Name: Gebruik van Afbeelding Cytometry voor kwantificering van pathogene schimmels in associatie met gastheercellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Leer beeldcytometrie voor kwantificering van pathogene schimmels in associatie met gastheercellen. Deze methode biedt een snel alternatief voor traditionele CFU-tellingen en versnelt onderzoek naar fungale pathogenese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Infectie van macrofagen met H. capsulatum, C. albicans <ol><li> 16 uur voorafgaand aan infectie, zaad macrofagen op gewenste dichtheid in 24-well platen. In dit protocol werd een dichtheid van 3,0 x 10 5 cellen / putje gebruikt. </li><li> Voeg schimmelcellen in log-fase groei op een gewenste multipliciteit van infectie (MOI). Dit protocol is geschikt voor een scala van MOI (0,2-5,0). Voor de infectie van RAW264.7 macrofagen met H. capsulatum, gebruikten we een MOI van 0,2. </li><li> Na 1,5 uur om voor fagocytose, macrofagen driemaal wassen met PBS om extracellulaire schimmels verwijderen. </li><li> Incubeer gewenste aantal uren voorafgaand aan de analyse van het monster. Bij lage MOI (0.2 in ons experiment), geïnfecteerde macrofaag cellen levensvatbaar blijven voor meerdere dagen, en monsters kunnen worden geanalyseerd ongeveer elke 12-24 uur. </li></ol> 2. Macrofaag Lysis <ol><li> Tegen schimmels uit macrofaagcellen bevrijden, verwijder media, was 3 keer met PBS, envoeg 0,5 ml steriel water. Onder deze omstandigheden zal macrofagen lyseren en schimmelcellen blijven intact. </li><li> Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Overdragen lysate tot steriele buis, houd op ijs. </li><li> Breng 20 pl lysaat naar een afzonderlijke buis en voeg 20 ul AO / PI oplossing. Ga dan naar stap 5: &quot;Monstervoorbereiding voor Beeld cytometrische analyse&quot; </li></ol> 3. CFU Plating <ol><li> Voer tienvoudige verdunning van lysaten (uit stap 2.3) in de media. </li><li> Plaat 100 ul van elke verdunning, in tweevoud, op HMM-agarose platen. Incubeer de platen in een bevochtigde kamer bij 37 ° C met 5% CO2 voor 7-8 dagen. </li><li> Handmatig tellen kolonies op platen tonen minimaal 100 en maximaal 1000 verschillende kolonies. </li></ol> 4. Visualisatie van Schimmels binnen Levende Macrofagen <ol><li> Om levende macrofagen verzamelen, wassen cellen 3 maal met PBS. Voeg 0,5 ml PBS en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C.</li><li> Om macrofagen uit weefselkweek putten te verwijderen, voorzichtig pipet op en neer meerdere malen. Vloeistof overbrengen in steriele buis, houd op ijs. </li><li> Breng 20 ul monster op een aparte buis, voeg 20 ul AO / PI-oplossing. Ga dan naar stap 5: &quot;Monstervoorbereiding voor Beeld cytometrische analyse&quot;. </li></ol> 5. Monstervoorbereiding voor Beeld cytometrieanalyse <ol><li> Pipetteer de doelmonster grondig en vervolgens de overdracht 20 ul van het monster in de wegwerp cel telkamer. </li><li> Laat de cellen om zich te vestigen in de kamer voor 30 sec. </li><li> Steek telkamer in de afbeelding cytometer. </li></ol> 6. Cellometer Instrument-setup <ol><li> Plaats de Fluorescentie Optics Modules: VB-535-402-en VB-660-502 in het systeem en zorg ervoor dat ze zijn opgesloten in zijn plaats. <ol><li> VB-535-402 (excitatie bij 475 nm, emissie bij 535 nm) wordt gebruikt voor acridine oranje en GFP detectie. </li><li> VB-660-502 (excitatiop bij 540 nm, emissie bij 660 nm) wordt gebruikt voor propidium iodide detectie. </li></ol></li><li> Zet de afbeelding cytometer en open de bijbehorende software. </li></ol> 7. Cellometer software-installatie <ol><li> Selecteer de preset &quot;Assay Type &#39;en&#39; Cell Type&quot; in de Assay Dropdown Menu. <ol><li> Voor levensvatbaarheid, wordt de test geoptimaliseerd voor acridine oranje en propidiumjodide detectie. </li><li> Voor detectie van Candida albicans-infectie wordt de assay geoptimaliseerd voor GFP detectie. </li></ol></li><li> Selecteer &quot;Opties&quot; op de bovenkant en klik op &quot;Take achtergrondafbeelding&quot;, en laat de operatie te voltooien. </li><li> Klik op &quot;Preview Bright-Field Schilderij&quot;. </li></ol> 8. Image Acquisition Procedure <ol><li> Plaats de voorbereide monsterkamer in de afbeelding cytometer. </li><li> Gebruik de scherpstelknop en scherp. </li><li> Eenmaal in focus, klik op &quot;Graaf&quot;, en laat het beeld overname operatie te voltooien. </li><li> Remove de wegwerp telkamer en bergen. </li></ol> 9. Image Data Analysis <ol><li> Concentratie en meting levensvatbaarheid <ol><li> Zodra het tellen is voltooid, worden de concentratie en levensvatbaarheid van de doelcellen weergegeven in de resultaten pagina. </li><li> Klik op &quot;Exporteren&quot; om de gegevens te exporteren naar FCS Express 4 voor celpopulatie analyse van GFP in de Candida albicans infectie experiment. </li></ol></li><li> FCS Express analyse van Candida albicans-geïnfecteerde cellen <ol><li> Importeer de &quot;NXDAT.&quot; Bestand in FCS Express 4 en plot de resultaten in een fluorescentie histogram. </li><li> Solliciteer celpopulatie poort naar het histogram aan de bevolking percentages van Candida albicans-geïnfecteerde cellen te bepalen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Worsham, P. L., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+plating+of+Histoplasma+capsulatum+without+addition+of+conditioned+medium+or+siderophores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Vet.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores.</a> J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).</li>
<li>Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).</li>
<li>Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+delivery+of+yeast+cells+as+an+explanation+for+reduced+plating+efficiency+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans.</a> Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).</li>
<li>Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantitation+of+yeast%3A+a+novel+technique+for+use+in+animal+model+work+and+in+vitro+immunologic+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays.</a> Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).</li>
<li>Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+antifungal+activity+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).</li>
<li>Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).</li>
<li>Chan, L. L. -Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+detection+method+for+apoptosis+and+necrosis+measurement+using+the+Cellometer+imaging+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry.</a> Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).</li>
<li>Chan, L. L. -Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+image-based+cytometry+method+for+autophagy+detection+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells.</a> Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).</li>
<li>Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Image-based+Cytometry+for+Comparison+of+Fluorescent+Viability+Staining+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods.</a> Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).</li>
<li>Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+kinetic+measurements+of+rare+cell+proliferation+using+Cellometer+image-based+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).</li>
<li>Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellometer+Vision+as+an+alternative+to+flow+cytometry+for+cell+cycle+analysis%2C+mitochondrial+potential%2C+and+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping.</a> Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).</li>
<li>Hull, C. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mating+type-like+locus+in+the+asexual+pathogenic+yeast+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans.</a> Science. 285, 1271-1275 (1999).</li>
<li>Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Quantification+of+Pathogenic+Fungi+by+Cellometer+Image-Based+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Micro.+Meth%22%5BJournal%5D)">Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry.</a> J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).</li>
<li>Nguyen, V. Q., Sil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+switch+to+the+pathogenic+yeast+form+of+Histoplasma+capsulatum+requires+Ryp1%2C+a+conserved+transcriptional+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).</li>
<li>Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+susceptibility+testing+of+fungi+by+flow+cytometry+using+vital+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).</li>
</ol>

De auteurs Leo Li-Ying Chan en Benjamin Paradis zijn medewerkers van Nexcelom Bioscience LLC.

Beeldcytometrie kan de gebruiker hoge kwaliteit beelden vast te leggen en, met behulp van gespecialiseerde software voert snelle kwantificering van cellen. Een mogelijke uitdaging voor de vaststelling van beeldcytometrie op het gebied van microbiële pathogenese is dat de microben te tellen aanwezig in een gemengde populatie van cellen, waaronder zoogdierlijke gastheercellen. Hier tonen wij dat beeldcytometrie kan worden gebruikt voor de kwantificering van levensvatbare pathogène gist in macrofagen in vitro infe...

Studies van pathogene schimmels in samenwerking met hun gastheren en / of gastheercellen vereisen vaak kwantificering van levensvatbare schimmels cellen over een tijdsverloop of onder verschillende omstandigheden infectie. Bepalen van kolonie vormende eenheden (CFU) is de standaard methode waarbij het aantal levensvatbare schimmelcellen is gemeten, maar deze techniek heeft een aantal nadelen en beperkingen. Ten eerste, veel schimmelsoorten groeien langzaam. Groei van zichtbare kolonies op vaste media kan 1-2 weken duren, aanzienlijk vertragen van het tempo van het onderzoek. Tweede, manipulatie van monsters tijdens CFU plating is een moeizaam proces, aangezien verschillende verdunningen moeten worden uitgeplaat op een aftelbaar aantal kolonies garanderen. Ten derde, het aantal CFU doorgaans lager is dan het aantal levensvatbare organismen uitgeplaat omdat de plating efficiëntie ruim onder 100%. Bijvoorbeeld kan plateren efficiëntie voor de dimorfe schimmel pathogeen Histoplasma capsulatum oplopen tot 90%, maar gewoonlijk zo laag als30% en zelfs lager (10%) voor de verbonden schimmel dimorph Paracoccidioides brasiliensis 1, 2. Plating efficiency voor Candida albicans is ook onderhevig aan variabiliteit 3. Tenslotte CFU analyse slechts verantwoordelijk voor levende en actief delende cellen kunnen vormen van de groei op vaste media, terwijl in veel situaties, zou het nuttig zijn om de aanwezigheid en concentratie van dode en / of metabolisch inactieve cellen te bepalen. Eerder heeft flowcytometrische werkwijzen voor kwantificering van verscheidene pathogène schimmelsoorten beschreven 4-6. Echter, vanwege de bioveiligheid insluiting kwesties die met behulp van bioveiligheidsniveau 2 (BSL2) of BSL3-niveau ziekteverwekkers op gedeelde flowcytometers, goedkeuring van deze techniek is beperkt. Zoals flowcytometrie, beeldcytometrie is een gevoelige en snelle methode van cel kwantificering. Echter, beeldcytometrie worden uitgevoerd bij een fractie van de kosten met vergelijkbare resultaten 7 -11. We beschrijven hier werkwijzen voor het uitvoeren beeldcytometrie van pathogene schimmels in samenhang met gastheercellen. We tonen onze methoden met behulp van twee menselijke pathogene schimmels: Histoplasma capsulatum en Candida albicans H.. capsulatum is een dimorphic schimmelziekteverwekker dat respiratoire aandoeningen veroorzaakt, bij de mens, het groeit als gist en repliceert binnen alveolaire macrofagen Candida albicans is een humane commensale soorten die soms veroorzaakt candidiasis.. We laten zien dat beeldcytometrie maakt een snelle kwantificering van deze gisten, samen met visualisatie mogelijkheden.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>AO/PI Solution</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CSK-0102</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Counting Chamber</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-SD100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Cellometer Vision</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Vision Software</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gebruik van afbeelding cytometry voor kwantificering van pathogene schimmels in associatie met gastheercellen

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies van de cellulaire mechanismen van de pathogenese van pathogene gisten zoals Candida albicans, Histoplasma capsulatum, en Cryptococcus neoformans algemeen gebruik infectie van zoogdierlijke gastheren of gastheercellen (bijvoorbeeld macrofagen), gevolgd door gist kwantificering middels kolonievormende eenheid analyse of flowcytometrie. Terwijl kolonievormende eenheid opsomming is de meest gebruikte methode op het, deze techniek heeft nadelen en beperkingen, waaronder trage groei van sommige schimmelsoorten op vaste media en lage en / of variabele plating efficiëntie, hetgeen vooral van belang bij het vergelijken van de groei van wild-type en mutante stammen. Flowcytometrie kan snelle kwantitatieve informatie over de levensvatbaarheid van gist te voorzien, echter de goedkeuring van flowcytometrische detectie van pathogene gisten is beperkt tot een aantal praktische redenen, waaronder de hoge kosten en bioveiligheid overwegingen. Hier laten we zien een beeld-gebaseerdecytometrische methode met behulp van de Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) voor de kwantificering van levensvatbare pathogene gisten in co-cultuur met macrofagen. Onze studies richten zich op de opsporing van twee menselijke pathogene schimmels: Histoplasma capsulatum en Candida albicans H.. capsulatum koloniseert alveolaire macrofagen door repliceren binnen de macrofaag phagosome, en hier, we kwantitatief de groei van H. te beoordelen capsulatum gisten in RAW 264,7 macrofagen met acridine oranje / propidiumjodide kleuring in combinatie met beeldcytometrie. Onze methode trouw recapituleert groei trends zoals gemeten volgens de traditionele kolonievormende eenheid opsomming, maar met aanzienlijk verhoogde gevoeligheid. Daarnaast hebben we direct beoordelen infectie van levende macrofagen met een GFP-expressie stam van C. albicans. Onze methodologie biedt een snelle, accurate en economische middelen voor detectie en kwantificering van belangrijke menselijke schimmels in associatie with gastheercellen.

We gebruikten de Cellometer Vision afbeelding cytometer om de groei te volgen van H. capsulatum in macrofaagcellen. RAW 264.7 cellen werden geïnfecteerd met H. capsulatum gistcellen en op verschillende tijdstippen werden monsters onderworpen aan AO / PI kleuring gevolgd door image-based cytometrische analyse. Daarnaast werden monsters geanalyseerd door traditionele CFU opsomming. Op elk tijdstip werden monsters geïncubeerd in water om macrofagen te lyseren en de bevrijde gistcellen werden geïdentificee...

Hier laten we zien hoe beeldcytometrie kan worden gebruikt voor kwantificering van pathogene schimmels in samenhang met gastheercellen in kweek. Deze techniek kan worden gebruikt als alternatief voor CFU opsomming.

Gebruik van Afbeelding Cytometry voor kwantificering van pathogene schimmels in associatie met gastheercellen

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Het algemene doel van deze procedure is om pathogene gisten in associatie met gastcellen te kwantificeren zonder kolonievormende eenheden uit te platen. Infecteer eerst de macrofaagcellen met H capsulation- of C albicans-gistcellen en kleur de geïnfecteerde macrofaagcellen met acridine orange en propidiumjodide om levensvatbare gistcellen te markeren. Gebruik vervolgens een imaging-cytometer om een reeks beelden vast te leggen en analyseer de grootte- en vormparameters om de gistcellen nauwkeurig te tellen.Resultaten van beeldcytometrie kunnen effectief worden gebruikt om pathogene gisten in associatie met gastheercellen te kwantificeren. Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methode tijdens onderzoek naar fungale pathogenese, waarbij ik herhaaldelijk kolonievormende eenheden moest uitplaten en tellen voor de kwantificering van de pathogene schimmel Histoplasma capsule. Het belangrijkste voordeel van beeldcytometrie ten opzichte van de standaardmethode van CFU-enumeratie is de verhoogde snelheid, omdat het de arbeids- en tijdintensieve stappen van het uitplaten, incuberen en tellen van meerdere seriële CFU-verdunningen elimineert bij het vergelijken van de groei van wild-type en mutante stammen binnen gastheercellen.Deze methode elimineert de potentiële bias die ontstaat door verschillen in het vermogen om kwalitatieve groei op vaste media te initiëren. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode uitdagingen ervaren bij de beeldcytometrie, de instrumentatie en de software.Begin de procedure door de macrofagen te kweken bij de gewenste dichtheid. Voeg in 24-wells platen de schimmelcellen in de logaritmische groeifase toe en incubeer deze vervolgens gedurende 90 minuten om fagocytose mogelijk te maken. Was daarna de macrofagen drie keer met PBS om de extracellulaire schimmels te verwijderen. Incubeer gedurende de experimenteel gedefinieerde tijdspunten voorafgaand aan de monsteranalyse; bij een lage multipliciteit van infectie blijven de geïnfecteerde macrofagen gedurende enkele dagen levensvatbaar en kunnen monsters ongeveer elke 12 tot 24 uur worden geanalyseerd.Voeg na drie wasbeurten met PBS 0,5 milliliters steriel water toe aan de geïnfecteerde macrofaagcellen. Incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur om de schimmels uit de macrofaagcellen te laten ontsnappen. Oogst vervolgens het lysaat in een steriele buis en bewaar dit op ijs.Breng 20 µL van het lysaat over naar een aparte buis. Voeg 20 µL aniline orange propidiumjodide-oplossing toe voor onmiddellijke image cytometrische analyse. Voer een tienvoudige verdunning van de lysaten uit in medium.Plate vervolgens 100 µL van elke verdunning in dubbloex op HMM aros-platen. Incubeer de platen in een bevochtigingskamer bij 37 °C met 5% CO2 gedurende zeven tot acht dagen.Tel handmatig de kolonies op de platen, waarbij een minimum van 100 en een maximum van 1000 afzonderlijke kolonies worden weergegeven. Om de levende macrofagen te verzamelen, worden de cellen drie keer gewassen met PBS. Voeg vervolgens 0,5 milliliters PBS toe en incubeer gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.Verwijder de macrofagen uit de weefselkweekputjes door voorzichtig te pipetteren. Breng de vloeistof over naar een steriele buis en bewaar deze op ijs. Om het accelerometrie-instrument in te stellen, plaatst u de fluorescentie-optica modules in het systeem en controleert u of deze stevig zijn vergrendeld.Schakel de beeldcytometer in via het assay-vervolgkeuzemenu van de software. Selecteer het vooraf ingestelde assay-type en celtype voor levensvatbaarheid. De assay is geoptimaliseerd voor de detectie van acridine orange en propidiumjodide om een infectie met Candida albicans aan te tonen.De assay is geoptimaliseerd voor GFP-detectie. Open nu het tabblad opties en klik op 'take background image'. Nadat de bewerking is voltooid, klikt u op 'preview brightfield image' voor de A OPI-viabiliteitsmeting. Meng 20 µL monster met 20 µL A OPI en pipetteer dit in de telkamer voor de infectiegraad van Candida albicans.Meng het monster goed en pipetteer het direct in de telkamer. Nadat de cellen in de kamer zijn bezonken, plaatst u de telkamer in de beeldcytometer voor beeldacquisitie. Stel het monster scherp en klik vervolgens op tellen.Wanneer de beeldacquisitie is voltooid, verwijdert u de wegwerptelkamer en voert u deze op de juiste wijze af. Voor een A OPI-meting worden de concentratie- en levensvatbaarheidsresultaten weergegeven op de pagina met telresultaten om de infectiegraad van candida albicans te bepalen. Nadat de telresultaten zijn verkregen, klikt u op exporteren.Stuur de gegevens vervolgens naar FCS express four voor de analyse van de celpopulatie van GFP. Importeer in FCS express het gegevensbestand en zet de resultaten uit in een fluorescentiehistogram. Pas daarna een gate voor de celpopulatie toe op het histogram om de populatiepercentages van met candida albicans geïnfecteerde cellen te bepalen.Dit experiment monitort de groei van macrofaagcellen die zijn geïnfecteerd met hcaps Lotum-gist op vastgestelde tijdspunten. Monsters worden gekleurd en geanalyseerd via image-based cytometry. De vrijgekomen gistcellen uit de geïnfecteerde macrofagen worden geïdentificeerd met de Soter vision-software.Hier is het absolute aantal gedetecteerde levende gisten groter dan het aantal gisten dat in staat is om koloniën te vormen op een vast medium. Deze gegevens benadrukken de aanwezigheid van aanzienlijke aantallen levensvatbare, maar niet kweekbare cellen. Deze uit beenmerg afgeleide macrofagen werden geïnfecteerd met C. albicans gistcellen die groen fluorescent eiwit tot expressie brachten onder controle van de ADH1-promotor.Multipliciteiten van infectie variërend van 0,1 tot 10 resulteerden in incrementele toenames van de GFP-intensiteit binnen geïnfecteerde macrofagen, evenals in het totale percentage geïnfecteerde macrofagen. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in slechts enkele minuten per monster worden uitgevoerd, mits correct uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het belangrijk om de parameters zo in te stellen dat alleen schimmelcellen en geen gastheercellen worden geteld.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u beeldcytometrie kunt gebruiken om pathogene gisten in associatie met gastheercellen te kwantificeren. Vergeet niet dat werken met pathogene schimmels uiterst gevaarlijk kan zijn; draag daarom persoonlijke beschermingsmiddelen en volg de juiste procedures voor de afvoer van biologisch gevaarlijk afval.

use-image-cytometry-for-quantification-pathogenic-fungi-association

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates a method for quantifying the phagocytosis of FITC-labeled pathogenic fungal spores by human leukocytes. Phagocytosed spores are discerned from cell-adherent spores through counterstaining, followed by flow cytometric analysis.

Quantitative Flow Cytometric Measurement of Fungal Spore Phagocytosis by Human Phagocytes

Hier beschrijven we een fenotypische test die van toepassing is op de high-throughput/high-content schermen van small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemische verbinding en Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. Deze methode is gebaseerd op de detectie van fluorescerend gelabelde Mycobacterium tuberculosis in fluorescerend gelabelde gastheercel met behulp van geautomatiseerde confocale microscopie.

Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud

Hier beschrijven we een protocol om antifungale activiteit van primaire menselijke immuuncellen te beoordelen in real-time met behulp van fluorescente Aspergillus reporter conidia in combinatie met live-cell video microscopie en flowcytometrie. Gegenereerde data inzicht in gastheer Aspergillus cel-interacties zoals fungicide werking, fagocytose, celmigratie remming van de schimmelgroei.

Live-Imaging van antischimmelactiviteit door Human Primary neutrofielen en monocyten in reactie op<em&gt; A. fumigatus</em

Hier beschrijven we een protocol om te bepalen van pulmonaire schimmel last in muizen met invasieve aspergillose door kwantificering van Gomori van gemodificeerde methanamine zilver kleuring in histologische secties. Gebruik van deze methode resulteerde in vergelijkbare resultaten met minder dieren in vergelijking met de beoordeling van schimmel last van kwantitatieve PCR van longkanker schimmel DNA.

Histologische kwantificering te bepalen van de schimmel last long in experimentele aspergillose

Dit papier is een protocol voor de voorbereiding van een co-cultuur van crypto Kokken cellen en eencellige die wordt bestudeerd met behulp van stilstaand, fluorescerende beelden en hoge-resolutie transmissie elektronen microscoop beelden. Hier wordt geïllustreerd hoe kwantitatieve gegevens dergelijke kwalitatieve informatie kunnen aanvullen.

Aanvullend gebruik van microscopische technieken en fluorescentie lezen in het bestuderen van interacties Cryptococcus-amoeba

We beschrijven een protocol met behulp van fluorescentie in situ hybridisatie (vissen) om meerdere herpes virale Rna's binnen lytisch geïnfecteerde menselijke cellen te visualiseren, hetzij in suspensie of aanhanger. Dit protocol omvat de kwantificering van fluorescentie die een nucleocytoplasmische verhouding produceert en kan worden uitgebreid voor gelijktijdige visualisatie van gastheer en virale eiwitten met immunofluorescentie (IF).

Kwantitatieve fluorescentie in situ-hybridisatie (vis) en immunofluorescentie (indien) van specifieke genproducten in KSHV-geïnfecteerde cellen

Het doel van dit protocol is het visualiseren van Candida albicans celvorm en lokalisatie in het maagdarmkanaal van zoogdieren.

Visualisatie van Candida albicans in de Murine gastro-intestinale tractus met behulp van fluorescerende in situ hybridisatie

Dit protocol biedt een snelle en betrouwbare methode voor het kwantificeren van de fagocytose van Aspergillus fumigatus conidiën door humane primaire fagocyten met behulp van Flowcytometrie en om de fagocytose van conidiën te onderscheiden van de loutere hechting op leukocyten.

Meten van fagocytose van Aspergillus fumigatus conidia door menselijke leukocyten met behulp van Flowcytometrie

Vitale fluorescerende kleurstoffen zijn essentiële hulpmiddelen voor Live-celbeeldvormings analyses in moderne schimmel celbiologie. Dit papier Details de toepassing van gevestigde en minder bekende fluorescerende kleurstoffen voor het volgen van plasma membraan dynamiek, Endo-/exocytose en celwand morfogenese in filamenteuze schimmels.

Toepassing van selectieve fluorescerende kleurstoffen voor membraan-en celwand voor het beeldvorming van filamenteuze schimmels in levende cellen

Hier presenteren we een protocol om het samenspel tussen gastheer en ziekteverwekker te profileren tijdens infectie door op massaspectrometrie gebaseerde proteomics. Dit protocol maakt gebruik van labelvrije kwantificering om veranderingen in eiwitrijkdom van zowel gastheer (bijv. macrofagen) als ziekteverwekker (bijv. Cryptococcus neoformans)in één experiment te meten.

Labelvrije kwantitatieve proteomics workflow voor discovery-driven host-pathogen interacties

We presenteren een methode, die gebruik maakt van een generaliseerbare gebiedsgebaseerde beeldanalysebenadering om celtellingen te identificeren. Analyse van verschillende celpopulaties maakte gebruik van de significante celhoogte en structuurverschillen tussen verschillende celtypen binnen een adaptief algoritme.

Gebiedsgebaseerd beeldanalysealgoritme voor kwantificering van macrofaag-fibroblastcoculturen

Leer beeldcytometrie voor kwantificering van pathogene schimmels in associatie met gastheercellen. Deze methode biedt een snel alternatief voor traditionele CFU-tellingen en versnelt onderzoek naar fungale pathogenese.

Gebruik van Afbeelding Cytometry voor kwantificering van pathogene schimmels in associatie met gastheercellen

Meer video's verkennen