Name: Proteomics Monstervoorbereiding van formaline gefixeerde en in paraffine ingebed weefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Leer een geoptimaliseerd protocol voor proteomics van FFPE-weefsel met laser-microdissectie en filterondersteunde monsterbereiding. Deze methode maakt diepe proteoomanalyse van minuscule klinische monsters mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteur dankt dr. Matthias Mann voor de voortdurende steun en mevrouw Katharina Zettl voor het aantonen van de methode. Dit werk werd ondersteund door het Max-Planck Instituut voor de Bevordering van de Wetenschap.

1. Instrumentatie Verplicht <ol><li> Voorbereiding van weefsel plakjes voor microdissection en sample lysis <ol><li> Thermoblok ingesteld op 99 ° C of een bad met kokend water. </li><li> Laser operationele microdissector (bijvoorbeeld PALM, Zeiss, Göttingen, Duitsland). </li><li> Thermostaat is bench-top centrifuge, temperatuur ingesteld op 20 ° C. </li><li> Natte kamer (box) met een rek voor Eppendorf-soort verwijdering buizen. </li><li> Incubator ingesteld op 37 ° C. </li><li> Spectrofluorometer waardoor meten van fluorescentie opgewonden nabije UV licht met micro-schaal kwartscuvetten (0,1-0,2 ml). </li></ol></li></ol> 2. Oplossingen <ol><li> &quot;Tissue Lysis Buffer (TLB): 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M DTT, 0,5% (w / v) polyethyleenglycol 20.000 en 4% SDS. </li><li> UA oplossing: 8 M ureum in 0,1 M Tris-HCl pH 8,5. Bereid 1 ml per 1 monster. UA en IAA oplossing moet vers worden bereid en gebruikt binnen een dag. </li><li> IAA oplossing: 0,05 M iodoacetamide in UA. Bereid 0,1 ml per 1 monster. </li><li> Endoproteïnase Lys-C, stock oplossing. </li><li> Trypsine, voorraad-oplossing. </li><li> &#39;Spijsvertering buffer&#39; (DB): 0,05 M Tris-HCl pH 8,5. Bereid 0,25 ml per 1 monster. </li><li> &#39;Tryptofaan Standard Solution&#39;: 0,1 ug tryptofaan in 1 ml gedeïoniseerd water. </li><li> &quot;Assay buffer B (ABB): 10 mM Tris-HCl, pH 7,6. </li><li> Stock oplossing van Britton &amp; Robinson Universal Buffer (Brub). Bereid een oplossing die 0,1 M CH3COOH, 0,1 MH 3 PO 4 en 0,1 MH 3 BO 3 en stel met 1 M NaOH om de gewenste pH (2, 4, 5, 6, en 11). Voor gebruik verdunnen 5-voudig met gedemineraliseerd water. </li><li> Buffer A: 1% (v / v) CH3COOH in gedeïoniseerd water. </li><li> Buffer B: 60% (v / v) CH3CN, 1% (v / v) CH3COOH in gedeïoniseerd water. </li></ol> 3. Pipet tip en &#39;StageTip&#39; Columns <ol><li> Bereid SAX tip-kolom door het stapelen van 6 lagen van Empore-anion membraan in een common 0,2 ml pipet tip. Maak twee SAX-tip kolommen per monster. </li><li> Bereid &#39;StageTip&#39; door het stapelen van 3 lagen Empore-C 18 in een 0,2 ml pipet tip. Maak 6 Stage tips voor elk monster. </li></ol> 4. Voorbereiding van de Tissue Slices voor Microdissection en Sample Lysis <ol><li> Snijd secties met een microtoom (de dikte van de plakjes afhankelijk van het monster. Gewoonlijk microdissectie werkt goed met plakken van 7-10 um). </li><li> Bestralen membraan slides (MembraneSlide 1.0 PEN) met UV-licht gedurende 45 minuten. </li><li> Monteer de hoofdstukken over de irradiate membraan glijbanen en droog bij 37 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Deparaffinize de gemonteerde delen door twee opeenvolgende incubaties in xyleen voor 2,5 min en 1,5 min. Hydrateren de secties achtereenvolgens incubaties in absolute ethanol, 70% ethanol en water, elk 1 minuut. </li><li> Vlekken op de secties met Mayer&#39;s hematoxyline gedurende 20 sec spoelen met water gedurende 1 minuut, en de lucht drogen. </li><li> Verzamel de cel populatiesop belangstelling gebruik lasermicrodissectie systeem. Bij gebruik van de PALM-instrument (Zeiss) het verzamelen van de monsters in de lijm caps (Adhesive CAP 200). </li><li> Pipetteer een hoeveelheid van de TLB over de gemicrodissecteerde materiaal in de dop. Sluit de buis en het verzamelen van de opschorting door een kort centrifugeren. Lyse de gemicrodissecteerde weefsel bij 99 ° C in een verwarmingsblok onder roeren (600 rpm) gedurende 1 uur. Gebruik 3 pl buffer 10 nl van de gemicrodissecteerde weefsel. </li><li> Verduidelijken het ruwe extract door centrifugatie bij 16.000 xg bij 18 ° C gedurende 10 minuten. Het lysaat kan worden opgeslagen bevroren bij -20 ° C. </li></ol> 5. Sample Processing <ol><li> Meng tot 50 ul van de geklaarde lysaat met 200 ui UA in de ultrafiltratie-eenheden (Forensic 30k) en gecentrifugeerd bij 14.000 xg tot minder dan 10 ul van de oplossing in het filter blijft. Meestal deze stap nodig 10-15 min centrifugeren. </li><li> Pipetteer 200 ul van UA naar de ultrafiltratie-eenheiden centrifuge zoals in 5.1. Leeg de collectie buis. </li><li> Pipetteer 50 ul van IAA oplossing en meng bij 600 rpm in een thermo-menger gedurende 1 minuut en centrifugeer punt 5.1. </li><li> Pipetteer 100 ul van UA naar de ultrafiltratie-eenheid en de centrifuge als in 5.1. Herhaal deze stap twee keer </li><li> Pipetteer 100 ul van de DB aan de ultrafiltratie-eenheid en centrifugeer bij 5.1. Herhaal deze stap tweemaal. </li><li> Breng de filtratie-eenheden naar nieuwe collectie buizen. Pipet 40 ul DB met endoproteïnase Lys-C (protease aan totaal eiwit verhouding van 1:100) en meng bij 600 rpm in thermo-mixer gedurende 1 minuut. Incubeer de eenheden in een vochtige kamer bij 37 ° C gedurende 18 uur. </li><li> Centrifugeer de filter units bij 14.000 xg, zoals in 5.1. </li><li> Pipetteer 160 ul van gedemineraliseerd water en centrifuge de filter units als in 5.1. De samengevoegde doorstroom (5.7 en 5.8 stappen) bevat gesecreteerd door endoproteinase Lys C. </li><li> Breng de ultrafiltratie-eenheid om een ​​nieuwe collectie buis. Voeg 40 ulDB met trypsine (enzym om eiwitverhouding 1:100) en meng bij 600 rpm in thermo-mixer gedurende 1 minuut. Incubeer de eenheden in een vochtige kamer bij 37 ° C gedurende 4 uur. Herhaal de stappen 5.7 en 5.8 aan de tryptische peptiden verzamelen. </li></ol> 6. Kwantificering van de peptiden <ol><li> De meting van het peptidegehalte in het eiwitdigesten kunnen verdunde buffer worden uitgevoerd omdat de tryptofaan residuen zijn goed toegankelijk voor het oplosmiddel. </li><li> Pipetteer 0,2 ml van ABB in de kwartscuvette en noteer de emissie-spectrum voor &#39;blank&#39;. </li><li> Bereid ijkcurve door 0,1 ug stappen door het toevoegen van 1 pl hoeveelheden van TSS aan de cuvet en zachte mix met de ABB. </li><li> Maak de cuvet. </li><li> Pipet het monster en noteer het spectrum (monster). </li><li> Bereken van het eiwit en peptide concentraties Aangezien 0,1 ug tryptofaan overeen met ongeveer 9 ug eiwit (gebaseerd op de gemiddelde 1,1% van het tryptofaan eiwitgehalte mengsels verkregen by lyseren menselijke cellen) het eiwitgehalte van de in het monster of peptide gehalte in de samenvatting is: <img alt="Vergelijking 1" fo:content-width="2.787in" fo:src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1.jpg" /> waar F (Standard1) is de fluorescentie van 0,1 ug tryptofaan standaard. Het peptidegehalte kan berekening van de opbrengst van de gemineraliseerde en biedt essentiële informatie na peptide fractionering en massaspectrometrische analyse. </li></ol> 7. Fractionering van het Lys-C en Tryptic Peptiden <ol><li> Verdun de verkregen digesties met Lys-C en trypsine 0,2 ml Brub pH 11 en pH 5 respectievelijk peptide oplossingen. </li><li> Monteer de SAX tip-kolom in de centrifugale buisadapter deksel. </li><li> Was en equilibreren de tip SAX-kolom met 0,1 ml methanol, 0,1 ml 1 M NaOH en 3 maal met 0,1 ml Brub, pH 11 voor de scheiding van Lys-C Peptides en Brub, pH 5 van de tryptische peptiden. De stroming van de oplossing door de kolom materiaal wordt vergemakkelijkt door centrifugeren bij 4000 x g. </li><li> Was en equilibreren C 18 - &#39;StageTips&#39; vervolgens met 0,05 ml methanol, vervolgens met 0,05 ml buffer B met 0,05 ml buffer A. Bereid zes C 18 - &#39;StageTips&#39;, 4 voor de scheiding van het Lys- C peptiden en twee voor de scheiding van de tryptische peptiden. </li><li> Monteer de SAX Tip-kolom in de C 18 - &#39;StageTip&#39;. Plaats het monster-oplossingen in de geëquilibreerde SAX Tip-kolommen en centrifuge de kolommen bij 5000 xg gedurende 3 minuten. </li><li> De &quot;pipet-tip&quot; kolommen evenwicht met 0,1 ml van de Brub, pH 11 en pH 5 respectievelijk de Lyc-C en tryptische monsters. Vergemakkelijken van de doorstroming door centrifugeren bij 5000 x g. </li><li> Breng de SAX Tip-kolom naar de C 18 - &#39;StageTip&#39;. </li><li> Verder elueren van de peptiden met Brub pH 6, 4 en 2 voor het Lys C monster en BRUB pH 2 voor het monster met tryptische peptiden. Voor elke elutiestap een aparte C 18 - &#39;StageTip&#39;. </li><li> Was de C 18 - &#39;StageTips&#39; met 0,05 ml buffer A. </li><li> Elueer fracties met 0,05 ml buffer B in flesjes direct gebruikt worden voor injectie van de monsters in LC systeem geassembleerd met een massaspectrometer. </li></ol>

<ol><li>Nagaraj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+proteome+and+transcriptome+mapping+of+a+human+cancer+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 548(2011).</li>
<li>Beck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantitative+proteome+of+a+human+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">The quantitative proteome of a human cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 549(2011).</li>
<li>Wisniewski, J. R., Dus, K., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+workflow+for+analysis+of+archival+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+clinical+samples+to+a+depth+of+10+000+proteins.+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Proteomic workflow for analysis of archival formalin-fixed and paraffin-embedded clinical samples to a depth of 10 000 proteins. Proteomics.</a> Clin. Appl. 7 (3-4), 225-233 (2013).</li>
<li>Magdeldin, S., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+deciphering+proteomes+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues.</a> Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).</li>
<li>Ostasiewicz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome%2C+phosphoproteome%2C+and+N-glycoproteome+are+quantitatively+preserved+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+and+analyzable+by+high-resolution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 9 (7), 3688-36700 (2010).</li>
<li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature. 6 (5), 359-362 (2009).</li>
<li>Wisniewski, J. R., Ostasiewicz, P., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+recovery+FASP+applied+to+the+proteomic+analysis+of+microdissected+formalin+fixed+paraffin+embedded+cancer+tissues+retrieves+known+colon+cancer+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+proteome+research%22%5BJournal%5D)">High recovery FASP applied to the proteomic analysis of microdissected formalin fixed paraffin embedded cancer tissues retrieves known colon cancer markers.</a> Journal of proteome research. 10 (7), 3040-3049 (2011).</li>
<li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+quantitative+remodeling+of+the+proteome+between+normal+colon+tissue+and+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extensive quantitative remodeling of the proteome between normal colon tissue and adenocarcinoma.</a> Mol. Syst. Biol. 8, 611(2012).</li>
<li>Wisniewski, J. R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consecutive+proteolytic+digestion+in+an+enzyme+reactor+increases+depth+of+proteomic+and+phosphoproteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Consecutive proteolytic digestion in an enzyme reactor increases depth of proteomic and phosphoproteomic analysis.</a> Anal. Chem. 84 (6), 2631-2637 (2012).</li>
<li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+FASP+and+StageTip-based+fractionation+allows+in-depth+analysis+of+the+hippocampal+membrane+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Combination of FASP and StageTip-based fractionation allows in-depth analysis of the hippocampal membrane proteome.</a> J. Proteome Res. 8 (12), 5674-5678 (2009).</li>
<li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization%2C+nanoelectrospray%2C+and+LC%2FMS+sample+pretreatment+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75 (3), 663-670 (2003).</li>
<li>Thompson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+pre-analytical+factors+on+the+proteomic+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Impact of pre-analytical factors on the proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Proteomics Clin. Appl. , (2012).</li>
</ol>

De auteur heeft niets te onthullen.

De mogelijkheid om de FFPE materiaal te bestuderen door de proteomics technologie tot een diepte vergelijkbaar met nucleïnezuursequentiebepaling en microarray technieken opent nieuwe perspectieven in biomarker en drug target discovery. De beschreven protocol maakt karakterisering en kwantificering van proteomen van populaties van gemicrodissecteerde cellen op een schaal van 10.000 eiwitten. Bij gebruik van minder van de gemicrodissecteerde materiaal een kleinere datasets kunnen worden gegenereerd, maar misschien in veel gevallen deze kan ook waardevolle klinische gegevens. Dus ofwel de monsters kunnen worden direct na de MED-FASP procedure geanalyseerd of kan in minder fracties worden gescheiden. Aangezien FASP procedure verenigbaar met elk type van protease, kunnen andere enzymen of een combinatie gebruikt worden van eiwit vertering 6. De kwaliteit van het materiaal FFPE lijkt het meest kritieke punt van de analyse. We hebben ervaren dat de vaste weefsel van dezelfde oorsprong, maar uit verschillenent klinieken hadden verschillende eigenschappen. Met weefsel van een bron we konden peptiden te genereren met hoge opbrengst, terwijl dergelijke uit andere kliniek was bijna nutteloos. Het is waarschijnlijk dat de toegepaste fixatie en inbedden procedures en bewaarcondities zijn de belangrijkste factoren die de eigenschappen van het klinisch materiaal 12. Daarom is het raadzaam om de eigenschappen van enkele monsters te testen voordat u een groter project. Veel publicaties maken melding van het FFPE materiaal in het verleden. Echter, het aantal eiwitten die in deze studies niet meer dan 1.000-2.000 eiwitten 4 overschreden. Gelet grootte van menselijke celspecifieke proteomen met meer 10.000 eiwitten zoals studies konden slechts zeer oppervlakkige schilderstuk bijna uitsluitend veel voorkomt proteïnen betrokken bij huishouding functies. Het protocol maakt efficiënte isolatie van de klinische of biologische materialen from bewaard weefsel en is geoptimaliseerd voor lysis, proteïneverwerking en peptide voorfractionering. Als gevolg van onze monstervoorbereiding workflow, wanneer gekoppeld aan de high-end massaspectrometrie, laat inzichten in een vrijwel volledige proteomen. Opmerkelijk is dit mogelijk bij minuut hoeveelheid monster eisen. Het belangrijkste voordeel van de bewaarde weefsels hun relatieve brede beschikbaarheid. FFPE monsters gearchiveerd voor vele jaren en decennia, en soms beschouwd als nutteloos, nu, dankzij proteomics technologie, verschijnen als zeer waardevol materiaal voor klinisch onderzoek. Overwegende dat vele ziekten kunnen worden bestudeerd met behulp van verse of diepgevroren materiaal onderzoek FFPE materiaal lijkt in het bijzonder belangrijk voor het bestuderen van zeldzame ziekten 12 te zijn, waren verzamelen van een representatieve set van monster duurt meestal een lange tijd.

Bevestiging met paraformaldehyde en inbedding in paraffine (FFPE) is de standaard methode voor het behoud en pathomorphologic onderzoek van klinisch weefsel materiaal. Microscopie van de bewaarde weefsel maakt de identificatie van ziekte-gerelateerde morfologische veranderingen, en opsporing en scoren van voorkomen van ziekte-gerelateerde antigenen. Aangezien typisch slechts een klein deel van de FFPE monster wordt gebruikt voor de analyses, grote hoeveelheden klinisch materiaal blijven gearchiveerd en kan in andere studies worden benut. Tijdens de recente decennium het onderzoek in de life sciences is versterkt door de krachtige proteomics technologie. Deze technologie maakt de identificatie en kwantificering van duizenden eiwitten in complexe eiwitmengsels. Een belangrijk kenmerk van de technologie is dat slechts kleine hoeveelheden materiaal nodig voor grootschalige analyses. Recente proteomics studies aangetoond dat eiwitten kunnen worden bestudeerd op een schaal van bijna compLETE proteomen 1, 2. Dergelijke onderzoeken kunnen het gehele systeem inzicht in de samenstelling van de cellen en identificatie van groepen van eiwitten die zich op abnormale niveaus ziekten. Overwegende dat deze studies vereist grote massaspectrometrische capaciteiten, heeft het recente werk heeft aangetoond dat in vergelijkbare mate van identificatie kan worden bereikt binnen een dag van de meting 3. De eis van relatief lage hoeveelheid monster en de ruime beschikbaarheid van de bewaarde klinische monsters geneigd ons en anderen om de methoden waarmee de proteomics verkenning van de FFPE materiaal (voor een overzicht zie 4) ontwikkelen. Profiterend van de omkeerbaarheid van de formalinefixatie onder een warmtebehandeling hebben we een protocol waarmee kwantitatieve extractie van eiwitten uit de vaste weefsel 5 ontwikkeld. We hebben aangetoond dat de fixatie procedure behoudt niet alleen eiwitten, maar heb enige posttranslationele modificaties. Phosphorylation en N-glycosylering kan worden bestudeerd met behulp van de FFPE monsters 5, maar een voorwaarde voor het is een grondig gecontroleerd weefsel verzamelen, opslaan en fixatie voorwaarden. Vervolgens hebben we de werkwijze voor laser capture microdissectie van het vaste weefsel en voor het proteomische reactor basis van verwerking 6, 7 geoptimaliseerd. Een grootschalig onderzoek naar darmkanker toegestaan ​​kwantitatieve analyse van 7500 eiwitten uit gemicrodissecteerde van klinisch materiaal 8. Tot slot hebben we de weg van de exploratie van gemicrodissecteerde materiaal verbeterd door opeenvolgende-twee stappen eiwitvertering protocol 9. In vergelijking met de gemeenschappelijke digestie strategieën enkelvoudige enzym met deze werkwijze kan generatie van sequentie-unieke peptiden en dus resulteert in een grotere diepte van proteïne-identificatie. Analyse van gemicrodissecteerde menselijke colonadenoom toegestaan ​​proteomics analyse tot een diepte van 9500 eiwitten per monster 3. In deze study we in kaart gebracht 55.000 peptiden per monster voor de identificatie van 88-89% eiwitten met minstens 2 peptiden. Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor bereiding van monsters FFPE materiaal voor LC-MS/MS analyse. Dit protocol omvat de voorbereiding van weefselplakken voor microdissection, lysis van de geïsoleerde cellen, en monster verwerking in een reactor formaat (FASP) 6. Daarna beschrijven we een spectrofluorometrische bepaling van peptide opbrengst, een taak met een groot belang voor optimale peptide identificatie door de massaspectrometrie. Tot slot tonen we een sterke anionenuitwisselaar (SAX)-gebaseerde scheiding techniek voor peptide fractionering. In deze methode zowel de peptide scheiding en eindschoonmaak worden uitgevoerd met behulp van een pipet-tip microkolommen 10, 11. Deze stap is optioneel, maar wordt aanbevolen in studies waarbij meer dan enkele microgram peptiden kunnen worden verkregen uit een enkel monster. De SAX-fractionering kan het aantal en het dynamisch bereik van ident aanzienlijk te verhogencaties en uitbreiding van de proteïnesequentie dekking 3, 10.

<table><tbody><tr><td>MembraneSlide 1.0 PEN</td><td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Göttingen, Duitsland</td><td>415190-9041-000</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive Cap 200 opaque</td><td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Göttingen, Duitsland</td><td>415190-9181-000</td><td></td></tr><tr><td>Mayer's hematoxyline oplossing </td><td>Sigma-Aldrich St. Louis, MO</td><td>MHS32</td><td></td></tr><tr><td>Forensic 30k </td><td>Merck Millipore Darmstadt, Duitsland</td><td>MRCF0R030</td><td>(Vóórheen verkocht als Microcon YM-30) </td></tr><tr><td>Empore Anion</td><td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN</td><td>2252</td><td></td></tr><tr><td>Empore C18</td><td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN</td><td>2215</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine </td><td>Promega</td><td>2014-06-27</td><td></td></tr><tr><td>Endoproteinase Lys-C</td><td>Wako</td><td>129-02541</td><td></td></tr></tbody></table>

proteomics monstervoorbereiding van formaline gefixeerde en in paraffine ingebed weefsel

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Bewaarde klinisch materiaal is een unieke bron voor proteomics onderzoek van menselijke aandoeningen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol waarmee grootschalige kwantitatieve analyse van formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde (FFPE) weefsel. De werkwijze omvat vier afzonderlijke stappen. De eerste is de bereiding van de punten uit de FFPE materiaal en microdissection van cellen van belang. In de tweede stap worden de geïsoleerde cellen worden gelyseerd en verwerkt met behulp van &#39;filter aided monstervoorbereiding&#39; (FASP) techniek. In deze stap worden eiwitten uitgeput van reagentia gebruikt voor het monster lysis en worden gedigereerd in twee stappen met endoproteinase LysC en trypsine. Na elke digestie worden de peptiden verzameld in afzonderlijke fracties en de inhoud wordt bepaald met een zeer gevoelige fluorescentie meting. Tenslotte worden de peptiden gefractioneerd op &#39;pipet-tip&#39; microkolommen. De LysC-peptiden worden gescheiden in 4 fracties, terwijl de tryptic peptides worden gescheiden in 2 fracties. Op deze wijze bereide monsters mogelijk analyse van eiwitprofielen van minuut hoeveelheden materiaal tot een diepte van 10.000 eiwitten. Zo is de beschreven workflow is een krachtige techniek voor het bestuderen van ziekten in een systeem-wide-mode als voor de identificatie van potentiële biomarkers en drug targets.

Proteomics analyse van FFPE materiaal vereist robuuste en reproduceerbare methoden voor monstervoorbereiding. In deze publicatie tonen we een protocol waarmee effectieve isolatie van celpopulaties uit het vaste materiaal en de chemische verwerking resulteert in een hoge zuiverheid peptide fracties die direct kunnen worden gebruikt voor LC-MS/MS analyse. De procedure bestaat uit vier delen: (1) bereiding van de punten van de FFPE monsters en de microdissectie, (2) lysis van het monster en de verwerking van de eiwitten met behulp MED FASP benadering, en (3) kwantificering en (4) de fractionering van de peptiden (figuur 1). In de eerste stap van de procedure de FFPE monsters coupes met een microtoom en gemonteerd op membraanbespannen dia. Om de hechting tussen de weefselsecties en het oppervlak van de schuif membraan te verhogen moet de dia oppervlak bestralen met UV-licht. Hiertoe het licht van een UV lamp gebruiken wegeïntegreerd in een celcultuur bankje. Na deze stap worden de objectglaasjes onderworpen aan wassen waardoor verwijdering van paraffine en rehydratatie van de monsters. De gerehydrateerde materiaal wordt gekleurd met hematoxiline voor een korte tijd. Dit resulteert in een zwakke kleuring van het monster, maar voldoende voor visualisatie van het monster gebieden voor microdissectie. De kleuring proces snel worden gestopt door het spoelen van de glaasjes met een overmaat water. Een langdurige kleuring van het monster resulteert in een slechte peptide opbrengsten. In de volgende stap de droge gedeelten onderworpen aan microdissectie. De keuze van de weefselgebieden van afzonderlijke cellen is afhankelijk van het soort onderzoek en altijd vereist specifieke kennis histologie of pathomorphology. De laser vrijgekomen materiaal wordt verzameld op zelfklevende oppervlakken van de monstername buizen. Aangezien de bindingscapaciteit van het hechtmateriaal beperkt moet de gemicrodissecteerde materiaal overbrengen van het deksel aan thij buis na sectie van elke 3-5 mm 2 van het monster. Dit kan eenvoudig worden gedaan door pipetteren van enkele microliter van het weefsel lysisbuffer (LTB) op het deksel en een kort draaien van de buis in een centrifuge. Nadat het monster wordt op de bodem van de buis, kan de microdissectie en monsterverzameling op het deksel worden voortgezet. Nadat het gehele monster wordt genomen de buizen moet bovendien worden afgesloten met parafilm en geïncubeerd in een waterbad bij ongeveer 99 ° C onder voortdurend roeren gedurende 1 uur. Aangezien tijdens de incubatie water condenseert op het deksel, elke 15 min de buizen binnenkort worden gecentrifugeerd terug halen het water in de buis kegel. Om peptiden de weefsellysaten worden verwerkt met behulp van de MED-FASP aanpak. In deze werkwijze de gelyseerde eiwitten uitgeput van het wasmiddel en andere laagmoleculaire stoffen, carboamidomethylated op cysteïnyl residuen, en vervolgens achtereenvolgens gedigesteerd met twee verschillende enzymenbieding in hun decollete specifieke kenmerken: endoproteïnase LysC en trypsine. Na elke digestiestap de peptiden worden verzameld in afzonderlijke fracties. In dit deel van de monstervoorbereiding is het belangrijk om te blijven elke centrifugering stappen totdat meer dan 95% van de oplossing aanvankelijk geladen in het filtersysteem voorbij het membraan. Analyseren dikke darmweefsel en de kanker waargenomen dat deze procedure levert 3-6 ug peptide per 100 nl (100 ug weefsel of 10 mm 2 een doorsnede 10 urn) van de gemicrodissecteerde materiaal (tabel 1). Aangezien het winbare hoeveelheid eiwit uit weefsels ongeveer 10% van het gewicht weefsel extractie en digestie procedures samen in een 30-60% opbrengst in de ten opzichte van het oorspronkelijke verse weefsel. Deze waarden weerspiegelen verlies van eiwit gedurende dehydratie en vlekken, microdissectie en vasthouden van het gedeelte van de onverteerde monster in de ultrafiltratie-eenheden. Omdat de winning en verwerking van nietn-gemicrodisseceerde FFPE weefsel geleid eiwitten naar peptide-omzettingsrendement van 75% 5 is het waarschijnlijk dat de kritische monster verliezen voordoen tijdens de voorgaande stappen MED-formalisme. Een belangrijk kenmerk van het peptide mengsels verkregen volgens deze werkwijze is de hoge zuiverheid die verder fractionering peptide fractioneringsproces en massaspectrometrie identificatie vergemakkelijkt. Het is onlangs aangetoond door een analyse van colorectaal adenoom monsters 3. In dat onderzoek ongeveer 40% van de MS / MS gebeurtenissen leidden tot de identificatie van peptiden uit de FFPE weefsels en resulteerde in kaart brengen tot 17.000 peptiden per enkele LC-MS/MS run. Hogere identificatie tarieven zijn alleen bereikt in de analyse van bevroren in vitro gekweekte cellen 3. In de twee laatste delen van de hele procedure de geïsoleerde peptiden worden gekwantificeerd en gefractioneerd op pipet-tip microkolommen. Aangezien de bedragen van peptide geïsoleerd uit de gemicrodissecteerde weefsel zijnlage 10 ug ze niet kunnen worden gekwantificeerd met behulp van algemeen gebruikte kleurstoffen gebaseerde eiwit assays. Ook de A280 UV-spectrale metingen bij deze concentraties niet bruikbaar vanwege lichtverstrooiing effect. Daarentegen metingen van de fluorescentie van tryptofaan residuen een betrouwbare manier voor bepaling van het peptidegehalte. Onlangs hebben we aangetoond dat tot 5.000 proteïnen uit gekweekte cellen kunnen worden geïdentificeerd in een &quot;enkel schot&quot; 4 uur LC-MS/MS analyse 7. Maar dit type analyse toegepast op inheemse weefsels zelden maakt de identificatie van meer dan 3000 duizend eiwitten. Voor het verhogen van de diepte van de analyse van de gegenereerde in MED FASP peptiden moeten vooraf worden gefractioneerd voor LC-MS/MS. De SAX gebaseerde micro-scheidingskolom is een eenvoudige en efficiënte fractionering methode 10. Het is al toegepast in verschillende proteomics studies waaronder die analyseren vaste weefsel 5, 8, 9. De SAX-&#39;pipet-tip&#39; microcolumns, en de C 18 - &#39;StageTip&#39; ontzouten kolommen 9 zijn gemakkelijk te bereiden. De kolommen zijn samengesteld door het stapelen van stekkers, gesneden uit de SAX of C 18 membranen, in een 200 ul pipet tip 11. Voorbeelden van de analyse van de SAX gefractioneerd FFPE monsters zijn weergegeven in Tabel 1. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/50589/50589fig1.jpg" /> Figuur 1. Procedure overzicht. De procedure bestaat uit vier delen: (1) bereiding van de punten van de FFPE monsters en de microdissectie, (2) lysis van het monster en de verwerking van de eiwitten met behulp MED FASP benadering, en (3) kwantificering en (4) de fractionering van de peptiden. <table border="1" class="jove_content_small" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.4in"> Monster </td><td fo:width="1in"> Monster pre-fractionering / spijsvertering </strong&gt; </td><td fo:width="1in"> Massaspectrometer gebruikt </td><td fo:width="1.25in"> Peptide opbrengst ng / nL monster (± SD) </td><td fo:width="1.25in"> Unieke eiwitidentificaties Per enkel monster </td><td fo:width=".75in"> Verwijzing </td></tr><tr><td> • Adenonocarcinoma • Normaal colonmucosa </td><td> SAX / een enzym </td><td> Orbitrap-Velos </td><td> 36 ± 11 (n = 8) 30 ± 8 (n = 8) </td><td> 5985 ± 54 5868 ± 110 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> • colonadenoom </td><td> SAX / twee enzymen </td><td> Q Exactive </td><td> 56 ± 6,1 (n = 3) </td><td> 9,501 ± 28 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Representatieve resultaten van proteomics analyses van de FFPE gemicrodissecteerde weefsel.

Archiefbeelden formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde (FFPE) klinische monsters zijn waardevol materiaal voor onderzoek naar ziekten. Hier laten we zien een monstervoorbereiding workflow waardoor diepgaande proteomics analyse van gemicrodissecteerde FFPE weefsel.

Proteomics Monstervoorbereiding van formaline gefixeerde en in paraffine ingebed weefsel

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren en voorfractioneren van peptiden uit formaldehyde-gefixeerd en in paraffine ingebed (FFPE) materiaal voor proteomische analyse. Dit wordt bereikt door isolatie van het gewenste weefsel via microdissectie, gevolgd door cellyse. De tweede stap is het genereren van peptiden door middel van monstervewerking.Gebruik van monsterpreparatie met behulp van filters voor multi-enzymatische digestie. De peptiden worden vervolgens gekwantificeerd door hun tryptofaanfluorescentie te meten. De laatste stap is het fractioneren van de peptiden met behulp van een scheidingstechniek op basis van een sterke anionenuitwisselaar voor peptidefractionering.Uiteindelijk maken de geprepareerde monsters het mogelijk om proteomen uit minimale hoeveelheden materiaal te analyseren tot een diepte van 10.000 eiwitten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals digestie in gel of in oplossing, is dat deze toepasbaar is op minimale hoeveelheden klinische monsters, zoals laser-microgedissecteerde cellen. De methode levert monsters op die perfecte en zuivere peptiden bevatten.Wat faciliteert de proteomische exploratie van menselijk weefsel en ziekten? Het volledige protocol bestaat uit technieken die in het verleden zijn ontwikkeld en gepubliceerd. Deze omvatten high recovery fasp, pipet tip ation, en bepaling van het peptidegehalte op basis van tryptofaanfluorescentie, waarbij de procedure door mevrouw [Naam] wordt gedemonstreerd.Catina, een technicus uit ons laboratorium, begint met het voorbereiden van weefselcoupes voor microdissectie door secties te snijden met een microtoom. De dikte van de coupes hangt af van het monster. Meestal werkt microdissectie goed met coupes van 7 tot 10 µm.Nadat de membraanpreparaten 45 minuten zijn bestraald met UV-licht, worden de coupes hierop gemonteerd alvoren ze twee uur gedurende 37 °C te drogen. Deparaffiniseer de gemonteerde coupes door twee opeenvolgende incubaties in opeenvolgende potjes xyleen gedurende twee en een half minuut en anderhalf minuut. Rehydrateer vervolgens de coupes opeenvolgend.Incubaties van één minuut in absolute ethanol, 70% ethanol en tot slot water. Vervolgens worden de coupes gedurende 20 seconden gekleurd met Meyer's Hematin.Spoel één minuut lang met water en laat aan de lucht drogen. Verzamel de gewenste celpopulatie met behulp van een laser capture microdissectiesysteem. Bij gebruik van het Palm-instrument worden de monsters in de adhesieve doppen verzameld met behulp van 3 µL weefsellysebuffer per 10 nL van het gemicrodisseceerd weefsel.Voeg de buffer toe aan het micro-gedissecteerde materiaal in de dop en sluit de buis. Verzamel de suspensie na een korte centrifugatie. Lyse vervolgens het micro-gedissecteerde weefsel bij 99 °C in een warmteblok met agitatie gedurende één uur.Klaar het ruwe extract op door centrifugatie bij 16.000 Gs en 18 graden Celsius gedurende 10 minuten. Meng tot 50 µL van het geklaarde lysaat met 200 µL van de UA-oplossing in een ultrafiltratie-eenheid. Centrifugeer vervolgens bij 14.000 GS totdat er minder dan 10 µL van de oplossing in het filter overblijft.Normaal gesproken vereist deze stap 10 tot 15 minuten centrifugatie. Pipetteer vervolgens 200 µL van de UA-oplossing in de ultrafiltratie-eenheid en centrifugeer. Leeg, zoals voorheen, de opvangbuis voordat u 50 µL van de I A A-oplossing in de ultrafiltratie-eenheid pipetteert.Meng één minuut lang bij 600 RPM in een thermomixer op kamertemperatuur en centrifugeer. Zet vervolgens de ultrafiltratie- en centrifugatiestappen voort zoals beschreven in het tekstprotocol bij deze video. Breng de filtratie-eenheden daarna over naar nieuwe opvangbuisjes.Pipetteer 40 µL digestiebuffer met endoproteïnase lic C voordat u mengt bij 600 RPM in de thermomixer gedurende één minuut. Incubeer de units in een vochtige kamer bij 37 °C gedurende 18 uur. Nadat de filterunits zijn gecentrifugeerd zoals eerder beschreven, pipetteert u 160 µL van de DB-buffer en centrifugeert u.De filtereenheden van de samengevoegde doorstroom bevatten de peptiden die zijn vrijgebuat door endoprotease Lys C. Verzamel vervolgens de tryptische peptiden zoals beschreven in het tekstprotocol. De meting van het peptidegehalte in de eiwitdigesten kan worden uitgevoerd in verdunde buffer, omdat de tryptofaanresiduen goed toegankelijk zijn voor het oplosmiddel. Pipetteer voor de kwantificering van peptiden eerst 0,2 milliliter assaybuffer DB in de kwartscuvet.Plaats vervolgens de Q-cuvet in de cuvethouder van het instrument en registreer het emissiespectrum voor de blanco. Stel een kalibratiecurve op met stappen van 0,1 µg door aliquoten van 1 µL van de tryptofaanstandaardoplossing aan de Q-cuvet toe te voegen en voorzichtig te mengen met de buffer db. Pipetteer na het reinigen van de Q-cuvet het monster in en registreer het monsterspectrum.Bereken vervolgens de eiwit- en peptideconcentratie zoals beschreven in het tekstprotocol vóór fractionering. Bereid de SAX-tipkolom voor door zes lagen EM.Import-ionmembraan in een standaard pipetteertip van 0,2 milliliter te stapelen. Maak twee SAX-tipkolommen per monster.Bereid vervolgens de stage-tip voor door drie lagen M four C 18 te stapelen. Maak in een pipetteertip van 0,2 milliliter zes stage-tips voor elk monster. Om te beginnen.Fractionering: verdun de peptidenoplossingen die zijn verkregen door digesties met ly C met 0,2 milliliters BRI- en Robinson universele buffer pH 11. Verdun op soortgelijke wijze de peptidenoplossingen die zijn verkregen door digesties met trypsine met 0,2 milliliters Britain- en Robinson universele buffer pH vijf. Monteer de SAX tipkolom in het dopje van de centrifugebuisadapter voordat de SAX tipkolom en de C 18 stage tips worden gewassen en geëquilibreerd zoals beschreven in het tekstprotocol.Stel vervolgens de SAX-tipkolom samen in de C 18-stadiumtip. Laad de monsteroplossingen in de geëquilibreerde SAX-tipkolommen en centrifugeer de kolommen bij 5.000 Gs gedurende drie minuten. Was de pipetpuntkolommen met 0,1 milliliters van de verdunde monsters.Bevorder de doorstroming door centrifugatie bij 5, 000 Gs. Breng de SAX-tipkolom over naar de volgende C 18-fase-tip en ga verder met het elueren van de peptiden zoals beschreven in het tekstprotocol. Na het wassen van de C 18-fase-tips met 0,05 milliliters buffer a, worden de fracties geëlueerd met 0,05 milliliters buffer B in vials, die later worden gebruikt voor injectie van de monsters in een vloeistofchromatografiesysteem gekoppeld aan een massaspectrometer. De resultaten van de proteinextractie en -digestie worden hier getoond.Lysis van 250 nanoliter weefsel, wat overeenkomt met een micro-gedissecteerd gebied van 25 vierkante millimeter uit een plak van 10 micrometer, resulteert in ongeveer 45 microgram totaal eiwit; na de tweestaps opeenvolgende digestie in het fasts-formaat met endoprotease slice C en trypsine worden opbrengsten van meer dan 50% van het totale eiwit behaald. Hier wordt een representatieve fluorescentiemeting van het peptidegehalte getoond, waarbij de spectra van de tryptofaanstandaard en het monster maxima vertonen bij 350 tot 360 nanometer. De intensiteit van de fluorescentie is proportioneel aan het tryptofaangehalte.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u monsters van weefsel voor proteomische analyse bereidt met behulp van de microdissectietechniek, monsterbewerking en peptidefractionering. Zodra deze techniek beheerst is, kan deze in drie tot vier uur worden uitgevoerd, exclusief de tijd die nodig is voor de proteïnedigestie. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat er vers bereide weefselsneden moeten worden gebruikt na de ontwikkeling ervan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van de proteomica om de proteomen van weefsels en cellen en afwijkingen bij mensen te onderzoeken met behulp van FFPE-materiaal.

proteomic-sample-preparation-from-formalin-fixed-paraffin-embedded

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont het protocol voor DNA-extractie van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde materiaal. Dit is een multi-dagen procedure waarbij weefsel secties worden ontdaan met xyleen, gerehydrateerd met ethanol en behandeld met proteinase K te zuiveren en DNA te isoleren voor latere gen-specifieke of genome-wide analyse.

DNA-extractie van paraffine Embedded materiaal voor genetische en epigenetische Analyses

The following video describes how to preserve morphology of a tissue with formalin fixation and paraffin embedding.

Formalin-Fixed Paraffin Embedded (FFPE) Tissue Preservation: A Method for Studying Tissue Morphology

Deze gewijzigde extractie protocol verbetert RNA en DNA opbrengst van meer doelgerichte regio's van belang in histopathologische weefsel blokken.

Bereiding van formaline gefixeerde paraffine-ingebed weefsel Cores voor zowel RNA en DNA-extractie

Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is vaak vereist in combinatie met histopathologie en moleculaire diagnostiek voor selectie van therapie in gepersonaliseerde geneeskunde. Een nieuwe niet-kruis-mailkoppeling, formaline-gratis weefsel-fixeerspray waarmee hoge kwaliteit morfologische, moleculaire en vis analyses van het zelfde model door toevoeging van een na fixatie stap voordat vis wordt aangeboden.

Protocol voor HER2 vissen combineren van de voordelen van Cryo-behoud en formaline fixatie met een niet-kruis-mailkoppeling, formaline-gratis weefsel fixatief

Dit protocol beschrijft een reproduceerbare en betrouwbare methode voor de sublimatie gebaseerde voorbereiding van formaline vaste weefsels die bestemd zijn voor imaging Spectrometrie van de massa.

Optimale voorbereiding van formaline vaste monsters voor Peptide Matrix gebaseerde bijgestaan Laser desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging Workflows

Dit protocol biedt een overzicht van de procedures voor de isolatie van RNA voor de profilering van de transcriptomic van de lymfeklier weefsels van grote dieren, met inbegrip van de stappen in de identificatie en de besnijdenis van lymfeklieren van vee en wilde dieren, bemonstering benaderingen te leveren consistentie in meerdere dieren, en overwegingen plus representatieve resultaten voor de post collectie bewaring en verwerking ten behoeve van RNA analyse.

Verzameling en verwerking van lymfklieren uit grote dieren RNA p.a.: lymfeklier Transcriptomic Studies van grote diersoorten voorbereiden

In het tijdperk van kankerimmunotherapie is de interesse in het ophelderen van de micro-omgevingsdynamiek van tumoren opvallend toegenomen. Dit protocol beschrijft een massaspectrometrie beeldvormingstechniek met betrekking tot de kleurings- en beeldvormingsstappen, die een zeer gemultiplexte ruimtelijke analyse mogelijk maken.

Uitbreiding van het begrip van de tumormicro-omgeving met behulp van massaspectrometrie Beeldvorming van formaline-vaste en paraffine-ingebedde weefselmonsters

Hier stellen we een op massaspectrometrie gebaseerde proteomische methode op met behulp van geïsoleerde interessegebieden in formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties. Dit protocol wordt gebruikt om proteoom te analyseren van specifieke weefselgebieden in gearchiveerde, in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties.

Een gestroomlijnde aanpak voor proteomics op basis van massaspectrometrie met behulp van geselecteerde weefselregio's

Deze video toont de voorbereiding van een ultra-dunne matrix / analyt laag voor het analyseren van peptiden en eiwitten door Matrix-assisted laser desorptie ionisatie massaspectrometrie (MALDI-MS).

MALDI Monstervoorbereiding: de Ultra Thin Layer methode

In deze video tonen we een methode voor de elektroforetische scheiding van eiwitten met behulp van poly-acrylimide gelelektroforese (PAGE).

Elektroforetische scheiding van eiwitten

Leer een geoptimaliseerd protocol voor proteomics van FFPE-weefsel met laser-microdissectie en filterondersteunde monsterbereiding. Deze methode maakt diepe proteoomanalyse van minuscule klinische monsters mogelijk.

Proteomics Monstervoorbereiding van formaline gefixeerde en in paraffine ingebed weefsel

Meer video's verkennen