Name: Permeabilisatie van Gekleefd cellen met behulp van een inert gas Jet (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Leer hoe je gekweekte hechtkankercellen tijdelijk permeabiliseert met een inert gasstraal om biomoleculen efficiënt over te brengen. Deze methode biedt een betrouwbare aanpak voor celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag de volgende financieringsbronnen bedanken: Canadian Institutes of Health Research (CIHR), de Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC).

1. Ontwikkeling van LabView Program <ol><li> Een massadebietregelaar (MKS M100B Mass-Flo Controller) is de heliumgas lijn bevestigd aan een nauwkeurige gasstroom te waarborgen. Deze wordt bediend door een ingangsspanning tussen 0 en 5 V. Een regelkring in het LabView programma bepaalt de gewenste spanning op een bepaald moment. Interfacing tussen de computer en de massadebietregelaar wordt uitgevoerd door een data-acquisitie apparaat (NI USB-6009), en een 12 V voeding levert stroom aan de massastroom controller. </li><li> Twee positionering lineaire geleidingen worden gebruikt om de beweging van de 6-well plaat, een voor elke richting besturen. Elke module bestaat uit een MA15-serie Velmex Unislide Montage in combinatie met een stappenmotor, en beide vergaderingen worden gecontroleerd door een enkele Velmex VXM stappenmotor controller. De regelaar kan met de hand joggen van elke motor of accepteert een reeks externe seriële commando, de combinatie waarmee specifieke beweging patterns. Verscheidene patronen kunnen worden geprogrammeerd in het LabView programma, dat de gebruiker alleen de gewenste toorts snelheid en het pad afmetingen leveren. </li></ol> 2. Voorbereiding van de apparatuur <ol><li> Open zowel de helium cilinder en regelaar. </li><li> Zet de motor controller. </li><li> Open het LabView programma en controleer alle omstandigheden. </li><li> Zorg ervoor dat het platform in het midden. Om te controleren, kijk naar elke motor stadium en controleer dat elke wagen is niet in de buurt van beide eind stadium. Ofwel het programma midden de rijtuigen of handmatig aanpassen met de jogging bedieningselementen aan de voorzijde van de motor controller. </li><li> Als dit de eerste run van de dag, is het raadzaam om het programma een keer draaien zonder cellen, om ervoor te zorgen de installatie goed werkt. </li></ol> 3. Voorbereiding van het Gas Jet capillaire Nozzle Hoogte <ol><li> Verwijder het capillair uit de houder en de hoogte draaiknop nul. </li><li> Plaats de 6-well plaat on het platform. </li><li> Vervangen en laat de gasstraal capillair naar de bodem van de put tot in de dekglas raakt. Zet het capillair in de houder. </li><li> Met behulp van de hoogte wijzerplaat, verhogen de capillaire 3 mm. Markeer deze hoogte de capillaire basis. </li><li> Breng de capillaire naar een veilige hoogte en verwijder vervolgens de 6-wells plaat. </li></ol> 4. Cel Permeabilisatie Protocol <ol><li> Cultuur hechtende cellijn tot confluentie op glas dekglaasjes in een 6-wells plaat met behulp van standaard kweektechnieken. Voor HeLa-cellen, zaden 6-well platen met 2 x 10 5 cellen per putje en incubeer 48 uur voor de behandeling. </li><li> Bereid geschikt volume van de oplossing die het gewenste vector. Voor hrGFPII-1, een concentratie van 50 ng / ul in 1x PBS verschaft een sterk fluorescerend signaal in HeLa-cellen 24 uur na transfectie. Voor dextran studies, is 80 ug / ml 10 kDa groen fluorescent dextran aanbevolen. Voortaan zal deze oplossing worden doorverwezen naar eens &quot;vector solution&quot;. </li><li> Verwijder celcultuurmedia uit goed en spoel drie keer met 1x PBS. </li><li> Pipet 1370 ul van vector bereid in stap 4.2 in goed. Dit moet resulteren in een vloeibare laag van ongeveer 1.3 mm. </li><li> Plaats het putje met de vector oplossing in het midden van het platform. Laat de gasstraalspuitmond het eerder gemarkeerde niveau aangeeft een mondstuk hoogte van 3 mm boven de dia. </li><li> Stel helium debiet in het LabView programma en selecteer de gewenste bewegingspatroon te gebruiken. Selecteer &quot;Run&quot; wanneer je klaar bent om de permeabilisatie protocol beginnen. Er zal een initiële vertraging periode waarin de massastroomregeleenheid bereidt zich voor om de nodige debiet te verschaffen. Zodra de juiste stroomsnelheid is bereikt, zal het LabView programma de stappenmotoren activeren om de put in de gewenste permeabilisatie patroon. Zodra het platform is gestopt, wacht ongeveer 30 seconden en verwijder de vector oplossing.Opmerking: Optimale permeabilisatie optreedt bij een dynamische druk van 100 tot 200 Pa bij de mondstukuitlaat, afhankelijk van de capillaire diameter. </li><li> Goed wassen driemaal met 1x PBS. </li><li> Vul goed met vers kweekmedium. </li><li> Herhaal de stappen 4,3-4,6 voor de gewenste aantal experimenten. Opmerking: Zorg ervoor dat u de controle monsters die bestaan ​​uit putten wordt gevuld met de vector-oplossing zonder de gas jet over hen wordt uitgevoerd omvatten. Laat de oplossing in de controleputjes ongeveer 1 min daarna verder met de stappen 4.5 en 4.6. </li><li> Als een actief hrGFP transfectie experiment terug 6-wells plaat incubator gedurende 24 uur om getransfecteerde materiaal wordt getranscribeerd door de cellen. Als het runnen van een dextran permeabilization experiment, terug 6-wells plaat incubator gedurende 15 minuten. </li></ol> 5. Cell imaging <ol><li> Indien gewenst, direct voor de beeldvorming, tegenkleuring met gepaste live / dead vlek om celdood te evalueren. </li><li> Afbeelding cellen met appropringen niet optreden microscoop om transfectie / permeabilisatie werkzaamheid onderzoeken. </li></ol>

<ol><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+humans--immunotherapy+of+patients+with+advanced+melanoma%2C+using+tumor-infiltrating+lymphocytes+modified+by+retroviral+gene+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into humans--immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction.</a> The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+immunity+to+viral+antigens+limits+E1-deleted+adenoviruses+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).</li>
<li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).</li>
<li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).</li>
<li>Felgner, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection%3A+a+highly+efficient%2C+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).</li>
<li>Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+method+for+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection method for primary cells.</a> Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).</li>
<li>Rauth, S., Kucherlapati, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+DNA+Transferred+into+Mammalian-Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells.</a> J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).</li>
<li>Spandidos, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field-mediated+gene+transfer+%28electroporation%29+into+mouse+Friend+and+human+K562+erythroleukemic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+analysis+techniques%22%5BJournal%5D)">Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells.</a> Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).</li>
<li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).</li>
<li>Fechheimer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+mammalian+cells+with+plasmid+DNA+by+scrape+loading+and+sonication+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).</li>
<li>Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+enhancement+of+liposome-mediated+cell+transfection+is+caused+by+cavitation+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects.</a> Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).</li>
<li>Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cavitation+nuclei+significantly+enhance+acoustically+induced+cell+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection.</a> Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).</li>
<li>Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+gene+transfer+to+mammalian+somatic+cells+by+particle+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).</li>
<li>Hallow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-induced+intracellular+loading+of+cells+with+molecules+by+controlled+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).</li>
<li>Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+inert+gas+jets+to+measure+the+forces+required+for+mechanical+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection.</a> Biomedical Engineering Online. 11, (2012).</li>
<li>Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+Pressure+Plasma+Jet+Deposition+of+Patterned+Polymer+Films+for+Cell+Culture+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Ieee+T.+Plasma+Sci%22%5BJournal%5D)">Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications.</a> Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).</li>
<li>Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsating+tandem+microbubble+for+localized+and+directional+single-cell+membrane+poration%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration.</a> Physical Review Letters. 105, 078101(2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Inert gas jet permeabilization is een nuttige techniek voor het aanhangend celtransfectie. Het biedt de mogelijkheid om biomoleculen overdracht in cellen met behulp van mechanische krachten, waardoor de behoefte aan potentieel schadelijke chemicaliën of virale vectoren elimineert. De techniek zou kunnen geven onderzoekers en werkers een efficiënte en relatief eenvoudige wijze nauwkeurig te transfecteren. De selectiviteit van de permeabilisatie is ook uniek voor onderzoekers die slechts bepaalde cellen behandeld met een ...

Met de evolutie van de medische biologie en het begrip van cel mechanica, is de levering van biomoleculen in cellen van vitaal belang voor vele onderzoeksgebieden en medische therapieën. Verschillende technieken zijn ontwikkeld om vreemde moleculen te introduceren door het plasmamembraan en de cel cytosol. Deze kunnen in het algemeen worden geclassificeerd als: virale, chemische of mechanische technieken. Virale technieken genetisch materiaal transfecteren zoals RNA en DNA onder toepassing van virale vectoren 1. Virale technieken hebben de neiging om een hoog rendement behalen in bepaalde cellijnen, maar ze hebben wel het potentieel voor immuun-en ontstekingsreacties 2. Gebruikelijke chemische transfectie werkwijzen omvatten precipitatie met calciumfosfaat 3, bacteriële exotoxinen 4 en 5 lipofectie. Deze technieken hebben bewezen effectief te zijn, maar ook problemen zoals toxiciteit cel en niet specifiek. Bovendien technieken zoals calcium Phosphate precipitatie gevonden transfectie efficiënties tot 70% maar alleen in bepaalde cellijnen, primaire cellen zelden 6. Dit is opmerkelijk het verhogen onderzoeksinspanningen worden in primaire cellen brengen, met name bij het ontwerpen van verschillende behandelingen voor klinisch gebruik en de studie van DNA functioneren. Tijdelijke verstoring van het celmembraan door mechanische stimuli is een alternatief voor het inbrengen van vreemde moleculen in cellen. Technieken omvatten: micro-injectie van moleculen 7, elektroporatie met behulp van een elektrisch veld aan het membraan 8,9 verstoren, sonoporatie met ultrasone golven aan het celmembraan 10-12, met deeltjes verstoren zoals blijkt uit de &quot;gene gun&quot;, welke deeltjes gebonden met scheuten genen in de cel 13, en meer recent, de toepassing van vloeistofschuifspanning die is getoond om tijdelijk doorlaatbaar zoogdiercellen 14,15. Hoewel monteural methoden voorkomen dat sommige van de bovengenoemde onderwerpen, zijn ze meestal gepaard met een lagere efficiëntie en zeer complexe en gespecialiseerde instellingen. Een atmosferische druk glimontlading fakkel (APGD-t) is ontwikkeld aan de McGill met het oorspronkelijke doel van functionaliserende oppervlakken en losmaken hechtende cellen in vitro 16. Vanzelf werd ontdekt dat een levende / dode vlek gebruikt werd ergens in genomen door cellen zonder permeabilisatie middel toegevoegd. Bovendien, dit leek te hebben plaatsgevonden alleen in gebieden van de putten, die toevallig overeenkomen met de fakkel pad beperkt. Onderzoek naar de permeabilisatie mogelijkheden van de APGD-t voortgezet en controle studies bleek dat de drager inert gas straal van het plasma zonder excitatie was ook in staat om cellen te permeabiliseren. Deze tegenspraak met de eerste hypothese dat de reactieve stoffen die door het plasma jet tijdelijk verminderde het membraan functie en suggereerde dat gewoon de mechanischecal krachten waren voldoende om cel permeabilisatie veroorzaken. Vanaf hier studies verder in ons lab om te proberen en te kwantificeren en karakteriseren van de permeabilisatie efficiëntie van een inert gas jet evenals blik op de transfectie mogelijkheden 16. Door deze studies is gebleken dat microporiën daadwerkelijk deel in het plasmamembraan en deze poriën vaak sluit op ongeveer 5 sec 15. We hebben bruikbaarheid van de techniek in vitro en in vivo in het chorioallantoïsmembraan van een kippenembryo aangetoond.

<table><tbody><tr><td>Vitality hrGFPII-1</td><td>Agilent Technologies Canada</td><td>240143-57</td><td>Groen fluorescent eiwit voor transfectie-experimenten op HeLa-cellen</td></tr><tr><td>Dextran, AlexaFluor 488; 10.000 MW, anionisch, fixeerbaar</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>D22910</td><td>dextran voor permeabilisatie-experimenten</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>L3224</td><td>voor tegenkleuring van zoogdiercellen</td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>voor het monteren van dia's bij beeldvorming</td></tr><tr><td>Ultra High Purity Helium</td><td>Praxair Canada Inc.</td><td>HE 5.0UH-T</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone DMEM/ Hoge Glucose Media - 500 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30022.01</td><td>voor HeLa-cellen</td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td>Voor DMEM-media</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine, vloeibaar</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Voor DMEM-media</td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferd zout (PBS) 1x</td><td></td><td></td><td>Geproduceerd in lab</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Tabel 1. Lijst van benodigde reagentia</td></tr><tr><td>6-Well Heldere TC-behandelde Microplates</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>#1 22 x 22 Deksels</td><td>Fisher</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>Glazen Capillairen</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>WPI Sizing Informatie</td></tr><tr><td>ID (mm): 1, 0,86, 0,68, 0,5 Bestelnummer: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mass-Flo Controller</td><td>MKS</td><td>M100B01314CS1BV</td><td>Massastroomcontroller, Serie M100B, vereist een externe 12 V voeding</td></tr><tr><td>USB-6009 DAQ Device</td><td>National Instruments</td><td>779026-01</td><td></td></tr><tr><td>UniSlide-assemblage met stapmotor en controller</td><td>Velmex</td><td></td><td>Twee series MA15 UniSlide-assemblages, uitgerust met Vexta 1,8&deg; stapmotoren geleverd door Velmex, en bestuurd door een VXM Stepping Motor Controller</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Tabel 2. Lijst van benodigde apparatuur</td></tr></tbody></table>

permeabilisatie van gekleefd cellen met behulp van een inert gas jet

Permeabilization of Adhered Cells Using an Inert Gas Jet

Verschillende celtransfectie technieken bestaan ​​en deze kunnen worden onderverdeeld in drie grote categorieën: virale, chemische en mechanische. Dit protocol beschrijft een mechanische methode om tijdelijk doorlaatbaar hechtende cellen met een inerte gasstroom die de overdracht van gewoonlijk ondoorlaatbare macromoleculen in cellen kan vergemakkelijken. Wij geloven dat deze techniek werkt door het meegeven van schuifkrachten op het plasmamembraan van hechtende cellen, waardoor de tijdelijke vorming van microporiën. Zodra deze poriën worden gecreëerd, de cellen worden vervolgens doorlaatbaar voor genetisch materiaal en andere biomoleculen. De mechanische krachten betrokken hebben, lopen het risico van blijvend beschadigen of losmaken cellen van hun substraat. Er is dus een beperkt aantal inert gas dynamiek waar deze techniek effectief is. Een inert gas jet is efficiënt gebleken bij permeabilizing verschillende hechtende cellijnen waaronder HeLa, HEK293 en menselijke abdominale aorta endotheelcellen. Dit protocol is geschikt voor de permeabilization van hechtende cellen zowel in vitro en, zoals aangetoond in vivo laten zien kan worden gebruikt voor onderzoek en mogelijk toekomstige klinische toepassingen. Het heeft ook het voordeel van permeabilisatie cellen in een ruimtelijk restrictief, waardoor zeer waardevol onderzoeksinstrument zijn.

Permeabilisatie van HeLa cellen met 10 kDa groene fluorescent dextran met een helium gasstraal met een 0,86 mm inwendige capillair diameter getoond in figuur 1. Cellen werden onmiddellijk na permeabilisatie met 2 pl / ml EthD-1-oplossing (live / DEAD Leefbaarheid / Cytotoxicity Kit) om celdood te visualiseren tegengekleurd. Onmiddellijk na tegenkleuring, werden dekglaasjes gemonteerd en afgebeeld. Deze figuur toont de resultaten van het uitvoeren van de helium gasstraal op drie verschillende uitlaatdruk...

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor de tijdelijke permeabilisatie van hechtende cellen met een inert gas jet. Deze techniek bevordert de overdracht van genetisch materiaal en biomoleculen in hechtende zoogdiercellen door het gebruik van mechanische krachten op het plasmamembraan verstoren.

Permeabilisatie van Gekleefd cellen met behulp van een inert gas Jet

Various cell transfection techniques exist and these can be broken down to three broad categories: viral, chemical and mechanical. This protocol describes ...

Het algemene doel van deze procedure is het permeabiliseren van adherente cellen. Dit wordt bereikt door eerst experimentele cellen op dekglasjes in zeswells-platen te kweken. De tweede stap is om de cellen te spoelen met 1x PBS en ze te bedekken met de oplossing die het biomolecuul bevat dat in de cel moet worden overgebracht.Vervolgens wordt de inerte gasstraal eroverheen geleid. Het monster maakt de cellen permeabel. De laatste stap is om de cellen, indien gewenst, te fixeren en te kleuren.Uiteindelijk wordt immunofluorescentiemicroscopie gebruikt om de permeatie-efficiëntie en de celviabiliteit aan te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals proliferatie of gene guns, is dat deze techniek eenvoudig kan worden opgezet en ruimtelijk beperkte permeatie van adherente cellen mogelijk maakt. In een kweek kunnen personen die nieuw zijn met deze techniek er in het begin moeite mee hebben, omdat het tijd kan kosten om bepaalde parameters, zoals de gasstroomsnelheid of de capillaire diameter, te perfectioneren om een efficiënte permeatie voor hun specifieke toepassingen te bewerkstelligen.De massflowcontroller die in deze procedure wordt gebruikt, vereist een externe 12 V voeding en is aangesloten op een heliumgasleiding om een nauwkeurige gasstroomsnelheid te garanderen. De koppeling tussen de massflowcontroller en de computer wordt gerealiseerd via een data-acquisitieapparaat. Deze unit wordt aangestuurd door een ingangsspanning variërend van nul tot vijf volt. Een regelkring in het LabVIEW-programma bepaalt op elk gegeven moment de vereiste spanning.Twee lineaire positioneringsschuifjes worden gebruikt om de beweging van de zeswellsplaat te regelen, één voor elke richting. Elke assemblage bestaat uit een MA 15-serie Velm X uni-schuifassemblage gekoppeld aan een stappenmotor, en beide assemblages worden aangestuurd door één enkele VELM XVXM stappenmotorcontroller. De controller maakt handmatige positionering van elke motor mogelijk of accepteert een reeks externe seriële commando's.De combinatie hiervan maakt specifieke bewegingspatronen mogelijk. Verschillende patronen kunnen in het LabVIEW-programma worden geprogrammeerd, waarbij de gebruiker alleen de gewenste brandsnelheid en de afmetingen van het pad hoeft op te geven. Begin met de voorbereiding van de apparatuur door zowel de heliumcilinder als de drukregelaar te openen en de motorcontroller in te schakelen.Open het LabVIEW-programma en controleer alle condities. Zorg vervolgens dat het platform gecentreerd is ter controle. Bekijk elke motorstage en verifieer dat geen enkele slede zich nabij het uiteinde van de stage bevindt, en laat het programma vervolgens de sleden centreren.Als dit de eerste run van de dag is, wordt aanbevolen om het programma eenmaal zonder cellen uit te voeren om te controleren of de opstelling correct werkt. Om de hoogte van de gas Jett capillaire spuitmond voor te bereiden, verwijdert u de capillair uit de houder en zet u de hoogteschaal op nul. Plaats de six-wellplaat op het platform.Vervang de capillaire van de gasstraal en laat deze zakken tot de bodem van de put, totdat deze het dekglas raakt. Zet de capillaire vast in de houder met behulp van de hoogteknop. Til de capillaire drie millimeter op en markeer deze hoogte op de basis van de capillaire.Til tot slot de capillaire naar een veilige hoogte en verwijder vervolgens de zeswellplaat. De adherente cellijn voor dit protocol moet tot confluentie worden gekweekt op glazen dekglasjes in een zeswellplaat, met gebruik van standaardkweektechnieken voor HeLa-cellen. Zaai zeswellplaten met 2 × 10⁵ cellen per well en incubeer deze 48 uur voor de behandeling.Bereid op de dag van de behandeling een geschikt volume van de oplossing voor met de gewenste vector. Voor studies met dextrine wordt voortaan een concentratie van 80 micrograms per milliliter van 10 kilodalton groen fluorescent dextrine aanbevolen. Deze oplossing zal worden aangeduid als de vectorsolution.Verwijder het celkweekmedium uit een well en spoel deze drie keer. Pipetteer 370 µL vectoroplossing met een XPBS-pipet in de well. Dit moet resulteren in een vloeistofdiepte van ongeveer 1,3 mm. Plaats de well met de vectoroplossing in het midden van het platform.Verlaag de straalbuis van de gasjet tot het eerder gemarkeerde niveau dat een nozzlehoogte van drie millimeter boven het objectglas aangeeft. Stel de heliumstroomsnelheid in het LabVIEW-programma in en selecteer het gewenste bewegingspatroon. Selecteer run.Wanneer u klaar bent om het permeatieprotocol te starten, volgt er een initiële vertragingstijd waarin de massaflowcontroller zich voorbereidt om de benodigde stroomsnelheid te leveren. Voor het succes van dit protocol is het belangrijk om de stroomcondities te optimaliseren om de celdiepte en celdetachement te minimaliseren. Zodra de juiste stroomsnelheid is bereikt, activeert het LabView-programma de stappenmotoren om de put in het gewenste permeatiepatroon te bewegen. Zodra het platform is gestopt, verwijdert u de zesputtsplaat van het platform.Wacht ongeveer 30 seconden en verwijder vervolgens de vectoroplossing. Was de well drie keer met PBS. Vul de well na de derde wasbeurt met vers kweekmedium.Herhaal het permeatieprotocol voor het gewenste aantal experimenten. Zorg ervoor dat er controlemonsters worden opgenomen, bestaande uit wells die worden gevuld met de vectorsolution zonder dat de gasstraal eroverheen wordt geleid. Laat de oplossing ongeveer één minuut in de controlewells blijven voordat u de oplossing verwijdert.Was de cellen met PBS en vul de putjes met vers kweekmedium. Plaats de zes-well plaat terug in de incubator; in het geval van dextrine-permeatie dient er 15 minuten te worden geïncubeerd. Maak vervolgens beelden van de cellen met de geschikte microscoop om de permeatie-efficiëntie te onderzoeken.Hier worden de resultaten getoond van de permeabilisatie van HeLa-cellen met 10 kilodalton groen fluorescerende dextrine met behulp van een heliumgasstraal met een binnendiameter van 0,86 millimeter. Capillaire panelen A, B en C tonen de resultaten bij het gebruiken van de heliumgasstraal bij drie verschillende uitlaatdrukken en paneel D is een controle waarbij dextrine is toegevoegd, maar zonder blootstelling aan de heliumgasstraal; de cellen werden direct na permeabilisatie tegengekleurd om celdood te visualiseren. In deze afbeeldingen fluoresceert dextrine groen en fluoresceren dode cellen rood.In panelen A en B werd waargenomen dat de breedte en efficiëntie van het permeatiespoor toenamen bij een hogere dynamische druk, met slechts een geringe toename in celsterfte. Echter, zodra een hoge dynamische druk werd bereikt, zoals waargenomen in paneel C, werden HeLa-cellen van de dekglasjes gestript en trad er volgens scanning-elektronenmicroscopie-onderzoeken zeer weinig perifere permeatie op. Microporiën werden waargenomen in het celmembraan.In dit voorbeeld werd permeabilisatie van HeLa-cellen uitgevoerd met een heliumgasstraal via een capillair met een binnendiameter van 0,86 millimeter bij een uitlaatdruk van 300 Pascal; er werden scanning elektronenmicroscopie-opnamen gemaakt bij een vergroting van 50.000 x. Paneel A toont een controlemonster met een glad celloppervlak, terwijl paneel B het oppervlak van een gepermeabiliseerde cel toont met een porie met een diameter van 84 nanometer. Zodra de techniek onder de knie is, zou het 15 tot 30 minuten moeten duren indien correct uitgevoerd. Na de procedure kunnen kleuringen worden uitgevoerd om aanvullende factoren, zoals celviabiliteit, te beoordelen.

permeabilization-of-adhered-cells-using-an-inert-gas-jet

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit protocol beschrijft een microfluïdisch co-cultuur model voor gelijktijdige en gelokaliseerde cultuur van epitheliale cellen en bacteriën. Dit model kan gebruikt worden voor het onderzoeken van de rol van verschillende oplosbare moleculaire signalen op pathogenese en het scherm van de effectiviteit van de vermeende probiotische bacteriestammen.

Microfluïdische Co-cultuur van epitheliale cellen en bacteriën voor het onderzoeken van Oplosbaar Signal-gemedieerde interacties

Een beschrijving van de methoden die worden gebruikt om een ​​HP DeskJet 500-printer te zetten in een bioprinter. De printer kan verwerken levende cellen die transient poriën veroorzaakt in het membraan. Deze poriën kan worden gebruikt om kleine moleculen zoals fluorescerende G-actine nemen in de gedrukte cellen.

Het creëren van voorbijgaande celmembraan poriën met een standaard inkjetprinter

De combinatie van monodisperse druppel generatie met traagheid ordening van cellen en deeltjes, beschrijven we een methode om een ​​gewenst aantal cellen of deeltjes in te kapselen in een enkele druppel op kHz tarieven. We laten zien efficiëntie twee maal groter dan die van niet-geordende inkapseling voor enkel-en dubbel-deeltje druppels.

High Throughput Single-cel en Multiple-cel Micro-encapsulatie

We hebben plasma geassisteerde chemische damp depositie van dunne films, variërend van een paar nm tot enkele 100 nm op de nano-deeltjes van verschillende materialen te storten. We vervolgens etsen kernmateriaal holle nanocapsules waarvan permeabiliteit wordt geregeld door de dikte van het reservoir te produceren. We karakteriseren de doorlaatbaarheid van deze coatings aan kleine opgeloste stoffen en aantonen dat deze barrières kunnen vertraagde afgifte van het kernmateriaal te bieden over...

Encapsulation en permeabiliteit Kenmerken van plasma-gepolymeriseerde holle deeltjes

Microfluïdische jetting tegen een druppel-interface lipide bilaag een betrouwbare manier om vesicles te genereren controle over membraan asymmetrie, incorporatie van transmembraan eiwitten en inkapseling materiaal. Deze techniek kan worden toegepast op een verscheidenheid van biologische systemen waarbij gecompartimenteerd biomoleculen gewenst bestuderen.

Lipidendubbellaag Vesicle Generation Met behulp Microfluidic Jetting

Cel-adhesiviteit is essentieel voor veel benaderingen in biomateriaalonderzoek en weefselengineering. Er wordt een stapsgewijze techniek gepresenteerd die gebruik maakt van natte chemie voor de oppervlaktemodificatie van het belangrijke polymeer PTFE met peptiden.

Natte Chemie en Peptide immobilisatie op Polytetrafluoroethyleen voor betere Cel-adhesie

Een microfluïdische chip werd vervaardigd om paren gouden stippen te produceren voor tandem bubbeltjesgeneratie en fibronectine-gecoate eilandjes voor nabijgelegen single-cel patterning. Het resulterende stromingsveld werd gekenmerkt door deeltjesbeeldsnelheidsmeting en werd gebruikt om verschillende bioeffecten te bestuderen, waaronder celmembraan poratie, membraanvervorming en intracellulaire calciumrespons.

Een microfluïdische systeem met patronen aan oppervlakken voor het onderzoeken van Cavitatie Bubble (s)-cel interactie en de daaruit voortvloeiende Bioeffects bij de single-cell niveau

Dit rapport beschrijft een eenvoudige, gemakkelijk uit te voeren techniek, met behulp van lagedrukvacuüm, om microfluïdische kanalen te vullen met cellen en substraten voor biologisch onderzoek.

Een veelzijdige methode van patroonvorming Eiwitten en cellen

Actuele modellen van de cultuur van de dubbelgelaagde toegestaan niet voor functionele in vitro studies die in vivo microenvironments na te bootsen. Met behulp van polyethyleenglycol en een methode van zinkoxide templating, beschrijft dit protocol de ontwikkeling van een uiterst dunne biomimetische kelder membraan met afstembare stijfheid, porositeit en biochemische samenstelling die nauw samen van de Nabootsers van in vivo extracellulaire matrices.

Uiterst dunne Porated elastisch Hydrogels als biomimetische kelder membraan voor Dual cel cultuur

Het gebruik van fotoafbreekbare hydrogels om bacteriële cellen te isoleren door gebruik te maken van een lichtpatiteringstool met hoge resolutie wordt gerapporteerd. Essentiële experimentele procedures, resultaten en voordelen van het proces worden beoordeeld. De methode maakt een snelle en goedkope isolatie mogelijk van gerichte bacteriën met zeldzame of unieke functies uit heterogene gemeenschappen of populaties.

Fotoafbreekbare hydrogelinterfaces voor screening, selectie en isolatie van bacteriën

We presenteren een methode van celinjectie via naaldvrije waterstraaltechnologie in combinatie met een vervolg op onderzoeken na toediening in termen van cellulaire levensvatbaarheid, proliferatie en elasticiteitsmetingen.

Injectie van van varkensweefsel afgeleide stromacellen via waterstraaltechnologie

Leer hoe je gekweekte hechtkankercellen tijdelijk permeabiliseert met een inert gasstraal om biomoleculen efficiënt over te brengen. Deze methode biedt een betrouwbare aanpak voor celbiologisch onderzoek.

Permeabilisatie van Gekleefd cellen met behulp van een inert gas Jet

Meer video's verkennen