Name: Drie-dimensionale confocale analyse van microglia / macrofagen Markers van Polarisatie in Experimentele Hersenletsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Leer driedimensionale confocale analyse van microglia- en macrofaagpolarisatiemarkers in een muismodel van focale ischemie. Deze methode verbetert de resolutie van markerexpressie en celinteracties in hersenontstekingsonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Stefano Fumagalli is een medewerker van de Monzino Foundation.

1. Immunofluorescentie Het volgende protocol wordt uitgevoerd op vriescoupes coronale hersenen verkregen transcardiale perfusie muizen (20 ml PBS, 0,1 mol / l, pH 7,4, gevolgd door 50 ml koud 4% paraformaldehyde in PBS). Na perfusie worden hersenen zorgvuldig verwijderd en overgebracht naar 30% sucrose in PBS bij 4 ° C overnacht voor cryobescherming. De hersenen worden vervolgens snel bevroren door onderdompeling in isopentaan bij - 45 ° C gedurende 3 min voordat ze verzegeld in flesjes en opgeslagen bij -70 ° C tot gebruik. Coronale hersenen cryosecties (20 micrometer) worden serieel gesneden en onderworpen aan immunofluorescentie protocol 11, 6. Breng alle reagentia en monsters op kamertemperatuur voor gebruik. Houd er rekening mee dat de gepresenteerde werken verdunningen van antilichamen en het serum het gevolg van proeven gedaan om de beste prestatie te verkrijgen. Wanneer verschillende antilichamen en serum wordt gebruikt, dit protocol moet worden gevalideerd. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Merk op dat omdat zowel anti-CD11b en anti-CD68 primaire antilichamen worden gemaakt in de rat, om cross-signaal te voorkomen door anti-rat Alexa 546, gebruikten we een sterke verdunning van anti-CD11 b gevolgd door fluorescerend signaalversterking met TSA kit (Cy5 tyramide). Wij hebben opgezet optimaal werkverdunning voor anti-CD 11 b na door de protocol behalve stap 1,17 en met ten minste 7 verschillende verdunningen van anti-CD 11 b volgens tabel 1. Hierdoor is 1:30.000 gekozen als enige verdunning bereiken: 1) zichtbaar signaal met Cy5 aan excitatiegolflengte 646 nm, 2) geen signaal met Alexa 546 in excitatiegolflengte 532 nm. Zo wordt Alexa 546 fluorescentiesignaal selectief verbonden CD68 expressie. De optimale verdunningen voor anti-CD 11 en anti-CD68 antilichamen kunnen variëren afhankelijk van het soort weefsel en moeten vóór de co-labeling protocol beginnen gedefinieerd. <ol><li> Was hersenen vriescoupes tweemaal met PBS. </li><li> Incubate cryosecties gedurende 5 min in PBS met 1% H 2 O 2 (stap nodig omdat de fluorescerende versterking nodig heeft incubatie met mierikswortelperoxidase, streptavidine-HRP, zie stap 1.12). </li><li> Was vriescoupes 2x met PBS. </li><li> Incubeer cryosecties gedurende 60 min in PBS bevattende 10% NGS en 0,3% Triton. </li><li> Incubeer vriescoupes bij 4 ° C geïncubeerd in PBS die primaire Ab Rat anti-CD 11 b [1:30.000], 10% NGS en 0,3% Triton. </li><li> Wash vriescoupes 2x (5 min) met PBS. </li><li> Incubeer cryosecties gedurende 60 min in PBS met gebiotinyleerde secundaire anti-rat Ab [1:200] en 1% NGS. </li><li> Was vriescoupes 2x met PBS. </li><li> Was cryosecties met TNT (Tris-HCl, NaCl, Tween: 0.1 M TRIS-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20). </li><li> Incubeer cryosecties gedurende 1,5 uur in TNB (Tris-HCl-NaCl-Blocking buffer: 0,1 M TRIS-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,5% blokkeren van geschikte reagens kit (zie tabel reagentia)). </li><li> Wassen cryosecties 3x keer met TNT. </li><li> Incubeer cryosecties in TNB met streptavidine-HRP [1:100]. </li><li> Wassen cryosecties 3x met TNT. </li><li> Incubeer cryosecties gedurende 8 min in Amplification Diluent met Cyanine 5 tyramide [1:300]. </li><li> Wassen cryosecties 3x met PBS. </li><li> Incubeer cryosecties gedurende 60 min in PBS bevattende 10% NGS en 0,1% Triton. </li><li> Incubeer vriescoupes bij 4 ° C geïncubeerd in PBS die primaire Ab Rat anti-CD68 [1:200], 3% NGS en 0,3% Triton. </li><li> Wassen cryosecties 3x met PBS. </li><li> Incubeer cryosecties gedurende 60 min in PBS met fluorconjugated secundaire Ab Alexa 546 anti-rat [1:500] en 1% NGS. </li><li> Wassen cryosecties 3x met PBS. </li><li> Incubeer cryosecties gedurende 10 min in PBS bevattende Hoechst 1 ug / ml. </li><li> Wassen cryosecties 3x met PBS. </li><li> Monteer cryosecties in Prolong Gold. </li></ol> 2. Overname van driedimensionale beelden door confocale microscopie <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; De microscoop hier gebruikte was een IX81 microscoop uitgerust met een confocale scan unit FV500 met 3 laserlijnen: Ar-Kr (488nm), He-Ne rood (646nm), en He-Ne groen (532nm) en UV diode. <ol><li> Selecteer de excitatie lasers afhankelijk van de golflengte van de fluorescente kleurstoffen te worden opgewekt (He-Ne rood voor Cy5, CD 11 b, He-Ne groen voor Alexa546, CD68 en UV diode Hoechst, kernen). </li><li> Selecteer de beste dichroïsche spiegel combinatie voor lichte collectie signaal. </li><li> Opgezet beeldresolutie met een minimum van 800 x 600 pixels. </li><li> Identificeer een gebied van belang met behulp van epi-fluorescentie en geleidelijk verhogen van de vergroting van de 40X doelstelling. </li><li> Schakel over naar laser scanning microscopie (LSM) modaliteit. </li><li> Run herhaalde scans om de photomultiplier (PMT) en de versterking voor elk kanaal. Lasers kunnen afzonderlijk worden ingeschakeld om de set-up te vergemakkelijken. Houd versterking zo laag mogelijk ongewenste niet-specifieke signalen te voorkomen. </li><li> Met Repeonderhevige scan uitgevoerd, verplaats de focusbesturing lagere en hogere uitersten van de z-as (totale lengte z-as = 10 pm) te definiëren. </li><li> Stop repetitieve scan. </li><li> Definieer stapgrootte. Het moet zo dicht mogelijk bij pixelgrootte (0.225 urn) een standaard formaat 01:01 verhouding te verkrijgen over de z-as zijn. </li><li> Activeer Kalman filter minstens 2 keer. </li><li> Activeer sequentiële scan mode te bloeden-through effecten te vermijden. </li><li> Ga halverwege langs de z-as en uitvoeren van een xy sequentiële scan. Controleer de set-up van PMT en versterking (goede signaal / ruisverhouding). Zo niet bevredigend is, herhaal dan stap 2.6. </li><li> Run xyz overname. </li><li> Gegevens als multitiff bestand exporteren. Elke multitiff bestand bevat meestal 3 kleurkanalen (blauw, groen en rood) en 44 focale vliegtuigen. </li></ol> 3. Drie-dimensionaal beeld van confocale Acquisities en Driedimensionale Rendering Upload multitiff bestanden naar Imaris software en verwerken ze als volgt: <ol><li>Open software. </li><li> Selecteer het overtreffen uitzicht. </li><li> Upload het multitiff bestand. </li><li> Selecteer de gewenste kleur voor elk kanaal. </li><li> Verwijder ruis uit de achtergrond door het verhogen van de minimale waarde op het scherm aanpassen. Stel elk kanaal afzonderlijk. </li><li> Ga naar de doorsnede. Bewegen langs de z-as zoekt co-lokalisatie (geel pixels). </li><li> Klik op een geel gebied te zien of de colocalization onderhavige langs de z-as (dus behoort tot een voorwerp) is. Z-as projecties zijn zichtbaar in de rechter-en onderkant van de figuur. </li><li> Neem een ​​momentopname. </li><li> Ga terug naar de weergave overtreffen. </li><li> Gewas 3D een cel of een cluster van cellen te isoleren. </li><li> Selecteer een kanaal op het scherm aanpassen. </li><li> Selecteer het overtreffen / oppervlakken algoritme bouwer. Algoritme stappen: <ol><li> Selecteer kanaal. </li><li> Definieer drempel (gebruik van dezelfde minimale waarde in thij aanpassing paneel weer te geven). </li><li> Definieer resizen. </li><li> Definieer smoothing (best = 0,200). </li><li> Definieer kleurweergave. </li><li> Eindigen algoritme. </li></ol></li><li> Herhaal stap 3.12 voor elk kanaal. </li><li> Deselecteer fluorescentie kanalen op het scherm aanpassen en selecteer alle drie vlakken. </li><li> Beweeg de volumeregelaar om het beste uitzicht te vinden. </li><li> Neem een ​​momentopname. </li></ol>

<ol><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li>
<li>Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+activation+in+stroke%3A+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Microglial activation in stroke: therapeutic targets.</a> Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).</li>
<li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunology+of+stroke%3A+from+mechanisms+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nat. Med. 17, 796-808 (2011).</li>
<li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke%3A+role+of+inflammatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 779-789 (2010).</li>
<li>Schilling, M., Besselmann, M., Muller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predominant+phagocytic+activity+of+resident+microglia+over+hematogenous+macrophages+following+transient+focal+cerebral+ischemia%3A+an+investigation+using+green+fluorescent+protein+transgenic+bone+marrow+chimeric+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice.</a> Exp. Neurol. 196, 290-297 (2005).</li>
<li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia%2Fmacrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> Journal of Neuroinflammation. 8, 174-193 (2011).</li>
<li>Zanier, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+blood+mesenchymal+stem+cells+protect+mice+brain+after+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+CareMed%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma.</a> Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).</li>
<li>Capone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosphere+derived+cells+exert+a+neuroprotective+action+by+changing+the+ischemic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment.</a> PLoS ONE. 2, e373(2007).</li>
<li>Bhatia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+ofalternatively+activated+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943(2011).</li>
<li>Raes, G., Noel, W., Beschin, A., Brys, L., de Baetselier, P., Hassanzadeh, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIZZ1+and+Ym+as+tools+to+discriminate+between+differentially+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">FIZZ1 and Ym as tools to discriminate between differentially activated macrophages.</a> Dev. Immunol. 9, 151-159 (2002).</li>
<li>Gesuete, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+C1+inhibitor+in+brain+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury.</a> Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+plasticity+and+polarization%3A+in+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

We presenteren hier immunofluorescence-gebaseerde protocollen gevolgd door driedimensionale confocale analyse als een krachtige benadering om lokalisatie en co-expressie van M/M fenomenmarkers in het ischemische gebied te onderzoeken (zie ref 6 voor een meer gedetailleerde analyse). Deze methode combineert specifieke kleuring van relevante marker van M/M activering met driedimensionale confocale beeldvorming. De fijne afstemming van antilichamen, serum en geconjugeerde werkverdunningen fluor laat een optimaa...

Na een acuut hersenletsel, worden microglia snel geactiveerd en ondergaan dramatische morfologische en fenotypische veranderingen 1-3. Deze intrinsieke reactie wordt geassocieerd met de aanwerving van bloed geboren macrofagen, die migreren naar de verwonde hersenen parenchym 4,5. De rol van microglia en macrofagen die antigeen zijn niet te onderscheiden (hierna te noemen M / M) in hersenletsel is nog steeds gedebatteerd. Een toenemend aantal studies blijkt dat, overeenkomstig hetgeen beschreven perifere macrofagen en microglia hersenen geworven macrofagen kunnen verschillende fenotypes die extremen overeen met klassieke pro-inflammatoire toxisch (M1) of anti-inflammatoire beschermende (M2) fenotype aannemen. De verschillende activatie staten, waaronder uitscheiding van pro-of anti-inflammatoire factoren, neurotrofe afgifte van moleculen en lysosomale activiteit worden gekenmerkt door een specifiek patroon van fenotypische merkers, waarvan de expressie afhankelijk is van de temporeleontwikkeling van de omgeving. De karakterisatie van deze M / M fenotypes in de verwonde hersenen is nog steeds schaars. We gebruikten een gevestigde muizenmodel van pMCAo naar M / M expressie en evolutie na een beroerte te analyseren. Immunofluorescentie gebaseerde protocollen hier gepresenteerd gericht op het verkrijgen van inzicht in het optreden van de specifieke M / M fenotype markers, hun lokalisatie en cellulaire co-expressie in het ischemische gebied. We onderzochten een paar moleculen gekoppeld aan verschillende activering staat of fenotype, namelijk CD11b, een oppervlakte marker door leukocyten en een veel gebruikte marker van M / M activering / recruitment 6-8 uitgedrukt, CD68 een marker van lysosomen 6,7 en Ym1 een secretoire eiwit door alternatief geactiveerde (M2) macrofagen tot expressie gebracht en gekoppeld aan herstel en functieherstel 9-10. Wanneer twee markers worden uitgedrukt door dezelfde cel, maar in verschillende subcellulaire compartimenten kan colocalization alleen veel inf nietormative. In dit geval kan de analyse van co-expressie worden uitgevoerd door een enkele bovenaanzicht en driedimensionale weergaven. We hier een protocol beschrijven aan een grondige driedimensionale analyse van de marker co-expressie te verkrijgen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materialen</td></tr><tr><td>Rat Anti-muis CD11b</td><td>Vriendelijk verstrekt door Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milaan, Italië</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat Anti-muis CD68 </td><td>AbD Serotec</td><td>MCA 1957</td><td></td></tr><tr><td>Konijn Anti-muis Ym1 </td><td>Stem Cell Technologies</td><td>1404</td><td></td></tr><tr><td>H&#8211;chst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>Muis Anti-Neural Nuclei (NeuN)</td><td>CHEMICON</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyleren Geit Anti-Rat antilichaam</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>112-065-143</td><td></td></tr><tr><td>TSA Cyanine 5 Systeem </td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL705A001KT</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold </td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rat alexa 546</td><td>Invitrogen</td><td>A-11081</td><td></td></tr><tr><td>Anti muis Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>Anti-konijn Alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-11037</td><td></td></tr><tr><td>Normaal Geit Serum</td><td>Vectors Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat Buffered Saline</td><td>Sigma</td><td>P4417-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Apparatuur</td></tr><tr><td>Cryostat CM1850</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81 confocal microscoop </td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AnalySIS software</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris software 5.0</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop cs2</td><td>Adobe Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Softwarepakketten GraphPad Prism versie 4.0</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

drie-dimensionale confocale analyse van microglia / macrofagen markers van polarisatie in experimentele hersenletsel

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

Na hersenenslag microglia / macrofagen (M / M) ondergaan snelle activering met dramatische morfologische en fenotypische veranderingen die expressie van het nieuwe oppervlakte-antigenen en productie van mediatoren die de opbouw en de ontstekingsreactie te handhaven omvatten. Opkomende bewijs geeft aan dat M / M zijn zeer plastic cellen die klassieke pro-inflammatoire (M1) of een andere anti-inflammatoire (M2) activering na een acuut hersenletsel kan aannemen. Maar een volledige karakterisering van M / M fenotype markerexpressie, hun colocalization en temporele evolutie in de beschadigde brein is nog steeds vermist. Immunofluorescentie specifiek beoordeelt kleuring relevante markers van M / M activering kan worden uitgevoerd in de ischemische hersenen. Hier presenteren we immunofluorescentie gebaseerde protocollen gevolgd door drie-dimensionale confocale analyse als een krachtige aanpak om het patroon van lokalisatie en co-expressie van M / M fenotype merkers zoals onderzoekenCD11b, CD68, Ym1, in muismodel ischemie geïnduceerd door permanente occlusie van de middelste cerebrale slagader (pMCAO). Tweedimensionale analyse van de vlek zien dat elke merker is gekoppeld aan een bepaalde M / M morfologie en een gegeven locatie in het ischemische letsel. Patronen van M / M fenotype marker co-expressie kan worden beoordeeld door driedimensionale confocale beeldvorming in het ischemische gebied. Afbeeldingen kunnen worden verkregen over een bepaald volume (10 urn z-as en een 0,23 urn stapgrootte, corresponderend met een 180 x 135 x 10 micrometer volume) met een sequentiële scan modus doorbloeding te minimaliseren en golflengte overlapping te vermijden. De beelden worden dan verwerkt tot driedimensionale renderings verkrijgen volgens Imaris software. Solid van drie dimensionale renderings maakt de definitie van markerexpressie in clusters van cellen. We zien dat M / M hebben de mogelijkheid om te differentiëren naar een veelheid van fenotypes, afhankelijk van de locatie van de laesie en time na een blessure.

Een voorbeeld van de resultaten die zijn verkregen wanneer labelingsprotocollen en confocale acquisities in het ischemische gebied worden uitgevoerd, is geïllustreerd in Figuren 1A en 1B. Een tweedimensionaal beeld van de verkregen afbeeldingen laat zien dat vierentwintig uur na ischemie (A) de lysosomale marker CD68 (groen) tot expressie komt in hypertrofische ameboïde CD11b-cellen (rood) die aanwezig zijn in de ischemische kern. In de randzone (B) vert...

Een manier om nieuwe inzichten te verkrijgen in de complexiteit van de inflammatoire hersenreactie wordt gepresenteerd. We beschrijven immunofluorescence-gebaseerde protocollen gevolgd door driedimensionale confocale analyse om het patroon van co-expressie van microglia/macrofaagfenotypemarkers in een muismodel van focale ischemie te onderzoeken.

Drie-dimensionale confocale analyse van microglia / macrofagen Markers van Polarisatie in Experimentele Hersenletsel

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de expressie en cellulaire lokalisatie van microglia-macrofaag-fenotypemarkers te visualiseren na hersenischemie. Ten eerste worden cryosneden van ischemische muizenhersenen gekleurd om markers van microglia-macrofaagactivatie te identificeren. De gekleurde sneden worden vervolgens onderworpen aan driedimensionale confocale beeldvorming.De resulterende beelden worden vervolgens verwerkt om driedimensionale weergaven te genereren, en er wordt een beeldanalyse uitgevoerd om de expressie van markers in celclusters te lokaliseren. De resulterende gegevens tonen de effectiviteit aan van driedimensionale confocale analyse bij het correct toewijzen van marker-expressie aan een specifiek cellichaam. Wanneer twee markers door dezelfde cel worden tot expressie gebracht, maar in verschillende subcellulaire compartimenten, is colocalisatie alleen mogelijk niet erg informatief. Het gebruik van driedimensionale analyse, zoals we hier zullen demonstreren, maakt een betere resolutie en nauwkeurigheid mogelijk.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de complexiteit van de hersenrespons op ischemisch letsel, kan deze ook worden toegepast op andere acute of chronische aandoeningen waarbij een dubbele rol voor microglia-macrofagen bij letsel en herstel is voorgesteld. Of in die gevallen waarin signalen selectief gelokaliseerd moeten worden in verschillende ruimtelijke vlakken, zullen Carlo Perigo en Stefan of Magali u door de verschillende stappen van de procedure leiden. Het volgende protocol maakt gebruik van muizenbreinweefsel waarin ischemie werd opgewekt door permanente occlusie van de arteria cerebri media.Gebruik een cryostaat om seriële coronale hersendoorsneden van 20 micron op gelatine te verzamelen. Laat alle reagentia en monsters op dekglas op kamertemperatuur komen voor gebruik. Houd er rekening mee dat de werkverdunningen van antilichamen en serum die in het bijbehorende document staan, het resultaat zijn van tests om de beste prestaties te verkrijgen bij het gebruik van verschillende antilichamen en serum.Het protocol moet worden gevalideerd. Begin met het omcirkelen van de coupes op het objectglas met een vloeibare blockerpen om de benodigde hoeveelheid reagentia te minimaliseren. Plaats vervolgens de hersencoupes in een vochtige kamer met behulp van een pipet van 1 mL.Voeg PBS op kamertemperatuur toe aan de coupes en incubeer deze vijf minuten om ze te wassen. Verwijder vervolgens de oplossing met een wegwerpspuit van 1 mL met naald en herhaal de wasstap nogmaals. Nadat de tweede wasbeurt is voltooid, kunnen de monsters worden gekleurd; gebruik hiervoor een pipet van 1 mL en een wegwerpspuit voor alle uitwisselingen van de oplossing. De kleuringsprocedure dient te worden uitgevoerd zoals hier samengevat.Raadpleeg de begeleidende tekst voor details, inclusief de wasstappen. Eerst worden de cellen geïncubeerd met 1% waterstofperoxide na blokkeren met normaal geiten serum. Vervolgens worden ze geïncubeerd met een primair antilichaam tegen CD 11 B. Daarna worden de preparaten geïncubeerd met een passend secundair antilichaam, gevolgd door triss, NACL tween buffer, of TNT, en vervolgens triss, H-C-L-N-A-C-L, blokkeringsbuffer, of TNB na de incubatie met TNB.De objectglazen worden geïncubeerd met streptavidine HRP, gevolgd door amplificatieverdunner met cyanide five tyram, wat het immunofluorescentiesignaal zal versterken. Vervolgens worden de objectglazen geïncubeerd met NGS om aspecifieke bindingsplaatsen te blokkeren. Daarna worden ze geïncubeerd met een primair antilichaam tegen CD 68.Na de incubatie met het primaire antilichaam worden de cellen vervolgens geïncubeerd in het geschikte fluor-geconjugeerde secundaire antilichaam, gevolgd door 1 µg/mL hooks om het DNA te labelen. Zodra de kleuring is voltooid, worden de cryosneden gemonteerd met prolonged gold; vermijd bij het monteren van de sneden de vorming van luchtbellen. Bewaar de sneden bij 4 °C in het donker tot ze worden geanalyseerd.De acquisitie van het fluorescentiesignaal moet binnen één week worden uitgevoerd. Dit protocol maakt gebruik van een IX 81-microscoop uitgerust met een FV 500 confocale scaneenheid met drie laserlijnen: argon-krypton bij 488 nanometers, helium-neon rood bij 646 nanometers en helium-neon groen bij 532 nanometers, plus een UV-diode in de flu van de U 500-software. Selecteer de juiste excitatielasers en dichroïsche spiegels.Stel daarnaast de beeldresolutie in op minimaal 800 bij 600 pixels. Plaats vervolgens het preparaat op de tafel van de microscoop en identificeer met behulp van epifluorescentie een gebied van interesse, waarbij de vergroting stapsgewijs wordt verhoogd tot het 40 x objectief. Schakel daarna over naar de modaliteit van laser-scanning microscopie en voer herhaalde scans uit, terwijl het vermogensniveau van de fotomultiplicator en de gain voor elk kanaal worden aangepast.Dit zal de signaaloverlap verminderen die wordt veroorzaakt door gelijktijdige excitatie bij verschillende golflengten. Houd de gain zo laag mogelijk om ongewenste aspecifieke signalen te voorkomen. Pas tijdens het voortzetten van de repetitieve scan de focus aan en bepaal de onderste en bovenste extremen van de Z-as met een totale Z-aslengte van 10 microns.Stop vervolgens de repetitieve scan. Voer daarna de stapgrootte in. Deze moet zo dicht mogelijk bij de pixelgrootte liggen, welke 0.225 microns is.Dit resulteert in een standaard één-op-één grootteverhouding over de Z-as in de software. Activeer het Kalman-filter ten minste twee keer. Het Kalman-algoritme is een iteratieve functie die willekeurige signalen elimineert, zoals enkele positieve voxels die tot de achtergrondruis behoren, waardoor de signaal-ruisverhouding wordt verbeterd. Activeer nu de sequentiële scanmodus om bleed-through-effecten te voorkomen.Ga naar het middelpunt van de Z-as en voer een sequentiële XY-scan uit. Controleer de instellingen van de PMT en de gain om een goede signaal-ruisverhouding te waarborgen. Voer na deze acquisitie een XY, Z-acquisitie uit.Exporteer de gegevens als een multi-TIF-bestand. Elk multi-TIF-bestand bevat doorgaans drie kleurkanalen en 44 brandvlakken voor verwerking. Begin met het openen van de imas-software.Selecteer eerst de surpass-weergave en upload vervolgens het multi-TIF-bestand. Selecteer daarna in het paneel voor beeldaanpassing hier de gewenste kleur voor elk kanaal. Rood staat voor CD 11 B, groen staat voor CD 68 en blauw staat voor de Hoechst DNA-kleuring. Om ruis uit de achtergrond te verwijderen, verhoogt u de minimumwaarde in het paneel voor beeldaanpassing voor elk kanaal.Ga vervolgens naar de sectie weergave om een enkel XY-brandvlak te visualiseren met orthogonale projecties van de x-, Z- en YZ-as. Beweeg langs de Z-as op zoek naar colocalisatie, wat zichtbaar is als gele pixels. Klik op een geel gebied om te controleren of de colocalisatie langs de Z-as aanwezig is, wat aangeeft dat deze behoort tot een solide object op de Z-as.Projecties zijn zichtbaar in het rechter- en onderste deel van de figuur. Maak een momentopname en keer vervolgens terug naar het surpass-overzicht. Selecteer daarna in het vervolgkeuzemenu 'edit' de optie 'crop 3D' en omlijst een interessegebied om een cel of een cluster van cellen te isoleren.Select vervolgens één kanaal op het paneel voor schermaanpassing. Selecteer de algorithm builder voor surpass surfaces. Selecteer vervolgens eerst een kanaal om het algoritme in te stellen.Definieer vervolgens de drempelwaarde als dezelfde minimumwaarde als ingesteld in het paneel voor beeldaanpassing en definieer indien nodig de herdimensionering. Stel daarna de smoothing in op 0.200. Selecteer het kleurpaneel en pas het uiterlijk naar behoefte aan.Herhaal de configuratie van de surpass surfaces-algoritmebouwer voor elk kanaal. Deselecteer vervolgens de fluorescentiekanalen in het paneel voor beeldafstelling en selecteer alle drie de oppervlakken. Verplaats tot slot het volume om het beste zicht te vinden en maak een snapshot om het co-expressiepatroon van MM-markers te bepalen.De protocollen voor immunofluorescentie en confocale acquisitie die in deze video worden beschreven, zijn uitgevoerd in een muismodel van focale ischemie, geïnduceerd door permanente occlusie van de arteria cerebri media. Een tweedimensionaal aanzicht van de verkregen beelden laat zien dat 24 uur na ischemie de lysosomale marker CD 68, weergegeven in het groen, tot expressie komt in de hypertrofische, CD 11 B-positieve cellen, die in het rood zichtbaar zijn in de ischemische kern. De Z-as projectie rechtsonder laat zien dat de markerdistributie die is vastgelegd in het enkelvoudige vlak ook aanwezig is langs de Z-as in de randzone.De CD 11 B-positieve cellen vertonen hypertrofische cellichamen met uitlopers die sterk positief zijn voor CD 68, wat suggereert dat fagosomen gebonden zijn aan het celmembraan. Dit duidt op actief PHA-zuur gedrag van microgliacellen om de co-expressie van CD 68 en YM 1, een marker voor M2-polarisatie, te beoordelen. De fluorescentiebeelden werden onderworpen aan driedimensionale rendering.Het driedimensionale beeld van de hier getoonde verworven beelden geeft de aanwezigheid aan van CD 68-positieve cellen, weergegeven in groene fluorescerende voxels, en YM-1-positieve cellen, weergegeven in rode fluorescerende voxels. Wanneer deze parallel liggen, kan het gezichtspunt van de waarnemer een colocalisatiesignaal opleveren dat als geel wordt gezien, wat mogelijk niet gerelateerd is aan de werkelijke afstand tussen de markers. Om colocalisatie te definiëren.Er moet een enkel vlakweergave met projecties van de Z-as worden gegenereerd terwijl men langs de Z-as beweegt. Er wordt gezocht naar colocalisatie. De Z-as projectie wordt verkregen zoals te zien is in het rechter- en onderste deel van deze afbeelding.Fluorescerende voxels kunnen worden omgezet in solide objecten door middel van driedimensionale rendering, waarbij de expressie van markers wordt toegewezen aan een specifiek cellulair lichaam. Na een hoge vergroting en 3D-rendering lijkt het erop dat de twee markers behoren tot verschillende cellen die zich in nauwe nabijheid van elkaar bevinden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een immunofluorescentie-assay uitvoert met meerdere markers en kleurstoffen, en hoe u driedimensionale beelden via confocale microscopie correct acquisiteert en visualiseert.Daarnaast kan de beschreven post-processing analyse effectief worden ingezet om co-expressie of colocalisatie op cellulair niveau te analyseren, of in gevallen waarin signalen selectief gelokaliseerd moeten worden in verschillende ruimtelijke vlakken.

three-dimensional-confocal-analysis-microgliamacrophage-markers

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Acuut hersenletsel is een ernstige verwonding die geen adequate behandeling tot op heden. Multifoton microscopie maakt het bestuderen van lengterichting van het proces van acuut hersenletsel ontwikkeling en indringende therapeutische strategieën bij knaagdieren. Twee modellen van acuut hersentrauma bestudeerd met in vivo twee-foton beeldvorming van de hersenen worden gedemonstreerd in dit protocol.

Acute Brain Trauma in Muizen gevolgd door Longitudinale Twee-foton Imaging

Twee-foton intravital beeldvorming kan worden gebruikt om interacties tussen verschillende celtypen in het ruggenmerg in hun oorspronkelijke weefselomgeving in een botmerg chimerisch dier met een traumatische ruggenmergverplettering in de dorsale kolom te onderzoeken.

Intravitale Imaging van Axonale Interacties met Microglia en macrofagen in een muis Dorsale Column Crush Injury

Microglia zijn hersenen immune cellen die enquête en reageren op veranderde hersenen fysiologie via morfologische veranderingen die kwantitatief kan worden beoordeeld. Dit protocol schetst een ImageJ gebaseerd analyse protocol te vertegenwoordigen microglia morfologie als continu gegevens volgens de statistieken, zoals de restanten van de cel, complexiteit en vorm.

Kwantificeren van Microglia morfologie van Photomicrographs van Immunohistochemistry bereid van weefsel met behulp van ImageJ

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze workflow voor immunofluorescerende cokleuring van IBA1 en TMEM119, naast de analyse van microgliale dichtheid, distributie en morfologie, evenals perifere myeloïde celinfiltratie in muizen hersenweefsel.

Immunofluorescentie kleuring met behulp van IBA1 en TMEM119 voor Microgliale dichtheid, morfologie en perifere myeloïde Celinfiltratie analyse in Muizenhersenen

Intraparenchymale bloeding en neuro-inflammatie vergezeld van hersenkneuzing kunnen ernstig secundair hersenletsel veroorzaken. Dit protocol beschrijft een muisgecontroleerd corticaal impactmodel (CCI), waarmee onderzoekers bloedingen, kneuzingen en posttraumatische immuunresponsen kunnen bestuderen en mogelijke therapieën kunnen onderzoeken.

Een preklinisch gecontroleerd corticaal impactmodel voor traumatische bloedingen, kneuzingen en neuro-inflammatie

Dit protocol presenteert methoden om de neuro-inflammatoire en hemodynamische respons op mild traumatisch hersenletsel te karakteriseren en om deze gegevens te integreren als onderdeel van een multivariate systeemanalyse met behulp van partiële kleinste kwadratenregressie.

Systeemanalyse van de neuro-inflammatoire en hemodynamische respons op traumatisch hersenletsel

Primaire microgliaculturen worden vaak gebruikt om nieuwe ontstekingsremmende moleculen te evalueren. Het huidige protocol beschrijft een reproduceerbare en relevante methode om microglia magnetisch te isoleren van pasgeboren pups.

Magnetische isolatie van microgliale cellen van neonate muis voor primaire celculturen

Het protocol beschrijft licht traumatisch hersenletsel in een muismodel. In het bijzonder wordt een stapsgewijs protocol om een milde middellijn gesloten hoofdletsel en de karakterisering van het diermodel te induceren volledig uitgelegd.

Elektromagnetisch gecontroleerd gesloten-hoofd model van mild traumatisch hersenletsel bij muizen

Het identificeren van microglia (MG) en perifere infiltrerende macrofagen (Mø) in beschadigde ruggenmerg is moeilijk. In dit protocol werd flowcytometrie (FCM) gebruikt om respectievelijk M1-achtige MG, M2-achtige MG, M1-achtige Mø en M2-achtige Mø te identificeren. Deze technologie kan ook worden toegepast op andere ziekten van het centrale zenuwstelsel om de rol van MG en Mø te begrijpen.

Identificatie van microglia en perifere infiltrerende macrofagen in het beschadigde ruggenmerg met behulp van flowcytometrie

Hier presenteren we een protocol om de immuuncelfunctie na een ischemische beroerte te beoordelen met behulp van flowcytometrische analyse in een mini-beroertemodel. Deze methode maakt gedetailleerd onderzoek van neuro-immuuninteracties mogelijk en kan worden aangepast voor het bestuderen van andere neurodegeneratieve ziekten, waardoor ons begrip van immuunresponsen bij beroertepathologie wordt vergroot.

Isolatie en flowcytometrische beoordeling van neuro-immuuninteracties in een mini-beroerte muizenmodel

Mapping Microglial Parameters Software (MMPS) is een gebruiksvriendelijke analysepijplijn die geen codeerexpertise vereist en semi-automatiseert single-cel microgliale morfologieanalyse op basis van immunofluorescentiebeelden. Gevalideerd in een door knaagdieren geïnduceerd neuro-inflammatiemodel, detecteert MMPS reproductief activatie-geassocieerde morfologische veranderingen en maakt gestandaardiseerde, schaalbare microgliale fenotypering mogelijk.

Mapping Microglial Parameters Software (MMPS): Een open-source, gebruiksvriendelijke tool voor kwantitatieve microglia-morfologieanalyse

Leer driedimensionale confocale analyse van microglia- en macrofaagpolarisatiemarkers in een muismodel van focale ischemie. Deze methode verbetert de resolutie van markerexpressie en celinteracties in hersenontstekingsonderzoek.

Drie-dimensionale confocale analyse van microglia / macrofagen Markers van Polarisatie in Experimentele Hersenletsel

Meer video's verkennen