Gelijktijdig vastleggen van real-time beelden in Two Emissie Kanalen Met een Dual Camera Emission Splitting Systeem: Toepassingen op Hechting Cell
September 4th, 2013
Dubbele camera emissie splitsen systemen voor twee-kleuren fluorescentie microscopie genereren real-time beeld sequenties met een uitzonderlijke optische en temporele resolutie, een eis van bepaalde levende cel proeven, waaronder parallelle plaat stroom kamer adhesietesten. Wanneer de software wordt gebruikt om beelden van simultane emissie kanalen samenvoegt, worden pseudocolored beeldsequenties geproduceerd.
Het algemene doel van deze procedure is om een parallel plate flow chamber adhesie-assay uit te voeren met behulp van een dual camera emissie splitsingssysteem om gelijktijdig realtime beeldsequenties in twee kleuren op te nemen. Om dit te doen, worden de twee camera's op de beeldvormingsopstelling eerst uitgelijnd. Vervolgens worden de cellen en reactieve substraat voorbereid en wordt de parallel plate flow chamber ingesteld.
Vervolgens worden de camera-instellingen gekalibreerd voor tweekleurige beeldacquisitie en worden eventueel noodzakelijke digitale correcties uitgevoerd aan de camera-uitlijning. Er worden vervolgens beeldsequenties vastgelegd, die de acquisitie van tweekleurige beelden met hoge temporele resolutie demonstreren. Het voordeel van dual camera emissie splitsingssystemen ten opzichte van enkel camera systemen is dat aan elke camera verschillende belichtingstijden kunnen worden toegewezen en het volledige gezichtsveld wordt behouden.
Deze techniek kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van celadhesie, zoals hoe de lokalisatie van adhesiemoleculen op het oppervlak van cellen dynamische biologische processen zoals celmigratie, ontsteking en kankermetastase kan beïnvloeden. De volgende procedure vereist een omgekeerde epi-fluorescentiemicroscoop. Deze moet zijn uitgerust met een hoogintensiviteitslichtbron gekoppeld aan een lichtgeleider, een combinatiefiltercube en een dual camera emissie splitsingscamerasysteem.
De microscoopopstelling moet worden aangesloten op een computer die beeldvormingssoftware draait die in staat is om beelden te verzamelen en te combineren die zijn vastgelegd door monochrome CCD-camera's. Hierbij wordt stream picks five multi-camera software gebruikt met de simul picks module. Begin door stream picks five in de taakbalk te openen, selecteer werkruimte.
Open vervolgens rechts op het scherm de werkruimtebeheerder en selecteer nieuwe werkruimte. Na het benoemen van de camera, volg de software-prompts om te selecteren uit een vooraf gevulde lijst, een grabber die overeenkomt met het cameramodel, er verschijnt een klein camerapictogram in de werkruimte om aan te geven dat de camerafeed wordt ontvangen. Objecten die met de microscoop zijn afgebeeld, kunnen nu op het scherm worden bekeken.
Herhaal dit proces voor de werkruimte van de tweede camera, vervolgens voor de samengevoegde werkruimte, herhaal dit nog een keer en alle camera's worden gebruikt. Er verschijnt een foutmelding. Deze melding is normaal en wijst aangewezen camera's van werkruimte één en twee toe aan de samengevoegde werkruimte in het dockingpaneel dat zich aan de rechterkant van het beeldscherm bevindt.
De beelden in werkruimte één en twee worden in de samengevoegde werkruimte gesuperponeerd als twee pseudo-gekleurde beelden. Het moeilijkste aspect van deze procedure is de camera-uitlijning. Om succes te garanderen, gebruiken we de fabrikantslide terwijl we de instructies van de fabrikant nauwgezet volgen.
Om de camera's in het dual camera emissie splitsingssysteem uit te lijnen, stuur licht met helder veld of fasecontrast naar het microscoopoogpunt. Plaats het metalen gecoate kalibratiescherm dat door de fabrikant is geleverd op de microscoopstandaard en maak het rooster op de microscoopstandaard vierkant. Toon het rooster zonder binning en zonder auto-scaling en breng het scherp en verplaats, maar verwijder niet de dichroische behuizing om camera één uit te lijnen.
Gebruik vervolgens de focusaanpassingsknop op seamount poort één om het beeld opnieuw scherp te stellen. Duw vervolgens de dichroische behuizing volledig in het dual kanaal acquisitieapparaat zodat het beeld door de dichroische wordt gesplitst naar beide camera's. Draai de 3 5 60 vierde inch stelschroeven los en draai de tweede camera op de vrouwelijke CM-montage poort twee tot de oriëntatie van het rooster identiek is in beide beelden met behulp van de focusaanpassingsknop op C-mount poort twee, breng het beeld van camera twee scherp.
Gebruik om de uitlijning te voltooien, de RL-knop aan de rechterkant van DC twee om de gecombineerde beeldposities aan te passen totdat de rechter lift. De verticale grens van de beelden precies is uitgelijnd in de samengevoegde werkruimte. Gebruik vervolgens de UD-knop om de up down-uitlijning van het tweede beeld aan te passen totdat de horizontale roosterbalken correct zijn uitgelijnd.
Als tijdens de up down-uitlijning een lichte camerarotatie optreedt, corrigeer dit probleem door de 3 5 60 vierde inch schroeven voor camera twee los te maken en te draaien tot het weergegeven beeld correct is uitgelijnd. Bereid BET 20 borstkankercellen voor op parallel plate flow chamber adhesie-assay door ze te kleuren met anti CD 24 en TECA 4 5 2 met behulp van LOR 5 68 en 4 88 secondaries zoals beschreven in het bijbehorende document, zorg ervoor dat u de juiste enkelkleurige controles bereidt na kleuring en giet cellen in het reservoir van de parallel plate flow chamber. Verbind twee afzonderlijke stukken slang met de inlaat- en uitlaatpoorten van de flowkamer.
Een buis zal verbinding maken met het reservoir dat de gelabelde cellen bevat die zijn opgeschort in DPBS plus bevattende 0,1% PSA. Verbind de andere buis met de spuitpomp, die vloeistof zal trekken met een gespecificeerde stromingssnelheid. Verbind een vacuümlijn met de flowkamer en plaats de flowkamer over de 35 millimeter weefselkweekschaal die een monolaag Chinese hamster eierstockcellen bevat die lectine of cho e cellen tot expressie brengen.
Stel de flowkamer en flowkamerpakking af om een adequate vacuümafdichting te garanderen. Trek vloeistof uit het reservoir en controleer de flowkamersamenstelling op een correcte afdichting. Plaats tenslotte de flowkamersamenstelling op de microscoop, zet de lichtbron en microscoopopstelling aan door middel van handmatige inspectie.
Zorg ervoor dat de dichroische behuizing zich in de juiste verzonken bedrijfspositie bevindt en zich niet in de bypassmodus bevindt. Schakel handmatig over naar de fluorescentiemodus en selecteer de groenrode fluorescentiefiltercube om de belichtingstijd en versterking afzonderlijk te bepalen. Beeld de cellen af met rode fluorescentie in camera één en groene fluorescentie
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een procedure voor het uitvoeren van een parallel plate flow chamber adhesie-assay met behulp van een dual camera emissie-splitsingssysteem. Het systeem maakt het mogelijk om tegelijkertijd real-time beeldsequenties in twee kleuren op te nemen, wat de kwaliteit van live celbeeldvorming verbetert.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Fluorescentiemicroscopie
- Live celbeeldvorming
- Cel adhesie-assays
Achtergrond
- Dual camera systemen verbeteren de beeldvormingscapaciteiten.
- Real-time beeldvorming is cruciaal voor live cel-assays.
- Hoge temporele resolutie is noodzakelijk voor nauwkeurige dataverzameling.
- Emissie-splitsing maakt gelijktijdige kleurbeeldvorming mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om adhesie-assays uit te voeren met behulp van geavanceerde beeldvormingstechnieken.
- Om de voordelen van dual camera systemen ten opzichte van enkele camera opstellingen aan te tonen.
- Om hoogwaardige dual kleur beelden in real-time vast te leggen.
Gebruikte methoden
- Uitlijning van dual camera's voor optimale beeldvorming.
- Voorbereiding van cellen en substraten voor de assay.
- Calibratie van camera-instellingen voor tweekleurige acquisitie.
- Opname van beeldsequenties die hoge temporele resolutie demonstreren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle acquisitie van dual kleur beelden.
- Hoge temporele resolutie bereikt in beeldsequenties.
- Verschillende belichtingstijden kunnen aan elke camera worden toegewezen.
- Volledig gezichtsveld wordt behouden tijdens beeldvorming.
Conclusies
- Dual camera systemen verbeteren de kwaliteit van fluorescentiemicroscopie.
- Real-time beeldvorming is haalbaar met hoge resolutie.
- Deze methode is voordelig voor live cel adhesie studies.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Real-time dual-color imaging enables precise tracking of molecular dynamics in live cell adhesion assays, critical for de-risking metastasis and inflammation targets. The dual camera emission splitting system provides high temporal resolution without sacrificing field of view, supporting quantitative analysis of rapidly moving cells. This capability strengthens predictive confidence in early discovery by revealing colocalization patterns of adhesion molecules under physiological flow conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of spatial distribution and colocalization of adhesion molecules like CD24 and HECA452 on circulating tumor cells.
- Operational Value: Supports hypothesis testing of how molecular localization affects cell rolling, adhesion, and transmigration under flow.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates spatially identical, fluorophore-specific image pairs for accurate multiplexed detection in flow-based assays.
- Operational Value: Allows independent exposure time optimization per channel to minimize bleed-through and maximize signal fidelity.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models cancer metastasis mechanisms by perfusing labeled cancer cells over reactive substrates expressing endothelial ligands.
- Operational Value: Maintains full field of view and high temporal resolution to capture rare adhesion events in dynamic systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by providing quantitative, real-time readouts of molecular interactions during cell adhesion, directly informing lead identification decisions.
- Discovery Biology: Enables mechanistic de-risking of targets by visualizing adhesion molecule dynamics in live cells under shear stress.
- Screening: Delivers standardized, reproducible dual-color outputs suitable for assay automation and compound screening campaigns.
- Analytics: Produces synchronized image sequences with precise temporal alignment for colocalization and motility analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro adhesion findings to in vivo relevance by simulating physiological flow conditions in metastasis models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for multi-parametric live cell analysis across oncology, immunology, and cardiovascular projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by directly observing molecular co-distribution on migrating cells.
- Operational Value: Ensures reproducibility through precise camera alignment protocols and digital correction tools.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing visual evidence of target engagement in dynamic, physiologically relevant contexts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of adhesion targets based on functional validation under flow.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and camera alignment using manufacturer calibration grids.
- Needs inverted epi-fluorescence microscope with high-intensity light source, filter cubes, and dual camera emission splitting hardware.
- Depends on imaging software capable of monochrome camera control, image merging, and spatial registration (e.g., StreamPix with SimulPix module).
- Involves standardization of cell preparation, staining protocols, and flow chamber assembly for consistent adhesion measurements.
- Limited by the need for careful bleed-through correction when using spectrally overlapping fluorophores in dual-channel detection.
