Name: Stereotactische Micro-injectie van virale vectoren uitdrukken Cre Recombinase om de rol van Target Genen in Cocaine Geconditioneerd Place Voorkeur Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Leer stereotactische micro-injectie van virale vectoren in de muizenhersenen om doelgenen tijdens verschillende fasen van cocaine-geconditioneerde plaatsvoorkeur te ableren. Deze methode helpt onderzoekers gedragsveranderingen in acquisitie, extinctie en herinstelling te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Anni Lee en Maureen Byrne bedanken voor hun hulp bij het vaststellen van de verlengde geconditioneerde plaats voorkeur protocol.

Alle procedures worden uitgevoerd in overeenstemming met het Weill Cornell Medical College Institutional Animal Care en regels comite gebruik. 1. Voorbereiding en Setup voor Stereotaxische Levering van virale vectoren <ol><li> Als een instrument, steriel wattenstaafje of hand dragen steriele handschoen wordt verontreinigd door in contact komen met een niet-steriele ondergrond, weggooien of opnieuw steriliseren het instrument met een hete kraal sterilisator, gooi het doekje of te wijzigen in nieuwe steriele handschoenen. </li><li> Plaats een muis kooi met beddengoed op een warmte-blok op te warmen voor het postoperatieve herstel. </li><li> Opgezet elektrisch scheerapparaat voor het scheren van het hoofd en ethanol en jodium aan de hoofdhuid te steriliseren. </li><li> Vegen van oor bars en mond greep van de stereotax met 70% ethanol. </li><li> Met behulp van een 5 ul Hamilton spuit, opstellen 5 pl virale vector (1 x 10 6 virale deeltjes / ul) en opgericht in spuithouder op stereotax. </li><li> Magnetron verwarming pad of zet elektrische pad op eennd plaats op stereotax. Dek af met een schone absorberende pad om het risico van brandwonden te beperken. Monitor muis lichaamstemperatuur (tussen 97-99,5 ° F) vaak de hele procedure. </li><li> Injecteer muis (met een gewicht van 22-35 g) met een mengsel van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (20 mg / kg). Zodra een muis is verdoofd, snuifje staartpunt tot reflexen van de muis te controleren en noteer elke beweging of reactie op ervoor te zorgen dat de muis is voldoende verdoofd. </li><li> Scheer hoofd tussen de oren en ogen. </li><li> Schoon geschoren hoofd met afwisselend ethanol en jodium steriele katoenen applicators. </li><li> Over te dragen muis om verwarmde pad op stereotax. </li></ol> 2. Stereotactische Micro-injectie van virale vectoren <ol><li> Draag steriele handschoenen hele operatie. Als handschoenen op enig moment zijn verontreinigd door het aanraken van niet-steriele oppervlakken, wijzigen handschoenen. </li><li> Zero tand bar en oor bar schalen. </li><li> Stel tanden tand bar. </li><li> Schroef in de snuit. Als wiebelen of snorhaar verplaatsenment wordt opgemerkt allen tijde beheer van een ip boosterdosis (~ 0,05 cc) van een mengsel van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (20 mg / kg). </li><li> Schroef in het oor bars. </li><li> Smeer ogen met PuraLube. </li><li> Opengesneden hoofdhuid tot net achter de oren met een scalpel. </li><li> Plaats bulldog clips op de hoeken van de hoofdhuid te pellen van de huid weg van de schedel. Bregma en lambda moet gemakkelijk zichtbaar. </li><li> Zorg ervoor hechtdraad van bregma tot lambda is recht uitgelijnd. Als de hechting is krom bijstellen positionering van het hoofd. </li><li> Controleer of alle instellingen op de stereotax worden op nul gezet. </li><li> Zet naald op zijn plaats bij bregma. </li><li> Meet alle coördinaten voor zowel bregma en lambda. Dit omvat dorsale / ventrale, mediale / laterale en anterieure / posterieure coördinaten. </li><li> Stel de kop tot de ventrale coördinaten bregma en lambda binnen 0,02 mm van elkaar. </li><li> Eenmaal uitgelijnd, uit bregma gaan mediaal naar de mediale / laterale (M / L) coördinaten. Zorg ervoor datlinks en rechts zijn uitgelijnd binnen 0,02 mm van elkaar. </li><li> Re-center naald tip over bregma en van daar te verplaatsen in de anterior / posterior (A / P) richting aan de gewenste anterior / posterior coördinaat. </li><li> Indien nodig, hoek naald in de ene richting en zorg ervoor dat de stereotax vergrendeld is. Gaan uit naar de linker M / L coördinaat (+ / - 1.52) </li><li> Meet de ventrale positie van de top van de schedel als referentie nadat het boorgat is geboord. </li><li> Boor een boorgat met behulp van een steriele boor op de gewenste coördinaat. Controleer of de naald ononderbroken kunt invoeren door de schedel. </li><li> Zet de naald op de gewenste ventrale coördinaat. </li><li> Zodra de coördinaat wordt bereikt, dip 0.015 mm onder voor ~ 10 sec tot een klein zakje voor de virale vector te creëren. </li><li> Injecteer de gewenste hoeveelheid virale vector met een snelheid van ~ 0,1 gl / min. 3 min. wachten voor virale vector volledig diffunderen. Zet de naald tip 0.015 mm en wacht een extra 2 minuten. </li><li>Dompel de naald (als dit schuine injecties) in de tegengestelde richting. Ook nemen de ventrale positie als referentie voor de top van de schedel. </li><li> Herhaal dezelfde stappen als op de eerste zijde van virale vector injecteren aan de andere kant (als het doen van bilaterale injecties). </li><li> Toepassing botwas om beide gaten om ze te verzegelen met de houten einde van een steriele katoenen applicator tip. </li><li> Hechten de hoofdhuid. </li><li> Toepassing zenuwblokkade om de gewonden gebied. </li><li> Verwijder de muis uit stereotax en plaats in de verwarmde kooi op hitteblok om te herstellen gedurende 45 minuten. </li><li> Monitoren op tekenen van pijn, waaronder: verminderde totale activiteit of rusteloosheid, verminderde voedsel-en waterverbruik of verhoogde vocalisatie. Buprenorfine (0,05-0,2 mg / kg) tweemaal daags kan worden toegediend gedurende een week indien nodig voor pijn. Aanvaardbare alternatieven omvatten: meperidine (20-60 mg / kg), pentazocine (10 mg / kg), nalbufine (4-8 mg / kg). </li></ol> 3. Geconditioneerd Plaats Voorkeur: ACQUISITIEn, Uitsterven, en Herstel <ol><li> Plaats muizen in de centrale kamer van een drie-kamer plaatsvoorkeur apparaat (Med Associates Inc, St. Albans, VT, USA) voor een 60 sec gewenningsperiode met guillotine deuren gesloten. </li><li> Na gewenning, geopend guillotine deuren en laat muizen vrije verkenning van alle 3 kamers voor 1.200 sec, met de tijd doorgebracht in elke kamer worden opgenomen met MedPC IV software (Med Associates, Inc). </li><li> Muizen toewijzen aan conditionering kamers op basis van hun prestaties tijdens de pre-test. Met behulp van een bevooroordeelde ontwerp, paar toediening van het geneesmiddel gedurende de daarop volgende 3 dagen met het compartiment, dat was de minst geprefereerde tijdens de basislijn pre-test. </li><li> Gedurende de volgende 3 dagen conditionering, injecteren muizen met cocaïne (10 mg / kg, ip) in de voormiddag beperken in hun toegewezen kamer gedurende 1200 seconden onmiddellijk na de injectie. Terug muizen om hun eigen kooien na de sessie. Na 4 uur, injecteren muizen met een zoutoplossing (0,01 ml / glichaamsgewicht) en beperken ze aan de tegenoverliggende kamer voor de 1200 sec middagsessie. </li><li> Om te testen voor aankoop, plaats muizen in de centrale kamer met guillotine deuren gesloten voor een seconde gewenningsperiode 60. Open guillotine deuren en laat gratis verkenning voor 1200 seconden, met de tijd doorgebracht in alle kamers opgenomen door MedPC IV software (Med Associates, Inc). Bereken voorkeur door het aftrekken van de hoeveelheid tijd doorgebracht in de zoutoplossing-gepaarde kamer van de hoeveelheid tijd doorgebracht in de cocaïne-gepaarde kamer. </li><li> Naar de plaats voorkeur blussen, muizen bloot aan twee 20 min sessies van vrije exploratie dagelijks in dezelfde inrichting, gescheiden door ten minste 2 uur, te beginnen 24 uur na de test voor overname. Tijd doorgebracht in elke kamer moet opnieuw worden geregistreerd en de omvang van de oorspronkelijke CPP moeten worden vergeleken met die van elke sessie uitsterven. </li><li> Bepaal of muizen de drug-geïnduceerde voorkeur hebben geblust door het beoordelen van de vraag of de voorkeur voor een parbijzonder kamer over twee opeenvolgende uitsterven dagen is aanzienlijk lager in vergelijking met de overname preferente score. </li><li> Herstel muizen met een priming dosis cocaïne (5 of 10 mg / kg, ip) en opnieuw blootstellen aan de inrichting waardoor vrije exploratie en noteer de tijd doorgebracht in elk compartiment. </li><li> Dien Euthasol euthanasie-oplossing (150 mg / kg). Transcardiaal perfuseren muizen met 4% paraformaldehyde (PFA) en het uitvoeren van een histologisch onderzoek om de juiste micro-injectie plaatsing valideren. </li></ol>

<ol><li>Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+neurobiology+of+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+on+Addictions%22%5BJournal%5D)">Molecular neurobiology of addiction.</a> American Journal on Addictions. 10 (3), (2001).</li>
<li>Thomas, M. J., Kalivas, P. W., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroplasticity+in+the+mesolimbic+dopamine+system+and+cocaine+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Neuroplasticity in the mesolimbic dopamine system and cocaine addiction.</a> British Journal of Pharmacology. 154 (2), (2008).</li>
<li>Robinson, T. E., Browman, K. E., Crombag, H. S., Badiani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+induction+or+expression+of+psychostimulant+sensitization+by+the+circumstances+surrounding+drug+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">Modulation of the induction or expression of psychostimulant sensitization by the circumstances surrounding drug administration.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (2), (1998).</li>
<li>Tzschentke, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+reward+with+the+conditioned+place+preference+%28CPP%29+paradigm%3A+update+of+the+last+decade%5BTitle%5D)+AND+%22Addiction+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: update of the last decade.</a> Addiction Biology. 12 (3-4), (2007).</li>
<li>Mueller, D., Stewart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine-induced+conditioned+place+preference%3A+reinstatement+by+priming+injections+of+cocaine+after+extinction%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Cocaine-induced conditioned place preference: reinstatement by priming injections of cocaine after extinction.</a> Behavioural Brain Research. 115 (1), (2000).</li>
<li>Itzhak, Y., Martin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine-induced+conditioned+place+preference+in+mice%3A+Induction%2C+extinction+and+reinstatement+by+related+psychostimulants%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Cocaine-induced conditioned place preference in mice: Induction, extinction and reinstatement by related psychostimulants.</a> Neuropsychopharmacology. 26 (1), (2002).</li>
<li>Kreibich, A. S., Blendy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP+response+element-binding+protein+is+required+for+stress+but+not+cocaine-induced+reinstatement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">cAMP response element-binding protein is required for stress but not cocaine-induced reinstatement.</a> Journal of Neuroscience. 24 (30), (2004).</li>
<li>Obrien, C. P., Childress, A. R., McLellan, T., Ehrman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+systematic+cue+exposure+with+standard+treatment+in+recovering+drug+dependent+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Addictive+Behaviors%22%5BJournal%5D)">Integrating systematic cue exposure with standard treatment in recovering drug dependent patients.</a> Addictive Behaviors. 15 (4), (1990).</li>
<li>O'Brien, C. P., Childress, A. R., McLellan, A. T., Ehrman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+learning+model+of+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Research+publications+-+Association+for+Research+in+Nervous+and+Mental+Disease%22%5BJournal%5D)">A learning model of addiction.</a> Research publications - Association for Research in Nervous and Mental Disease. 70, (1992).</li>
<li>Stewart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychological+and+neural+mechanisms+of+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B-Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Psychological and neural mechanisms of relapse.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 363 (1507), (2008).</li>
<li>Bueler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno+associated+viral+vectors+for+gene+transfer+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Adeno associated viral vectors for gene transfer and gene therapy.</a> Biological Chemistry. 380, (1999).</li>
<li>Xiao, X., Li, J., McCown, T. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+by+adeno-associated+virus+vectors+into+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer by adeno-associated virus vectors into the central nervous system.</a> Experimental Neurology. 144 (1), (1997).</li>
<li>Alexander, I. E., Russell, D. W., Spence, A. M., Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+gamma+irradiation+on+the+transduction+of+dividing+and+nondividing+cells+in+brain+and+muscle+of+rats+by+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Effects of gamma irradiation on the transduction of dividing and nondividing cells in brain and muscle of rats by adeno-associated virus vectors.</a> Human Gene Therapy. 7 (7), (1996).</li>
<li>Schierberl, K., Hao, J., Tropea, T. F., Ra, S., Giordano, T. P., Xu, Q., Garraway, S. M., Hofmann, F., Moosmang, S., Striessnig, J., Inturrisi, C. E., Rajadhyaksha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%28v%291.2+L-Type+Ca2%2B+Channels+Mediate+Cocaine-Induced+GluA1+Trafficking+in+the+Nucleus+Accumbens%2C+a+Long-Term+Adaptation+Dependent+on+Ventral+Tegmental+Area+Ca%28v%291.3+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ca(v)1.2 L-Type Ca2+ Channels Mediate Cocaine-Induced GluA1 Trafficking in the Nucleus Accumbens, a Long-Term Adaptation Dependent on Ventral Tegmental Area Ca(v)1.3 Channels.</a> Journal of Neuroscience. 31 (38), (2011).</li>
<li>Schierberl, K., Giordano, T., Satpute, S., Hao, J., Kaur, G., Hofmann, F., Moosmang, S., Striessnig, J., Rajadhyaksha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%28v%291.3+L-type+Ca2%2B+channels+mediate+long-term+adaptation+in+dopamine+D2L-mediated+GluA1+trafficking+in+the+dorsal+striatum+following+cocaine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">Ca(v)1.3 L-type Ca2+ channels mediate long-term adaptation in dopamine D2L-mediated GluA1 trafficking in the dorsal striatum following cocaine exposure.</a> Channels. 6 (1), 11-17 (2012).</li>
<li>Nestler, E. J., Bergson, C. M., Gultart, X., Hope, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neural+gene+expression+in+opiate+and+cocaine+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22NIDA+Research+Monograph%22%5BJournal%5D)">Regulation of neural gene expression in opiate and cocaine addiction.</a> NIDA Research Monograph. 125, (1993).</li>
<li>Hyman, S. E., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addiction+and+the+brain%3A+The+neurobiology+of+compulsion+and+its+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Addiction and the brain: The neurobiology of compulsion and its persistence.</a> Nature Reviews Neuroscience. 2 (10), (2001).</li>
<li>Lee, A. S., Ra, S., Rajadhyaksha, A. M., Britt, J. K., De Jesus-Cortes, H., Gonzales, K. L., Lee, A., Moosmang, S., Hofmann, F., Pieper, A. A., Rajadhyaksha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain+elimination+of+cacna1c+mediates+anxiety-like+behavior+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Forebrain elimination of cacna1c mediates anxiety-like behavior in mice.</a> Molecular Psychiatry. 17 (11), (2012).</li>
<li>Li, X., Wolf, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+virus-infected+brain+regions+using+a+GFP-illuminating+flashlight+enables+accurate+and+rapid+dissection+for+biochemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Visualization of virus-infected brain regions using a GFP-illuminating flashlight enables accurate and rapid dissection for biochemical analysis.</a> Journal of Neuroscience Methods. 201 (1), 177-179 (2011).</li>
<li>Ahmed, B. Y., Chakravarthy, S., Eggers, R., Hermens, W., Zhang, J. Y., Niclou, S. P., Levelt, C., Sablitzky, F., Anderson, P. N., Lieberman, A. R., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+delivery+of+Cre-recombinase+to+neurons+in+vivo+and+stable+transduction+of+neurons+using+adeno-associated+and+lentiviral+vectors+-+art.+no.+5%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient delivery of Cre-recombinase to neurons in vivo and stable transduction of neurons using adeno-associated and lentiviral vectors - art. no. 5.</a> BMC Neuroscience. 5, (2004).</li>
<li>Kaspar, B. K., Vissel, B., Bengoechea, T., Crone, S., Randolph-Moore, L., Muller, R., Brandon, E. P., Schaffer, D., Verma, I. M., Lee, K. F., Heinemann, S. F., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+effectively+mediates+conditional+gene+modification+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus effectively mediates conditional gene modification in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2320-2325 (2002).</li>
<li>Neve, R. L., Neve, K. A., Nestler, E. J., Carlezon, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+herpes+virus+amplicon+vectors+to+study+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Use of herpes virus amplicon vectors to study brain disorders.</a> Biotechniques. 39 (3), 9(2005).</li>
<li>Pohl, M., Braz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+of+pain%3A+emerging+strategies+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Gene therapy of pain: emerging strategies and future directions.</a> European Journal of Pharmacology. 429 (1-3), (2001).</li>
<li>Rinaldi, A., Marshall, K. R., Preston, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-cytotoxic+herpes+simplex+virus+vector+which+expresses+Cre+recombinase+directs+efficient+site+specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">A non-cytotoxic herpes simplex virus vector which expresses Cre recombinase directs efficient site specific recombination.</a> Virus Research. 65 (1), (1999).</li>
<li>Choi, V. W., McCarty, D. M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+hybrid+serotypes%3A+Improved+vectors+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">AAV hybrid serotypes: Improved vectors for gene delivery.</a> Current Gene Therapy. 5 (3), (2005).</li>
<li>Passini, M. A., Dodge, J. C., Bu, J., Yang, W., Zhao, Q., Sondhi, D., Hackett, N. R., Kaminsky, S. M., Mao, Q. W., Shihabuddin, L. S., Cheng, S. H., Sleat, D. E., Stewart, G. R., Davidson, B. L., Lobel, P., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+delivery+of+CLN2+reduces+brain+pathology+in+a+mouse+model+of+classical+late+infantile+neuronal+ceroid+lipofuscinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intracranial delivery of CLN2 reduces brain pathology in a mouse model of classical late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis.</a> Journal of Neuroscience. 26 (5), (2006).</li>
<li>Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-free+stocks+of+recombinant+adeno-associated+viruses+-+normal+integration+does+not+require+viral+gene-expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses - normal integration does not require viral gene-expression.</a> Journal of Virology. 63 (9), (1989).</li>
<li>Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., Omalley, K. L., During, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene-expression+and+phenotypic+correction+using+adenoassociated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Long-term gene-expression and phenotypic correction using adenoassociated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nature Genetics. 8 (2), (1994).</li>
<li>Johansen, J. P., Hamanaka, H., Monfils, M. H., Behnia, R., Deisseroth, K., Blair, H. T., LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+activation+of+lateral+amygdala+pyramidal+cells+instructs+associative+fear+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Optical activation of lateral amygdala pyramidal cells instructs associative fear learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (28), (2010).</li>
<li>Zhang, F., Gradinaru, V., Adamantidis, A. R., Durand, R., Airan, R. D., de Lecea, L., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits%3A+technology+for+probing+mammalian+brain+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nature Protocols. 5 (3), (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Regionaal-als in de tijd-specifiek gen ablatie via stereotactische micro-injectie van virale vectoren in combinatie met CPP die uitsterven en herplaatsing fasen omvat maakt voor het onderzoek van de specifieke bijdragen van genen tot drie verschillende fasen van verslavende-achtig gedrag. Terwijl conditionele knockout dat wordt bereikt met behulp van de traditionele Cre-LoxP systeem biedt voor spatio-temporeel beperkt gen ablatie, stereotaxically microinjecting Cre-recombinase in discrete hersengebieden van floxed muize...

Cocaïne is een zeer versterkende psychostimulantia. Na herhaalde blootstelling, verschillende moleculaire en cellulaire adaptaties optreden in beloning-relevante hersenen circuits die worden verondersteld te resulteren in dwangmatige drug-zoekend gedrag, wordt gevraagd een hoge mate van terugval die een ernstig klinisch probleem 1 opleveren. Cocaïne oefent deze langdurige gedrags-effecten door het reguleren van genexpressie. Om de aanpassingen die voortvloeien uit chronische cocaïnegebruik studeren, hebben preklinische diermodellen uitgebreid gebruikt. Een dergelijk model is de plaats voorkeur (CPP) paradigma airconditioning. Dit model omvat de ontwikkeling van een geleerde associatie tussen een eerder neutrale omgeving en lonende eigenschappen van cocaïne. Na verschillende paringen van cocaïne met een bepaalde kamer, worden dieren toegelaten om de cocaïne-gepaarde en niet-cocaïne-gepaarde omgevingen vrij te verkennen en als ze liever de drug-gepaarde compartiment, worden ze zei een cocaïne-geïnduceerde Plac te hebben verworvene voorkeur. Bovendien, na een uitsterven stage, dit paradigma kan worden gebruikt om context-specifieke herstel van cocaïne-zoekend gedrag te bestuderen. Vergeleken met andere gedragsmodellen verslavend-achtig gedrag, zoals psychomotorische sensibilisatie, die wordt gebruikt om te bestuderen langdurige cocaïne geïnduceerde gedrag en moleculaire plasticiteit 2,3 en zelftoediening (SA), dat wordt verondersteld om nauwkeuriger na te bootsen verslavend -achtig gedrag gevonden bij de mens, het CPP paradigma is een eenvoudige procedure om cocaïne contextueel leren 4 bestuderen. CPP-protocollen kunnen gemakkelijk worden uitgebreid tot uitsterven en herstel fasen omvatten, net als bij SA, die het mogelijk maken voor onderzoek naar de mechanismen die ten grondslag liggen aan drugs verlangen en terugval 5-7 en die worden verondersteld om aspecten van wat er gebeurt in de menselijke recapituleren drug-zoekend gedrag en drugs - en cue-geïnduceerde terugval 8-10. Een mechanisme dat ten grondslag ligt aan decocaïne geïnduceerde gedrag plasticiteit die kenmerken van elk van de afzonderlijke fasen van CPP, inclusief aankoop, extinctie en herstel, is activatie van unieke signaturen van genexpressie in verschillende hersengebieden. Om direct testen welke genen binnen beloning-relevante hersengebieden bemiddelen cocaïne-geïnduceerde gedragsveranderingen, is het handig om te kunnen om ze selectief te manipuleren in een regionaal-specifieke wijze. Een manier om dit te bereiken is om recombinant adeno-geassocieerde virale (rAAV) vectoren die uitdrukken Cre recombinase met stereotaxische chirurgie, in verschillende hersengebieden van muizen die doelwit genen geflankeerd door LoxP sites (floxed muizen) hebben microinject. Deze methode zorgt voor een zeer nauwkeurige temporele en regionale controle over wanneer en waar genen worden weggenomen, in zowel delende als niet-delende neuronen, zonder het induceren van immuunreacties 11-13. Dit niveau van controle vormt een belangrijk voordeel ten opzichte van traditionele Cre-LoxP technologie van de fokkerij floxed muizen with muizen die Cre recombinase onder de controle van een endogeen gen promoter, dat de timing en de distributie van gendeletie kan strakker geregeld. Bovendien, virale vector-gemedieerde gen-knockout omzeilt mogelijke ontwikkelingsstoornissen compenserende effecten die zich kunnen voordoen met behulp van traditionele knockout strategieën. Naast cocaïne CPP, die hier in de hersenen van muizen floxed beschreven, micro-injectie van rAAV-Cre om de rol van specifieke genen kan worden alom toegepast gedragsparadigma&#39;s die afzonderlijke fasen, waaronder zelf-toediening en psychomotorische overgevoeligheid betrokken beoordelen. Zo heeft ons laboratorium gebruik gemaakt van de rAAV-Cre technologie om de rol van Ca v 1.2 L-type Ca2 +-kanalen in cocaïne psychomotorische sensibilisatie 14 bestuderen. Specifiek rAAV-Cre werd microgeïnjecteerd in de nucleus accumbens (NAC) van muizen met het gen dat codeert Ca v 1.2 floxed, aantonen dat Ca v </sub&gt; 1.2 handelt in deze regio bemiddelt de uitdrukking fase van psychomotorische overgevoeligheid 14,15. Echter, kan het rAAV-Cre strategie niet worden gebruikt als muizen met een floxed gen van belang niet bestaan, als onze ervaring was bij de beoordeling van de rol van Ca v 1.3 L-type Ca2 + kanalen in psychomotorische overgevoeligheid. Vandaar dat een beperking van het gebruik van rAAV-Cre aandient conditionele muizen bestaan ​​niet voor een bepaald gen van belang. Echter, rAAVs dat uitdrukkelijke siRNA kan worden gebruikt om knockdown doelwit-genen, zoals wij hebben gedaan om de rol van Ca v 1.3 kanalen 14,15 onderzoeken. Microinjecting rAAV-Cre in discrete hersengebieden floxed muizen en testen daarvan in het CPP paradigma maakt onderzoek naar de specifieke genen die de verschillende fasen van verslavende-achtige gedrag en wanneer hun activiteiten mediëren. Gebruik van dit paradigma heeft geholpen in ons begrip van hoe herhaalde cocaïne administratie in wezen kaapt de brAins beloningsschakelschema waardoor onaangepast veranderingen in de moleculaire signaaltransductie en genexpressie die leiden tot de verslaafde toestand 1,16,17.

<table><tbody><tr><td>Geconditioneerde plaatsvoorkeur activiteitskamers</td><td>Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA</td><td>MED-CPP-MS</td><td></td></tr><tr><td>Stereotactisch uitlijningssysteem voor muis</td><td>David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA</td><td>model 900</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton-spuit</td><td>Hamilton Company, Reno, Nevada, USA</td><td>7634-01</td><td></td></tr><tr><td>rAAV2-Cre-GFP</td><td>Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA</td><td>7016</td><td></td></tr><tr><td>rAAV2-GFP</td><td>Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA</td><td>7004</td><td></td></tr></tbody></table>

stereotactische micro-injectie van virale vectoren uitdrukken cre recombinase om de rol van target genen in cocaine geconditioneerd place voorkeur studie

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

Microinjecting recombinant adeno-geassocieerde virale (rAAV) vectoren die Cre-recombinase in aparte muis hersengebieden selectief knockout genen van belang maakt voor verbeterde tijdelijk-en regionaal-specifieke controle van gen-deletie, in vergelijking met bestaande methoden. Terwijl voorwaardelijke deletie kan ook worden bereikt door voortplanting muizen die uitdrukken Cre recombinase onder de controle van promoters specifiek gen met muizen die een floxed gen stereotaxische microinjectie maakt targeting van discrete hersengebieden bij experimentator bepaalde tijdstippen plaats. In de context van cocaïne geconditioneerde plaatsvoorkeur en andere cocaïne gedragsparadigma&#39;s zoals zelf-toediening of psychomotorische overgevoeligheid die intrekking, uitsterven en / of herstel fasen omvatten, deze techniek is bijzonder bruikbaar bij de unieke bijdrage van doelgenen onderzoeken om deze verschillende fasen van gedragsmodellen van cocaïne geïnduceerde plasticiteit. Specifiek,Deze techniek maakt het mogelijk voor selectieve ablatie van target genen tijdens discrete fasen van het gedrag van hun bijdrage aan het gedrag in de tijd te testen. Uiteindelijk is dit begrip kunnen gerichtere therapieën die het best in staat om de meest potente risicofactoren die zich tijdens elke fase van verslavend gedrag te presenteren pakken.

CPP Na het uitvoeren van CPP op gemicroinjecteerd muizen, moet men controleren of de cohort van controle-geïnjecteerde (rAAV-GFP) muizen normaal hebben verworven voorkeur voor de drug-gepaarde kamer (Figuur 1A, 1B). Muizen worden geacht te hebben verworven voorkeur voor een bepaalde kamer toen cocaïne voorkeur (tijd doorgebracht in de cocaïne-gepaarde kamer minus de tijd doorgebracht in de zoutoplossing-gepaarde kamer) is significant hoger in vergelijking met de uitgangssituati...

In dit artikel wordt beschreven hoe u virale vectoren microinject in de hersenen van muizen en vervolgens te testen in een geconditioneerde voorkeur paradigma plaats die een overname, uitsterven en herstel fase omvat.

Stereotactische Micro-injectie van virale vectoren uitdrukken Cre Recombinase om de rol van Target Genen in Cocaine Geconditioneerd Place Voorkeur Studie

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Het algemene doel van deze procedure is om doelgenen selectief ablatie te onderwerpen tijdens discrete fasen van het condition place preference paradigma om hun bijdrage aan dit gedrag in de loop van de tijd te testen. Dit wordt bereikt door eerst stereotactisch een recombinant eno-geassocieerde virale vector die Cree-recombinase tot expressie brengt, micro-injecteren. Vervolgens krijgen de muizen 10 tot 14 dagen de tijd om in hun thuiskooi te herstellen voor een maximale C-reactivatie.De derde stap van de procedure is het testen van de muizen via een conditionele plaatsvoorkeur (conditioned place preference), inclusief de acquisitie-, extinctie- en reinstatement-fasen. De laatste stap van de procedure is het uitvoeren van een histologisch onderzoek van de micro-geïnjecteerde muizen om de correcte plaatsing van de micro-injectie te valideren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die veranderingen in het acquisitie-, extinctie- en/of reinstatement-gedrag laten zien als reactie op gene knockout via gedragstesten van de conditionele plaatsvoorkeur.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het CRE lock P-paringssysteem, is dat he

stereotaxic-microinjection-viral-vectors-expressing-cre-recombinase

Research

JoVE Journal

Behavior

Gedrag

Source: Chen, S., et al., Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the stereotaxic injection of a viral vector encoding Cre recombinase and green fluorescence protein or GFP into the striatum of a genetically modified mouse pup to achieve gene manipulation by excising a loxP-flanked STOP cassette, activating red fluorescence protein or RFP as a reporter.

Stereotactic Microinjection of a Viral Vector for Gene Manipulation in a Mouse Pup Striatum

Source: Pereira, M. et. al., In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates stereotaxic injection of an adeno-associated virus into the cerebral cortex of a transgenic mouse to deliver Cre-dependent neuronal reprogramming and fluorescent reporter genes into glial cells.

Stereotaxic Injection of Viral Vectors for Glial Cell Reprogramming in a Mouse Model

Source: Fricano-Kugler, C. J., et al. Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates stereotaxic viral injection for precise neuronal gene editing in the mouse brain. The protocol ensures accurate virus delivery to the dentate gyrus, enabling fluorescent labeling and CRISPR-mediated gene knockout to study neural circuits, gene function, and disease mechanisms in vivo.

Stereotaxic Viral Injection for Targeted Neuronal Gene Editing in the Mouse Brain

MicroRNA een belangrijke rol spelen in hersenstructuur en functie. Hier beschrijven we een methode om hippocampus miRNA dwingen over-expressie met behulp van stereotactische injectie van een aangelegde miRNA-expressie lentivirus. Deze benadering kan dienen als een relatief snelle manier om te...

Stereotactische injectie van MicroRNA expressie Lentivirussen om de muis Hippocampus CA1 regio en Evaluatie van de Behavioral Outcome

Virale vectoren kunnen gerichte genetische manipulatie. We tonen een werkwijze voor voorwaardelijke genexpressie of ablatie in de muis ruggenmerg, met stereotactische injectie van een virale vector in de dorsale hoorn, een prominente plaats van synaptische contacten tussen primaire somatosensorische afferenten en neuronen van het centrale zenuwstelsel.

Stereotactische injectie van een virale vector voor voorwaardelijke Gene Manipulation in de muis Spinal Cord

Stereotactische injectie van lentivirussen uiten cDNAs of shRNAs kan genexpressie moduleren in specifieke hersengebieden van muizen. Hier presenteren we een protocol om stereotactische injecties te combineren met gedragsproblemen taken, zoals het open veld Test (OFT) en de Gedwongen Swim Test (FST).

Het toepassen van stereotactische injectie techniek om genetische effecten op Animal Gedrag Studie

Knaagdieren zijn een geschikt model om de moleculaire substraten van gedrag en complexe psychiatrische stoornissen te onderzoeken. Hersenmicro-injectie bij wakkere knaagdieren kan worden gebruikt om ziekte-substraten te verduidelijken. Een efficiënte en aanpasbare hersenmicro-injectiemethode evenals de uitvoering van een operante paradigma dat motivatie kwantificeert wordt gepresenteerd.

Knaagdieren Brain Micro-injectie om te studeren Molecular substraten van gemotiveerd gedrag

Optogenetische benaderingen worden wijd gebruikt om neurale activiteit te manipuleren en de gevolgen voor hersenfunctie beoordelen. Hier, wordt een techniek beschreven die bij in vivo expressie van het optische activator Channelrhodopsin, maakt de ex vivo analyse van synaptische eigenschappen specifieke lange afstand en lokale neurale verbindingen in angst gerelateerde circuits.

Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

De CRISPR / Cas9 systeem biedt de mogelijkheid om gerichte genoom bewerken toegankelijk en betaalbaar voor de wetenschappelijke gemeenschap. Dit protocol is bedoeld om te demonstreren hoe virussen die een gen van belang met behulp van de CRISPR / Cas9 systeem zal knock-out, en dan injecteren ze stereotaxically in de volwassen hersenen van muizen te creëren.

Ontwerpen, Verpakkingen en Levering van hoge titer CRISPR Retro en Lentivirussen via Stereotaxische Injection

We beschrijven een protocol van stereotaxic chirurgie met een zelfgemaakte hoofd-fixed device voor microinjecting reagentia in het striatum van neonatale muis hersenen. Deze techniek maakt het mogelijk specifieke genmanipulatie in neuronale cellen van bepaalde regio's van neonatale muis hersenen.

Stereotaxic chirurgie voor genetische manipulatie van striatale cellen van neonatale muis hersenen

Leer stereotactische micro-injectie van virale vectoren in de muizenhersenen om doelgenen tijdens verschillende fasen van cocaine-geconditioneerde plaatsvoorkeur te ableren. Deze methode helpt onderzoekers gedragsveranderingen in acquisitie, extinctie en herinstelling te bestuderen.

Stereotactische Micro-injectie van virale vectoren uitdrukken Cre Recombinase om de rol van Target Genen in Cocaine Geconditioneerd Place Voorkeur Studie (Video) | JoVE Journal

Stereotactische Micro-injectie van virale vectoren uitdrukken Cre Recombinase om de rol van Target Genen in Cocaine Geconditioneerd Place Voorkeur Studie

Meer video's verkennen