Isolatie, zuivering en etikettering van de Muis Bone Marrow Neutrophils voor functionele studies en adoptieve overdracht Experimenten

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren en labelen van neutrofielen uit het beenmerg van muizen voor daaropvolgende functionele studies en adoptieve transfer-experimenten. Dit wordt bereikt door eerst de beenmergcellen uit de dijbeenderen en scheenbeenderen van muizen te verzamelen. Tijdens de tweede stap worden de rode bloedcellen osmotisch gelyseerd door ze opeenvolgend te suspenderen in respectievelijk 0,2% en 1,6% natriumchloride-oplossingen.

Vervolgens worden de neutrofielen geïsoleerd door middel van dichtheidsgradiëntcentrifugatie. In de laatste stap worden de neutrofielen gelabeld met cell tracker-kleurstoffen. Uiteindelijk kan flowcytometrie worden gebruikt om het aantal adoptief overgedragen neutrofielen te bepalen dat is gerekruteerd naar diverse muisweefsels.

Het belangrijkste voordeel van het isoleren van muisneutrofielen uit het beenmerg ten opzichte van bloed of het peritoneum, is dat er zowel tijdens de rusttoestand als na infectie een groot aantal cellen uit het beenmerg kan worden verkregen, wat voldoende is voor downstream functionele studies en adoptieve transfer-experimenten. Het voordeel van het gebruik van een gradiëntcentrifugatietechniek voor het isoleren van muisneutrofielen boven immunomagnetische selectie of fluorescentie-geactiveerde cel sortering is dat het snel en economisch is, en dat het labelen van de neutrofielen met antilichamen, die neutrofielenactivatie kunnen induceren, wordt vermeden. De procedure zal worden gedemonstreerd door Muca Swami, een technicus uit mijn laboratorium, nadat een geëuthanaseerde muis is besproeid met 70% ethanol.

Maak een incisie in de huid van de middenbuik van het dier en verwijder vervolgens het huidweefsel van het distale deel van het dier, inclusief de onderste extremiteiten. Gebruik daarna een schaar om de spieren van de achterpoten van het dier door te snijden en ontwricht vervolgens voorzichtig de ACE beum uit het heupgewricht, waarbij moet worden voorkomen dat de femurkop breekt. Gebruik vervolgens de schaar en een scalpel om de resterende spieren van het femur en de tibia te verwijderen.

Scheid de pootbeenderen bij het kniegewricht, waarbij u er zorg voor draagt dat de uiteinden van het bot niet breken, en plaats de beenderen vervolgens in een Petrischaal met ijskoud RPMI 1 6 4 oh. Voeg FBS en antibiotica toe. Verplaats de schaal naar een weefselkweekkast en steriliseer vervolgens de buitenkant van elk bot met 70% ethanol in een nieuwe Petrischaal.

Spoel na ongeveer 10 tot 15 seconden de ethanol van het oppervlak van elk bot af met drie opeenvolgende wasbeurten in ijskoud, steriel PBS. Snijd vervolgens de epifyse van elk van de botten af en plaats deze in een nieuwe steriele Petrischaal. Bevestig daarna een naald van 25 gauge aan een spuit van 12 cc gevuld met 10 milliliters RPMI.

Vullen met FBS en EDTA. Spoel vervolgens de beenmergcellen vanuit beide uiteinden van de schacht van elk femur-tibia-paar in een Falcon-buis met schroefdop van 50 ml, voorzien van een filter van 100 µm om alle cellen te verwijderen. Schraap de binnenzijden van de botten met de naaldpunt.

Wanneer de botten gebleekt lijken, zijn de cellen voldoende verwijderd. Gebruik nu een scalpel om de botepifysen in kleine stukjes van 0,5 tot 1 mm te snijden en gebruik vervolgens de achterkant van een 2,5 mL einor comb tip plus BioPure pipetpunt om ze door het 100 µm filter te drukken. Na het centrifugeren van de geoogste cellen gedurende zeven minuten bij 427 ×g en 4 °C, worden de rode bloedcellen in 20 mL 0,2% natriumchloride gedurende ongeveer 20 seconden gelyseerd.

Stop vervolgens de lysis met 20 milliliters 1,6% natriumchloride, centrifuger de cellen en resuspendeer het pellet daarna in RPMI 1640 aangevuld met FBS en EDTA. Tel de cellen en resuspendeer, na het opnieuw centrifugeren, het gewassen pellet in ijskoud steriel PBS met een concentratie van maximaal 100 × 10⁶ cellen per 1 milliliter. Doseer nu 3 milliliters histidine-opaque 1119 van 18 tot 26 °C in een conische buis van 15 milliliter, en breng vervolgens langzaam 3 milliliters van 18 tot 26 °C aan als overlay.

Ficoll-Paque 1 0 7 7. Om te voorkomen dat de twee dichtheden direct na bereiding mengen, wordt de beenmergcelsuspensie voorzichtig bovenop de Ficoll-Paque 1 0 7 7 laag geplaatst. Centrifugeer de dichtheidsgradiënt gedurende 30 minuten bij 834 ×g en 25 °C zonder rem, en verzamel vervolgens de neutrofielen op de interface van de Ficoll-Paque 1 1 1 9 en 1 0 7 7 lagen. Na het tweemaal wassen van de verzamelde neutrofielen in RPMI 1 6 40 FBS en antibiotica, worden de cellen geresuspendeerd op vijf × 10⁶ cellen per milliliter in PBS, voorverwarmd tot 37 °C.

Reserveer na het tellen van de cellen een kleine aliquot van elk experimenteel monster om de zuiverheid en levensvatbaarheid via flowcytometrie te bepalen. Label vervolgens de resterende neutrofielen met een cell tracker-kleurstof bij een eindconcentratie van 5 µM gedurende 10 minuten bij 37 °C in een schudend waterbad in het donker. Was de cellen tenslotte tweemaal met ijskoud RPMI 1640 aangevuld met FBS en antibiotica om kruiscontaminatie van de kleurstof te voorkomen, alvorens de differentieel gelabelde neutrofielpopulaties te mengen voor downstream competitieve repopulatiestudies. In dit paneel worden representatieve flowcytometrie-plots getoond van uit het beenmerg geïsoleerde, via dichtheidsgradiënt gescheiden neutrofielen van een niet-geïnfecteerde C57BL/6 muis. De initiële gating werd gebruikt voor de beenmergcellen die werden verzameld van de interface van Histopaque 1119 en Histopaque 1077.

Met behulp van forward- en side-scatter wordt aangetoond dat de via dichtheidsgradiënt gescheiden neutrofielen meer dan 90% zuiver en meer dan 95% levensvatbaar zijn gedurende ten minste vier uur na adoptieve transfer. Met Cell Tracker DIA gelabelde neutrofielen kunnen via flowcytometrie worden gevolgd in diverse weefsels van de muis. Bijvoorbeeld, in het bloed, het beenmerg en de nieren van de recipiënte Candida-geïnfecteerde C 57 black six muis, zoals getoond in dit experiment door gating op de levende CD 45 LY six G CD 11 B cellen; deze representatieve adoptief getransfereerde C-M-T-M-R gelabelde neutrofielen kunnen op basis van hun PE-expressie worden onderscheiden van de native C-M-T-M-R en PE-negatieve neutrofielen van de recipiënte muis.

Zodra de isolatie en markering van neutrofielen uit het muizenbeenmerg onder de knie zijn, kan het proces in drie uur worden voltooid.