Proteomics Monstervoorbereiding van formaline gefixeerde en in paraffine ingebed weefsel

Het algemene doel van deze procedure is om peptiden te genereren en vooraf te fractieneren uit formaal en vast en paraffine-ingebed of FFPE-materiaal voor proteomanalyse. Dit wordt bereikt door isolatie van het gewenste weefsel door microdissectie, gevolgd door cellyse. De tweede stap is om peptiden te genereren door monsterverwerking.

Met behulp van multi-enzymdigestie filterondersteunde monstervoorbereiding. De peptiden worden vervolgens gekwantificeerd door hun trytopfanfluorescentie te meten. De laatste stap is fractierings van de peptiden met behulp van een scheidingstechniek op basis van een sterke anionenuitwisser voor peptidefractierings.

Uiteindelijk laten de bereide monsters analyse van proteomen toe van kleine hoeveelheden materiaal tot een diepte van 10.000 eiwitten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals in-gel of in-oplossingsdigestie, is dat het toepasbaar is op kleine hoeveelheden klinische monsters, zoals lasermicrodissectiecellen. De methode levert monsters op die perfectie en pure peptiden bevatten.

Wat vergemakkelijkt proteomische exploratie van menselijk weefsel en ziekten? Het hele protocol bestaat uit technieken die in het verleden zijn ontwikkeld en gepubliceerd. Deze omvatten hoge herstel fasp, pipettip ation en bepaling van peptidegehalte op basis van tryptofaanfluorescentie die aantoont dat de procedure Mrs. zal zijn.

Catina settle een technicus uit ons laboratorium Om te beginnen weefselsnijdingen voorbereiden voor microdissectie snijd secties met een microtoom. De dikte van de plakjes hangt af van het monster. Meestal werkt microdissectie goed met plakjes van zeven tot 10 micrometer.

Na het belichten van de membraanplakken met UV-licht gedurende 45 minuten, monteer de secties erop voordat ze gedurende twee uur drogen bij 37 graden Celsius. De gemonteerde secties deparizeren door twee opeenvolgende incubaties in achtereenvolgende potten xyleen gedurende twee en een half minuten en anderhalve minuut. Hydrateer vervolgens de secties door achtereenvolgens.

Een minuut incubatie in absoluut ethanol, 70% ethanol. En tenslotte, water. Na het kleuren van de secties met Meyer's Hematin gedurende 20 seconden.

Spoel af met water gedurende een minuut en laat het aan de lucht drogen. Verzamel de celpopulatie van belang met behulp van een lasercapture-microdissectiesysteem. Bij gebruik van het palminstrument verzamel de monsters in de kleefdoppen met behulp van drie microliters weefsellysebuffer voor 10 nanoliters van het microdissectieweefsel.

Breng de buffer aan op het microdissected materiaal in de dop en sluit de buis. Verzamel de suspensie na een korte centrifugatie. Lyzeer vervolgens het microdissected weefsel bij 99 graden Celsius in een verwarmingsblok met roeren gedurende een uur.

Verduidelijk de ruwe extract door centrifugatie bij 16.000 Gs en 18 graden Celsius gedurende 10 minuten. Meng maximaal 50 microliters van de verduidelijkte lysaat met 200 microliters van de UA-oplossing in een ultrafiltratie-eenheid. Centrifugeer vervolgens bij 14.000 GS tot er minder dan 10 microliters van de oplossing in de filter achterblijft.

Meestal duurt deze stap 10 tot 15 minuten centrifugatie. Pipetteer vervolgens 200 microliters van de UA-oplossing naar de ultrafiltratie-eenheid en centrifugeer. Leeg, zoals eerder, de verzamelbuis voordat u 50 microliters van de I A A-oplossing in de ultrafiltratie-eenheid pipetteert.

Meng gedurende een minuut bij 600 RPM in een thermomixer op kamertemperatuur en centrifugeer. Ga zoals eerder aangegeven verder met de ultrafiltratie- en centrifugatiestap zoals beschreven in het tekstprotocol dat bij deze video hoort. Breng vervolgens de filtratie-eenheden over naar nieuwe verzamelbuizen.

Pipetteer 40 microliters van de verteringsbuffer met endo-proteïnase lic C voordat u bij 600 RPM gedurende een minuut in de thermomixer mengt. Incubeer de eenheden in een natte kamer gedurende 18 uur bij 37 graden Celsius. Na het centrifugeren van de filtereenheden zoals eerder gedaan, pipetteer 160 microliters van de DB-buffer en centrifugeer.

De filtereenheden, het gepoolde doorstromen, bevatten de peptiden die vrijkomen door endo-protease lic C. Verzamel vervolgens de triptych-peptiden zoals beschreven in het tekstprotocol. De meting van het peptidegehalte in de eiwitverteringen kan worden uitgevoerd in verdunde buffer omdat de tryptofaanresiduen goed toegankelijk zijn voor het oplosmiddel. Om peptiden te kwantificeren pipetteert u eerst 0,2 milliliter van de assaybuffer DB in de kwarts Q vet.

Plaats vervolgens de Q vet in de qve-houder van het instrument en neem het emissiespectrum op voor de blanco. Bereid een kalibratiecurve voor met stappen van 0,1 microgram door een microliter-aliquots van de tryptofaanstandaardoplossing aan de Q vet toe te voegen en voorzichtig te mengen met de buffer db. Na het reinigen van de Q vet pipetteert u het monster erin en neemt u het monsterspectrum op.

Ga door met het berekenen van de eiwit- en peptideconcentratie zoals beschreven in het tekstprotocol vóór fractierings. Bereid de SAX-tipkolom voor door zes lagen EM. Import ionenmembraan in een gewone 0,2 milliliter-pipettip te stapelen. Maak twee SAX-tipkolommen per monster.

Bereid vervolgens de stagetip voor door drie lagen M four C 18 te stapelen. In een 0,2 milliliter-pipettip maakt u zes stagetips voor elk monster. Om te beginnen.

Fractierings verdunt de peptideoplossingen verkregen door vertering met ly C met 0,2 milliliter BRI en Robinson universele buffer. pH 11 verdunt vergelijkbaar de peptideoplossingen verkregen door vertering met trypsine met 0,2 milliliter BRI en Robinson Universele buffer. pH vijf assembleer de SAX-tipkolom in de aanpassingsdop voor centrifugalisatie voordat u de SAX-tipkolom en de C 18 stagetips wast en equilibreert zoals beschreven in het tekstprotocol.

Assembleer vervolgens de SAX-tipkolom in de C 18 stagetip. Laad de monstersoplossingen in de geëquilibreerde SAX-tipkolommen en centrifugeer de kolommen gedurende drie