Name: Genetisch gecodeerde Molecular Probes aan G-eiwit gekoppelde receptoren Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-13T16:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 16 s
Description: Leer hoe je genetisch gecodeerde moleculaire probes gebruikt om G-eiwit gekoppelde receptoren te bestuderen via fotokruislinking en bioorthogonale labeling. Deze methode biedt specifieke inzichten in GPCR-structuur en -functie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de gulle steun van diverse stichtingen en filantropische donoren (zie SakmarLab.org).

1. Site-specifieke genetische Oprichting van natuurlijke aminozuren in GPCR <ol><li> Handhaaf HEK293T cellen in DMEM (4,5 g / l glucose, 2 mM glutamine), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer. </li><li> Transfecteren de cellen gekweekt tot 60-80% confluentie in een 10 cm plaat met behulp van Lipofectamine Plus reagens. <ol><li> Aan 750 ul DMEM, voeg 10 ul Plus reagens, 3,5 ug GPCR cDNA (pMT4. Rho of pcDNA 3.1. CCR5) bevattende amber stopcodon op een gewenste positie, 3,5 ug tRNA cDNA (pSVB.Yam) en 0,35 ug van mutante amino-acyl tRNA synthetase cDNA voor p-azido-L-fenylalanine (pcDNA.RS). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Ook voeren soortgelijke transfectie met de wt GPCR cDNA (een amber stopcodon bevatten) dienen als controle. Voeg dit mengsel aan 750 ul DMEM met 17 ul lipofectamine. Na equilibreren 15 minuten bij kamertemperatuur, breng detotale volume 4 ml. </li><li> Zuig media 10-cm plaat, gelden transfectie mengsel aan cellen en terug naar 37 ° C in 5% CO2 atmosfeer. Na 4-6 uur, vullen cellen met 4 ml DMEM met 20% FBS en 1 mM azf. </li></ol></li><li> De volgende dag, vervang de groeimedia met DMEM met 10% FBS en 0,5 mM AZF. </li><li> Oogst cellen 48 uur na transfectie, om uitdrukking te analyseren of zich naar fotoverknoping of etikettering procedures in de volgende paragrafen beschreven. <ol><li> Bevestig expressie van de GPCR amber mutant in aanwezigheid van de UAA van de groeimedia. We doen dit door Westerse immunoblot detectie. Lyse de celpellet in 1% (w / v) dodecyl-β-D-maltoside (DDM) in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl gedurende 1 uur bij 4 ° C. Centrifugeer het lysaat bij 16.000 xg en de supernatant oplossing onder reducerende omstandigheden door SDS-PAGE. Transfer naar een PVDF membraan en uitvoeren immunoblotanalyse volledige lengte receptor expressie te detecteren met behulp van ee 1D4 mAb (Nationale Cell Culture Center), die een aangelegde epitoop aan het C-uiteinde van de receptor herkent. 31 </li></ol></li></ol> 2. Het toewijzen van een ligandbindingsplaats Met behulp van gerichte fotoverknopende <ol><li> 48 uur na transfectie, zuig media uit cellen en vervangen door 4 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Terug naar 37 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Resuspendeer de cellen met 1 x PBS en overbrengen in een Falcon buis. Centrifugeer bij 1.500 rpm gedurende 2 minuten om de cellen te pelleteren en zuig de supernatant. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 1x Hank&#39;s gebufferde zoutoplossing bevattende 20 mM HEPES, pH 7,5, 0,2% BSA en getritieerd ligand binding aan verzadigende concentratie de vereiste tijd en temperatuur receptor-ligand complexvorming te waarborgen. </li><li> Breng de celsuspensie op een 24-well of 96-well plaat voor fotoactivatie van de AZF bij 365 nm (bijv. gebruik van een UV-A lamp) gedurende 15 min bij 4 ° C. Maintain de plaat op het ijs om te voorkomen dat monster verwarming en cellysis. </li><li> Breng de cellen aan een Eppendorf buis, centrifuge de cellen neer te slaan, de bovenstaande vloeistof en overgaan tot analyse. De pellets kunnen worden bewaard bij -20 ° C voor toekomstig gebruik. </li><li> Resuspendeer de celpellets in lysisbuffer die 1% (w / v) DDM, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 en proteaseremmers. Na 1 uur incubatie bij 4 ° C, centrifugeer het cellysaat gedurende 10 minuten bij 16.000 xg en breng het supernatant naar een nieuwe buis. </li><li> Add mAb 1D4-Sepharose 2B hars aan het supernatant en incubeer overnacht bij 4 ° C aan de GPCR op immunologische met de gemanipuleerde C-terminus mAb 1D4 epitoop. De volgende dag was de kralen meerdere malen met lysisbuffer. Elueer monsters met 1% SDS bij 37 ° C gedurende 1 uur onder schudden. </li><li> Breng een gedeelte van de elutievloeistof een 15 ml flacon met scintillatievloeistof en tellen op een beta-scintillatieteller om de hoeveelheid specifieke binding van getritieerd ligand kwantificeren ee receptor. </li><li> Het oplossen van de resterende 1D4 mAb gezuiverd eluens door standaard gel-elektroforese. We gebruiken een 4-12% SDS-PAGE gel en vervolgens semi-droge overdracht naar een PVDF membraan voor immunoblotting. We hebben ook een laan met standaard eiwit ladder naar visuele aanpassing van moleculair gewicht te begeleiden. <ol><li> Blokkeer de PVDF membraan met 5% melk in TBS buffer die 0,05% Tween-20. Probe het membraan volledige lengte receptor expressie te bevestigen met mAb 1D4 gevolgd door HRP-geconjugeerd anti-muis IgG secundair antilichaam. </li><li> Behandel met verbeterde chemiluminescentie (ECL) reagens en bloot membraan film autoradiografie om bands te visualiseren. </li></ol></li><li> Knip het membraan met een scheermesje aan elk monster laan scheiden, gevolgd door het snijden op bepaalde molecuulgewicht merkers. Transfer membraan segmenten flesjes met scintillatievloeistof. Kwantificeren van de hoeveelheid tritium in elk membraan segment door te tellen op een beta-scintillatieteller. </li><li> Identificeer de positievephotocrosslink de detectie van tritium in de schijnbare molecuulmassa gelijk aan de som van dat van de GPCR en de ligand. </li></ol> 3. Gerichte Epitoop Tagging en celoppervlak Enzymgekoppelde Immunosorbent Assay (ELISA) <ol><li> 24 uur na transfectie, was cellen met 1x PBS en 1 ml trypsinize met 1 ml 0,25% trypsine gedurende 3 minuten. Aan te vullen met 9 ml DMEM met 10% FBS en 0,5 mM AZF. Resuspendeer cellen en tel de celdichtheid. We maken gebruik van een standaard hemocytometer. </li><li> Pre-behandeling van een hoog-bindende, heldere bodem 96-well plaat met 100 ml 0,01 mg / ml poly-D-lysine per putje. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur herhaaldelijk wassen met 1 x PBS en drogen. </li><li> Plaat 200 ul van de getransfecteerde cellen bij een dichtheid van 6 x 04-08 oktober x 10 4 cellen / putje aan de 96-well plaat en terug naar 37 ° C in 5% CO2 atmosfeer. </li><li> Volgende dag voor te bereiden cellen voor etikettering. Was voorzichtig drie keer met 100 pl / well 1x PBS to verwijder AZF met groeimedia. Zorg cellen blijven gehecht, bijvoorbeeld door PBS dat Ca2 + en Mg2 +. </li><li> Bereid 50-200 uM FLAG-triarylfosfine labelingsreagens in 1x HBSS / PBS uit een voorraad gehandhaafd op 5-20 mM in PBS. Breng 60 ml aan elk putje (in drievoud voor elke amber mutant) en terugkeer naar 37 ° C gedurende 30 minuten tot 4 uur. Handhaven van een reeks putten zonder label behandeling in 1x HBSS / PBS. Ook een gew GPCR controle te vergelijken met AZF-GPCR varianten. </li><li> Was de cellen 3 maal met 100 ul / putje blokkerende buffer, BB (1x PBS, 0,5% BSA), om niet-omgezette label volledig te verwijderen. </li><li> Breng 100 ul / putje van 4% paraformaldehyde (bereid uit een 16% voorraad in 1x PBS) aan de cellen. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Was driemaal uit met BB. </li><li> Voer standaard celoppervlak ELISA-protocol om het label receptor en receptor expressie te detecteren. Incubeer met primair antilichaam gedurende 1,5 uur op het ijs gevolgd door secundaire eentibody incubatie bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. <ol><li> Voeg 100 ul van anti-FLAG M2 antilichaam (bijv. 1:2000 verdunning van antilichamen in BB) tot FLAG-peptide epitoop van de FLAG-triarylfosfine labelingsreagens detecteren. Ook probe niet-behandelde putjes label als een negatieve controle. Voeg anti-CCR5 2D7 (we gebruiken een 1:500 verdunning) antilichaam aan een aparte reeks putten om te bepalen gew of AZF-GPCR expressie op het celoppervlak. </li><li> Was de cellen drie maal met BB en incubeer met 100 ul HRP-geconjugeerd anti-muis IgG secundair antilichaam (1:2000 verdunning). </li><li> Wassen zorgvuldig cellen vijf keer met BB. Voeg 50 ul buffer detectie: Amplex Red, 20 mM H 2 O 2, 1x PBS (1:10:90 verhouding) en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur. Verzamel spectrale gegevens op fluorescentie multi-well plaatlezer bij λ = 530 af en λ em = 590. </li></ol></li></ol> 4. Bioorthogonal Fluorescerende Labeling van een GPCR <ol><li> Lyse10 7 geoogste cellen die wt of AZF-Rhodopsin varianten in 1 ml solubilisatie-buffer bevattende 1% (w / v) DM, 50 mM HEPES en Tris-HCl, pH 6,8, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2 en proteaseremmers 1 uur bij 4 ° C. Centrifugeer het cellysaat bij 15.000 xg gedurende 10 minuten en verzamel de supernatant fractie. </li><li> Voeg 100 ul 1D4-mAb sepharose 2B hars receptor vast te leggen met behulp van de gemanipuleerde C terminus 1D4 epitoop. Incubeer 12 uur bij 4 ° C. Was de hars driemaal met 0,1% (w / v) DDM in 0,1 M natriumfosfaatbuffer, pH 7,3. </li><li> Voeg 0,1 mM fluoresceïne-fosfine in een totaal volume van 0,3-0,5 ml receptor geïmmobiliseerd op de immuno matrix (1D4-mAb Sepharose 2B) label. Incubeer 12 uur bij kamertemperatuur geroerd. Centrifuge en verwijder supernatant. Was de hars gereageerde label te verwijderen. </li><li> Elueer het gemerkte receptor met 100 ml elutiebuffer die 0,1% (w / v) DDM en 0,33 mg / ml nonapeptide (C9 peptide tegen de epitoop 1D4)in 2 mM fosfaatbuffer, pH 6,0 door incubatie op ijs gedurende 1 uur. </li><li> Los gelabelde monsters met SDS-PAGE onder reducerende omstandigheden. Wassen gels kort in PBS en vervolgens visualiseren etikettering van AZF-GPCR door in-gel fluorescentie. Gebruik bijvoorbeeld een confocale fluorescentie-scanner met een 488-nm laser om receptor gemodificeerd met fluoresceïne detecteren. </li></ol>

<ol><li>Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+ligand+binding+and+specificity+in+adrenergic+receptors%3A+Implications+for+GPCR-targeted+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery.</a> Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).</li>
<li>Steyaert, J., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody+stabilization+of+G+protein-coupled+receptor+conformational+states%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states.</a> Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).</li>
<li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+CXCR4+chemokine+GPCR+with+small-molecule+and+cyclic+peptide+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists.</a> Science. 330, 1066-1071 (2010).</li>
<li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+beta2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li>
<li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+eukaryotic+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An expanded eukaryotic genetic code.</a> Science. 301, 964-967 (2003).</li>
<li>Ye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+incorporation+of+keto+amino+acids+into+functional+G+protein-coupled+receptors+using+unnatural+amino+acid+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis.</a> The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).</li>
<li>Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTIR+analysis+of+GPCR+activation+using+azido+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">FTIR analysis of GPCR activation using azido probes.</a> Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).</li>
<li>Ye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+G-protein-coupled+receptor+activation+using+genetically+encoded+infrared+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes.</a> Nature. 464, 1386-1389 (2010).</li>
<li>Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photolysis+of+diazoacetylchymotrypsin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The photolysis of diazoacetylchymotrypsin.</a> The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).</li>
<li>Nakayama, T. A., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+retinal+in+bovine+rhodopsin+determined+by+cross-linking+using+a+photoactivatable+analog+of+11-cis-retinal%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal.</a> The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).</li>
<li>Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+glucagon-like+peptide+1+docking+to+its+intact+receptor+studied+with+carboxyl-terminal+photolabile+probes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes.</a> The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).</li>
<li>Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+retinal+in+bacteriorhodopsin+as+studied+by+cross-linking+using+a+photosensitive+analog+of+retinal%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal.</a> The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).</li>
<li>Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+fluorescent+and+photoactivatable+MIP-1alpha+ligands+and+interactions+with+chemokine+receptors+CCR1+and+CCR5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5.</a> Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).</li>
<li>Janz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+between+an+allosteric+agonist+pepducin+and+the+chemokine+receptor+CXCR4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).</li>
<li>Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+a+photocrosslinking+amino+acid+to+the+genetic+code+of+Escherichiacoli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).</li>
<li>Hino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+photo-cross-linking+in+mammalian+cells+by+site-specific+incorporation+of+a+photoreactive+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid.</a> Nature. 2, 201-206 (2005).</li>
<li>Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+ligand-binding+site+on+a+G+protein-coupled+receptor+%28GPCR%29+using+genetically+encoded+photocrosslinkers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers.</a> Biochemistry. 50, 3411-3413 (2011).</li>
<li>Grunbeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+photo-cross-linkers+map+the+binding+site+of+an+allosteric+drug+on+a+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor.</a> ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).</li>
<li>Dunham, T. D., Farrens, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+rhodopsin.+Movement+of+helix+f+detected+by+site-specific+chemical+labeling+and+fluorescence+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy.</a> The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).</li>
<li>Maurel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+protein-protein+interaction+analysis+with+time-resolved+FRET+and+snap-tag+technologies%3A+application+to+GPCR+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization.</a> Nature. 5, 561-567 (2008).</li>
<li>Huber, T., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escaping+the+flatlands%3A+new+approaches+for+studying+the+dynamic+assembly+and+activation+of+GPCR+signaling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+pharmacological+sciences%22%5BJournal%5D)">Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes.</a> Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).</li>
<li>Saxon, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+engineering+by+a+modified+Staudinger+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction.</a> Science. 287, 2007-2010 (2000).</li>
<li>Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+azides+into+recombinant+proteins+for+chemoselective+modification+by+the+Staudinger+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).</li>
<li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strain-promoted+%5B3+%2B+2%5D+azide-alkyne+cycloaddition+for+covalent+modification+of+biomolecules+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems.</a> Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).</li>
<li>Kolb, H. C., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+impact+of+click+chemistry+on+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+discovery+today%22%5BJournal%5D)">The growing impact of click chemistry on drug discovery.</a> Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).</li>
<li>Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Model+for+the+G-Protein-Coupled+Receptor+Rhodopsin%3A+Hydrophobic+Interface+and+Dynamical+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure.</a> Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).</li>
<li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+conformation+and+its+environment+in+rhodopsin+in+light+of+a+new+2.2+%C3%85+crystal+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 Å crystal structure.</a> J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).</li>
<li>Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+labeling+of+functional+G+protein-coupled+receptors+at+genetically+encoded+azido+groups%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups.</a> , submitted (2013).</li>
<li>Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+epitope+tagging+of+GPCRs+by+bioorthogonal+modification+of+a+genetically-encoded+unnatural+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid.</a> Biochemistry. , (2013).</li>
<li>Molday, R. S., MacKenzie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+rhodopsin%3A+characterization%2C+cross-reactivity%2C+and+application+as+structural+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes.</a> Biochemistry. 22, 653-660 (1983).</li>
<li>Gether, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonists+induce+conformational+changes+in+transmembrane+domains+III+and+VI+of+the+beta2+adrenoceptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor.</a> The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).</li>
<li>Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+structure%2C+dynamics%2C+and+activation%3A+A+perspective+from+crystallography%2C+site-directed+spin+labeling%2C+sulfhydryl+reactivity%2C+and+disulfide+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Protein+Chemistry%3B+Membrane+Proteins%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking.</a> Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).</li>
<li>Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+contact+sites+in+complex+formation+between+transducin+and+light-activated+rhodopsin+by+covalent+crosslinking%3A+use+of+a+photoactivatable+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).</li>
<li>Dorman, G., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzophenone+photophores+in+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Benzophenone photophores in biochemistry.</a> Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+the+site-specific+modification+of+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo.</a> Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).</li>
<li>Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleophilic+catalysis+of+oxime+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Nucleophilic catalysis of oxime ligation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).</li>
<li>Yanagisawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+engineering+of+pyrrolysyl-tRNA+synthetase+to+genetically+encode+N%28epsilon%29-%28o-azidobenzyloxycarbonyl%29+lysine+for+site-specific+protein+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+biology%22%5BJournal%5D)">Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification.</a> Chemistry & biology. 15, 1187-1197 (2008).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

We beschrijven hier een robuuste methode voor plaatsspecifieke integratie van een reactieve probe, AZF, in GPCRs en tonen drie nuttige toepassingen van dit hulpmiddel om de structuur en dynamiek van GPCR bestuderen. Onze methode naar site-specifiek te nemen UAAs omzeilt een fundamenteel probleem met een alternatieve strategie op basis van chemisch labelen 32, 33 of vastmaken fotocrosslinkers 34 tot een enkel toegankelijk cysteïne mutant. Hoewel chemische dat cysteïne thiol doelgroepen zijn gebruikt...

Heptahelical G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCR&#39;s) omvatten een superfamilie van zeer dynamische membraaneiwitten die belangrijk en diverse extracellulaire signalen mediëren. In het klassieke paradigma wordt receptoractivering gekoppeld ligand geïnduceerde conformatieveranderingen. 1, 2 hebben recente ontwikkelingen in de structurele biologie van GPCRs belangrijke inzicht in de moleculaire mechanismen van transmembraan signalering ontvangen. 3-5 echter te begrijpen met een grotere nauwkeurigheid de chemische werkingsmechanisme en structurele dynamica van GPCR-signalering, is een toolkit van benaderingen nodig zijn om informatieve moleculaire en chemische probes te nemen aan actieve signalering complexen ondervragen. Daarom passen wij een methode om plaatsspecifiek voeren niet of minimaal storende sondes in expressie receptoren gebaseerd op natuurlijk aminozuur (UAA) mutagenese met amber codon suppressie technologie eerder ontwikkeld door Schultz en coworkers. 6 We geoptimaliseerd de UAA mutagenese methode om een high-yield expressie en mutagenesesysteem voor eiwitten zoals GPCR&#39;s, die moeilijk uit te drukken in een andere dan de zoogdiercellen meeste heterologe systemen zijn te bereiken. Met behulp van een orthogonale gemanipuleerde suppressor tRNA en evolueerde aminoacyl-tRNA synthetase paar voor een specifiek UAA, we plaatsspecifiek geïntroduceerd UAAs in uitgedrukt doel GPCR&#39;s. De succesvolle integratie van UAAs, p-acetyl-L-fenylalanine (ACF), p-benzoyl-L-fenylalanine (BZF), en p-azido-L-fenylalanine (azf) is aangetoond in ons model GPCRs - rhodopsine en menselijke CC chemokine receptor CCR5. 7, 8 In beginsel kan een UAA genetisch gecodeerd op elke positie in het eiwit sequentie en deze woning is een waardevol biochemische instrument omdat het zorgt voor single-codon scannen van een doel GPCR. We richten ons hier specifiek op de veelzijdigheid van de UAA, AZF, die een reactieve Azi heeftdo groep. Naast het dienen als een uniek infrarood (IR) sensor, 8, 9 azf kan ook dienen als een fotoactiveerbare verknoper door reactie met naburige primaire aminen of alifatische waterstofatomen. Bovendien kan het biologisch inerte azidogroep nemen als een selectief chemisch handvat bioorthogonal labelingsreacties. Hier laten we voorbeelden illustreren de nuttige toepassingen van plaats-specifieke incorporatie van AZF in GPCRs, zoals gerichte fotoverknoping te controleren een receptor-ligand-complex en modificatie van GPCR door bioorthogonal epitoop tagging en fluorescente labeling strategieën. Fotoactiveerbare reagentia zijn gebruikt om biologische systemen te bestuderen sinds 1960. 10 In deze periode zijn een overvloed aan receptor-ligand verknoping experimenten gerapporteerd dat GPCR complexen studie, waarvan de meeste betrekking het gebruik van foto-affiniteit liganden. 11, 12 Echter, deze toepassingen zijn technisch beperkt, aangezien zij require synthese van liganden richting een verknopende groep. 13-15 bovendien de crosslinker deel in het ligand, is het een uitdaging om de locatie van de verknoping bepalen de GPCR. Plaatsspecifiek introduceren fotoverknopende groepen UAAs in eiwitten met het amber codon onderdrukking technologie is een waardevolle vooruitgang. 16 17 We ontwikkelden een fotoverknoping techniek om de binding interface op een receptor die betrokken is bij de vorming van een receptor-ligand-complex te identificeren levende cellen door de invoering fotolabiele groepen in GPCR&#39;s. 18, 19 Hier beschrijven we de experimentele protocol en de wijze van data-analyse voor de toepassing van deze gerichte fotoverknoping technologie om de bindingsplaats van een klein-molecule ligand, tritiumhoudend maraviroc, op CCR5 identificeren. Deze werkwijze in op de precieze kwantificering van de radioactieve handvat op het ligand, naast behoud van de natuurlijke chemische structuur van het ligand. Fluorescentie-gebaseerde technieken ondersteunen juist begrip van de structurele basis van receptoractivering door direct sonderen van de conformationele toestand van de receptor. 20, 21 echter technieken bezit de flexibiliteit om fluorescerende labels introduceren in GPCRs plaatsspecifiek beperkt. Wij zijn geïnteresseerd in het gebruik van bioorthogonal chemische modificatie strategieën om single-molecule detectie (SMD) van GPCR signalering complexen te vergemakkelijken. 22 De azidogroep kan deelnemen aan bioorthogonal chemicaliën zoals Staudinger-Bertozzi ligatie, 23, 24 kopervrije-stam bevorderd azide- alkyne cycloadditie (SpAAC) 25 en-koper-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie (CuAAC). 26 Wij richten ons hier op de Staudinger-Bertozzi ligatie reactie die de specifieke reactie tussen een azide en een fosfine gaat. We demonstreren het gebruik van twee verschillende fosfine derivaten geconjugeerd aan een peptide epitoop (FLAG peptide) of een fluorescerend label(Fluoresceïne) naar plaatsspecifieke modificatie van GPCR&#39;s te bereiken. We hebben eerder geoptimaliseerd voorwaarden voor plaats-specifieke labeling van rhodopsine AZF varianten met de röntgenbron kristalstructuur en dynamische simulaties doelplaatsen die aan oplosmiddel blootgestelde zijn kiezen. 27 28 We geïllustreerd tevens de mogelijkheid om zonder achtergrond labeling bereiken door Staudinger- Bertozzi ligatie. 29 We tonen hier de algemene procedure gebruikt voor fluorescente labeling van een detergens gesolubiliseerde receptor die is geïmmobiliseerd op een matrix immuno vervolgens gevisualiseerd door in-gel fluorescentie bereiken. Daarnaast tonen we een nuttige uitbreiding op deze etikettering strategie om posities ontvankelijk voor etikettering op een receptor van onbekende structuur, CCR5 identificeren. Dit wordt uitgevoerd met een gerichte peptide-epitoop tagging strategie die is gebaseerd op bioorthogonal modificatie van AZF-GPCR varianten in een celgebaseerde semi-high throughput format. 30 Ditmethode maakt gebruik van de multi-step detectie eigenschappen van een cel-oppervlak ELISA etikettering gebeurtenissen volgen. De methoden die we hier besproken zijn algemeen en kunnen in principe worden toegepast op elk GPCR opgenomen met AZF met het amber codon onderdrukking technologie. In de hier gepresenteerde gedetailleerde weergave van de stappen die in zoogdiercellen expressie van receptoren opgenomen met UAAs zoals AZF met het onnatuurlijke aminozuur mutagenese werkwijze en de latere toepassingen structurele en dynamische studies van GPCRs vergemakkelijken protocollen.

<table><tbody><tr><td>Plasmid pSVB. Yam</td><td></td><td></td><td>(Ye et al., 2008)</td></tr><tr><td>Plasmid pcDNA.RS voor azF</td><td></td><td></td><td>(Ye et al., 2009)</td></tr><tr><td>Plasmids pMT4.Rho en pcDNA 3.1.CCR5</td><td></td><td></td><td>Bevatten optioneel de amber stopcodon (TAG) op een gewenste positie</td></tr><tr><td>HEK 293T-cellen</td><td></td><td></td><td>Aderente cellen</td></tr><tr><td>Dulbecco's Gemodificeerd Eagle-medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10566</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosfaatbufferoplossing</td><td>Gibco</td><td>14200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>Gemini Bio-products</td><td>100-106</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamine Plus</td><td>Invitrogen</td><td>Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p-azido-L-fenylalanine</td><td>Chem-Impex International</td><td>6162</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tabel 1. Specifieke genetische incorporatie van onnatuurlijke aminozuren in GPCR's materialen</td></tr><tr><td>Maxima ML-3500S UV-A lamp</td><td>Spectronics Corporation</td><td></td><td>azF wordt geactiveerd door 365-nm licht</td></tr><tr><td>Hank's Gebufferde Zout Oplossing (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14065</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Irvine Scientific</td><td>9319</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bovien serumalbumine</td><td>Roche</td><td>3117405001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tritium-gelabelde ligand</td><td></td><td></td><td>Van medewerker (Grunbeck et al., 2012)</td></tr><tr><td>1% (w/v) n-dodecyl-&beta;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>D310LA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1D4-sepharose resin</td><td></td><td></td><td>1D4 mAb geïmmobiliseerd op CNBr-geactiveerde sepharose 2B resin</td></tr><tr><td>1% (w/v) natriumdodecylsulfaat (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>SDS-PAGE uitgevoerd op NuPAGE apparaat</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD apparaat</td><td>Biorad</td><td></td><td>Apparaat voor semi-droge overdracht</td></tr><tr><td>Immobilon polyvinylideen difluoride (PVDF) membraan</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Vetvrij melkpoeder</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9934262</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Aldrich</td><td>274348</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-273</td><td>Scintillatievloeistof</td></tr><tr><td>Scintillatiebuisjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>333726</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillatieteller</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Beta-Scintillatieteller</td></tr><tr><td>Anti-rhodopsine 1D4 mAb</td><td>National Cell Culture Center</td><td>op maat</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase (HRP)-geconjugeerd anti-muis IgG</td><td>KPL, Inc.</td><td>474-1806</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substraat</td><td>Thermo Scientific</td><td>34080</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hyblot CL AR film</td><td>Denville</td><td>E3018</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tabel 2. Materiaal voor gerichte fotocrosslinking</td></tr><tr><td>0.25% Trypsine</td><td>Invitrogen</td><td>15050065</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FLAG-triarylfosfine</td><td>Sigma</td><td>GPHOS1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>M2 FLAG mAb</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-CCR5 2D7 mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>555990</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Costar</td><td>3601</td><td>Duidelijk bodem, hoge binding EIA/RIA</td></tr><tr><td>Fosfaatbufferoplossing (Calcium, Magnesium)</td><td>Gibco</td><td>14040</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd</td><td>EMS</td><td>28908</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HRP-geconjugeerd</td><td>KPL, Inc.</td><td>474-1516</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-konijn IgG</td><td>KPL, Inc.</td><td>474-1516</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Amplex Red</td><td>Invitrogen</td><td>A12222</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Waterstofperoxide</td><td>DE Healthcare Products</td><td>97-93399</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CytoFluor II fluorescentie multi-well plate reader</td><td>Perseptive Biosystems</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tabel 3. Materiaal voor gerichte peptide-epitope tagging en ELISA op celoppervlak</td></tr><tr><td>Fluoresceïne-fosfine</td><td></td><td></td><td>(Huber et al., ingediend 2012)</td></tr><tr><td>Nonapeptide (C9 peptide)</td><td>AnaSpec</td><td>62190</td><td>Peptid dat de 1D4-epitoop nabootst NH2-TETSQVAPA-COOH</td></tr><tr><td>1% (w/v) n-dodecyl-&beta;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>D310LA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1D4-sepharose resin</td><td></td><td></td><td>1D4 mAb geïmmobiliseerd op CNBr-geactiveerde sepharose 2B resin</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>SDS-PAGE uitgevoerd op NuPAGE apparaat</td></tr><tr><td>Confocal Typhoon 9400 fluorescentiescanner</td><td>GE Healthcare</td><td>discontinue</td><td>Scanner met 488-nm golflengtelaser</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tabel 4. Materiaal voor fluorescente labeling</td></tr></tbody></table>

genetisch gecodeerde molecular probes aan g-eiwit gekoppelde receptoren studie

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Structurele en dynamische studies van G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) signalering complexen te vergemakkelijken, zijn nieuwe benaderingen nodig zijn om informatieve probes of labels introduceren in uitgedrukt receptoren die geen receptor functie niet verstoren. We gebruikten amber codon suppressie technologie genetisch coderen van het niet-natuurlijke aminozuur, p-azido-L-fenylalanine (azf) bij verschillende gerichte posities in GPCRs heteroloog tot expressie gebracht in zoogdiercellen. De veelzijdigheid van de azidogroep is hier weergegeven in verschillende toepassingen GPCR bestuderen in hun natieve cellulaire omgeving of in detergens gesolubiliseerde omstandigheden. Ten eerste tonen we een cel-gebaseerde gerichte fotoverknoping technologie aan de residuen in de ligand-bindingsplaats van GPCR wanneer een tritium-gelabeld kleine moleculen ligand verknoopt een genetisch gecodeerd aminozuur azido identificeren. We tonen dan plaatsspecifieke modificatie van GPCR&#39;s door de bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligatie reactiestie dat de azidogroep richt met behulp van fosfine derivaten. We bespreken een algemene strategie voor gerichte peptide-epitoop tagging van uitgedrukt membraaneiwitten in-cultuur en de detectie met behulp van een whole-cell-gebaseerde ELISA aanpak. Tot slot laten we AZF-GPCR selectief kan worden gelabeld met fluorescente probes. De methoden besproken algemeen, aangezien zij kunnen in beginsel worden toegepast op elk aminozuur positie in een GPCR tot expressie actieve signalering complexen ondervragen.

We gebruikten het onnatuurlijke aminozuur mutagenese methode voor plaatsspecifiek moleculaire probes introduceren in een GPCR volgens de amber codon onderdrukking technologie. De regeling in Figuur 1 schetst de voornaamste stappen van de methodologie en de verschillende toepassingen van het opnemen van de veelzijdige UAA, p-azido-L-fenylalanine (AZF), in GPCR&#39;s. Expressie van AZF-GPCR&#39;s in zoogdiercellen maakt het mogelijk gerichte fotoverknoping aan liganden, en gerichte peptide-epitoo...

We genetisch coderen natuurlijk aminozuur, p-azido-L-fenylalanine op verschillende gerichte posities in GPCRs en tonen de veelzijdigheid van de azidogroep in verschillende toepassingen. Deze omvatten een gerichte fotoverknoping technologie om resten in de ligand-bindingsplaats van een GPCR te identificeren, en de site-specifieke bioorthogonal modificatie van GPCR&#39;s met een peptide-epitoopmerker of fluorescente probe.

Genetisch gecodeerde Molecular Probes aan G-eiwit gekoppelde receptoren Studie

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om een enkele informatieve probe te introduceren in doelwit G-proteïnegekoppelde receptoren om structurele en dynamische studies van signaleringscomplexen te vergemakkelijken. Dit wordt bereikt door cellen te transfecteren met de plasmiden die nodig zijn voor het tot expressie brengen van de vereiste translationele machinerie om het onnatuurlijke aminozuur zeto, fenylalanine of zeto fee in een tot expressie gebrachte GPCR in te bouwen. De GPCR zeto fee-variant kan vervolgens op drie verschillende manieren worden toegepast om de structuur en functie van de receptor te onderzoeken.Ten eerste wordt de zeto-fee gebruikt als foto-geactiveerde crosslinker in de GPCR, wat de identificatie van de bindingsplaats van een getritieerd ligand mogelijk maakt. Vervolgens kan de zeto-fee worden ingezet als reactieve chemische handgreep om een geconjugeerd peptide of een fluorescente probe aan de GPCR te koppelen via bio-orthogonale labelingschemie; de verkregen resultaten tonen het gebruik van de moleculaire probe zeto-fee aan bij gerichte foto-crosslinking, gerichte epitoop-tagging en fluorescentielabeling van GPCR's op basis van live-cell en biochemische methoden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het gebruik van foto-affiniteitsliganden of cysteïne-labeling, is de flexibiliteit om op positie-specifieke wijze een biologisch inert en reactief onnatuurlijk aminozuur, p-zeto-fenylalanine, te introduceren op een bekende positie in een doelreceptor.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van GPCR-signalering, waaronder het in kaart brengen van de interactieplaatsen in een receptor-LIG-complex in de natuurlijke membraanomgeving, en het faciliteren van fluorescentiestudies op enkelmolecuulniveau door posities in GPCR te identificeren die geschikt zijn voor bio-orthogonale labelen. Ten derde kan deze methode inzicht bieden in het moleculaire mechanisme van G-proteïnegekoppelde receptoren en kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals diverse cellulaire en membraaneiwitten. Houd vóór aanvang van dit experiment HEC 2 9 3 T-cellen in KO's modified eagle medium, aangevuld met 10% foetaal runderserum bij 37 °C in een 5% CO2-atmosfeer.Transfecte cellen bij 60 tot 80% confluentie in een plaat van 10 centimeter met G pcr, r CD, NA met behulp van lipectomy plus reagens zoals beschreven in het tekstprotocol. Vervang de volgende dag het groeimedium door DMEM bevattend 10% FBS en 0,5 millimolar fee. Analyseer 48 uur na transfectie de expressie zoals beschreven in de tekst.Ga verder met de procedures voor fotografie, crosslinking of labeling zoals beschreven in het resterende deel van deze video. Aspireer 48 uur na transfectie het medium van de cellen en vervang dit door vier milliliter één keer fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS; breng dit terug naar 37 °C voor 15 minuten zodat de cellen loslaten van de plaat. Resuspendeer de cellen vervolgens met 1x PBS en breng ze over naar een Falcon-buis; centrifugeer bij 1500 RPM gedurende twee minuten.Om de cellen te pelletteren, wordt het supernatant afgezogen voordat het celpellet wordt geresuspendeerd in een éénvoudige Hanks gebufferde zoutoplossing die het getriteerde ligand bevat in een verzadigende bindingsconcentratie, bereid volgens de beschrijving in het tekstprotocol. Incubeer het pellet bij 37 °C gedurende de vereiste tijd om de vorming van receptor-ligandcomplexen te waarborgen, wat afhankelijk is van de specifieke receptor en het ligand. Breng de celsuspensie vervolgens over naar een 24-well- of 96-wellplaat.Activeer vervolgens de zeto fee foto-chemisch met een ultraviolette lamp op 365 nanometer gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius, waarbij de plaat op ijs wordt gehouden om opwarming van de monsters en cellyse te voorkomen. Breng de cellen na foto-activatie over naar een einor-buis en centrifugeer deze om de cellen te pelletteren. Verwijder het supernatant en ga over tot de analyse.Resuspendeer de celpellet in lysisbuffer en incubeer de cellen gedurende één uur bij 4 °C. Centrifugeer vervolgens het cellisaat 10 minuten bij 16.000 ×g. Voeg voordat het supernatant naar een nieuwe buis wordt overgebracht 1D4 monoklonaal antilichaam-gemodificeerde SROs 2B-hars toe aan het supernatant en incubeer dit overnacht bij 4 °C om de GPCR immuunzuiver te maken met behulp van het gemodificeerde C-terminus 1D4 monoklonaal antilichaam-epitoop. Was de volgende dag de beads meerdere keren met lysisbuffer. Elueer de monsters met 1% SDS bij 37 °C gedurende één uur onder schudding.Overbreng een deel van het EENT naar een flacon van 15 milliliter met scintillatievloeistof en tel dit op een bèta-scintillatieteller om de hoeveelheid specifieke binding van het getritieerde ligand aan de receptor te kwantificeren. Scheid het resterende gezuiverde EENT via standaard gelelektroforese met gebruik van een 4 tot 12% SDS-gel en een standaard eiwitladder. Voer vervolgens een semi-droge overdracht uit naar een A-P-V-D-F-membraan voor immunoblottings.Blokkeer het PVDF-membraan met 5% melk in TBS-buffer met 0,05% Tween 20. Test het membraan om de expressie van de receptor op volledige lengte te bevestigen met een 1D vier monoklonaal antilichaam, gevolgd door een HRP-geconjugeerd anti-US IgG secundair antilichaam. Behandel het membraan vervolgens met een enhanced chemiluminescence-reagens.Belicht de membraan met autoradiografische film om de banden te visualiseren. Snijd vervolgens de membraan met een scheermesje om elke monsterbaan te scheiden en snijd daarna bij specifieke molecuulgewichtmarkers. Overdraag de membraansegmenten naar vials met scintillatievloeistof en kwantificeer vervolgens de hoeveelheid tritium in elk membraansegment door te tellen op een bètascintillatieteller.Identificeer de positieve fotocrosslink door de detectie van tritium bij de schijnbare molecuulmassa die gelijk is aan de som van de GPCR en het ligand. Behandel na het wassen en tellen van de cellen een 96-well high-binding plaat met transparante bodem voorbehandeld met 100 µL van 10 µg/mL poly-D-lysine per well; incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Was vervolgens herhaaldelijk met 1XPBS voordat u de plaat aan de lucht laat drogen; zaai de getransfecteerde cellen uit in 200 µL bij een dichtheid van 60 tot 80.000 cellen per put in de 96-well plaat en plaats deze terug bij 37 °C in een 5% CO2-atmosfeer. De volgende dag.Bereid de cellen voor op labeling. Was de cellen voorzichtig drie keer met 100 µL XPBS per well om alle groeimedia met resten te verwijderen. Bereid een buffer voor die 50 tot 200 µM flag Tri AAL PHOSPHINE labeling-reagens bevat, zoals beschreven in het tekstprotocol.Breng 60 µL aan in elke well. Houd een set wells aan zonder labelbehandeling en buffer. Neem daarnaast een wild-type GPCR-controle mee om te vergelijken met een zeto-feed GPCR-variant.Plaats de plaat na incubatie gedurende 30 minuten tot vier uur terug bij 37 °C. Was de cellen drie keer met 100 µL per well blokkeringsbuffer om niet-reactieve labels volledig te verwijderen. Breng vervolgens 100 µL per well 4%paraformaldehyde aan op de cellen na een incubatiestap van 20 minuten bij kamertemperatuur.Was de cellen drie keer met blokkeringsbuffer. Voer een standaard cell surface EISA-protocol uit om gelabelde receptor en receptorexpressie te detecteren door eerst 1,5 uur op ijs te incuberen met het primaire antilichaam. Volg dit met een incubatie met een secundair antilichaam gedurende één uur bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens 100 µL verdunde Anti-Flag M twee antilichaam toe om het flag-peptide-epitoop van het flag. Tri AAL fosfine-labelingsreagens te detecteren. Test daarnaast putjes die niet zijn behandeld met het label als negatieve controle.Voeg vervolgens verdunde anti CCR5 2D7-antilichamen toe aan afzonderlijke sets putjes om de celoppervlakexpressie van de GPCR in wildtype- of zetofee-cellen te bepalen. Was de cellen drie keer met blokkeerbuffer en incubeer deze met 100 µL verdunde HRP-geconjugeerde anti-US IgG-antilichamen.Nadat de cellen zorgvuldig vijf keer zijn gewassen met blokkeringsbuffer, voegt u 50 µL detectiebuffer toe en incubeert u dit gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verzamel tot slot spectrale gegevens op een fluorescentie multi-well plaatlezer bij een excitatiegolflengte van 530 nm en een emissiegolflengte van 590 nm. Begin de labelingsprocedure door 10 miljoen geoogste cellen die wild type of zeto fee tot expressie brengen te lyseren.Laat staafjescapsopsine één uur lang incuberen in één milliliter solubilisatiebuffer bij vier graden Celsius. Verzamel de bovenzijde fractie na centrifugatie van het cellysaat bij 15.000 ×g gedurende 10 minuten. Voeg vervolgens 100 µL 1D4 monoklonaal antilichaam-gemodificeerde spheros 2B-hars toe om de receptor te vangen via het gemanipuleerde C-terminus 1D4-epitoop.Na 12 uur incubatie bij vier graden Celsius wordt de hars drie keer gewassen zoals beschreven in het tekstprotocol. Label vervolgens de receptor die is geïmmobiliseerd op de immunoaffiniteitmatrix door 0,1 millimol fluoresceïnefosfine toe te voegen aan een totaalvolume van 0,3 tot 0,5 milliliters; incubeer dit gedurende 12 uur bij kamertemperatuur en centrifugeer vervolgens na verwijdering van het supernatant. Was de hars om eventueel niet-reagerend label te verwijderen en elueer de gelabelde receptor met 100 microliters Elian-buffer door een uur incubatie op ijs.Scheid de gelabelde monsters via SDS-PAGE onder reducerende omstandigheden. Was de gels kort in PBS voordat de GPCR wordt gelabeld met een Zeto fee. Detecteer de met fluoresceïne gemodificeerde receptor middels Ingel-fluorescentie met een confocale fluorescentiescanner met een laser van 488 nanometer golflengte.De methodologie voor mutagenese met onnatuurlijke aminozuren werd gebruikt om met behulp van de amber-codon-suppressietechnologie op site-specifieke wijze moleculaire probes in A-G-P-C-R te introduceren. De fotocrosslinkingtechniek kan vervolgens worden gebruikt om de structurele aspecten van GPCR-ligandcomplexen in levende cellen te onderzoeken, waarbij een radioactief gelabeld klein molecuul ligand is getritieerd. Ravi Rock werd gebruikt om de bindingsplaats op de G-P-C-R-C-C-R vijf te identificeren.In dit voorbeeld resulteert UV-bestraling van cellen die zeto fee. CCR vijf varianten tot expressie brengen en zijn voorbehandeld met tritiated Ravi. Rock in covalent gecrosslinkte complexen die kunnen worden geïdentificeerd met behulp van de gevoelige radioactieve markering op het ligand.Van de verschillende posities op CCR5 waren leucine 28 zero fee en tryptofaan 86 zero fee in staat om te fotocrosslinken met getritieerde Ravi Rock, zoals blijkt uit significant hogere scintillatietellingen. De wild-type receptor vertoonde geen crosslinking met het radioactieve ligand. Bio-orthogonale labelingschemieën kunnen worden gebruikt om een zero fee C-site-specifiek te modificeren.Eén strategie voor GPCR-variantie omvat het gerichte epitope-tagging van A-G-P-C-R in levende cellen met behulp van een geconjugeerd peptide-label flag-peptide. Tri AAL PHOSFINE labelreagens wordt gebruikt om specifiek en selectief een zeto fee te modificeren. De hier getoonde CCR vijf variantie is representatieve data van een gevoelige en meerstaps EISA-detectiestrategie die wordt gebruikt om posities te identificeren die zijn getagd met het flag-peptide.Van de posities op CCR5 werden alle zeto fees onderzocht. CCR5-varianten werden tot expressie gebracht aan het celoppervlak en ongeveer de helft daarvan onderging succesvol gerichte epitope-tagging; wild-type CCR5 diende als negatieve controle voor epitope-tagging, wat werd aangetoond door het ontbreken van een Anti-Flag-signaal. In een alternatieve strategie werden detergens-gesolubiliseerde zeto feed G PCR's, geïmmobiliseerd op een immuno-affiniteitsmatrix zoals anti-1D4 monoklonaal antilichaam geconjugeerd aan Spheros 2B-hars, gelabeld met een fluoro four-geconjugeerd label.De Ingel-fluorescentieafbeelding demonstreert de succesvolle fluorescente labeling van de GPCR-opsine op drie verschillende posities zoals verwacht; de wild-type opsine vertoonde geen achtergrondlabeling, wat blijkt uit de afwezigheid van een fluorescente band bij het verwachte moleculaire gewicht van de receptor. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de volledige lens-expressie van de doel-GPCR te bevestigen met een specifieke geïntroduceerde zure AOL-alanine na de ontwikkeling.Deze techniek zal de weg vrijmaken voor onderzoekers in het veld van de receptorbiologie om elk receptor-ligandcomplex te verkennen of een doelreceptor te labelen. Hierbij wordt het specifiek op één positie ingebrachte onnatuurlijke aminozuur, p-zeto-fenylalanine, als reactieve probe gebruikt. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe onnatuurlijke aminozuurneogenese kan worden gebruikt om een moleculaire probe in een GPCR te introduceren, om zo structurele en dynamische studies van GPCR-signaleringscomplexen te faciliteren middels gerichte fotocrosslinking en bio-orthogonale labelingstechnieken.

genetically-encoded-molecular-probes-to-study-g-protein-coupled

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De hier beschreven op fluorescentie gebaseerde calcium-mobilisatie assay is een medium-doorvoer screening omgekeerde farmacologie identificatie van functioneel activerend ligand (en) orphan G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR).

Karakterisering van G-eiwit gekoppelde receptoren met een op fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie Assay

Eenvoudige methoden om de selectieve activering van G-eiwitten door G-eiwit-gekoppelde receptoren te detecteren, blijven een grote uitdaging in celsignalering. Hiervoor zijn Fӧrster resonantie-energieoverdracht (FRET) biosensoren ontwikkeld door een GPCR paarsgewijs vast te maken aan G-eiwitpeptiden om conformationele veranderingen te onderzoeken bij gecontroleerde concentraties in levende cellen.

G Protein-selectieve GPCR Conformaties gemeten met behulp van FRET sensoren in een Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Guanosine trifosfaat (GTP) binding is een van de vroegste gebeurtenissen bij G-proteïne-koppelde receptor (GPCR) activatie. Dit protocol beschrijft hoe u specifieke GPCR-ligandinteracties farmacologisch kunt karakteriseren door de binding van het radioactief gemerkte GTP-analoog, [35S] guanosine-5'-O- (3-thio) trifosfaat ([35S] GTPγS) te monitoren in Reactie op een ligand van interesse.

Het meten van G-eiwit-gekoppelde Receptor Signaling via Radio-gelabeld GTP Binding

De beschreven cellulaire assay is ontworpen voor de identificatie van CXC chemokine receptor 4 (CXCR4)-interagerende agenten die remmen of deze te stimuleren, concurrerend of allosterically, de intracellulaire Ca2 + release geïnitieerd door CXCR4 activering.

Een kinetische fluorescentie gebaseerde Ca2 + mobilisatie Assay te identificeren van G eiwit-gekoppelde Receptor agonisten en antagonisten Allosteric modulatoren

Een facile fluorescentie-bepaling is bedoeld om te evalueren van de doeltreffendheid van amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren integratie van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. De toepassing van ncAAs op het bestuderen van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) wordt beschreven, met inbegrip van foto-crosslinking toewijzing van bindende sites en bioorthogonal GPCR etiketten op levende cellen.

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

Hier presenteren we protocollen om te ontdekken van verbindingen actief bij GABAA -receptoren, van de binding aan de Fysiologie en farmacologie.

Methoden voor de ontdekking van nieuwe verbindingen moduleren van een Receptor Gamma - aminoboterzuur Typ een transmissie

Aangezien GPCRs aantrekkelijke geneesmiddelendoelstellingen zijn, is GPCR ligandscreening dus onmisbaar voor de identificatie van loodverbindingen en voor deorphanisatiestudies. In de richting van deze inspanningen beschrijven we PRESTO-Tango, een open-source resource platform dat wordt gebruikt voor gelijktijdige profilering van voorbijgaande β-arrestin2 werving bij ongeveer 300 GPCRs met behulp van een TEV-gebaseerde reporter test.

Parallelle ondervraging van β-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening op een GPCR-Brede Schaal met presto-Tango Assay

In dit werk wordt een high-throughput, intracellulaire calciumfluorescentietest voor 384-well platen beschreven om kleine molecuulbibliotheken te screenen op recombinante G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's). Het doelwit, de kininereceptor van de runderkoortsteek, Rhipicephalus microplus, komt tot expressie in CHO-K1-cellen. Deze test identificeert agonisten en antagonisten die dezelfde cellen gebruiken in één "dual-addition" assay.

Een "Dual-Addition" Calcium Fluorescentie Assay voor de High-Throughput Screening van Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Dit protocol beschrijft het gebruik van op BRET gebaseerde biosensoren voor real-time meting van G-eiwitactivering in levende HEK293-cellen bij G-eiwitgekoppelde receptorligandstimulatie. Hier dienen de β2-adrenerge receptor en cannabinoïde type 1-receptor als voorbeeld om de efficiëntie van sensoren voor verschillende G-eiwitsubtypes en voor verschillende GPCR's aan te tonen.

Op BRET gebaseerde G-eiwitbiosensoren voor het meten van G-eiwitgekoppelde receptoractiviteit in levende cellen

Het testen van visuele gevoeligheid bij hagedissen met behulp van een operante conditionering paradigma dat het afspelen van video van de random-dot kinematograms en computer-gegenereerde ongewervelde dieren in dienst heeft.

Het testen van visuele gevoeligheid voor de snelheid en richting van de beweging in Lizards

Leer hoe je genetisch gecodeerde moleculaire probes gebruikt om G-eiwit gekoppelde receptoren te bestuderen via fotokruislinking en bioorthogonale labeling. Deze methode biedt specifieke inzichten in GPCR-structuur en -functie.

Genetisch gecodeerde Molecular Probes aan G-eiwit gekoppelde receptoren Studie

Meer video's verkennen