Gebruik van Afbeelding Cytometry voor kwantificering van pathogene schimmels in associatie met gastheercellen
19 juni 2013
Hier laten we zien hoe beeldcytometrie kan worden gebruikt voor kwantificering van pathogene schimmels in samenhang met gastheercellen in kweek. Deze techniek kan worden gebruikt als alternatief voor CFU opsomming.
Het algemene doel van deze procedure is om pathogene gisten te kwantificeren in associatie met gastheercellen zonder het plateren van kolonievormingseenheden. Infecteer eerst de macrofaagcellen met H capsulering of C albicans-gistcellen, kleuren de geïnfecteerde macrofaagcellen met aine oranje en propidiumjodide om levensvatbare gistcellen te markeren. Gebruik vervolgens een beeldcytometer om een reeks afbeeldingen vast te leggen en analyseer de grootte- en vormparameters om de gistcellen nauwkeurig te tellen.
Resultaten van beeldcytometrie kunnen effectief worden gebruikt om pathogene gisten in associatie met gastheercellen te kwantificeren. Ik kreeg het idee voor deze methode tijdens onderzoek op het gebied van schimmelpathogenese, waarbij ik herhaaldelijk kolonievormingseenheden moest plateren en tellen voor kwantificering van de pathogene schimmel Histoplasma capsule. Het belangrijkste voordeel van beeldcytometrie ten opzichte van de standaardmethode van CFU-telling is de hogere snelheid, omdat het de arbeids- en tijdrovende stappen van het plateren, incuberen en tellen van meerdere seriële verdunningen van CFU elimineert. Bij het vergelijken van de groei van wildtype- en mutanteststam binnen gastheercellen.
Deze methode elimineert de potentiële bias die wordt geïntroduceerd door verschillende vermogens om kwaliteitsgroei op vaste media te initiëren. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode uitgedaagd worden door de beeldcytometrie. Instrumentatie en software.
Begin de procedure door de macrofagen te kweken bij de gewenste dichtheid. Voeg in 24-wells platen de schimmelcellen in logfase groei toe en incubeer vervolgens gedurende 90 minuten om fagocytose mogelijk te maken. Was vervolgens de macrofagen drie keer met PBS om de extracellulaire schimmels te verwijderen en incubeer voor de experimenteel gedefinieerde tijdstippen voorafgaand aan monsteranalyse bij lage multipliciteit van infectie blijven de geïnfecteerde macrofaagcellen enkele dagen levensvatbaar en kunnen monsters ongeveer elke 12 tot 24 uur worden geanalyseerd.
Na drie wasbeurten met PBS, voeg 0,5 milliliter steriele water toe aan de geïnfecteerde macrofaagcellen. Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om de schimmels uit de macrofaagcellen te bevrijden. Verzamel vervolgens het lysate in een steriele buis en bewaar op ijs.
Breng 20 microliter van het lysate over naar een afzonderlijke buis. Voeg 20 microliter aine oranje propidiumjodide-oplossing toe voor onmiddellijke beeldcytometrische analyse. Voer een tienvoudige verdunning van de lysaten in media uit.
Plateer vervolgens 100 microliter van elke verdunning in duplicaat. Op HMM aros platen. Bewaar de platen gedurende zeven tot acht dagen in een bevochtigde kamer bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.
Tel handmatig kolonies op de platen, met een minimum van 100 en een maximum van 1000 verschillende kolonies. Om de levende macrofagen te verzamelen, was de cellen drie keer met PBS. Voeg vervolgens 0,5 milliliter PBS toe en incubeer gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.
Verwijder de macrofagen uit de wel van weefselcultuur door voorzichtig te pipetteren. Breng de vloeistof over in een steriele buis en bewaar op ijs. Om het versnellerinstrument in te stellen, plaats de fluorescentie-opticamodules in het systeem en zorg ervoor dat ze op hun plaats zijn vergrendeld.
Schakel de beeldcytometer in via het dropdown-menu van de test in de software. Selecteer het vooraf ingestelde testtype en celtype voor levensvatbaarheid. De test is geoptimaliseerd voor aine oranje en propidiumjodide detectie voor detectie van candida albicans infectie.
De test is geoptimaliseerd voor GFP-detectie. Open nu het optietabblad en klik op achtergrondfoto maken. Nadat de bewerking is voltooid, klikt u op voorbeeld brightfield-afbeelding voor de A OPI-levensvatbaarheidsmeting. Meng 20 microliter monster met 20 microliter A OPI en pipet in de rekenkamer voor candida albicans infectiepercentage.
Meng het monster goed en pipet het direct in de telkamer. Nadat de cellen zich in de kamer hebben gesetteld, plaatst u de telkamer in de beeldcytometer voor beeldacquisitie. Breng het monster scherp en klik op tellen.
Wanneer de beeldacquisitie is voltooid, verwijdert u de wegwerp telkamer en gooit u deze op de juiste manier weg. Voor A OPI-meting worden de concentratie en levensvatbaarheidsresultaten weergegeven op de telresultatenpagina om het candida albicans infectiepercentage te bepalen. Nadat u de telresultaten hebt verkregen, klikt u op exporteren.
Stuur vervolgens de gegevens naar FCS express vier voor celpopulatie-analyse van GFP. Importeer in FCS express het gegevensbestand en plot de resultaten in een fluorescentiehistogram. Pas vervolgens een celpopulatiepoort toe op het histogram om de populatiepercentages van met candida albicans geïnfecteerde cellen te bepalen.
Dit experiment bewaakt de groei van macrofaagcellen geïnfecteerd door hcaps Lotum-gist op gedefinieerde tijdstippen. Stekken worden gekleurd en geanalyseerd door beeldgebaseerde cytologie. De bevrijde gistcellen uit de macrofagen worden geïdentificeerd door de Soter vision-software.
Hier is het absolute aantal gedetecteerde levende gisten groter dan gisten die in staat zijn om kolonievorming op vast medium te vormen. Deze gegevens benadrukken de aanwezigheid van significante aantallen levensvatbare, maar niet-cultiveerbare cellen. Deze beenmerg afgeleide macrofagen werden geïnfecteerd met C albican-gistcellen die groen fluorescerend eiwit tot expressie brengen onder controle van de A DH een-promotor.
Multipliciteiten van infectie variërend van 0,1 tot 10 resulteerden in incrementele toenames in GFP-intensiteit binnen geïnfecteerde macrofagen, evenals totaal percentage geïnfecteerde macrofagen Eenmaal beheerst. Deze techniek kan in slechts enkele minuten per monster worden uitgevoerd als het goed wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de parameters in te stellen zodat alleen schimmelcellen, niet gastheercellen, worden geteld.
Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van he
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie demonstreert het gebruik van beeldcytometrie voor het kwantificeren van pathogene schimmels in associatie met gastheercellen in kweek. Deze methode dient als een efficiënt alternatief voor de traditionele telling van kolonievormende eenheden (CFU).
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Schimmels pathogenese
- Cellulaire microbiologie
- Kwantitatieve beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Pathogene gisten kunnen lastig te kwantificeren zijn met traditionele methoden.
- CFU-enumeratie is arbeidsintensief en tijdrovend.
- Beeldcytometrie biedt een sneller alternatief voor kwantificatie.
- De studie richt zich op de interactie tussen macrofagen en pathogene gisten.
Doel van de studie
- Om pathogene gisten in gastheercellen te kwantificeren zonder gebruik te maken van CFU-methoden.
- Om de efficiëntie van het kwantificeren van schimmelinfecties te verbeteren.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het analyseren van interacties tussen gist en cel.
Gebruikte methoden
- Infectie van macrofaagcellen met H capsulation of C albicans gistcellen.
- Kleuring van geïnfecteerde cellen met aine oranje en propidiumjodide.
- Beeldvastlegging met behulp van een imaging cytometer.
- Analyse van grootte- en vormparameters om gistcellen te tellen.
Belangrijkste resultaten
- Beeldcytometrie kwantificeert pathogene gisten in gastheercellen op effectieve wijze.
- De methode vermindert de tijd en arbeid die gepaard gaan met de telling van CFU's.
- De resultaten kunnen worden gebruikt om de groei tussen wild-type en mutante stammen te vergelijken.
- De techniek verbetert de studie van fungal pathogenese.
Conclusies
- Beeldcytometrie is een levensvatbaar alternatief voor CFU-enumeratie.
- Deze methode stroomlijnt het kwantificeringsproces voor onderzoekers.
- Het opent nieuwe wegen voor het bestuderen van interacties tussen gastheer en pathogeen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het kwantificeren van pathogene schimmels in gastheercellen is cruciaal voor de validatie van antifungale targets en de identificatie van lead-verbindingen bij de ontdekking van antifungale geneesmiddelen. Traditionele CFU-enumeratie heeft te maken met een langzame groei, variabele plating-efficiëntie en arbeidsintensieve workflows, wat de doorvoersnelheid bij stamvergelijkingen en mechanistische studies beperkt. Beeldcytometrie biedt een snel, gevoelig en economisch alternatief dat kwantitatieve beoordeling van de levensvatbaarheid en intracellulaire groei van gist mogelijk maakt zonder plating, wat het voorspellend vertrouwen in preklinische antifungale screening ondersteunt.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de intracellulaire gistgroei in macrofagen te kwantificeren, waardoor de dynamiek van de interactie tussen pathogeen en gastheer wordt verduidelijkt.
- Operationele waarde: Biedt functionele targetvalidatie door directe meting van de levensvatbare gistlast in gastheercellen, waardoor de afhankelijkheid van surrogaat-eindpunten wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het voorspellend vertrouwen en de portfolio-triage door het detecteren van levensvatbare maar niet-kweekbare gistpopulaties die bij CFU over het hoofd worden gezien, wat de nauwkeurigheid van stamvergelijkingen verbetert.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen (gist-macrofaag co-culturen) voor op downstream screening van antifungale verbindingen met gestandaardiseerde infectie- en lysisprotocollen.
- Kwantitatieve output: Levert reproduceerbare enumeratie van gistcellen op basis van grootte en vorm via acridine oranje/propidiumjodide-kleuring en imagingcytometrie, wat een betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk maakt.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt hergebruik van het platform voor diverse schimmelpathogenen (bijv. Histoplasma capsulatum, Candida albicans) en analyse van mutantstammen, waardoor de screeningcapaciteit wordt verhoogd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Modelleert humane schimmelpathogenese door de gistreplicatie in macrofaagfagosomen te kwantificeren, wat aansluit bij translationele biomarkerstrategieën voor de intracellulaire pathogenelast.
- Preklinische continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinische validatie door kwantitatieve infectiemetrieken over een tijdsverloop te leveren, wat risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling ondersteunt.
- Mechanische risicoreductie: Richt zich op voorspellende risicoreductie door discrepanties tussen CFU en het werkelijke aantal levensvatbare gisten te onthullen, waarmee de beperkingen van traditionele levensvatbaarheidstests worden benadrukt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het continuüm van antifungale ontdekking, van vroege targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische werkzaamheidstests, waardoor een kwantitatieve beoordeling van antifungale verbindingen in fysiologisch relevante gastheer-pathogeenmodellen mogelijk wordt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van pathways door de overleving en replicatie van gisten binnen gastheercellen te kwantificeren onder genetische of farmacologische perturbatie.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via gestandaardiseerde workflows voor infectie, lyse en kleuring die reproduceerbare kwantitatieve resultaten opleveren voor screening van verbindingenbibliotheken.
- Analytics: Genereert gistenumeratie- en viabiliteitsmetrieken op basis van grootte en vorm via imagecytometrie, wat de vergelijking van antifungale condities en stamfenotypes faciliteert.
- Translationeel Onderzoek: Legt een verbinding met preklinische continuïteit door intracellulaire schimmelgroei in macrofagen te modelleren, een cruciale virulentie-eigenschap bij systemische mycosen.
- Enterprise Hergebruik: Fungeert als een herbruikbaar kwantificeringsplatform voor verschillende schimmelsoorten en gastheerceltypen, waardoor redundante assay-ontwikkeling wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door levensvatbare gistpopulaties te detecteren die niet door CFU worden opgepikt, waardoor mechanistische ambiguïteit in studies naar het werkingsmechanisme van antifungalia wordt verminderd.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid door geautomatiseerde beeldverwerving en -analyse, waardoor gebruikersafhankelijke variabiliteit bij het tellen van gisten wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door snellere en nauwkeurigere infectiekinetiek te bieden, wat de tijd en het verbruik van middelen bij vroege antifungal screening vermindert.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk door verbindingen te identificeren die effectief zijn tegen intracellulaire gistreservoirs, waarmee een belangrijke beperking van huidige antifungalia wordt aangepakt.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in schimmelpathogenese, macrofaagcultuur en fluorescentiemicroscopie om een nauwkeurige discriminatie tussen gist en gastheer te waarborgen.
- Afhankelijk van imaging-cytometrie-instrumentatie (bijv. Cellometer Vision) met fluorescentie-optiek en software voor levensvatbaarheidsassays voor de detectie van acridine-oranje/propidiumjodide en GFP.
- Vereist cross-team standaardisatie van de timing van de infectie, de multiplicity of infection en lyseprotocollen om reproduceerbare vrijmaking en kwantificering van gisten te garanderen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie aan verschillende schimmelsoorten (bijv. GFP-expresserende stammen) en gastheerceltypen (bijv. primaire macrofagen versus cellijnen) om de signaleringsspecificiteit te behouden.
- Beperkt door de noodzaak om kleurings- en beeldvormingsparameters te optimaliseren om gastheercelsignalen uit te sluiten en overtelling te voorkomen, met name bij monsters met een hoge achtergrond.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
1:39
Infection of Macrophages with H. capsulatum, C. albicans
2:21
Macrophage Lysis
2:56
CFU Plating
3:28
Visualization of Fungi within Live Macrophages
3:54
Image Cytometric Analysis
6:04
Results: H. capsulatum in Macrophage Cells
7:12
Conclusion
