Name: Isolatie, zuivering en etikettering van de Muis Bone Marrow Neutrophils voor functionele studies en adoptieve overdracht Experimenten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Leer neutrofielen isoleren en labelen uit muizenbotmerg met dichtheidsgradiëntcentrifugatie en CellTracker-kleurstoffen. Deze methode biedt een reproduceerbare aanpak voor functionele studies en adoptieve overdrachtexperimenten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de afdeling Intramurale Onderzoek van het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten (NIAID), National Institute of Health (NIH), USA. Alle muizen werden gehandhaafd op een Amerikaanse Vereniging voor de Accreditatie van Laboratory Animal Care-geaccrediteerde dierfaciliteit bij het Nationale Instituut voor Allergie en Infectieziekten (NIAID) en gehuisvest in overeenstemming met de in de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren procedures onder de auspiciën van een protocol door de Animal Care en gebruik Comite van de NIAID goedgekeurd.

1. Isolatie van beenmergcellen van de muis <ol><li> Euthanaseren muizen met behulp van dierlijke zorg van de instelling commissie-goedgekeurde protocol en spuit het dier oppervlak met 70% ethanol. </li><li> Maak een incisie van de huid in het midden van de buik en verwijder het vel van het distale deel van de muis met inbegrip van de huid die de onderste ledematen. </li><li> Afgesneden van de spieren van de onderste ledematen met een schaar en zorgvuldig ontwrichten de heupkom van het heupgewricht, terwijl het vermijden van het breken van de femurkop. </li><li> Verwijder de resterende spieren van het bovenbeen en onderbeen met behulp van een scalpel en schaar en scheiden het dijbeen van de tibia op het kniegewricht uitoefening zorg aan niet op het bot uiteinden breken. Plaats de botten in een petrischaal met ijskoude RPMI 1640 1X aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline / streptomycine. </li><li> Ga verder met de volgende stappen onder een weefselkweek kap. Neem extra voorzorgsmaatregelen om strikte steriele technieken te behouden om neutrophi voorkomenl activatie. </li><li> Spoel elk been met 70% ethanol (bij een petrischaal) gevolgd door drie opeenvolgende wasbeurten in ijskoud steriel PBS (binnen Petrischalen) te spoelen van de ethanol uit het oppervlak van de botten. </li><li> Binnen een schone steriele petrischaal, afgesneden van de epifysen van de botten en houd ze apart. </li><li> Gebruik een 25-gauge naald en een 12 cc spuit gevuld met RPMI gesupplementeerd met 10% FBS en 2 mM EDTA, en spoel de beenmergcellen van beide uiteinden van het bot assen op een schroefdop ml Falcon buis 50 voorzien van een 100 urn filteren. Om efficiënt alle cellen te verwijderen, schraap het binnenoppervlak van de botten met de 25-gauge naald. </li></ol> OPMERKING: blancheren van botten geeft aan dat de cellen voldoende zijn geschraapt. OPMERKING: Gebruik ongeveer 10 ml van de media om een ​​femur / tibia paar spoelen. Het toevoegen van EDTA aan het medium essentiële klonteren van de cellen te voorkomen. <ol start="9"><li> Snijd het bot epifysenin kleine 0.5-1 mm 3 stuks met een scalpel en smash hen door de 100 um filter met behulp van de back-end van een 2,5 ml Eppendorf Combitip Plus Biopur pipet tip. </li><li> Centrifugeer bij 1.400 rpm gedurende 7 minuten bij 4 ° C. </li><li> Lyse de rode bloedcellen door resuspenderen de celpellet in 20 ml 0,2% NaCl gedurende ongeveer 20 seconden gevolgd door toevoeging van 20 ml 1,6% NaCl. (Kritiek: Neem niet meer dan 20-30 sec van hypotone lysis om beenmerg celdood te voorkomen Het gebruik van hypotone NaCl voor lysis wordt aanbevolen boven ACK lyseren buffer omdat de laatste heeft het potentieel om de neutrofielen te activeren.). </li><li> Centrifugeer gedurende 7 minuten bij 1400 rpm bij 4 ° C om de cellen te verzamelen. </li><li> Was de cellen met RPMI 1640 1X aangevuld met 10% FBS en 2 mM EDTA en gecentrifugeerd zoals in stap 1.12. </li><li> De opbrengst van beenmergcellen met deze methode is ongeveer 60-80.000.000 per geïnfecteerde 8-12 weken oude C57BL / 6 muis. </li></ol> 2. Scheiding van neutrofielendoor dichtheidsgradiëntcentrifugatie <ol><li> Tel de beenmergcellen en opnieuw in suspensie in 1 ml ijskoude steriele PBS. </li><li> Voeg 3 ml Histopaque 1119 (dichtheid, 1,119 g / ml) in een 15-ml conische buis. </li><li> Overlay 3 ml Histopaque 1077 (dichtheid 1,077 g / ml) op de 3 ml Histopaque 1119. </li></ol> OPMERKING: Histopaque 1119 en Histopaque 1077 dient te worden opgewarmd 18-26 C vóór gebruik °. Critical Stap: Bereid gradiënten direct voor gebruik als werkvoorbereiding gradient vooraf leidt tot diffusie tussen de twee lagen en suboptimale neutrofielen zuiverheid en terugwinning. Critical Stap: overlay Histopaque 1077 op 1119 moet langzaam gebeuren om te vermengen de twee dichtheden, welke cel separatie verhinderen tijdens het centrifugeren. <ol start="4"><li> Overlay het beenmerg celsuspensie bovenop Histopaque 1077. </li></ol> Kritische stap: Overlaying het beenmerg celsuspensie op Histopaque 1077 moet langzaam gebeuren om te voorkomen dat verstoring van de interface tussen de cellen en Histopaque 1077. Opmerking: Het mengen beenmergcellen uit een geïnfecteerde muizen in 1 ml PBS levert neutrofiel zuiverheid van&gt; 90%. Echter, pooling veel beenmergmonsters compromitteert neutrofielen zuiverheid, bijvoorbeeld resuspenderen 300 x 10 6 cellen in 3 ml PBS vermindert neutrofielen zuiverheid van&gt; 90% tot ~ 80%. Daarom moeten onderzoekers proefprojecten uit te voeren om de ideale celgetal / volume voorwaarden vaststellen voor hun specifieke experimenten <ol start="5"><li> Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 2000 rpm bij 25 ° C zonder rem. </li></ol> OPMERKING: Centrifugeren van de gradiënt bij kamertemperatuur kritisch en essentieel voor effectieve scheiding van de neutrofielen. <ol start="6"><li> Verzamel de neutrofielen op het grensvlak van de Histopaque 1119 en Histopaque 1077 lagen. </li&gt; <li> Was tweemaal de verzamelde neutrofielen met RPMI 1640 aangevuld met 1X 10% FBS en 1% penicilline / streptomycine en centrifugeer bij 1400 rpm gedurende 7 minuten bij 4 ° C. </li><li> Tel de neutrofielen en bepalen hun levensvatbaarheid. </li></ol> OPMERKING: Neutrofielen typisch&gt; 95% levend en&gt; 90% zuiver zoals bepaald door FACS-analyse. De typische opbrengst van neutrofielen uit het beenmerg (dwz 2 femur en tibia bot 2) van een niet-geïnfecteerde 8-12 weken oude C57BL / 6 muis ~ 6-12.000.000 cellen. Dit aantal is aanzienlijk groter wanneer neutrofielen geoogst uit beenmerg van geïnfecteerde dieren. Vandaar ~ 30-40000000 neutrofielen / muis werden teruggevonden bij Candida-geïnfecteerde muizen werden gebruikt voor mobiele oogsten 6. 3. Etikettering van neutrofielen gebruik CellTracker Kleurstoffen <ol><li> Resuspendeer de neutrofielen tot 5 x 10 6 cellen / ml in PBS voorverwarmd bij 37 ° C. </li><li> Voeg een CellTracker kleurstof bij een uiteindelijke concentrantsoen van 5 uM. </li></ol> OPMERKING: CellTracker Groen (CMFDA (5-Chloromethylfluorescein Diacetaat) en CellTracker Oranje (CMTMR (5 - (en-6)-4-Chloormethyl Benzoyl Amino tetramethylrhodamine) werd gebruikt in dit protocol om differentieel labelen neutrofielen van wild-type en gendeficiënte muizen. OPMERKING: Bereid een voorraad oplossing van 10 mM van CellTracker Groen en CellTracker Orange, hoeveelheid, en bewaar bij -80 ° C tot de dag van het experiment. <ol start="3"><li> Incubeer neutrofielen met 5 uM van de overeenkomstige CellTracker kleurstof gedurende 10 min bij 37 ° C in een schuddend waterbad in het donker. </li><li> Was de cellen tweemaal met ijskoude RPMI 1640 1X aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline / streptomycine. </li></ol> OPMERKING: Efficiënte wassen van de cellen na het labelen stap met de CellTracker kleurstof is essentieel voor dye kruisbesmetting te vermijden alvorens te mengen differentieel-gelabelde neutrofielen bevolking voor downstream concurrerende herbevolking studies. 4. Adoptieve overdracht van neutrofielen in Muizen en analyse van Overgedragen Neutrophils Met behulp van flowcytometrie <ol><li> Resuspendeer neutrofielen in ijskoude PBS bij een concentratie van 25 x 10 6 cellen / ml en injecteer 200 ul van de suspensie in de laterale staartader zodat 5 x 10 6 neutrofielen per muis worden overgedragen. Voor een concurrentiegerichte herbevolking neutrofielen studies, meng wild-type en gendeficiënte neutrofielen op een 1:1 verhouding en injecteer een totaal van 5 x 10 6 neutrofielen per muis als hierboven. </li></ol> Opmerking: In ieder geval tot 10 x 10 6 neutrofielen adoptief per muis worden overgedragen zonder duidelijke directe toxiciteit voor de dieren. <ol start="2"><li> Op verschillende tijdstippen na adoptieve overdracht (bijv. 1, 2, 3 of 4 uur na overdracht), euthanize muizen en oogsten bloed en / of beenmerg en / of andere doelorganen (s) plaats. </li><li> Bereid single celsuspensies van deze weefsels voor de kwantitatieve en kwalitatieve analyse van adoptief overgedragen gelabelde neutrofielen behulp gepubliceerde protocollen 6,15. </li><li> Naar aanleiding van levende / dode levensvatbaarheid kleuring en Fc blokkade, label cellen met CD45 (kloon 30-F11), Ly6G (kloon 1A8) en CD11b (kloon M1/70) en poort op live CD45 + Ly6G + CD11b + neutrofielen. Neutrofielen in deze poort bevatten ingebouwde neutrofielen van de ontvanger muis en de adoptief overgedragen gemerkte neutrofielen, die FITC + (indien gelabeld met CellTracker groen) of PE + (indien gelabeld met Cell Tracker Orange). </li></ol> OPMERKING: Neutrofielen worden bijgehouden in bloed, beenmerg en nier van Candida-geïnfecteerde muizen gedurende tenminste 4 uur na overdracht. OPMERKING: Bevestiging met 2% paraformaldehyde in PBS geen nadelige invloed op de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de neutrofielen gelabeld met CellTracker GrENL of CellTracker Oranje gedurende tenminste 48 uur.

<ol><li>Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLehrer%2C+RI+%22Ann.+Intern.+Med%22">Ann. Intern. Med</a>. 109 (2), 127-142 (1988).</li>
<li>Rot, A., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+innate+and+adaptive+host+defense%3A+basic+chemokinese+grammar+for+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).</li>
<li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+function%3A+from+mechanisms+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).</li>
<li>Blomgran, R., Ernst, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+neutrophils+facilitate+activation+of+naive+antigen-specific+CD4%2B+T+cells+during+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection.</a> J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).</li>
<li>Narasaraju, T., Yang, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+neutrophils+and+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+acute+lung+injury+of+influenza+pneumonitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis.</a> Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).</li>
<li>Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+Ccr1+drives+neutrophil-mediated+kidney+immunopathology+and+mortality+in+invasive+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis.</a> PLoS Pathog. 8 (8), (2012).</li>
<li>Cascão, R., Rosário, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+rheumatoid+arthritis%3A+More+than+simple+final+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun.+Rev%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors.</a> Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).</li>
<li>Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+subset+of+proinflammatory+neutrophils+isolated+from+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+induces+vascular+damage+and+synthesizes+type+I+IFNs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs.</a> J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).</li>
<li>Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+requirement+for+the+leukotriene+B4+receptor+BLT1+for+neutrophil+recruitment+in+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis.</a> J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).</li>
<li>Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+isolation+of+neutrophils+from+murine+blood+using+negative+immunomagnetic+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation.</a> Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).</li>
<li>Hasenberg, M., Köhler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+immunomagnetic+negative+enrichment+of+neutrophil+granulocytes+from+murine+bone+marrow+for+functional+studies+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo.</a> PLoS One. 6 (2), e17314(2011).</li>
<li>Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+antibacterial+host+defense+in+mice+lacking+the+N-formylpeptide+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor.</a> J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).</li>
<li>Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+are+indispensable+for+hematopoietic+stem+cell+mobilization+induced+by+interleukin-8+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).</li>
<li>Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR2+and+CXCR4+antagonistically+regulate+neutrophil+trafficking+from+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow.</a> J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).</li>
<li>Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+innate+immune+responses+in+a+mouse+model+of+invasive+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Innate.+Immun%22%5BJournal%5D)">Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis.</a> J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).</li>
<li>Boxio, R., Bossenmeyer-Pourié, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nüsse, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+bone+marrow+contains+large+numbers+of+functionally+competent+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils.</a> J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).</li>
<li>Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+requirement+for+the+leukotriene+B4+receptor+BLT1+for+neutrophil+recruitment+in+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis.</a> J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).</li>
<li>Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+negative+enrichment+of+CD4%2B+and+CD8%2B+T+cells+from+murine+spleen+via+nylon+wool+adherence+and+an+optimized+antibody+cocktail%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail.</a> J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).</li>
<li>Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17RA+signaling+reduces+inflammation+and+mortality+during+Trypanosoma+cruzi+infection+by+recruiting+suppressive+IL-10-producing+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils.</a> PLoS Pathog. 8 (4), e1002658(2012).</li>
<li>Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+screen+identifies+reactive+oxygen+species+as+key+regulators+of+neutrophil+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).</li>
<li>Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roffê, E., Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Deletion+of+Chemokine+Receptor+Ccr7+Exacerbates+Atherogenesis+in+ApoE-deficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice.</a> Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).</li>
<li>Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+the+reciprocal+production+of+granulocytes+and+lymphocytes+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow.</a> J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).</li>
<li>Berkow, R. L., Dodson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+functional+evaluation+of+mature+neutrophils+from+human+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow.</a> Blood. 68 (4), 853-860 (1986).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen.

Hierin presenteren we een betrouwbaar, eenvoudig, snel en economisch protocol voor isolatie van grote aantallen van neutrofielen uit het beenmerg van muizen met een hoge zuiverheid en levensvatbaarheid met een dichtheidsgradiënt centrifugatie benadering. Wanneer dit protocol correct wordt uitgevoerd, kan ~ 6-12 × 10 6 neutrofielen worden verhaald op een niet-geïnfecteerde muizen en maar liefst ~ 30-40 × 10 6 neutrofielen kunnen worden geïsoleerd uit een muis na infectie 6. De geïsoleerde...

Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in de mens. Zij zijn de belangrijkste cellulaire component van het aangeboren immuunsysteem en fungeren als een eerste lijn van verdediging tegen binnendringende micro-organismen. Patiënten met verworven neutropenie en primaire immuundeficiënties dat neutrofielen nummers en / of functie beïnvloeden de ontwikkeling van levensbedreigende invasieve bacteriële en schimmelinfecties, met de nadruk op het belang van deze cellen in de afweer 1. Immuunherkenning van binnendringende ziekteverwekkers op de infectieplaats door hun verwante patroonherkenning receptoren resulteert in de inductie van een georkestreerde aangeboren immuunreactie, wat leidt tot uitscheiding van chemoattractants een chemotactische gradiënt kan werven neutrofielen uit het bloed in ontstoken weefsel 2 genereren . Na neutrofielen alstublieft de besmettingsplaats, worden ze geactiveerd, wat leidt tot cytokine en chemokine productie pathogeen opname en doden via oxidatieve en niet-oxidatieve mechanisms 3. Naast hun goed-erkende rol in aangeboren immuniteit, neutrofielen zijn ook onlangs aangetoond dat een belangrijke rol spelen als initiatiefnemers van effectieve adaptieve immuunreacties 4. Anderzijds, los van hun beschermende rol in immuniteit, neutrofielen bemiddelen ook weefselschade en immunopathologie door overmatige accumulatie en / of activatie op plaatsen van ontsteking, zoals getoond in diverse infectieziekten en auto-immuunziekten 5-7. Ondanks de onmisbare rol van neutrofielen bij de montage effectieve aangeboren immuunrespons en hun pleiotropische effector functies in diverse infectieziekten en ontstekingen, technische problemen met de behandeling van deze cellen en het ontbreken van betrouwbare experimentele protocollen heeft belemmerd onderzoek met een aantal neutrofielen in de afgelopen decennia. Daarom wordt gebruik van reproduceerbare assays voor isolatie van neutrofielen moet verder onderzoek neutrofiel-gemedieerde immunolo vergemakkelijkengische functies ex vivo en in vivo. Tot op heden zijn verscheidene werkwijzen beschreven voor het isoleren van neutrofielen zoals dichtheidsgradiënt centrifugering van bloed en muis bloed of beenmerg 8,9, positieve of negatieve immunomagnetische verrijking van neutrofielen van muizen bloed of beenmerg 10,11 en oogsten van neutrofielen uit de peritoneale holte van muizen na intraperitoneale injectie van thioglycollaat of andere inflammatoire middelen 12. Hoewel neutrofielen gemakkelijk afzonderlijk in grote aantallen uit menselijk bloed, deze methode niet optimaal bij muizen vanwege de beperkte hoeveelheid muizenbloed die isolatie voldoende neutrofielen voor functionele studies of adoptieve overdrachtsexperimenten 13 uitsluit. Bovendien, hoewel de opbrengst van thioglycollaat-opgewekte cellen van de peritoneale holte groter is vergeleken met die van muizenbloed, de zuiverheid van neutrofielen in de inflammatoire peritoneale lavage varieert60-90%, en de geïsoleerde neutrofielen vertonen een geactiveerde fenotype. Aldus, de cellen verzameld met deze methode alleen gebruikt voor het uitvoeren van functionele studies van geactiveerde, maar niet die van niet-gestimuleerde neutrofielen, zoals de muis peritoneale holte weinig neutrofielen bij het ​​stationaire 12. In plaats daarvan, het beenmerg is handig reservoir voor het oogsten grote aantallen of ongestimuleerde of geactiveerde neutrofielen 11,14, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse functionele studies zoals fagocytose en doden degranulatie of voor adoptieve overdracht in ontvangende muizen. Een eenvoudige en snelle (~ 2 uur) protocol, dat een hoge opbrengst geeft Hierin beschrijven we (~ 6-12 x 10 6 cellen / geïnfecteerde muis of tot 30-40 x 10 6 cellen / geïnfecteerde muizen) zuiver (80 -95%) neutrofielen bij&gt; 95% levensvatbaarheid van het beenmerg. Deze methode maakt gebruik van commercieel verkrijgbare Histopaque, die dichtheidsgradiënt cel separantsoen media bestaande uit Ficoll en natrium diatrizoaat te scheiden neutrofielen uit het beenmerg van muizen. Deze methode levert veel grotere aantallen neutrofielen per muis vergeleken met bloed of peritoneale holte, kan het worden gebruikt om neutrofielen ophalen muizen zowel steady state of na infectie, en het is gemakkelijker te laag ten opzichte van de dichtheidsgradiënt centrifugatie methode gebruikt discontinue Percoll gradiënt bestaande uit 55% / 65% / 75% Percoll in PBS 9. Bovendien worden de tijd en de middelen om pure neutrofielen verzamelen significant verlaagd vergeleken met neutrofiel isolatie met fluorescentie-geactiveerde celsortering. Ook, omdat deze methode geen sprake van een immuno verrijkingsstap is rendabeler en vermijdt de blootstelling van cellen aan de magnetische kolom en antilichamen, wordt de kans op neutrofiel activatie afneemt. Naast het uitvoeren van functionele studies van geïsoleerde neutrophils ex vivo en adoptieve overdracht van cellen in de ontvangende muizen, dit protocol beschrijft ook een werkwijze voor het labelen van geïsoleerde neutrofielen met verschillende CellTracker kleurstoffen. Differentiële labeling van neutrofielen van muizen van verschillende genetische achtergronden kan worden aangepast in concurrerende herbevolking studies voor het bijhouden van de overgedragen neutrofielen in de weefsels van de ontvangende muizen met behulp van flowcytometrie, die mechanistisch inzicht kan verschaffen over de directe rol van specifieke genen in de handel van neutrofielen uit het bloed in doel ontstoken organen 6.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Reagenten</td></tr><tr><td>RPMI 1640 1X met L-glutamine en 25 mM HEPES</td><td>Cellgro</td><td>10-041-CV</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (hitte geïnactiveerd)</td><td>GemCell</td><td>100500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine (10.000 eenheden penicilline / 10.000 mg/ml streptomycine)</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Quality Biological Inc</td><td>351-027-101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0,2% en 1,6% natriumchloride</td><td>JT Baker</td><td>3624</td><td>Natriumchloride-oplossingen bereid met gedistilleerd water en sterieel gefilterd</td></tr><tr><td>Sterieel gefilterd Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td>Histopaque 1077 moet voor gebruik op 18-26 &deg;C worden gebracht</td></tr><tr><td>Sterieel gefilterd Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Histopaque 1119 moet voor gebruik op 18-26 &deg;C worden gebracht</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calcium en magnesium</td><td>Cellgro</td><td>210-40-CV</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ethyl alcohol (200 proof)</td><td>The Warner Graham Company</td><td>64-17-5</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetaat)</td><td>Invitrogen</td><td>C-7025</td><td>Maak stockoplossingen van 10 mM in DMSO, verdeel in aliquoten en bewaar bij -80 &deg;C</td></tr><tr><td>CellTracker Orange (CMTMR, 5-(en 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)</td><td>Invitrogen</td><td>C-2927</td><td>Maak stockoplossingen van 10 mM in DMSO, verdeel in aliquoten en bewaar bij -80 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-muis CD45 (Clone 30-F11)</td><td>eBioscience</td><td>170451-82</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-muis Ly6G (Clone 1A8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>551461</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-muis Ly6G (Clone 1A8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>560599</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-muis CD11b (Clone M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>47-0112-82</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-muis CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td>Gebruik bij 1:100 verdunning</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td><td>Molecular Probes</td><td>L-23105</td><td>Gebruik bij 1:1000 verdunning</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfaat (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>67-68-5</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde-oplossing, 4% in PBS</td><td>USB Corporation</td><td>19943</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tabel 1. Reagentia voor isolatie, labelen en traceren van adoptief overgedragen neutrofielen.</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Materialen</td></tr><tr><td>C57BL/6 muizen</td><td>Taconic</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml centrifugeerbuizen</td><td>Corning</td><td>430053</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml centrifugeerbuizen</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>25 ml serologische pipetten</td><td>Celltreat</td><td>229225B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>10 ml serologische pipetten</td><td>Celltreat</td><td>229210B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>5 ml serologische pipetten</td><td>Celltreat</td><td>229205B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pasteur pipetten (3 ml)</td><td>BD Falcon</td><td>357575</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>12 ml spuiten</td><td>Kendall monoject</td><td>512878</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>25 G x 5/8 inch naalden (precision glide naalden)</td><td>BD</td><td>305122</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>100 mm celstrainers</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bactericidaal Petri-schaaltjes</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Combitips Plus Biopur</td><td>Eppendorf</td><td>2249608-5</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Muis dissectie-instrumenten (Schaar, pincetten, scalpel)</td><td>Biomedical Research Instruments</td><td>10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000</td><td>Instrumenten gesteriliseerd voor gebruik</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>Weefselkweek kast</td><td>The Baker Company</td><td>SG403</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Gekoelde centrifuge</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>75004521</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>37 &deg;C schudbaad</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>3166721</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tabel 2. Lijst van materialen en apparatuur gebruikt in dit protocol.</td></tr></tbody></table>

isolatie, zuivering en etikettering van de muis bone marrow neutrophils voor functionele studies en adoptieve overdracht experimenten

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrofielen zijn kritisch effector cellen van het aangeboren immuunsysteem. Ze zijn snel aangeworven op plaatsen van acute ontsteking en oefenen beschermende of pathogene effecten, afhankelijk van de inflammatoire milieu. Toch, ondanks de onmisbare rol van neutrofielen bij de immuniteit, gedetailleerd inzicht in de moleculaire factoren die neutrofielen &#39;effector en immunopathogene effecten in verschillende infectieziekten en ontstekingen bemiddelen ontbreekt nog, deels vanwege hun korte halfwaardetijd, de problemen met de afhandeling van deze cellen en het ontbreken van betrouwbare experimentele protocollen voor het verkrijgen van voldoende aantallen neutrofielen voor downstream functionele studies en adoptieve overdracht experimenten. Daarom, eenvoudige, snelle, zuinige en betrouwbare methoden zijn zeer wenselijk voor het oogsten van voldoende aantallen muis neutrofielen voor het beoordelen van functies zoals fagocytose, moord, cytokine productie, degranulatie en mensenhandel. Daartoepresenteren wij een reproduceerbare dichtheidsgradiënt centrifugatie gebaseerd protocol kan worden aangepast in een laboratorium grote aantallen neutrofielen isoleren uit het beenmerg van muizen met een hoge zuiverheid en levensvatbaarheid. Bovendien presenteren we een eenvoudig protocol dat CellTracker kleurstoffen gebruikt om de geïsoleerde neutrofielen, die vervolgens kunnen adoptief overgebracht in ontvangende muizen en bijgehouden in verscheidene weefsels ten minste 4 uur na overdracht met flowcytometrie label. Met deze aanpak kan differentiële labeling van neutrofielen van wild-type en gen-deficiënte muizen met verschillende CellTracker kleurstoffen met succes worden gebruikt om concurrerende herbevolking studies uit te voeren voor het evalueren van de directe rol van specifieke genen in de handel van neutrofielen uit het bloed in doelweefsels in vivo .

Dit protocol is geoptimaliseerd voor de oogst van beenmergcellen van muizen en de daaropvolgende afscheiding van neutrofielen uit deze cellen door dichtheidsgradiënt centrifugatie met behulp van commercieel verkrijgbaar Histopaque cel scheidingsmedium. Neutrofielen geïsoleerd met behulp van deze methode kan worden gebruikt voor een verscheidenheid van stroomafwaartse functionele studies ex vivo en adoptieve overdrachtsexperimenten in ontvangende muizen. De typische opbrengst van de ...

We beschrijven een protocol voor isolatie en zuivering van neutrofielen van muizen beenmerg door dichtheidsgradiënt centrifugatie en neutrofielen labeling met CellTracker kleurstoffen. Dit is een eenvoudige, snelle, reproduceerbare en economische methode voor het verkrijgen van grote aantallen neutrofielen voor downstream functionele studies of adoptieve overdracht en experimenten volgen.

Isolatie, zuivering en etikettering van de Muis Bone Marrow Neutrophils voor functionele studies en adoptieve overdracht Experimenten

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren en labelen van neutrofielen uit het beenmerg van muizen voor daaropvolgende functionele studies en adoptieve transfer-experimenten. Dit wordt bereikt door eerst de beenmergcellen uit de dijbeenderen en scheenbeenderen van muizen te verzamelen. Tijdens de tweede stap worden de rode bloedcellen osmotisch gelyseerd door ze opeenvolgend te suspenderen in respectievelijk 0,2% en 1,6% natriumchloride-oplossingen.Vervolgens worden de neutrofielen geïsoleerd door middel van dichtheidsgradiëntcentrifugatie. In de laatste stap worden de neutrofielen gelabeld met cell tracker-kleurstoffen. Uiteindelijk kan flowcytometrie worden gebruikt om het aantal adoptief overgedragen neutrofielen te bepalen dat is gerekruteerd naar diverse muisweefsels.Het belangrijkste voordeel van het isoleren van muisneutrofielen uit het beenmerg ten opzichte van bloed of het peritoneum, is dat er zowel tijdens de rusttoestand als na infectie een groot aantal cellen uit het beenmerg kan worden verkregen, wat voldoende is voor downstream functionele studies en adoptieve transfer-experimenten. Het voordeel van het gebruik van een gradiëntcentrifugatietechniek voor het

isolation-purification-labeling-mouse-bone-marrow-neutrophils-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Beenmergtransplantatie geeft een manier om het genotype van het beenmerg afgeleide cellen. Als het gen van interesse tot expressie wordt gebracht in zowel van beenmerg afgeleide cellen en niet-beenmerg afgeleide cellen kan beenmergtransplantatie wijzigen beenmerg afgeleide cellen een ander genotype zonder de niet-beenmerg cellen genotype.

Onderscheidende functionele rol van genexpressie van immune als niet-immune cellen in de muis Colitis door beenmergtransplantatie

Hier presenteren we een protocol dat grote hoeveelheden muis-monocyten genereert uit heterogeen beenmerg voor translationele toepassingen. In vergelijking met andere methoden helpt deze nieuwe methode het aantal geofferde dieren te verminderen en de kosten te drukken door dure methoden zoals hooggradige magnetische celscheiding (MACS) te vermijden.

Isolatie en intraveneuze injectie van muizen beenmerg afgeleide Monocyten

Het manuscript geeft een technische procedure die kan worden gebruikt om C1498 celkweken karakteriseren in vitro en acute leukemie geïnduceerd in muizen na de injectie. Fenotypische en functionele analyses worden uitgevoerd met behulp van flowcytometrie, immunofluorescentie microscopie, cytochemie en May-Grünwald Giemsa kleuring.

Een gedetailleerd protocol voor het karakteriseren van het Muizen C1498 Cell Line en de bijbehorende Leukemie muismodel

Nieuwe protocollen worden hier beschreven om te isoleren en karakteriseren van deeltjes afgeleid van mens en muis neutrofiele granulocyten. Deze protocollen gebruiken ultracentrifugatie en stroom cytometry immunoblotting technieken voor het analyseren van microparticle inhoud, en ze kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de rol van deeltjes afgeleid van verschillende celtypes in cellulaire functie.

Isolatie en karakterisatie van neutrofiele afkomstige deeltjes voor functionele Studies

We laten zien hoe te identificeren en te isoleren 6 deelverzamelingen van myeloïde voorlopercellen uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een combinatie van magnetische en fluorescentie sorteren (MACS en FACS). Dit protocol kan worden gebruikt voor in vitro cultuur assays (methylcellulose of vloeistof culturen), in vivo adoptief overdracht experimenten en RNA/eiwit analyses.

Identificatie en isolatie van de Oligopotent en Lineage-begaan myeloïde voorlopercellen uit beenmerg van de muis

Hier presenteren we een protocol voor het verwerken van vers beenmerg (BM) geïsoleerd van muis of mens voor High-dimensionale massa Cytometry (Cytometry door time-of-Flight, CyTOF) analyse van neutrofiele-Lineage cellen.

Voorbereiding van het hele beenmerg voor massa Cytometry analyse van neutrofiele-Lineage cellen

Deze methode beschrijft de zuivering door flowcytometrie van MEP en MKp van muizendijbenen, tibia's en bekkenbotten.

Isolatie van muizen megakaryocyten voorlopers

Dit onderzoek schetst twee technieken voor het isoleren van overvloedige neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) uit het beenmerg van ratten. De ene methode combineert een commerciële neutrofielenisolatiekit met dichtheidsgradiëntcentrifugatie, terwijl de andere alleen dichtheidsgradiëntcentrifugatie gebruikt. Beide benaderingen leveren functionele NET's op die die van perifere bloedneutrofielen overtreffen.

Unieke aanpak voor het isoleren van beenmergneutrofielen bij ratten met vergelijkbare capaciteit

Dit protocol beschrijft een niet-enzymatische en eenvoudige methode voor het isoleren van 7-9 dagen oude neonatale beenmergcellen van muizen en het genereren van gedifferentieerde macrofagen met behulp van een supernatans van L929-cellen als bron van granulocytkoloniestimulerende factor (M-CSF). De van beenmerg afgeleide macrofagen werden verder geanalyseerd op oppervlakteantigenen F4/80, CD206, CD11b en functionele competentie.

Neonatale beenmergisolatie bij muizen en bereiding van van beenmerg afgeleide macrofagen

Dit manuscript schetst een protocol voor het voorbereiden van een ATAC-seq-bibliotheek van neutrofielen uit muizenbeenmerg, met als doel een optimale levensvatbaarheid van neutrofielen en een hoge bibliotheekkwaliteit te garanderen. Het biedt stapsgewijze instructies voor BMC-voorbereiding, immunomagnetische sortering en bibliotheekconstructie, en dient als een waardevolle gids, vooral voor nieuwkomers in het bestuderen van neutrofielen.

ATAC-SEQ Bibliotheekbereiding van van muizen beenmerg-afgeleide neutrofielen

Leer neutrofielen isoleren en labelen uit muizenbotmerg met dichtheidsgradiëntcentrifugatie en CellTracker-kleurstoffen. Deze methode biedt een reproduceerbare aanpak voor functionele studies en adoptieve overdrachtexperimenten.

Isolatie, zuivering en etikettering van de Muis Bone Marrow Neutrophils voor functionele studies en adoptieve overdracht Experimenten (Video) | JoVE Journal

Isolatie, zuivering en etikettering van de Muis Bone Marrow Neutrophils voor functionele studies en adoptieve overdracht Experimenten

Meer video's verkennen