Gelijktijdig vastleggen van real-time beelden in Two Emissie Kanalen Met een Dual Camera Emission Splitting Systeem: Toepassingen op Hechting Cell

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van een adhesie-assay in een parallelle plaatstroomkamer met behulp van een systeem voor emissiesplitsing met twee camera's om gelijktijdig realtime beeldsequenties in twee kleuren vast te leggen. Hiervoor worden eerst de twee camera's op de beeldvormingsopstelling uitgelijnd. Vervolgens worden de cellen en het reactieve substraat voorbereid en wordt de parallelle plaatstroomkamer opgezet.

De camera-instellingen worden vervolgens gekalibreerd voor de acquisitie van beelden in twee kleuren en eventuele benodigde digitale correcties aan de camera-uitlijning worden doorgevoerd. Vervolgens worden beeldsequenties vastgelegd, die aantonen dat beelden in twee kleuren met een hoge temporele resolutie kunnen worden geacquireerd. Het voordeel van emissiesplit-systemen met twee camera's ten opzichte van systemen met één camera is dat er verschillende belichtingstijden aan elke camera kunnen worden toegewezen en het volledige gezichtsveld behouden blijft.

Deze techniek kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van celadhesie, zoals de vraag hoe de lokalisatie van adhesiemoleculen op het celoppervlak dynamische biologische processen zoals celmigratie, inflammatie en kankermetastase kan beïnvloeden. De volgende procedure vereist een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop. Deze moet zijn uitgerust met een lichtbron met hoge intensiteit gekoppeld aan een lichtgeleider, een combinatiefilterkubus en een camerasysteem met dubbele emissiesplitsing.

De microscoopopstelling moet worden verbonden met een computer waarop beeldsbehandelingssoftware draait die in staat is om beelden vastgelegd door monochrome CCD-camera's te verzamelen en te combineren. Hier wordt stream picks five multi-camera software gebruikt met de simul picks module. Begin met het openen van stream picks five en selecteer workspace in het taaklint.

Open vervolgens uiterst rechts op het scherm de workspace manager en selecteer 'new workspace'. Nadat de camera is benoemd, volgt u de aanwijzingen van de software om uit een vooraf ingevulde lijst een grabber te selecteren die overeenkomt met het cameramodel; er verschijnt een klein camera-icoon in de workspace om aan te geven dat het camerabeeld wordt ontvangen. Objecten die met de microscoop worden afgebeeld, kunnen nu op het scherm worden bekeken.

Herhaal dit proces voor de tweede camera-werkruimte; herhaal dit vervolgens nogmaals voor de samengevoegde werkruimte, waarna alle camera's in gebruik zijn. Er zal een foutmelding verschijnen. Deze melding is normaal; wijs de camera's van werkruimte één en twee toe aan de samengevoegde werkruimte in het dockingpaneel aan de rechterkant van het weergavevenster.

De beelden in werkruimte één en twee worden in de samengevoegde werkruimte over elkaar gelegd als twee pseudogekleurde beelden. Het meest uitdagende aspect van deze procedure is de uitlijning van de camera. Om succes te garanderen, gebruiken we de objectglas van de fabrikant terwijl we de instructies van de fabrikant nauwgezet opvolgen.

Om de camera's in het emissiesplitsingssysteem met dubbele camera uit te lijnen, stuurt u brightfield- of fasecontrastlicht naar het oculair van de microscoop. Plaats het door de fabrikant meegeleverde metaalgecoate kalibratierooster op de microscooptafel en richt het rooster haaks op de microscooptafel. Toon het rooster zonder binning en zonder automatische schaling, stel het scherp en verplaats vervolgens de dichroïsche behuizing, zonder deze te verwijderen, om camera één uit te lijnen.

Gebruik vervolgens de focusinstelknop op seamount-poort één om het beeld opnieuw scherp te stellen. Schuif daarna de dichroïsche behuizing volledig in het apparaat voor dual-channel acquisitie, zodat het beeld door de dichroïsche spiegel naar beide camera's wordt gesplitst. Draai de 3/60 inch stelschroeven los en roteer de tweede camera op female CM-montagepoort twee totdat de oriëntatie van het raster in beide beelden identiek is. Gebruik de focusinstelknop op C-montagepoort twee om het beeld van camera twee scherp te stellen.

Om de uitlijning te voltooien, gebruikt u de RL-knop aan de rechterkant van DC twee om de gecombineerde beeldposities aan te passen totdat de rechter verticale grens van de beelden precies is uitgelijnd in de samengevoegde werkruimte. Gebruik vervolgens de UD-knop om de verticale uitlijning van het tweede beeld aan te passen totdat de horizontale rasterbalken correct zijn uitgelijnd.

Als er tijdens de verticale uitlijning een lichte rotatie van de camera optreedt, corrigeer dit probleem dan door de 3 5 60 fourth inch schroeven voor camera twee los te draaien en te draaien tot het weergegeven beeld correct is uitgelijnd. Bereid BET 20 borstkankercellen voor voor de adhesie-assay in een parallelle plaatstroomkamer door ze te kleuren met anti CD 24 en TECA 4 5 2 met behulp van LOR 5 68 en 4 88 secundaire antikopers, zoals beschreven in het bijbehorende document; zorg ervoor dat de juiste enkelkleurcontroles worden voorbereid. Dispenseer na het kleuren de cellen in het reservoir van de parallelle plaatstroomkamer. Sluit twee afzonderlijke stukken slang aan op de inlaat- en uitlaatpoorten van de stroomkamer.

Eén slang wordt verbonden met het reservoir dat de gelabelde cellen bevat, gesuspendeerd in DPBS met toevoeging van 0,1% PSA. Verbind de andere slang met de spuitpomp, die vloeistof met een gespecificeerde stroomsnelheid zal onttrekken. Verbind een vacuümlijn met de stroomkamer en positioneer de stroomkamer boven de 35 millimeter weefselkweekschaal die een monolaag van Chinese hamster ovary-cellen bevat die lectine tot expressie brengen of cho e-cellen.

Stel de stroomkamer en de pakking van de stroomkamer zo in dat een adequate vacuümafsluiting wordt gegarandeerd. Trek vloeistof uit het reservoir terwijl u de stroomkamerassemblage controleert op een goede afdichting. Plaats tot slot de stroomkamerassemblage op de microscoop en schakel de lichtbron en de microscoopopstelling in via een handmatige inspectie.

Zorg ervoor dat de dichroïsche behuizing zich in de juiste ingedrukte werkstand bevindt en niet in de bypass-modus staat. Schakel handmatig over naar de fluorescentiemodus en selecteer de groen-rode fluorescentiefilterkubus om de belichtingstijd en gain afzonderlijk te bepalen. Beeld de cellen af met rode fluorescentie in camera één en groene fluorescentie in camera twee.

Druk handmatig op de dichroïsche spiegel indien nodig om de beelden te verkrijgen. Breng vervolgens een suspensie aan van BT 20-cellen die enkel met rode flora zijn gekleurd. Vier geconjugeerde antilichamen in het reservoir dat is verbonden met de inlaatpoort van de parallelle plaatstroomkamer.

Gebruik de spuitenpomp om BT 20-cellen over de choi-monolaag in de parallelle plaatstroomkamer te perfunderen. Pas in de live-instellingen van de beeldvormingssoftware de belichtingstijd van camera één aan om een beeld in het rode kanaal te verkrijgen. Stem de belichtingstijd van camera twee af op de belichtingstijd van camera één.

Als er een beeld zichtbaar is in het groene kanaal, zijn er bleed-through artefacten aanwezig. Als dit gebeurt, houd dan de belichtingstijd in camera één en camera twee gelijk en verminder de belichtingstijd totdat het bleed-through artefact niet langer zichtbaar is in het groene kanaal. Pas indien nodig de gain van camera één aan om de zichtbaarheid van het beeld in het rode kanaal te verbeteren.

Verwijder vervolgens alle resterende BT 20-celсусpensie uit het reservoir en vervang de suspensie door DPBS. Gebruik de spuitenpomp om de oplossing over de choi-monolaag te perfunderen totdat de BT 20-cellen niet langer zichtbaar zijn op de monolaag. Vul het reservoir opnieuw met de suspensie van BT 20-cellen die enkel zijn gekleurd met groen fluoro four-geconjugeerd antilichaam.

Herhaal het cameraproces voor kalibratie met behulp van de groene enkelkleurige controles. Bepaal ditmaal de belichtingstijd met camera twee om cellen in het groene kanaal af te beelden zonder bleed-through artefacten in het rode kanaal die door camera één worden geregistreerd. Gebruik de imaging-software om gelijktijdig beelden te bekijken die zijn vastgelegd door de twee monochrome CCD-camera's in de flowkamer.Experiment.

Voeg de beelden die met beide camera's zijn verzameld samen met behulp van de simul pics-module van stream picks. Gebruik digitale correctie-instellingen in simul pic of alternatieve software om de samengevoegde beelden ruimtelijk uit te lijnen. Indien nodig kunnen de beelden met de simul PIC-module worden gecorrigeerd voor horizontale, verticale en rotationele aanpassingen.

Het systeem is nu klaar voor gebruik om gelijktijdig twee kleurenbeelden vast te leggen. Een adhesie-assay in een parallelle plaatstroomkamer werd gebruikt om het systeem voor emissiesplitsing met dubbele camera's te demonstreren, zoals beschreven in deze video. Zoals hier te zien is, detecteerde het systeem BT 20-cellen die fluorescent waren gelabeld met anti-human CD 24 (weergegeven in rood) en HECA 4 52, dat bindt aan SCO-gerelateerde moleculen (weergegeven in groen).

Sommige rollende cellen vertoonden rode maar geen groene signalen. Andere vertoonden groene maar geen rode signalen, en nog andere cellen vertoonden zowel rode als groene signalen. De camera's behielden de optische en temporele resolutie om celkenmerken te volgen terwijl een cel tuimelde en over zich heen rolde op het reactieve substraat in de richting van de stroom; samengevoegde emissiekanalen onthulden de distributie en colocalisatie van CD 24 en sated-moleculen op het oppervlak van BT 20-cellen die rolden en hechtte aan CHO e-monolagen.

Deze afbeeldingen tonen een vergroting van een enkele BT 20-cel waarin CD 24- en sated-moleculen colokaliseren en verschijnen als geel tot oranje stippen wanneer de rood en groen pseudogekleurde emissiekanalen worden samengevoegd. Gezien in samenhang demonstreert deze informatie dat het duale camerasysteem voor emissiesplitsing beschikt over de ruimtelijke, temporele en optische resolutie die nodig is om cellulaire en moleculaire kenmerken te onthullen in toepassingen zoals adhesie-assays in stromingskamers, waarbij cellen zich snel door het gezichtsveld bewegen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van het opzetten en kalibreren van een dual-camera emissie-splitsingssysteem voor het in real-time in twee kleuren afbeelden van een adhesie-assay in een parallelle plaatstroomkamer. Deze methode kan worden toegepast op andere in vitro assays die fluorescentie gebruiken om celgedrag te bestuderen.