Drie-dimensionale confocale analyse van microglia / macrofagen Markers van Polarisatie in Experimentele Hersenletsel
4 september 2013
Een manier om nieuwe inzichten te verkrijgen in de complexiteit van de inflammatoire hersenreactie wordt gepresenteerd. We beschrijven immunofluorescence-gebaseerde protocollen gevolgd door driedimensionale confocale analyse om het patroon van co-expressie van microglia/macrofaagfenotypemarkers in een muismodel van focale ischemie te onderzoeken.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de expressie en cellulaire lokalisatie van microglia-macrofaagfenotypemarkers te visualiseren na hersenischemie. Eerst worden cryosecties van ischemische muizenhersenen gekleurd om markers van microglia-macrofaagactivatie te identificeren. De gekleurde secties worden onderworpen aan driedimensionale confocale beeldvorming.
De resulterende beelden worden vervolgens verwerkt om driedimensionale renderings te genereren en er wordt beeldafbeeldanalyse uitgevoerd om de expressie van markeren in clusters van cellen te lokaliseren. De resulterende gegevens tonen de effectiviteit van driedimensionale confocale analyse aan bij het correct toewijzen van markerexpressie aan een specifiek cellulair lichaam. Wanneer twee markers door dezelfde cel worden tot expressie gebracht, maar in verschillende subcellulaire compartimenten, kan co-lokalisatie alleen niet erg informatief zijn. Het gebruik van driedimensionale analyse, zoals we hier zullen demonstreren, zorgt voor een betere resolutie en nauwkeurigheid.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in de complexiteit van de hersenreactie op ischemische schade, kan deze ook worden toegepast op andere acute of chronische aandoeningen waarbij een dubbele rol voor microglia-macrofagen bij letsel en herstel is voorgesteld. Of in die gevallen waarin signalen selectief in verschillende speciale vlakken moeten worden gelokaliseerd, zullen Carlo Perigo en Stefan van Magali u door de verschillende stappen van de procedure leiden. Het volgende protocol maakt gebruik van muizenhersenweefsel waarin ischemie werd geïnduceerd door permanente occlusie van de middelste hersenslagader.
Gebruik een cryostaat om seriële 20 micron coronale secties van de hersenen op gelatine te verzamelen. Breng bedekt glas voor gebruik alle reagentia en monsters naar kamertemperatuur. Let op, de werkverdunning van antilichamen en serum vermeld in hun bijbehorende document resulteerde uit proeven die zijn gemaakt om de beste prestaties te behalen wanneer verschillende antilichamen en serum worden gebruikt.
Protocol moet worden gevalideerd. Begin door de secties op de glijbaan in te cirkelen met een vloeibare blokkeerstift om de hoeveelheid benodigde reagentia te minimaliseren. Plaats vervolgens de hersensecties in een natte kamer met behulp van een pipet van één milliliter.
Voeg PBS bij kamertemperatuur toe aan de secties en incubeer gedurende vijf minuten om ze te wassen. Vervolgens verwijdert u de oplossing met behulp van een wegwerpspuit met naald van één milliliter en herhaalt u de wassing nog een keer. Na verwijdering van de tweede wassing, gaat u verder met het kleuren van de monsters met behulp van een pipet van één milliliter en een wegwerpspuit voor alle oplossingsuitwisselingen. De kleurprocedure moet worden uitgevoerd zoals samengevat.Hier.
Zie de bijbehorende tekst voor details, inclusief wasstappen. Eerst worden de cellen gedurende een uur geïncubeerd met 1% waterstofperoxide na blokkering met normaal geitenserum. Ze worden geïncubeerd met primaire antilichaam tegen CD 11 B. Vervolgens worden de glijbanen gedurende een uur geïncubeerd met een geschikt secundair antilichaam gevolgd door triss, NACL tween-buffer of TNT, vervolgens triss, H-C-L-N-A-C-L, blokkerende buffer of TNB na de incubatie met TNB.
De glijbanen worden gedurende een uur geïncubeerd met streptavidin HRP gevolgd door versterkingsverdunning met cyanide vijf tyrom, die het immunofluorescente signaal zal versterken. Vervolgens worden de glijbanen gedurende een uur geïncubeerd met NGS om niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren. Daarna worden ze geïncubeerd met een primaire antilichaam tegen CD 68.
Na de incubatie met het primaire antilichaam worden de cellen vervolgens gedurende een uur geïncubeerd in het juiste Fluor-geconjugeerde secundaire antilichaam, gevolgd door één microgram per milliliter haken om het DNA te labelen. Zodra de kleuring is voltooid, monteer cryosecties met verlengd goud bij het monteren van secties, vermijd het genereren van luchtbellen. Bewaar de secties bij vier graden Celsius in het donker totdat ze worden geanalyseerd.
Verwerving van het fluorescente signaal moet binnen een week worden uitgevoerd. Dit protocol maakt gebruik van een IX 81 microscoop uitgerust met een confocale scaneenheid FV 500 met drie laserlijnen argon krypton bij 488 nanometer helium neon rood bij 646 nanometer en helium neon groen bij 532 nanometer plus een UV-diode in de flu van U 500 software. Selecteer de juiste excitatielasers en dichroïsche spiegels.
Stel ook de beeldresolutie in op minimaal 800 bij 600 pixels. Plaats vervolgens de glijbaan op het podium van de microscoop en identificeer met behulp van epifluorescentie een gebied van belang, verhoog geleidelijk de vergroting tot het 40 x objectief. Schakel vervolgens over naar laserscanning microscopie en voer repetitieve scans uit terwijl u het vermogen van de fotomultiplier en de versterking voor elk kanaal aanpast.
Dit zal de signaaloverlapping verminderen die wordt veroorzaakt door gelijktijdige excitatie op verschillende golflengten. Houd de versterking zo laag mogelijk om ongewenste niet-specifieke signalen te voorkomen. Door de repetitieve scan te continueren, pas de focus aan en definieer de onderste en bovenste uitersten van de Z-as met een totale Z-aslengte van 10 microns.
Stop vervolgens met de repetitieve scan. Voer vervolgens de stapgrootte in. Deze moet zo dicht mogelijk bij de pixelgrootte zijn, die 0,225 microns is.
Dit geeft een standaard een-op-een grootteverhouding over de Z-as in de software Activeer kalman-filter ten minste twee keer. Het kalman-algoritme is een iteratieve functie die willekeurige signalen elimineert, zoals enkele positieve voxels die tot achtergrondruis behoren, waardoor de signaal-ruisverhouding wordt verbeterd. Activeer nu de sequentiële scanmodus om doorlaateffecten te voorkomen.
Ga naar het middenpunt van de Z-as en voer een XY-sequentiële scan uit. Controleer de instelling van PMT en versterking om een bevredigende signaal-ruisverhouding te garanderen. Voer XY, Z-acquisitie uit na de acquisitie.
Exporteer de gegevens als een multi TIF-bestand. Elk multi TIF-bestand bevat doorgaans drie kleurkanalen en 44 focale vlakken voor verwerking. Begin met het openen van
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode om de expressie en lokalisatie van fenotype-markers voor microglia/macrofagen te visualiseren in een muismodel van focale ischemie. Met behulp van immunofluorescentie en driedimensionale confocale beeldvorming beoogt het onderzoek het begrip van de inflammatoire respons van de hersenen te verbeteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Immunologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Microglia en macrofagen spelen een cruciale rol bij hersenontstekingen.
- Het begrijpen van hun activatiepatronen is essentieel voor het bestuderen van ischemische aandoeningen.
- Driedimensionale beeldvormingstechnieken kunnen betere inzichten bieden in cellulaire interacties.
- Colocalisatie van markers onthult mogelijk niet volledig de cellulaire dynamiek.
Doel van de studie
- Om microglia/macrofaagactivatie na herschischemie te visualiseren.
- Om de resolutie van de analyse van markerexpressie te verbeteren.
- Om de effectiviteit van driedimensionale confocale beeldvorming in neurowetenschappelijk onderzoek aan te tonen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van cryosecties van ischemische muizenhersenen.
- Immunofluorescentiekleuring om microglia/macrofaagmarkers te identificeren.
- Driedimensionale confocale beeldvorming voor gedetailleerde visualisatie.
- Beeldanalyse om de expressie van markers in cellulaire clusters te lokaliseren.
Belangrijkste resultaten
- Driedimensionale beeldvorming maakt een nauwkeurige toewijzing van marker-expressie mogelijk.
- Markers kunnen tot expressie komen in verschillende subcellulaire compartimenten.
- Een verbeterde resolutie biedt betere inzichten in cellulaire interacties.
- De methodologie vertoont aanzienlijk potentieel voor toekomstige studies.
Conclusies
- Driedimensionale confocale analyse is effectief voor het bestuderen van hersenontstekingen.
- Inzicht in de dynamiek van microglia/macrofagen is cruciaal voor therapeutische strategieën.
- Deze benadering kan worden toegepast op verschillende modellen van hersenletsel.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Driedimensionale confocale analyse van microglia/macrofaag-polarisatiemarkers maakt een precieze ruimtelijke en fenotypische mapping van neuroinflammatoire responsen in preklinische modellen van hersenletsel mogelijk. Deze mogelijkheid vergroot het voorspellend vertrouwen bij de validatie van targets en het mechanistisch reduceren van risico's voor geneesmiddelenonderzoek gericht op neuroinflammatie. De aanpak ondersteunt de translationele continuïteit door kwantitatieve data met een hoge resolutie te leveren over immuunceldynamiek die relevant zijn voor het testen van therapeutische hypothesen en portfolio-triage.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar activatietoestanden en ruimtelijke distributie van microglia/macrofagen na hersenletsel.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door pro- en anti-inflammatoire fenotypes op cellulair niveau te onderscheiden.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door co-expressie en lokalisatie van markers in ziekterelevent weefsel te verduidelijken.
- Levert kwantitatieve resultaten voor hypothesegestuurde beslissingen over de verdere ontwikkeling van de portfolio.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Bereidt gevalideerde weefselsneden en markerpanels voor voor downstream imaging- en analyseworkflows.
- Standaardiseert immunofluorescentie- en confocale imaging-protocollen voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Genereert kwantitatieve, multi-channel read-outs die geschikt zijn voor comparatieve evaluatie van verbindingen.
- Maakt betrouwbare beoordeling van marker-colocalisatie en cellulaire heterogeniteit in screeningsassays mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Stemt overeen met ziekterelateerde modellen van neuroinflammatie en letsel voor de translationele ontdekking van biomarkers.
- Ondersteunt de continuïteit van vroege ontdekking tot preklinische validatie door longitudinale fenotypische analyse mogelijk te maken.
- Levert risico-gecorrigeerde gegevens voor het verder ontwikkelen van neuroinflammatoire targets richting preklinische ontwikkeling.
- Verhoogt de voorspellende waarde voor therapeutische modulatie van immuuncelfenotypen in het CZS.
Pipeline- & workflowintegratie
Deze methode integreert in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek door hoogresolutie, kwantitatieve analyse van immuuncelfenotypen in modellen voor hersenletsel mogelijk te maken.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten en het verduidelijken van pathways door het in situ in kaart brengen van markerexpressie en colocalisatie.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve imaging-resultaten voor assay-ontwikkeling en de evaluatie van verbindingen.
- Analytiek: Biedt multidimensionale metingen en statistische outputs voor het vergelijken van experimentele condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt cellulaire fenotypering met ziekterelevante eindpunten en biomarkerstrategieën.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar imaging- en analyseplatform voor diverse neuroinflammatoire modellen en letselmodellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in onderzoek naar neuroinflammatie.
- Operationele waarde: Standaardiseert imaging- en analyseworkflows voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over studies heen.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en kapitaalallocatie door het leveren van robuuste fenotypische gegevens.
- Portfolio-impact: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van neuroinflammatoire targets en therapeutische strategieën mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in immunofluorescentie, confocale microscopie en software voor beeldanalyse.
- Vereist toegang tot geavanceerde beeldgevingsinstrumentatie en computationele infrastructuur.
- Noodzaakt standaardisatie van kleuringsprotocollen en beeldgevingsparameters over verschillende teams heen.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende weefseltypen of ziektemodellen, afhankelijk van de selectie van markers.
- Afhankelijk van de validatie van antilichaamspecificiteit en beeldresolutie voor een nauwkeurige kwantificering.
