als alternatief zou geautomatiseerde systemen die ASC kunnen isoleren in een gesloten systeem in de operatiekamer deze belangrijke kwestie voorkomen, terwijl het onmiddellijke gebruik van ASC zonder enige noodzaak voor daaropvolgende in vitro expansie. Tot op heden zijn er zes geautomatiseerde systemen die commercieel beschikbaar zijn voor de isolatie van cellen uit menselijk weefsel. Deze systemen maken het mogelijk isoleren van eenaanzienlijk aantal ASC uit grote hoeveelheden vetweefsel onmiddellijk na de oogst. Deze ASC kunnen daarna opnieuw in de patiënt voor verschillende regeneratieve doelen zonder de patiënt ooit de operatiekamer verlaten. Daarnaast protocol beschrijft de handleiding isolatie van ASC, is een protocol voor isolatie van geautomatiseerde ASC met het Celution systeem eveneens in een begeleidend artikel.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagens</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&#8217;s Modificatie van Eagle&#8217;s Medium)</td><td>Mediatech Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>met 4,5 g/ml glucose, L-glutamine, natriumpyruvaat</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Mediatech Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>10.000 IE/ml penicilline/10.000 &#956;g/ml streptomycine</td></tr><tr><td>Amphotericine B</td><td>Mediatech Cellgro</td><td>30-003-CF</td><td>250 &#956;g/ml amphotericine B</td></tr><tr><td>10X PBS (Fosfaat-gebufferde zoutoplossing)</td><td>Mediatech Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td>zonder calcium, zonder magnesium</td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA</td><td>Mediatech Cellgro</td><td>20-031-CV</td><td>0,25% trypsine/2,21mM EDTA</td></tr><tr><td>Collageenase type IA (van Clostridium histolyticum)</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>ruwe bereiding; &lt;125 collageen verterings-eenheden/mg vaste stof</td></tr><tr><td>FBS (Foetaal Rundserum) hitte-geïnactiveerd</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>100106</td><td>USDA-bron, hitte-geïnactiveerd</td></tr><tr><td>10 ml serologische pipetten</td><td>Genesee Scientific</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>25 ml serologische pipetten</td><td>Genesee Scientific</td><td>12-106</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropyleen centrifugebuizen</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-106</td><td></td></tr><tr><td>100 mm weefselkweekschotels</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>150 mm weefselkweekschotels</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-203</td><td></td></tr><tr><td>500 ml Stericup-filtereenheden</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>PES-membraan, 0,22 &#956;m porie</td></tr><tr><td>Celsifters</td><td>FisherBrand</td><td>22-363-549</td><td>100 &#956;m nylon gaas</td></tr><tr><td>dexamethason - wateroplosbaar</td><td>Sigma</td><td>D-2915</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbinezuur 2-fosfaat</td><td>Sigma</td><td>A-8960</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-glycerofosfaat dinatriumzout</td><td>Sigma</td><td>G-9422</td><td>ook bekend als glycerofosfaat</td></tr><tr><td>insuline</td><td>Sigma</td><td>I-6634</td><td>gemaakt van rundse alvleesklier</td></tr><tr><td>indomethacine</td><td>Sigma</td><td>I-7378</td><td></td></tr><tr><td>apo-transferrine</td><td>Sigma</td><td>T-4382</td><td></td></tr><tr><td>TGF&#946;1</td><td>R&amp;D Systems</td><td>240-B-002</td><td>recombinant humaan</td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma</td><td>O-0625</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blauw</td><td>Sigma</td><td>A-5268</td><td></td></tr><tr><td>Zilvernitraat</td><td>Sigma</td><td>S-0319</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>30525-89-4</td><td>geleverd als een 16% stockoplossing</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">Benodigde apparatuur</td></tr><tr><td>Klasse II A/B Bioveiligheidskap</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>zorg ervoor dat de kap vacuümleidingen heeft voor aspiratie</td></tr><tr><td>Centrifuge voor op tafel</td><td>Hermle Labnet</td><td>Z383</td><td>Zwaai-uit rotor voor 50 ml buizen vereist, geschikt voor 1200xg</td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Fisher Scientific Isotemp</td><td>S52602Q</td><td>5-10L capaciteit, geschikt voor 37C</td></tr><tr><td>Automatische Pipet Hulpmiddelen</td><td>Drummond Pipet Hulp XL</td><td>4-000-105</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Forma 310</td><td>directe warmte of watermantel</td></tr></tbody></table>

handmatig isolatie van vetweefsel-afgeleide stamcellen uit menselijke lipoaspirates

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

In 2001, onderzoekers van de Universiteit van Californië, Los Angeles, beschreef de isolatie van een nieuwe populatie van volwassen stamcellen uit liposuctie vetweefsel dat ze in eerste instantie genoemd Verwerkte Lipoaspirate Cells of PLA cellen. Sindsdien zijn deze stamcellen zijn hernoemd vetweefsel-afgeleide stamcellen of ASC en zijn gegaan naar een van de meest populaire volwassen stamcellen populaties op het gebied van stamcelonderzoek en regeneratieve geneeskunde geworden. Duizenden artikelen beschrijven nu het gebruik van ASC in verschillende regeneratieve diermodellen, zoals botherstel, perifere zenuwen reparatie en cardiovasculaire techniek. Recente artikelen zijn begonnen met de talloze toepassingen te beschrijven voor ASC in de kliniek. De in dit artikel protocol beschrijft de basisprocedure voor het handmatig en enzymatisch ASC isoleren van grote hoeveelheden lipoaspirates verkregen cosmetische ingrepen. Dit protocol kan gemakkelijk worden opgeschaald of omlaag om accomat de hoeveelheid lipoaspirate en kan worden aangepast aan ASC&#39;s uit vetweefsel verkregen via abdominoplasties en andere soortgelijke procedures isoleren.

De hiervoor beschreven protocol beschrijft een handleiding enzymatische methode voor het isoleren van een SVF uit een groot volume lipoaspirate monster. Binnen deze SVF zijn talrijk celpopulaties, waaronder de ASC. Talrijke studies stellen dat het kweken van deze SVF onder standaard weefselkweek voorwaarden zullen kiezen voor een aanhanger fibroblast bevolking die hoofdzakelijk bestaat uit het type ASC. Consistent hiermee hebben we aangetoond, met flowcytometrie en immunofluorescentie, dat gekweekte SVF pellets worden i...

In 2001, onderzoekers van UCLA beschreef de isolatie van een populatie van volwassen stamcellen, genaamd vet-afgeleide stamcellen of ASC, uit vetweefsel. Dit artikel schetst de isolatie van ASC uit lipoaspirates behulp van een handleiding, enzymatische afbraak protocol met behulp van collagenase.

Handmatig Isolatie van vetweefsel-afgeleide stamcellen uit menselijke Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van adipose-afgeleide stamcellen uit vet dat is verkregen in de vorm van een lipo-aspiraat. Dit wordt bereikt door eerst de chirurgische oplossing te verwijderen en het aspiraat te wassen om contaminerende rode bloedcellen te verwijderen. De tweede stap is het vrijmaken van de stamcellen via enzymatische digestie van het gewassen lipo-aspiraat met collagenase.Vervolgens worden de vrijgekomen cellen in de vorm van een stromale vasculaire fractie of SVF verzameld door centrifugatie. De laatste stap is het verwijderen van het supernatant en het uitplaten van de SVF-cellen voor selectie en kweek van de adherente ASC's. Uiteindelijk vindt er een in vitro inductie van deze gekweekte ASC's plaats richting bot, vet en kraakbeen.Cellijnen kunnen worden gebruikt om de aanwezigheid van deze cellen binnen de cultuur te bevestigen, naast het bevestigen van hun multipotentie. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de logistiek van het werken met grote volumes liposuctie-aspiraten voorafgaand aan de celwinning. Bereid een steriele collagenase type 1-oplossing en steriel controlemedium voor.Verzamel het liposuctie-asperaat in een aspiratiecontainer. Giet het liposuctie-asperaat voorzichtig over in een steriele glazen beker van één liter. Wanneer de lagen van het liposuctie-asperaat door zwaartekracht zijn gescheiden, wordt de bovenste olielaag, indien aanwezig, geaspireerd.Verwijder daarnaast het onderste pellet. Bepaal het volume van de resulterende adiposelaag. Voeg een gelijk volume steriele 1x PBS toe en meng dit met de pipet die voor de aspiratie is gebruikt.Wanneer de twee lagen zijn gescheiden, wordt het supernatant afgezogen met een serologische pipet van 10 milliliter. Was de fractie adipose weefsel verder met PBS totdat de adiposelaag een geelgouden kleur heeft. Zuig het supernatant voor de laatste keer af, zodat alleen de fractie adipose weefsel overblijft.In de glazen beker. Laat de lagen van het liposucum-aspiraat vijf minuten bezinken na de laatste wasbeurt en vóór de laatste aspiratie. Bereid in een filterunit een steriele collagenase type 1-oplossing.Voeg een volume toe dat gelijk is aan dat van de adipose fractie en filter dit steriel. Giet vervolgens voorzichtig de gewassen adipose fractie in de collagenase-oplossing en sluit de fles stevig. Incubeer het collagenase-adipose mengsel vervolgens 30 minuten in een waterbad van 37 °C met voorzichtig zwenken om de vijf tot 10 minuten; controleer of de laag adipose weefsel een gladder uiterlijk krijgt naarmate de digestie vordert en verleng indien nodig de reactietijd om eventuele vaste vetstukken op te lossen.Steriliseer de filtereenheid die het verteerde collagenase-adipose mengsel bevat met 70% ethanol en plaats deze terug in de veiligheidskast. Pipetteer nu aliquots van 25 milliliter van het inaat dat de stromale vasculaire fractie bevat in steriele centrifugebuizen van 50 milliliter. Voeg 25 milliliter controlemedium toe aan elke buis en laat dit vijf minuten bij kamertemperatuur incuberen om de collagenase te inactiveren.Centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 1.200 ×g in de veiligheidskabinet om de stromale vasculaire fractie als pellet te verzamelen. Aspireer het supernatant uit elke buis. Zorg ervoor dat de bovenste olielaag en eventuele drijvende adipocyten samen met dit supernatant worden geaspireerd.Combine vervolgens de SVF-pellets in één centrifugebuis met 30 milliliters geconditioneerd medium en verdeel deze gelijkmatig over twee nieuwe centrifugebuisjes van 50 milliliter. Aspireer na centrifugatie de supernatanten van de twee pellets. Indien RBC-lyse gewenst is, kunnen deze twee pellets elk worden geresuspendeerd in 10 milliliters RBC-lysebuffer en 10 minuten bij kamertemperatuur worden geïncubeerd. Aspireer na centrifugatie de supernatanten om pellets van de stromale vasculaire fractie te verkrijgen.Combineer deze twee pellets in een nieuwe centrifugebuis. Met gebruik van vijf tot 10 milliliters controlemedium kunnen grote weefseldeeltjes worden gefilterd met een 100 micron meshfilter dat bovenop een nieuwe 50 milliliter centrifugebuis is geplaatst. Verdeel nu de gefilterde fractie die de adipose stamcellen bevat over weefkweekschalen.Voeg vervolgens aan elke schaal een geschikt volume controle-kweekmedium toe. Kweek de cellen drie tot vier dagen zonder het medium te verversen. Aspireer het kweekmedium en was de cellen één keer met steriel PBS om eventuele contaminerende rode bloedcellen te verwijderen, vul dan het medium weer aan en kweek verder wanneer deze handmatige enzymatische methode wordt gebruikt voor de isolatie van een stroma-vasculaire fractie uit een liposuctie-monster met een groot volume.De resulterende gecultiveerde A SC-populatie is relatief homogeen van uiterlijk en bestaat uit fibroblast-achtige cellen, wat de meest gebruikte methode voor validatie is. In vitro inductie van de A SC-populatie onder gedefinieerde kweekcondities resulteert in hun differentiatie in mesodermale, ectodermale en endodermale lijnen. Terwijl het in vitro potentieel voor drie kiembladen heeft geleid tot het gebruik van ASC's voor een breed scala aan regeneratieve modelsystemen.Differentiatie naar adipogene, osteogene en chondrogene cellen is over het algemeen voldoende om de ASC te identificeren en de multipotentie ervan te bevestigen. Daarnaast kunnen ASC's ook worden gedifferentieerd naar skeletmyogene en gladmyogene cellijnen, cellen van de ectodermale lijn of de endodermale hepatische cellijn. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een stromale vasculaire fractie uit liposuctievet isoleert.Voor de doeleinden van Turing is het een SC-component.

manual-isolation-adipose-derived-stem-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft de isolatie van vet-afgeleide stromale cellen van lipoaspirate en de oprichting van een 4 mm kritische grootte calvarial defect aan het skelet regeneratie te evalueren.

Reparatie van een kritische grootte Calvarial Defect Model Met behulp van Adipose-afgeleide stromale cellen geoogst uit Lipoaspirate

This video demonstrates a technique for isolating and culturing fluorescently labeled neural crest-derived adipose-derived stem cells (ADSCs) from murine periaortic arch adipose tissue. Following isolation, the NCADSCs are detected, sorted using fluorescence-activated cell sorting, and subsequently cultured on a plate, promoting cell proliferation.

Isolating Adipose-Derived Stem Cells from Murine Periaortic Adipose Tissue

De transcriptionele heterogeniteit binnen humane adipogeen-afgeleide stromale cellen kan op enkelcellig niveau worden gedefinieerd met behulp van celoppervlaktemarkers en osteogene genen. We beschrijven een protocol dat flowcytometrie gebruikt voor de isolatie van celsubpopulaties met verhoogd osteogeen potentieel, die kunnen worden gebruikt om craniofaciale skeletreconstructie te verbeteren.

Isolatie en Verrijking van Human Adipose-afgeleide stromale cellen voor Enhanced Osteogenesis

Hier presenteren we een protocol om te verkrijgen stromale vasculaire breuk van adipeus weefsel door middel van een reeks van mechanische processen, waaronder membraanemulsificatie en meerdere centrifugations.

Mechanische micronisatie voor Lipoaspirates voor regeneratieve therapie

Nauwkeurige openbaarmaking van methoden en protocollen is cruciaal voor grootschalige opname van stamceltherapieën. Hier presenteren we een protocol om van vetweefsel afgeleide regeneratieve cellen te isoleren, gebruikt voor een enkele intracaverneuze injectie als behandeling van erectiestoornissen (ED) na radicale prostatectomie (RP).

Isolatie van van vetweefsel afgeleide regeneratieve cellen voor de behandeling van erectiestoornissen na radicale prostatectomie

Dit protocol biedt een enzym vrije methode voor het isoleren van mesenchymale stamcellen uit correctie-en lipoaspirate-monsters met behulp van een explant methode. De afwezigheid van harde enzymen of centrifugeer stappen voorziet in klinisch relevante stamcellen die kunnen worden gebruikt voor studies in vitro of teruggeplaatst naar de kliniek.

Een enzym vrije methode voor isolatie en uitbreiding van mesenchymale stamcellen van menselijke adipeus

Hier presenteren we menselijke vetweefsel enzym-vrije micro-fragmentatie met behulp van een gesloten systeem apparaat. Deze nieuwe methode maakt het verkrijgen van sub-millimeter clusters van vetweefsel geschikt voor in vivo transplantatie, in vitro cultuur, en verdere celisolatie en karakterisering.

Menselijke vetweefsel micro-fragmentatie voor Celfenotyping en Secretome karakterisatie

Het huidige protocol beschrijft een verbeterde methodologie voor ADSC-isolatie, wat resulteert in een enorme cellulaire opbrengst met tijdwinst in vergelijking met de literatuur. Deze studie biedt ook een eenvoudige methode voor het verkrijgen van een relatief groot aantal levensvatbare cellen na cryopreservatie op lange termijn.

Techniek voor het verkrijgen van mesenchymale stamcel uit vetweefsel en stromale vasculaire fractiekarakterisering bij cryopreservatie op lange termijn

Dit protocol beschrijft een methodologie voor het isoleren en identificeren van van vetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's) van Sprague Dawley-ratten.

Isolatie en identificatie van mesenchymale stamcellen afgeleid van vetweefsel van Sprague Dawley-ratten

Dit protocol beschrijft de semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel om preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie in vitro te bereiken. Het gebruik van een weefseldissociator voor collagenasevertering vermindert experimentele variatie en verhoogt de reproduceerbaarheid.

Semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator

Hier presenteren we een standaardmethode om effectief stamcellen en adipocyten van vetweefsel te isoleren, gekenmerkt door &gt;90% vermindering van verwerkingstijd, hoge cellevensvatbaarheid en brede compatibiliteit.

Efficiënte isolatie van vetweefselstamcellen en adipocyten uit varkensvet vetweefsel

Leer de handmatige isolatie van vetweefsel-afgeleide stamcellen uit menselijke lipoaspirates met behulp van enzymatische vertering met collageenase. Deze methode optimaliseert celopbrengst voor regeneratieve geneeskunde en weefselengineering.

Handmatig Isolatie van vetweefsel-afgeleide stamcellen uit menselijke Lipoaspirates

Meer video's verkennen