Name: Transplantatie van olfactorische Ensheathing Cellen tot functioneel herstel Evalueer na perifere zenuwschade (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Leer hoe olfactorische ensheathing cellen worden getransplanteerd voor functioneel herstel na perifere zenuwschade. Deze methode evalueert axonale groei en functionaliteit via laryngoscopie en elektromyografie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag ADIR (Aide à Domicile aux Insuffisants respiratoires) en Fondation de l&#39;Avenir erkennen voor hun financiële steun en Dr Fanie Barnabe-Heider voor het bewerken van het manuscript.

1. Primaire culturen van olfactorische slijmvlies en reukbollen <ol><li> Voorafgaand aan ontleding <ol><li> Maak medium, 50 ml door toevoeging van 44 ml calcium-vrije Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s / Ham&#39;s F12-medium (DMEM/F12), aangevuld met 5 ml foetaal runderserum (FBS) en 1 ml penicilline / streptomycine. </li><li> Coat 75 cm2 flessen met poly-L-lysine (50 ug / ml, 1,5 ug / cm 2), 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Spoel kolven met PBS 1x. </li><li> Bewaar de gecoate kolven in de koelkast tot 1 week. </li></ol></li><li> Ontleding <ol><li> Elke methode van euthanasie moet vooraf worden goedgekeurd door Animal Care en gebruik Comite van de instelling en uitgevoerd door gekwalificeerd personeel. </li><li> Kies inteelt ratten zoals Fischer ratten. </li><li> Nadat de rat is bevestigd diepe narcose te zijn aangegaan met natrium-pentobarbital of andere injecteerbare vormen van anesthesie, zoals ketamine / xylazine, onthoofden hem en rchrap de huid. </li><li> Open de schedel van de voorste tot de achterste deel. </li><li> Verwijder de OB verzorgen naar de hersenvliezen voorkomen. </li><li> In dezelfde rat, opent de neusholte sagittaly. </li><li> Verwijder het OM en zorg ervoor dat de luchtwegen slijmvlies vermijden. Merk op dat de OM epitheel gemakkelijk geïdentificeerd door een geelachtige kleur. </li><li> Verdere gedetailleerde protocollen over dissectie van OM kan vinden in een eerdere <a href="https://www.jove.com/video/2762/isolating-nasal-olfactory-stem-cells-from-rodents-or-humans">J. Vis. Exp</a> . publicatie 13. </li></ol></li><li> Cultuur <ol><li> Plaats OB in Hank&#39;s gebufferde zoutoplossing (HBSS) die 0,1% trypsine gedurende 45 minuten bij 37 ° C. </li><li> Plaats OM in HBSS met 0,05% collagenase A gedurende 45 minuten bij 37 ° C. </li><li> Stop enzymatische vertering door toevoeging van 2 ml warm medium. </li><li> Was de cellen met medium en centrifugeer ze bij 300 xg gedurende 3 minuten. </li><li> Vermaal monsters 2ml medium met een P1000 pipet totdat een homogene celsuspensie wordt verkregen. </li><li> Plaat de cellen in de vooraf beklede kolven (5-10 x 10 6 cellen / kolf) met 25 ml warm medium. </li><li> Incubeer en cultuur van de cellen bij 37 ° C met 5% CO2. </li><li> Verander de helft van het medium om de 2 dagen. </li><li> Na 6-8 dagen in vitro, check het aandeel van de p75-positieve cellen op kleincellige monsters, verondersteld OECS in knaagdieren, door flowcytometrie of immunocytochemie. Voor deze analyses, kunnen andere markers worden bestudeerd zoals GFAP en S100β. </li></ol></li><li> Flowcytometrieanalyse <ol><li> Het verzamelen van de cellen zoals beschreven in &quot;cellulaire transplantatie&quot; (punt 2.2). </li><li> Incubeer ze met p75 primaire antilichaam (1:100) gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Was de cellen met 2 ml PBS-EDTA en centrifugeer ze bij 300 xg gedurende 3 minuten. </li><li> Incubeer de cellen met PE geconjugeerd anti-muis secundair antilichaam gedurende 15min bij 4 ° C in het donker (1:200). </li><li> Was de cellen met 2 ml PBS-EDTA en centrifugeer ze bij 300 xg gedurende 3 minuten. </li><li> Resuspendeer de cellen in 500 ui PBS-EDTA. </li><li> Analyseer 10-30 x 10 3 cellen met stroom-cytometer. </li></ol></li><li> Immunocytochemie analyse <ol><li> Plate de cellen in 6-well platen voorgecoat voor 48 uur, zoals beschreven in &quot;cultuur&quot; (paragraaf 1.1.2 hieronder). </li><li> Was de cellen met PBS. </li><li> Fixeer de cellen met 4% PFA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de cellen met PBS. </li><li> Incubeer de cellen met PBS / Triton X100 (0,1%) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de cellen met PBS. </li><li> Incubeer de cellen met primaire antilichamen (1:200): p75, S100β en GFAP nacht bij 4 ° C. </li><li> Was de cellen met PBS. </li><li> Incubeer de cellen met de secundaire antilichamen (1:500) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Was de cellen met PBS. </li><li> Incubeer de cellen met Hoechst 10 min bij RTT in het donker. </li><li> Was de cellen met PBS. </li><li> Analyseer de cellen met een fluorescentiemicroscoop. </li></ol></li><li> GFP etikettering cellen <ol><li> Vijf dagen voor de transplantatie, infecteren OB en OM culturen overnachting met lentivirale vector die versterkt GFP (multipliciteit van infectie: 20). </li><li> Vóór de transplantatie controle op kleine steekproeven de snelheid van de GFP-positieve cellen door flow-cytometrie zoals eerder beschreven in &quot;cultuur&quot; (punt 1.1). </li></ol></li></ol> 2. Chirurgie en Transplantatie <ol><li> Recurrens anastomose <ol><li> Alle experimenten met dieren moeten vooraf worden goedgekeurd door Animal Care en gebruik Comite van de instelling en uitgevoerd door gekwalificeerd personeel. </li><li> Voorafgaand aan chirurgie autoclaaf alle instrumenten en onderhouden steriliteit gedurende de chirurgische procedures. </li><li> Verdoven rat door intraperitoneale injectie van ketamine hydrochloride (12,5 mg / kg) en chloorpromazine hydrochloride (0.625 mg / kg). Beoordelen toereikendheid van de anesthesie door teen knijpen voorafgaand aan de operatie. </li><li> Plaats de rat in dorsale decubitus. </li><li> Voer een 2 cm verticale medium cervicale cutane incisie met een scalpel. </li><li> Voer een verticale insnijding van de infrahyoid spieren na de mediale witte lijn. </li><li> Expose strottenhoofd door gebruik autostatic retractor tussen infrahyoid spieren. </li><li> Expose de RLN. </li><li> Onder microscopische controle, snijd de zenuw volledig met microscissors op het niveau van de zevende tracheale ring. </li><li> Voer anastomose met behulp van een punt van 11,0 hechtdraad onder microscopische controle. Deze operatie leidt tot een specifieke motor denervatie van het strottenhoofd. </li></ol></li><li> Cellulaire transplantatie <ol><li> Net voor transplantatie, verwijdert de cellen van de gerechten met 0,05% trypsine EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ° C. </li><li> Stop enzymatische vertering door toevoeging van 2 ml warm medium. </li><li> Centrifugeer bij 300 xg gedurende 3 minuten. </li><li&gt; Onder een microscoop te tellen van de cellen met een hemocytometer en pas de cellulaire concentratie overeenkomstig specifiek protocol. In dit model, gewenste concentraties van 1,2-6 x 10 6 cellen in 30 ui DMEM/F12. </li><li> Maak cellulaire voorbereiding met 1:02 mix (30 en 60 ul in dit experiment) van DMEM/F12-Matrige l in 1,5 ml tube voor het enten en plaats het op het ijs. Om niet-specifieke effecten te vermijden, te gebruiken groeifactor verminderd Matrigel. </li><li> Enkel voorafgaand aan transplantatie houden de buis in je hand voor een paar seconden op te warmen de Matrigel-medium mix. </li><li> Onttronen de mix op de anastomose site met behulp van een pipet en wacht tot het mengsel zelf-assembleert op de beschadigde zenuw. </li><li> Sluit de spieren en de huid met een 4,0 hechtdraad. </li><li> Huis de ratten individueel en houden onder een warmtelamp voor 24 uur. </li></ol></li></ol> 3. Evaluatie <ol><li> Laryngoscopie <ol><li> Verdoven ratten door intraperitoneal injectie van ketamine hydrochloride (12,5 mg / kg) en chloorpromazine hydrochloride (0.625 mg / kg). Bevestig ratten worden verdoofd met een teen knijpen voordat u verdergaat met het protocol. </li><li> Plaats de rat in dorsale decubitus. </li><li> Plaats een 30 ° videolaryngoscope aangepast aan het beste uitzicht van het strottenhoofd te bieden. Bepaal anatomische oriëntatiepunten om dezelfde weergave voor elke opname te reproduceren. </li><li> Noteer stembanden bewegingen met behulp van de videolaryngoscope (5-10 sequenties / dier). Voor elk dier selecteert drie reeksen van opeenvolgende maximale adductie en maximale ontvoering. </li><li> Analyseer laryngeale functie met behulp van software voor beeldanalyse. Bepaal absolute hoekige beweging door het meten van het verschil tussen de beweging van de maximale abductie en maximale adductie van de stembanden. Bepaal dynamische score door het meten van de beweging amplitude. Bepaal functionele score door het meten van de synkinesis en paradoxale bewegingen. </li></ol></li><li> Elektromyografie (EMG) <ol><li&gt; Plaats een elektrode op de hamstring spieren van de rat voor elektrische isolatie. </li><li> Expose strottenhoofd en de luchtpijp door het openen van de huid en spieren, zoals eerder beschreven in &quot;recurrens anastomose&quot; (paragraaf 2.1). </li><li> Expose de cricothyroid kraakbeen. </li><li> Open de cricothyroid kraakbeen aan het achterste cricoarytenoid (PCA) spier bloot behulp microscissors. </li><li> Introduceer een monopolaire naald elektrode (38 x 0,45 mm) in de PSO spier. </li><li> Noteer de elektrische spieractiviteit van de PSO spier met behulp van een acquisitie systeem tijdens spontane ademhaling. </li><li> Analyseer de spieractiviteit in termen van rijkdom en synchronisatie met de ademhaling. Om EMGs analyseren, wijs een kwalitatieve score 0-3 met behulp van de volgende schaal: 0: unrhymed tracing, zonder stijging in inspiratie, 1: rijmde tracing met inspiratoire toe, maar slechte tracing (Neurogen), 2: rijmde tracing met rijkere activiteit, 3: rijmende tracing, zeer rijk, vormt een interference patroon, vergelijkbaar met een maximale opzettelijke activiteit. </li><li> Expose de nervus vagus te latency en mogelijke duur te meten. De nervus vagus wordt gekozen als de locatie van stimulatie omdat RLN tijdens de stimulatie kan worden beschadigd als gevolg van de kleine omvang. </li><li> Stimuleren van de nervus vagus met een elektrode. </li><li> Noteer elektrische signalen in de PSO spier. Meet latency en mogelijke duur. Indien mogelijk gebruik maken van een overname module om spieractiviteit, latency en mogelijke duur van het opnemen van bijvoorbeeld Powerlab systeem. </li></ol></li><li> Histologie <ol><li> Euthanaseren het dier met behulp van pentobarbital overdosis. </li><li> Verwijder de distale stomp van RLN onder microscopische controle. Het distale deel van RMN wordt gedefinieerd als het gedeelte tussen anastomose en strottenhoofd. Merk op dat het mogelijk is de anastomose site enkele weken na de operatie omdat de 11,0 hechtdraad is een resorbeerbaar hechtdraad. </li><li> Plaats het distale gedeelte van RMN in 2% glutaaraldehyde met 0,1 M fosfaat(PH = 7,3) gedurende 2 uur bij 4 ° C. </li><li> Voorzichtig oriënteren de monsters naar coronale secties realiseren. </li><li> Was monsters in fosfaatbuffer. </li><li> Snij in kleinere segmenten (3-4 mm lang) en postfix gedurende 60 min bij kamertemperatuur in 1% cacodylate gebufferde OsO 4 en gedehydrateerd met ethanol. </li><li> Orient monsters siliconen mallen en ingebed in harsen bestaande in Polybed 812, DDSA en MNA, waaraan werd toegevoegd 2% van het gaspedaal BDMA. </li><li> Maak semi-dunne dwarsdoorsneden (1 pm-dik) met een Pyramitome ultramicrotomie System. </li><li> Kleuren met 0,1% toluidineblauw in 1% natriumtetraboraat voor 75 sec bij 70 ° C. </li><li> Analyseer RLN monsters met een telling analysesysteem. Tel het aantal vezels en meet gemyeliniseerde zenuwvezels profielen door bepaling van de buitenste en binnenste begrenzing van de myelineschede. </li></ol></li><li> Transplantatie <ol><li> Bereid cellen voor transplantatie en de transplantatie van de cellen zoals eerder beschrevenin &quot;cellulaire transplantatie&quot; (paragraaf 2.2). </li><li> Analyse </li><li> Euthanaseren het dier met behulp van pentobarbital overdosis. Merk op dat fixatie van de dieren kan worden uitgevoerd met intracardiale injectie van 4% PFA. </li><li> Verwijder ongeveer 2 cm van RLN. Gebruik proximale en distale delen van de RMN. </li><li> Fix RLN monster in vloeibare stikstof. </li><li> WINKEL monsters bij -80 ° C. </li><li> Doorsneden lengterichting behulp cryostaat (10-20 micrometer dik). </li><li> Analyseren monsters onder fluorescentiemicroscoop om GFP positieve cellen te detecteren. Merk op dat anti-GFP antilichaam kan worden gebruikt om fluorescentie-emissie te vergroten en costainings voeren. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Barraud, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+origin+of+olfactory+ensheathing+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neural crest origin of olfactory ensheathing glia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21040-21045 (2010).</li>
<li>Guerout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+gene+expression+profiling+of+olfactory+ensheathing+cells+from+olfactory+bulb+and+olfactory+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Comparative gene expression profiling of olfactory ensheathing cells from olfactory bulb and olfactory mucosa.</a> Glia. 58, 1570-1580 (1002).</li>
<li>Honore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+genetic+profiling+of+subpopulations+of+olfactory+ensheathing+cells+from+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and genetic profiling of subpopulations of olfactory ensheathing cells from the olfactory bulb.</a> Glia. 60, 404-413 (2012).</li>
<li>Franssen, E. H., de Bree, F. M., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+glia%3A+their+contribution+to+primary+olfactory+nervous+system+regeneration+and+their+regenerative+potential+following+transplantation+into+the+injured+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord.</a> Brain Res. Rev. 56, 236-258 (2007).</li>
<li>Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+and+Schwann+cells+differ+in+their+in+vitro+interactions+with+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes.</a> Glia. 32, 214-225 (2000).</li>
<li>Woodhall, E., West, A. K., Chuah, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+olfactory+ensheathing+cells+express+nerve+growth+factor%2C+brain-derived+neurotrophic+factor%2C+glia+cell+line-derived+neurotrophic+factor+and+their+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Mol.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 88, 203-213 (2001).</li>
<li>Dombrowski, M. A., Sasaki, M., Lankford, K. L., Kocsis, J. D., Radtke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+nodal+formation+of+regenerated+peripheral+nerve+fibers+following+transplantation+of+acutely+prepared+olfactory+ensheathing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells.</a> Brain Res. 1125, 1-8 (2006).</li>
<li>Guerout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+olfactory+ensheathing+cells+promotes+axonal+regeneration+and+functional+recovery+of+peripheral+nerve+lesion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Transplantation of olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration and functional recovery of peripheral nerve lesion in rats.</a> Muscle Nerve. 43, 543-551 (2011).</li>
<li>Guntinas-Lichius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+olfactory+ensheathing+cells+stimulates+the+collateral+sprouting+from+axotomized+adult+rat+facial+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons.</a> Exp. Neurol. 172, 70-80 (2001).</li>
<li>Makoukji, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium+enhances+remyelination+of+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Lithium enhances remyelination of peripheral nerves.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109, 3973-3978 (2012).</li>
<li>Guerout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-transplantation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+mucosa+and+bulb+origin+enhances+functional+recovery+after+peripheral+nerve+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Co-transplantation of olfactory ensheathing cells from mucosa and bulb origin enhances functional recovery after peripheral nerve lesion.</a> PloS one. 6, 22816 (2011).</li>
<li>Paviot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+laryngeal+motor+nerve+repair+is+greater+with+bulbar+than+with+mucosal+olfactory+ensheathing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Efficiency of laryngeal motor nerve repair is greater with bulbar than with mucosal olfactory ensheathing cells.</a> Neurobiol. Dis. 41, 688-694 (2011).</li>
<li>Girard, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+nasal+olfactory+stem+cells+from+rodents+or+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Nash, H. H., Borke, R. C., Anders, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+of+purification+for+establishing+primary+cultures+of+ensheathing+cells+from+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb.</a> Glia. 34, 81-87 (2001).</li>
<li>Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin+3+promotes+purification+and+proliferation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+human+nose%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose.</a> Glia. 45, 111-123 (2004).</li>
<li>Paviot, A., Bon-Mardion, N., Duclos, C., Marie, J. P., Guerout, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Although+olfactory+ensheathing+cells+have+remarkable+potential+to+sustain+nerve+regeneration%2C+they+cannot+be+applied+to+a+severe+vagus+nerve+section%2Fresection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Although olfactory ensheathing cells have remarkable potential to sustain nerve regeneration, they cannot be applied to a severe vagus nerve section/resection model.</a> Muscle Nerve. 43, 919-920 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier gepresenteerde technieken maken OECS een bruikbaar model om cellulaire transplantaties studeren in perifere zenuwschade modellen. De celkweek protocol is relatief eenvoudig en kan gemakkelijk worden uitgevoerd. Aan de andere kant, chirurgische ingrepen, met name punt / anastomose van de RLN, vereist ervaring en moeten door gekwalificeerd personeel worden uitgevoerd. De in dit protocol beschreven procedures markeer belangrijke factoren te richten op om de best mogelijke resultaten te ...

Het primaire olfactorische systeem bestaat uit twee afzonderlijke delen, de olfactorische mucosa (OM) in perifere zenuwstelsel en de bulbus olfactorius (OB) in het centrale zenuwstelsel. Het primaire olfactorische systeem wordt gekenmerkt door het vermogen van de primaire olfactorische neuronen (PON) om te hernieuwen hele leven zoogdiersoorten. Dit vermogen wordt mogelijk gemaakt door de aanwezigheid van neurale stamcellen in de OM. PON groei en hergroei van OM tot OB wordt gefaciliteerd door gespecialiseerde gliacellen genoemd olfactorische ensheathing cellen (OECS). OECS zijn neurale lijst cellen die een gunstig micro-omgeving te creëren voor neurogenese van de PON van OM tot OB 1. Daardoor kan OECS worden gevonden in OM en in OB vormen verschillende subpopulaties van cellen 2,3. De verschillende eigenschappen van OECS hebben geleid wetenschappers om ze te gebruiken voor cellulaire transplantaties in verschillende zenuwstelsel laesie paradigma 4. Inderdaad, OECS produceren groeifactoren, verminderen gliale littekens, promote axonale hergroei, en kan vrij vermengen met astrocyten 5,6. De overgrote meerderheid van deze studies zijn gebaseerd op ruggenmergletsel (SCI), weinige daarvan OECS gebruikt na perifere zenuwschade (PNI) 7,8. Hoewel het perifere zenuwstelsel heeft een grote capaciteit om te regenereren na zenuwletsel, compleet secties induceren afwijkende axonale hergroei. Inderdaad, na volledige doorsnijdingen van het gezicht of de terugkerende larynx zenuwen (RMN) ze verkeerd verzonden axonen veroorzaken gespierde cocontractions genoemd synkinesis. Daarom is het van primair belang om een ​​model van PNI voorstellen om niet alleen kwantificeren axonale hergroei maar ook de efficiëntie van de spiersamentrekkingen evalueren. In de literatuur het meest voorkomende model wordt beschreven, is gebaseerd op het gezicht zenuwlaesie 9,10. In dit model worden functionele evaluaties op basis van het herstel van de snorhaar bewegingen 10. Het is echter ingewikkeld om de efficiëntie van de mov tonenements en de gespierde cocontractions verschijnselen discrimineren. We stellen hier een model gebaseerd op een RLN laesie. Dit model maakt de evaluatie van niet alleen axonale hergroei en bewegingen van de stembanden maar ook de efficiëntie en functionaliteit van deze bewegingen na cellulaire transplantaties 11,12. Dit protocol voorziet in een stapsgewijze procedure om de cultuur en de transplantatie OECS van OM en OB in een RLN sectie / anastomose model en dieren te evalueren na de operatie.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>E3521T</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>E3387M</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>1152-8876</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>M3467Y</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>M3513P</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylate</td><td>Merck</td><td>1.03256.0100</td><td></td></tr><tr><td>DDSA</td><td>Biovalley</td><td>00563-450</td><td></td></tr><tr><td>MNA</td><td>Biovalley</td><td>00886-450</td><td></td></tr><tr><td>BDMA</td><td>Biovalley</td><td>00141-100</td><td></td></tr><tr><td>Polybed 812</td><td>Biovalley</td><td>08791-500</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-muis&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>550589</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR</td><td>BD Bioscience</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Muis anti P75</td><td>Chemicon</td><td>MAB 365</td><td></td></tr><tr><td>11.0 Draad</td><td>Ethicon</td><td>FG 2881</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blauw&nbsp;</td><td>Ral Diagnostics</td><td>361590-0025</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sigma</td><td>Sigma 2-16PK</td><td></td></tr><tr><td>Incubator&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminare stromingshaak</td><td>Faster</td><td>BH-EN 2003 S</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Bioscience</td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Videolaryngoscoop</td><td>Karl Storz Endoskope</td><td>Telecam SL NLSC 20212120</td><td></td></tr><tr><td>Acquisitiesysteem</td><td>AD Instruments</td><td>Powerlab systeem</td><td></td></tr><tr><td>Pyramitome Ultramicrotomiesysteem&nbsp;</td><td>Leica</td><td>Ultracut S</td><td></td></tr><tr><td>Beeldanalysesysteem</td><td>Explora Nova</td><td>Mercator</td><td></td></tr></tbody></table>

transplantatie van olfactorische ensheathing cellen tot functioneel herstel evalueer na perifere zenuwschade

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

<html> Olfactorische ensheathing cellen (OECS) zijn neurale lijst cellen die de groei en de hergroei van de primaire olfactorische neuronen mogelijk te maken. Inderdaad, is de primaire olfactorische systeem gekenmerkt door het vermogen om aanleiding te geven tot nieuwe neuronen zelfs bij volwassen dieren. Deze bijzondere vermogen is deels te wijten aan de aanwezigheid van OECS die een gunstig micro-omgeving te creëren voor de neurogenese. Deze eigenschap van OECS is gebruikt voor cellulaire transplantatie zoals bij ruggenmergletsel modellen. Hoewel het perifere zenuwstelsel heeft een grotere capaciteit om te regenereren na zenuwschade dan het centrale zenuwstelsel, compleet secties induceren misrouting tijdens axonale hergroei in het bijzonder na het gezicht van laryngeus doorsnijding. Specifiek, volledige opdeling van de recurrens (RMN) induceert afwijkende axonale hergroei resulteert in synkinesis van de stembanden. In dit specifieke model, hebben we aangetoond dat OECS transplantatie efficiënt verhoogt axonale hergroei. ve_content &quot;&gt; OECS worden gevormd van verschillende subpopulaties aanwezig in zowel de olfactorische mucosa (OM-OECS) en reukbollen (OB-OECS). We presenteren hier een model van cellulaire transplantatie gebaseerd op het gebruik van deze verschillende subpopulaties OECS in een RLN letsel model. Met behulp van dit paradigma, primaire culturen van OB-OECS en OM-OECS werden getransplanteerd in Matrigel na sectie en anastomose van de RLN. Twee maanden na de operatie, we door aanvullende analyses geëvalueerd getransplanteerde dieren op basis van videolaryngoscopy, elektromyografie (EMG) en histologische studies. eerste videolaryngoscopy konden we larynx functies uitwerken, met name spier cocontractions verschijnselen. Vervolgens EMG analyses toonden rijkdom en synchronisatie van spieren activiteiten. Tenslotte histologische studies gebaseerd op toluidine blauw kleuring kon de kwantificering van het aantal en profiel gemyeliniseerde vezels. Alles bij elkaar, beschrijven we hier hoe te isoleren, cultuur, identify en transplantatie OECS van OM en OB na RLN sectie-anastomose en hoe te evalueren en analyseren van de efficiëntie van deze getransplanteerde cellen op axonale hergroei en laryngeale functies.

Illustraties met controle en reinnervated (sectie / geanastomoseerd) dieren zijn gekozen als resultaten kunnen variëren, afhankelijk van de cellulaire transplantaties uitgevoerd (OM, OB of OM + OB). Celcultuur De cellen hechten zich snel aan het kunststof oppervlak en werd gescheiden in evenwijdige banen van cellen die lange of taps, driehoekig, multipolaire of spoelvormige zijn (Figuren 1A en 1B). Na 8 dagen in vitro flowcytometrieana...

Olfactorische ensheathing cellen (OECS) zijn neurale lijst cellen die de groei van de primaire olfactorische neuronen mogelijk te maken. Deze specifieke eigenschap kan worden gebruikt voor cellulaire transplantatie. We presenteren hier een model van cellulaire transplantatie gebaseerd op het gebruik van OECS in een laryngeal zenuwletsel model.

Transplantatie van olfactorische Ensheathing Cellen tot functioneel herstel Evalueer na perifere zenuwschade

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Het algemene doel van deze procedure is het presenteren van een model voor celtransplantatie op basis van het gebruik van olfactorische cellen en scheidcellen in een model van larynxzenuwbeschadiging. Dit wordt bereikt door eerst de nervus laryngeus recurrens door te snijden en een anastomose uit te voeren. Vervolgens worden de olfactorische cellen en scheidcellen, verkregen uit het olfactorische slijmvlies of de bulbi olfactorii, getransplanteerd.Vervolgens worden de dieren twee tot drie maanden na de operatie geëvalueerd via laryngoscopie en elektromyografie. Ten slotte wordt de nervus laryngeus recurrens geïsoleerd voor histologische studies. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen dat olfactorische cellen en schedecellen de axonale hergroei van de nervus laryngeus recurrens en het functionele herstel van de stembanden verbeteren, vastgesteld via laryngoscopie, elektromyografie en histologische metingen.Deze methode kan sleutelvragen beantwoorden op het gebied van perifere zenuwletsels die betrekking hebben op de meting van axonale groei en het vermogen om de functionaliteit van het herstel te kwantificeren. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat herhaalde anastomose van lal-zenuwen microsurgische vaardigheden vereist. Nadat GFP-gelabelde primaire culturen van bulbi olfactorii (OB) en het olfactorisch slijmvlies (OM) zijn gegenereerd zoals beschreven in het geschreven protocol, dient men zich voor de operatie voor te bereiden door alle instrumenten te autoclaveren.Zodra de rat is geanestheseerd door intraperitonele injectie van ketamine en chloorpromazine, dient het sedatieniveau te worden geverifieerd door een knijptest aan de teen uit te voeren. Scheer de operatieve plaats, plaats de rat in rugligging en desinfecteer de huid met afwisselende spoelingen van alcohol en Betadine-oplossing. Stel vervolgens een steriele operatieve omgeving samen en hanteer gedurende de gehele operatie steriele procedures.Gebruik een scalpel om een mediale cervicale cutane incisie van twee centimeter te maken. Maak vervolgens, langs de mediale witte lijn, een verticale incisie van de infrahyoïdspieren door een orthostatische retractor tussen de infrahyoïdspieren te plaatsen. Leg de larynx en vervolgens de nervus laryngeus recurrens of RLN bloot.Knip vervolgens onder een chirurgische microscoop met microschaar de zenuw volledig door ter hoogte van de zevende tracheaalring met één punt van 11 T hechtdraad. Voer een anastomose uit om de larynx te dennerveren vlak voor de transplantatie. Gebruik 0,05%trypsine EDTA om de OB- en OM-cellen uit de schaaltjes te verwijderen.Voeg vervolgens vijf milliliter warm medium toe om de digestie te stoppen, nadat de cellen vijf minuten zijn gecentrifugeerd bij 432 G. Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen en stel de cellulaire concentratie in dit model zo in dat 1,2 tot zes keer 10⁶ cellen in 30 µL D-M-E-M-F 12 in een microcentrifugebuis worden gebruikt. Bereid een ratio van één op twee van cellen ten opzichte van groeifactor en reduced matrigel voor, en plaats dit vlak voor de transplantatie op ijs.Haal de buis uit het ijs en houd deze vast om het mengsel op te warmen. Breng met een pipet de cell-matrigel-oplossing aan op de anastomoseplaats en laat het mengsel zelf assembleren op de beschadigde zenuw zodra het stolt. Gebruik 4-0 hechtingen om de spieren en de huid te sluiten.Plaats de rat in een individuele kooi en houd deze 24 uur lang onder een warmtelamp. Dien gedurende de volgende vijf dagen analgetica toe, ongeveer twee maanden na de operatie en na het toedienen van anesthesie. Voor de ratten zoals eerder in deze video beschreven, gebruik een teenknijptest om de sedatie te bevestigen.Plaats de rat in rugligging voordat een videolaryngoscoop van 30 graden wordt ingebracht. Pas de laryngoscoop aan om het beste zicht op de larynx te verkrijgen, zodat hetzelfde beeld voor elke opname wordt gereproduceerd. Bepaal anatomische oriëntatiepunten zoals de commissura posterior, de rechter stemband waar deze inzet in de apofyse vocalis van de OID en de linker stemband waar deze inzet in de apofyse vocalis van de OID.Registreer de bewegingen van de stembanden door drie sequenties van opeenvolgende maximale abductie en maximale adductie te selecteren. Bepaal voor de analyse van de larynxfunctie de absolute hoekbeweging door het verschil te meten tussen de maximale abductie en maximale adductie van de stembanden. Bepaal de dynamische score door de bewegingsamplitude te meten en de functionele score door synkinesie en paradoxale bewegingen te meten om electromyografie uit te voeren.Plaats een elektrode op de hamstringspier van de rat nadat de larynx en trachea zijn blootgelegd, zoals gedemonstreerd voor de anastomose van de nervus recurrens. Leg het kraakbeen van het schildkraakbeen en ringkraakbeen (cricothyroid cartilage) bloot. Open vervolgens met microschaar het cricothyroid kraakbeen om de mus cricothyroide posterior of PCA-spier bloot te leggen.Plaats een monopolaire naaldelektrode in de spier terwijl het dier onder spontane ventilatie is. Gebruik een acquisitiesysteem om de elektrische spieractiviteit van de PCA-spier te registreren. Analyseer de spieractiviteit op basis van rijkdom en synchronisatie met de ademhaling door een kwalitatieve score van nul tot drie toe te kennen met behulp van de volgende schaal.Nul staat voor een niet-getest spoor zonder toename tijdens de inspiratie. Eén staat voor een geritmeerd spoor waarbij de inspiratie toeneemt, maar het spoor zwak is; twee staat voor een geritmeerd spoor met een rijkere activiteit en drie staat voor een geritmeerd spoor dat zeer rijk is en een interferentiepatroon vormt dat vergelijkbaar is met een maximale intentionele activiteit.Vervolgens, om beschadiging van de RLN door de geringe omvang ervan te voorkomen, legt u de nervus vagus bloot, bevestigt u een elektrode en stimuleert u op deze locatie. Registreer de latentie en de potentiaalduur in de PCA-spier. Euthanaseer ten slotte het dier met een overdosis pentobarbital onder een microscoop, lokaliseer de anastomosis, en hecht en verwijder de distale stomp van de RLN tussen de anastomosis en de larynx.Voer de histologische analyse uit volgens het hier getoonde tekstprotocol na transplantatie van cellen uit primaire culturen van de reukschutsel, het slijmvlies en de bulbi olfactorii; dit zijn voorbeelden van EMG-sporen verkregen in de m. pectoralis caudalis tijdens de ademhaling. Dieren uit de controlegroep vertoonden een rijke elektrische spieractiviteit met een toename tijdens de inspiratie, wat niet aanwezig was in de Rerated-groep. In deze figuur tonen histologische analyses van de RLN via toluidineblauwkleuring typische vezelprofielen van normale, geherinnerveerde en getransplanteerde dieren.Deze meting maakt kwantificering mogelijk van het aantal gemyeliniseerde vezels, de gemiddelde grootte van de vezels en de gemiddelde dikte van de myeline, zoals hier wordt getoond. Om de histologische analyses te voltooien, werd de tracking van GFP-positieve cellen uitgevoerd na intranerveuze transplantatie in de nervus ischiadicus.Deze locatie werd gekozen in plaats van de RLN, omdat de geringe omvang van de RLN intranerveuze transplantatie verhindert. Een anastomose van de nervus recurrens kan in 15 minuten worden voltooid als deze na ontwikkeling correct wordt uitgevoerd. Deze technieken hebben de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van perifere zenuwletsels om het gebruik van cellulaire transplantatie in een ratmodel te verkennen.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het transplanteren van cellen in het model voor recidiverend zenuwletsel en het evalueren van het functionele herstel van de stembanden via elektromyografie, een laboratoriumendoscopie en histologische metingen.

transplantation-olfactory-ensheathing-cells-to-evaluate-functional

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Traumatisch letsel aan het ruggenmerg verstoort de communicatie met de hersenen. Voor het herstellen van verloren connectiviteit we gebruik maken van een perifere zenuw graft om een ​​substraat te bieden voor het regenereren van vezels in combinatie met neurotrofe factoren en matrix-modulerende remmende enzymen om moleculen te verwijderen om lange afstand groei te bevorderen.

De combinatie van Peripheral Nerve enten en Matrix Modulation aan de benadeelde Rat Spinal Cord Repair

We beschrijven hier een methode voor biopsying olfactorische slijmvlies van de rat en mens neusholten. Deze biopten kunnen worden gebruikt voor zowel het identificeren van moleculaire afwijkingen in de hersenen ziekten of isoleren van multipotente volwassen stamcellen die gebruikt kunnen worden voor mobiele transplantatie in diermodellen van de hersenen trauma / ziekte.

Isoleren neus Olfactorische stamcellen van Knaagdieren of mensen

This video demonstrates the procedure to isolate retinal ganglion neurons (RGNs) from a rat's retina and coculture them with olfactory ensheathing glia (OEG) cells. This method allows for studying the neuro-regenerative potential of OEGs after neural injury.

Coculturing of Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia

Source: Portela-Lomba, M., et. al. Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates imaging and quantification of axonal regeneration in axotomized rat retinal ganglion neurons (RGNs) co-cultured with immortalized human olfactory ensheathing glia cells. RGNs are immunolabeled, with red somas and green axons. Images were captured using an epifluorescence microscope,...

Imaging and Quantification of Axonal Regeneration in Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons

Het analyseren van de fysiologische eigenschappen van olfactorische sensorische neuronen kent nog steeds technische beperkingen. Hier registreren we ze door middel van perforated patch-clamp in een intacte voorbereiding van het olfactorische epitheel in gene-targeted muizen. Deze techniek maakt de karakterisering mogelijk van membraaneigenschappen en reacties op specifieke liganden van neuronen die gedefinieerde olfactorische receptoren tot expressie brengen.

Geperforeerde Patch-clamp-opname van de muis olfactorische sensorische neuronen in Intact neuroepithelium: functionele analyse van neuronen uiten van een geïdentificeerd Odorant Receptor

Dit artikel beschrijft een techniek om het invoegen van een holle buis tussen de stronken van de ruggenmerg na volledige transect en vullen met cellen van Schwann (gcv) en injecteerbare kelder membraan matrix bevorderen van axon regeneratie over de kloof te overbruggen.

Transplantatie van Schwann cellen binnen PVDF-TrFE Conduits verbeelde Rat ruggenmerg stronken ter bevordering van de regeneratie van het Axon over de kloof overbruggen

Dit protocol presenteert een robuust, reproduceerbaar model van vascularized composiet allotransplant (VCA) gericht op gelijktijdige studie van immunologie en functioneel herstel. De tijd geïnvesteerd in zorgvuldige techniek in een rechter mid-dij achterpoot orthotopische transplantatie met de hand genaaid vasculaire anastomoses en neurale coaptatie levert de mogelijkheid om functioneel herstel te bestuderen.

Het nemen van de volgende stap: een neurale coaptatie orthotopische achterste ledemaat transplantatie model om functioneel herstel in Rat maximaliseren

We presenteren een in vitro model om olfactorisch verwarmend glia (OEG) neuroregeneratief vermogen te beoordelen, na neuraal letsel. Het is gebaseerd op een cocultuur van axotomized volwassen retinale ganglion neuronen (RGN) op OEG monolagen en daaropvolgende studie van axonale regeneratie, door het analyseren van RGN axonale en somatodendritische markers.

Cocultuur van Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons met Olfactory Ensheathing Glia, als een In Vitro Model van Volwassen Axonale Regeneratie

In dit artikel bieden we een reproduceerbare methode om organotypische plakjes ruggenmerg te genereren en te onderhouden die zijn getransplanteerd met neurale stamcellen als een ex vivo-model voor het testen van cellulaire vervangingstherapieën.

Organotypische plakcultuur van het ruggenmerg van muizen als platform voor het valideren van celtransplantatie bij ruggenmergletsel

Ganglia (DRG) zijn structuren die de sensorische neuronen van het perifere zenuwstelsel. Wanneer gedissocieerd kunnen zij samen gekweekt met SC-achtige adipose afgeleide stamcellen (ASC), die een waardevol model voor in vitro zenuwregeneratie en myelinisatie bestuderen nabootsen van de in vivo omgeving bij de verwonding.

Achterwortelganglia Neuronen en Gedifferentieerde Adipose-afgeleide stamcellen: Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultuur Model naar regeneratie van perifere zenuwen Bestudeer

Leer hoe olfactorische ensheathing cellen worden getransplanteerd voor functioneel herstel na perifere zenuwschade. Deze methode evalueert axonale groei en functionaliteit via laryngoscopie en elektromyografie.

Transplantatie van olfactorische Ensheathing Cellen tot functioneel herstel Evalueer na perifere zenuwschade

Meer video's verkennen