Name: Isolatie van humane hepatocyten door een twee-stap Collagenase Perfusie Procedure (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Leer humane hepatocyten isoleren via een twee-staps collageenase-perfusieprocedure voor leveronderzoek en farmacologie. Deze methode levert levende cellen op voor toxicologische en regeneratieve studies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd mogelijk gemaakt door de Human Tissue en Cell Research Foundation, die menselijke weefsels voor onderzoek beschikbaar maakt. Financiële steun voor dit werk werd ontvangen van het ministerie van Onderwijs en Onderzoek (subsidie ​​naam: Virtual Lever Netwerk, subsidie ​​nummer: 0315759) en Hepacult GmbH. Onze dank gaat ook uit naar de technische assistenten van de Grosshadern Ziekenhuis weefselbank voor het verzamelen van de lever monsters en de technische assistenten van de Cell Isolation Core Faciliteit voor het uitvoeren van de lever perfusie en hepatocyten isolement. In het bijzonder willen we Natalja Löwen bedanken voor het aantonen van deze procedure in de video. Tot slot willen we Natalja Löwen en Edeltraud Hanesch bedanken voor het maken van de illustraties voor figuur 1 en de cijfers in het schematisch overzicht van de video.

1. Bereiding van perfusie en isolatie oplossingen <ol><li> Bereid de voor de perfusie van de lever stuk en isolatie van hepatocyten volgens tabel 1 oplossingen. Oplossingen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C tot gebruik. </li><li> Steriele filter alle oplossingen met behulp van een 0,22 pm filter. </li><li> Alle oplossingen die in contact komen met de lever moet steriel zijn. </li></ol> 2. Voorbereiding van de perfusie apparatuur en oplossingen <ol><li> Apparatuur voor de perfusie van de lever stuk moeten worden opgezet, zoals weergegeven in figuur 1. </li><li> Het waterbad moet worden vastgesteld op een geschikte temperatuur, die verschillend is in elk afzonderlijk experimentele set-up, zodat de oplossingen bij de temperatuur van 37 ° C, als ze de lever stuk te bereiken. In dit geval wordt het waterbad van 41 ° C voor verwarming van de oplossingen 1, 2 en 3 en het dubbelwandige glazen condensor. Oplossing 4 moet worden opgewarmd tot37 ° C in een afzonderlijke waterbad voor het verlies van collagenase activiteit te verminderen. </li><li> Kort voor leverperfusie, zet de regulator van de gas tank met 95% O 2/5% CO 2 aan de zuurstofvoorziening apparaat (figuur 1E) gas. </li></ol> 3. Perfusie van de lever <ol><li> Een lever stuk met zoveel intacte Glisson capsule mogelijk en bij voorkeur met slechts 1 snijvlak moet worden verkregen van een patholoog voor perfusie. </li><li> Plaats deze lever stuk op de Büchner trechter die een geperforeerde filter disc (Figuur 1B) bevat. </li><li> De perfusie systeem moet worden gegrond met Oplossing 1. </li><li> Met een lage stroomsnelheid, moet gebogen irrigatie canules met olijf-tips in de grotere bloedvaten worden ingebracht op het snijvlak van de lever stuk. Zoals bloed spoelt uit de lever, het weefsel wordt lichter in gebieden met een goede doorbloeding. Het aantal canules voor verschillende matenlevers wordt getoond in figuur 2A. De meterformaat gekozen zou moeten resulteren in een goede pasvorm die de canules zijn plaats houdt. De kleinere bloedvaten open moet staan ​​voor de perfusie buffer eruit lopen van de lever stuk worden gelaten. </li><li> Verhoog de ​​stroomsnelheid van de peristaltische pomp tussen 110-460 ml / min afhankelijk van de grootte van de lever (Figuur 2B). Dit resulteert in een gemiddelde stroomsnelheid van 44 ± 16 ml / min per canule (figuur 2C). De gekozen snelheid is afhankelijk van de lever stuk en moet resulteren in een lichte plumping up van de lever stuk. In sommige gevallen kan het nodig zijn om klemmen sluiten enkele open vaten met microvasculaire klemmen de lichte plumping bovengenoemde bereiken. Een goede perfusie kan worden waargenomen wanneer de lever stuk is een lichtere kleur overal. </li><li> Houd de lever stuk vochtig tijdens perfusie door te bedekken met een gaasje gedrenkt in een zoutoplossing. </li><li> Perfuse met 1 L van Oplossing 1 te spoelen elke remaining bloed in de lever stuk. </li><li> Wijzig de perfusievloeistof naar oplossing 2 en perfuseren gedurende 10 minuten. </li><li> Schakel de perfusie vloeistof Oplossing 3 en perfuseren met 0,5 L. </li><li> Wijzig de perfusievloeistof Oplossing 4, die 0,1-0,15% collagenase (tabel 2) bevat. </li><li> Voor deze stap perfusie worden uitgevoerd in een recirculerende wijze uitgevoerd gedurende 9-12 min of totdat de lever voldoende verteerd, het leverweefsel zou lijken enigszins uit elkaar breken onder de Glisson capsule en voelen zacht wanneer onderzocht met de botte kant van een scalpel. </li></ol> 4. Isolatie van Hepatocyten <ol><li> Schakel de peristaltische pomp en verwijder cannulae uit de lever stuk. </li><li> Leg de lever stuk in een kristallisatieoplosmiddel schotel met 100-200 ml Oplossing 5. </li><li> Verwijder de Glisson capsule zorgvuldig en schud uit de cellen. Als er gebieden die niet goed doorbloed, kan een scalpel gebruikt doorsnijdendeze regio cellen bevat binnen vrijkomen. Voeg meer Oplossing 5 indien nodig tijdens het proces. </li><li> Voeg meer 5 oplossing tot een eindvolume van 500 ml wordt bereikt. </li><li> Filter celsuspensie tweemaal, eerst door een 210 um nylon mesh, gevolgd door een 70 um nylon mesh. Vervolgens giet de celsuspensie in 200 ml centrifuge buizen. </li><li> Centrifugeer de celsuspensie bij 72 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Zuig supernatant en voorzichtig resuspendeer celpellet voorzichtig in 200 ml oplossing 5. </li><li> Herhaal de wasstap nummer 4.6 drie keer. Op de laatste centrifuge stap, resuspendeer cellen in koude opslag-oplossing (zie de lijst van materialen). De cellen moet ongeveer 2,5 miljoen hepatocyten per milliliter voor de beoordeling van opbrengst en levensvatbaarheid behulp van een hemocytometer gebaseerde trypan blauw exclusietest. </li><li> Voor het uitvoeren van een trypan blauw exclusietest, voeg 0,1 ml geschikt verdunde cellen (≈ 2,5 miljoen / ml) een microcentrifugebuis die 0,5 ml trypan blauw solution (0,4% trypan blauw opgelost in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)) en 0,4 ml PBS. Na het mengen van de celsuspensie grondig, laadt een hemocytometer met de schorsing en onderzoeken onder een microscoop op 100X vergroting. Onder microscopie, zal de dode cellen blauw worden gekleurd, terwijl de levende cellen verschijnen ongekleurd. Tel het aantal levende en de totale cellen in elk van de 1 mm 2 roosters die op de hemocytometer. Levensvatbaarheid (%) opbrengst van levende cellen (hepatocyten miljoen per ml koeloplossing (CSS) of hepatocyten miljoen per g lever) kan worden berekend met de volgende formules. </li></ol><img alt="Vergelijking 1" fo:src="/files/ftp_upload/50615/50615eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50615/50615eq1.jpg" /> Opmerking: In dit geval, de trypan blauw verdunningsfactor 10 en de hemocytometer factor 10.000.

<ol><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Schneider, W. C., Potter, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assay+of+animal+tissues+for+respiratory+enzymes+II.+Succinic+dehydrogenase+and+cytochrome+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase.</a> J. Biol. Chem. 149, 217-227 (1943).</li>
<li>Aubin, P. M. G., Bucher, N. L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Study+of+Binucleate+Cell+Counts+in+Resting+and+Regenerating+Rat+Liver+Employing+a+Mechanical+Method+for+the+Separation+of+Liver+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">A Study of Binucleate Cell Counts in Resting and Regenerating Rat Liver Employing a Mechanical Method for the Separation of Liver Cells.</a> Anat. Rec. 112, 797-809 (1952).</li>
<li>Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mass+Isolation+of+Whole+Cells+from+Rat+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Mass Isolation of Whole Cells from Rat Liver.</a> Science. 117, 627-628 (1953).</li>
<li>Jacob, S. T., Bhargava, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Method+for+Preparation+of+Liver+Cell+Suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">New Method for Preparation of Liver Cell Suspensions.</a> Experimental Cell Research. 27 (62), 453-467 (1962).</li>
<li>Berry, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Properties+of+Cells+Isolated+from+Adult+Mouse+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic Properties of Cells Isolated from Adult Mouse Liver.</a> Journal of Cell Biology. 15, 1-8 (1962).</li>
<li>Laws, J. O., Stickland, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+Isolated+Liver+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolism of Isolated Liver Cells.</a> Nature. 178, 309-310 (1038).</li>
<li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells%3A+a+biochemical+and+fine+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> The Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Rat-Liver+Cells+.3.+Enzymatic+Requirements+for+Tissue+Dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Preparation of Rat-Liver Cells .3. Enzymatic Requirements for Tissue Dispersion.</a> Experimental Cell Research. 82 (73), 391-398 (1973).</li>
<li>Thasler, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charitable+State-Controlled+Foundation+Human+Tissue+and+Cell+Research%3A+Ethic+and+Legal+Aspects+in+the+Supply+of+Surgically+Removed+Human+Tissue+For+Research+in+the+Academic+and+Commercial+Sector+in+Germany%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Banking%22%5BJournal%5D)">Charitable State-Controlled Foundation Human Tissue and Cell Research: Ethic and Legal Aspects in the Supply of Surgically Removed Human Tissue For Research in the Academic and Commercial Sector in Germany.</a> Cell and Tissue Banking. 4, 49-56 (2003).</li>
<li>Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+collagenases+on+the+isolation+of+viable+hepatocytes+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver.</a> Analytical Biochemistry. 138, 235-237 (1984).</li>
<li>Smedsrod, B., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Pure+Hepatocytes+and+Reticuloendothelial+Cells+in+High-Yield+from+a+Single-Rat+Liver+by+Means+of+Percoll+Centrifugation+and+Selective+Adherence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of Pure Hepatocytes and Reticuloendothelial Cells in High-Yield from a Single-Rat Liver by Means of Percoll Centrifugation and Selective Adherence.</a> J. Leukocyte Biol. 38, 213-230 (1985).</li>
<li>Cantrell, E., Bresnick, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzpyrene+Hydroxylase-Activity+in+Isolated+Parenchymal+and+Nonparenchymal+Cells+of+Rat-Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Benzpyrene Hydroxylase-Activity in Isolated Parenchymal and Nonparenchymal Cells of Rat-Liver.</a> Journal of Cell Biology. 52, 316-321 (1972).</li>
<li>Weiskirchen, R., Gressner, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hepatic+stellate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hepatic stellate cells.</a> Methods in Molecular Medicine. 117, 99-113 (2005).</li>
<li>Baccarani, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steatotic+versus+cirrhotic+livers+as+a+source+for+human+hepatocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+P%22%5BJournal%5D)">Steatotic versus cirrhotic livers as a source for human hepatocyte isolation.</a> Transplant P. 33, 664-665 (2001).</li>
<li>Renz, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+extended+donor+criteria+liver+allografts+maximizes+donor+use+and+patient+access+to+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Utilization of extended donor criteria liver allografts maximizes donor use and patient access to liver transplantation.</a> Annals of Surgery. 242, 556-563 (2005).</li>
<li>Schemmer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+donor+criteria+have+no+negative+impact+on+early+outcome+after+liver+transplantation%3A+a+single-center+multivariate+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Extended donor criteria have no negative impact on early outcome after liver transplantation: a single-center multivariate analysis.</a> Transplant Proc. 39, 529-534 (2007).</li>
<li>Alexandre, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+pre-%2C+intra-+and+post-operative+parameters+of+donor+liver+on+the+outcome+of+isolated+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Banking%22%5BJournal%5D)">Influence of pre-, intra- and post-operative parameters of donor liver on the outcome of isolated human hepatocytes.</a> Cell and Tissue Banking. 3, 223-233 (2002).</li>
<li>Spotnitz, W. D., Burks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-art+review%3A+Hemostats%2C+sealants%2C+and+adhesives+II%3A+Update+as+well+as+how+and+when+to+use+the+components+of+the+surgical+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+applied+thrombosis%2Fhemostasis+%3A+official+journal+of+the+International+Academy+of+Clinical+and+Applied+Thrombosis%2FHemostasis%22%5BJournal%5D)">State-of-the-art review: Hemostats, sealants, and adhesives II: Update as well as how and when to use the components of the surgical toolbox.</a> Clinical and applied thrombosis/hemostasis : official journal of the International Academy of Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16, 497-514 (2010).</li>
<li>Spotnitz, W. D., Burks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemostats%2C+sealants%2C+and+adhesives+III%3A+a+new+update+as+well+as+cost+and+regulatory+considerations+for+components+of+the+surgical+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Hemostats, sealants, and adhesives III: a new update as well as cost and regulatory considerations for components of the surgical toolbox.</a> Transfusion. 52, 2243-2255 (2012).</li>
<li>Toriumi, D. M., Raslan, W. F., Friedman, M., Tardy, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histotoxicity+of+cyanoacrylate+tissue+adhesives.+A+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+otolaryngology--head+%26+neck+surgery%22%5BJournal%5D)">Histotoxicity of cyanoacrylate tissue adhesives. A comparative study.</a> Archives of otolaryngology--head & neck surgery. 116, 546-550 (1990).</li>
<li>Vinters, H. V., Galil, K. A., Lundie, M. J., Kaufmann, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histotoxicity+of+cyanoacrylates.+A+selective+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroradiology%22%5BJournal%5D)">The histotoxicity of cyanoacrylates. A selective review.</a> Neuroradiology. 27, 279-291 (1985).</li>
<li>Bhogal, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+human+hepatocytes+from+normal+and+diseased+liver+tissue%3A+a+one+hundred+liver+experience%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary human hepatocytes from normal and diseased liver tissue: a one hundred liver experience.</a> PloS ONE. 6, e18222(2011).</li>
<li>Olson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concordance+of+the+toxicity+of+pharmaceuticals+in+humans+and+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Regul.+Toxicol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals.</a> Regul. Toxicol. Pharm. 32, 56-67 (2000).</li>
<li>Koebe, H. G., Pahernik, S. A., Sproede, M., Thasler, W. E., Schildberg, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+hepatocytes+from+slaughterhouse+organs.+An+unlimited+resource+for+bioartificial+liver+devices%5BTitle%5D)+AND+%22ASAIO+Journal%22%5BJournal%5D)">Porcine hepatocytes from slaughterhouse organs. An unlimited resource for bioartificial liver devices.</a> ASAIO Journal. 41, 189-193 (1995).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Methuen. (1959).</li>
</ol>

Optimalisatie van dit protocol werd gedeeltelijk gefinancierd door een subsidie ​​van Hepacult GmbH. Dr Wolfgang Thasler is een van de oprichters van Hepacult GmbH en blijft een van de leden van de raad van bestuur van deze vennootschap. De tewerkstelling van Maresa Demmel is gedeeltelijk door Hepacult. Maria Hauner is in dienst van Hepacult GmbH. Hepacult is een spin-off biotechnologische onderneming van de Universiteit, die de menselijke hepatocyten biedt met toestemming en open toegang voor onderzoeksdoeleinden.

Dit protocol resulteert in de isolatie van humane hepatocyten met een hoge levensvatbaarheid en zuiverheid. Om dit te bereiken, is het belangrijk om te beginnen met een geschikt stuk lever. Het stuk van de lever moeten intact Glisson capsule op alle oppervlakken met uitzondering van 1 snijvlak hebben. Een andere belangrijke factor is de bepaalde partij collagenase worden gebruikt als verschillende partijen kan leiden tot grote verschillen in de levensvatbaarheid van hepatocyten na digestie 11. Daarom moeten v...

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/50615/isolation-human-hepatocytes-two-step-collagenase-perfusion">Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure </a>
The changes listed below have been made to Table 1.
1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EGTA&#160;</td>
			<td>0.1mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EGTA&#160;</td>
			<td>1mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>0.5&#181;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>5mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure.
The Final Concentration of EGTA in Solution 2 and the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate in solutions 3 and 4 have been updated in Table 1.

Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Een lever celsuspensie kan worden bereid uit de lever door mechanische of enzymatische werkwijzen. Mechanische methoden gebruikt om hele levercellen bereiden omvatten waardoor de lever door kaasdoek 2, schudden van een lever stuk met glazen kralen in een Kahn shaker 3, het gebruik van glas homogeniseerders met losse stampers 4,5 etc. In de loop der jaren zijn mechanische methoden van gevallen gunst vanwege de schade aan celmembranen en functieverlies van de geïsoleerde hepatocyten 6,7. Bijgevolg is het gebruik van een enzymatische Tegenwoordig is de belangrijkste methode voor isolatie van de hepatocyten. Isolatie van hepatocyten met behulp van een enzymatische methode is sterk verbeterd toen Berry en vriend 8 doorbloed collagenase en hyaluronidase door de lever via de poortader in ratten. Dit perfusieproces gebruikt de vasculatuur om de enzymen in nauw contact met de meerderheid van de cellen te komen, waardooreen 6-voudige toename in opbrengst van hepatocyten 8. Verder is deze methode leverde cellen die hun structurele integriteit behouden, met vrijwel geen verandering van endoplasmatisch reticulum in geïsoleerde blaasjes en geen mitochondriale schade 8. Deze methode werd gewijzigd door Seglen 1, die een twee-staps procedure perfusie pionier voor levercel isolement. In deze procedure wordt de rattenlever geperfuseerd met een Ca2 + vrije buffer gevolgd door perfusie met collagenase buffer die Ca 2 + 1. De verwijdering van Ca2 + in de eerste stap helpt desmosomen verstoren, terwijl de toevoeging van Ca2 + in de tweede stap is vereist voor optimale collagenase activiteit 1,9. Aangezien het gepubliceerde werk hierboven beschreven uitgevoerd bij ratten dit artikel beoogt een gewijzigde procedure die kan worden gebruikt voor isolatie van hepatocyten met hoge levensvatbaarheid van brom toneneen levers. Het gebruik van menselijke hepatocyten blijft belangrijk voor translationeel onderzoek en voor het valideren van experimenten met diermodellen. De menselijke lever stukken die in deze studie werden met toestemming van het bestuur overgenomen door de Human Tissue en Cell Research Foundation, een door de staat gecontroleerde non-profit stichting 10. Na een patholoog verwijderd wat nodig is voor diagnose, werden lever stukken vanuit het restmateriaal. Het weefsel afgezet door de patholoog was morfologisch gezond weefsel verkregen van resectie marges na leverresectie.

<table><tbody><tr><td>Bubble trap</td><td>Gaßner Glastechnik</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glass jacketed condenser</td><td>Gaßner Glastechnik</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>41 °C Water bath</td><td>Julabo</td><td>35723-H24/EG</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>37 °C Water bath</td><td>GFL</td><td>1083</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2)</td><td>Linde</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Gas permeable tubing</td><td>Neolab</td><td>2-4440</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Ismatec</td><td>IP65</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Feather</td><td>320010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Omnilab</td><td>5171014</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Conical flasks 1 L</td><td>Schott Duran</td><td>2121654</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Conical flasks 5 L</td><td>Schott Duran</td><td>2121673</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Beakers</td><td>Schott Duran</td><td>2110654</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>200 ml centrifuge tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>352075</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Crystallizing dish</td><td>Omnilab</td><td>5144063</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Curved irrigation cannulae with ball tips</td><td>Ernst Kratz GmbH</td><td>1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Micro vascular clamps</td><td>Ernst Kratz GmbH</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Büchner funnel</td><td>Carl Roth</td><td>HT38.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nylon mesh 210 µm</td><td>Neolab</td><td>4-1413</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nylon mesh 70 µm</td><td>Neolab</td><td>4-1419</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0.22 µm sterile filters</td><td>Peske</td><td>99505</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>500 ml bottles</td><td>Schott Duran</td><td>2180144</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1 L bottles</td><td>Schott Duran</td><td>2180154</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Peske</td><td>06-0001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1.5 ml tubes</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120,086</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>Neolab</td><td>1508454</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sterile Pasteur pipettes</td><td>Brand</td><td>747715</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Motorised pipette filler (Pipette boy acu)</td><td>Integra</td><td>155017</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Refridgerated centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Laminar flow</td><td>Kendro</td><td>Hera safe-KS9</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Aspirator (Low-flow surgical suction pump)</td><td>Atmos</td><td>C361</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Laboratory Gas Burner</td><td>Integra</td><td>Fire Boy eco</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Disposable laboratory coat</td><td>Paperlynen GmbH</td><td>MD0202414</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Surgical mask with visor</td><td>Kimberly-Clark</td><td>48247</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Surgical hood</td><td>Barrier</td><td>42072</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Latex gloves</td><td>Semper Care</td><td>CE0321</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Collagenase (Batch number NB 4G)</td><td>Serva</td><td>17465</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Merck</td><td>2382</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Roth</td><td>9265.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Roth</td><td>9105.3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Serva</td><td>26868</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Biomol</td><td>01400-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Serva</td><td>22700</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium hydrogen carbonate</td><td>Serva</td><td>30180</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0.4% Trypan blue solution</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cold storage solution</td><td>Hepacult GmbH</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

isolatie van humane hepatocyten door een twee-stap collagenase perfusie procedure

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

De lever, een orgaan met een uitzonderlijk regeneratiecapaciteit, voert een groot aantal functies, zoals ontgifting, metabolisme en homeostase. Als zodanig, hepatocyten zijn een belangrijk model voor een grote verscheidenheid van vraagstellingen. Met name het gebruik van menselijke hepatocyten is bijzonder belangrijk op het gebied van farmacokinetica, toxicologie, leverregeneratie en translationeel onderzoek. Aldus stelt deze werkwijze een gemodificeerde versie van een tweefasige collagenase perfusie procedure hepatocyten te isoleren zoals beschreven door Seglen 1. Eerder hebben hepatocyten werden geïsoleerd door mechanische methoden. Echter enzymatische werkwijzen aangetoond superieur als hepatocyten behouden hun structurele integriteit en functie na isolatie. De hier gepresenteerde methode past de werkwijze eerder ontworpen rat lever menselijke lever stukken en resulteert in een grote opbrengst van hepatocyten met een levensvatbaarheid van 77 ± 10%. De belangrijksteverschil in deze procedure is het proces van cannulization van de bloedvaten. Verder kan de beschreven werkwijze ook toegepast worden levers van andere soorten met vergelijkbare lever of bloedvat maten.

Perfusie Setup De voor leverperfusie apparatuur moet worden ingesteld volgens figuur 1. Levensvatbaarheid en de opbrengst van geïsoleerde humane hepatocyten De gemiddelde levensvatbaarheid van geïsoleerde menselijke hepatocyten was 77 ± 10% en de gemiddelde opbrengst van hepatocyten was 13 ± 11 miljoen hepatocyten / g lever, met uitgedrukt als gemiddelden ± standaardafwijking. Het aantal hepatocyt isolaties uitgevoerd om te...

Een gewijzigde tweefasige collagenase perfusie procedure voor isolatie van humane hepatocyten is beschreven. Deze methode kan ook worden toegepast op andere zoogdieren levers. De geïsoleerde hepatocyten zijn beschikbaar in hoge opbrengst en haalbaarheid, waardoor ze een geschikt model voor wetenschappelijk onderzoek op gebieden zoals lever regeneratie, farmacokinetiek en toxicologie.

Isolatie van humane hepatocyten door een twee-stap Collagenase Perfusie Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Het algemene doel van deze procedure is om humane hepatocyten te isoleren met behulp van een twee-staps collagenase-perfusieprocedure. Dit wordt bereikt door eerst de bloedvaten in een stuk lever te canuleren met een irrigatiecanule. Hierop volgt de perfusie en digestie van het leverstuk met behulp van collagenase.De derde stap is het verwijderen van het glisten-kapsel, waardoor de gedissocieerde levercellen vrijkomen. De laatste stap is een centrifugatie op lage snelheid om de hepatocyten te isoleren. Uiteindelijk kunnen hepatocyten worden geïdentificeerd met fasecontrastmicroscopie of door albuminekleuring middels immunocytochemie, waarbij de levensvatbaarheid en opbrengst van de hepatocyten worden bepaald met een trypaanblauw-uitsluitingstest.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen voor canulatie en digestie moeilijk aan te leren zijn. Dit komt doordat canulatie een zekere finesse vereist en het voltooid zijn van de digestie moeilijk te identificeren kan zijn. Voor personen die nieuw zijn aan deze techniek, zal Natalie Lun, een technicus uit mijn laboratorium, de procedure demonstreren.In deze demonstratie gebruiken we een stuk schapenlever

isolation-human-hepatocytes-two-step-collagenase-perfusion

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De studie van de lever sinusoïdale endotheelcellen (SEC) moeten worden uitgevoerd met primaire cellen afkomstig van het dier als geen cel-lijnen bestaan. Deze methode is gebaseerd op de lever spijsvertering en differentiële centrifugatie voor SEC zuivering voor latere kweken en experimenteren.

In vivo Lever endocytose gevolgd door zuivering van levercellen door leverperfusie

Er wordt een techniek beschreven om menselijke hepatocyten en niet-parenchymale levercellen van dezelfde donor te isoleren. De verschillende leverceltypen vormen de basis voor functionele levermodellen en weefselengineering. Deze nieuwe methode streeft ernaar om levercellen met een hoge opbrengst en levensvatbaarheid te isoleren.

Protocol voor isolatie van primaire menselijke hepatocyten en Overeenkomstige Major Populaties van niet-parenchymale Liver Cells

Het doel van dit protocol is te verkrijgen van hoge levensvatbaarheid en hoog rendement van hepatocyten en sinusoïdale endotheliale cellen van lever. Dit wordt bereikt door zoogdierlevercellen de lever met een type IV collagenase oplossing via de portal ader, gevolgd door differentiële centrifugeren hepatocyten en sinusoïdale endotheliale cellen te verkrijgen.

Zuivering van hepatocyten en sinusvormige endotheliale cellen van lever muis perfusie

Dit is een protocol om weefsel extracellulaire blaasjes (EVs) te isoleren van de lever. Het protocol beschrijft een proces in twee stappen waarbij Collagenase perfusie gevolgd door differentiële ultracentrifugatie om leverweefsel EVs te isoleren.

Isolatie van weefsel extracellulaire vesicles uit de lever

Hier gepresenteerd is een protocol voor de isolatie van muizen hepatocyten van volwassen muis levers met behulp van een gemodificeerde Collagenase perfusie techniek. Ook beschreven is de lange termijn cultuur van hepatocyten in een 3D collageen sandwich setting evenals immunolabeling van de cytoskelet componenten om gal canaliculaire vorming en de respons op de behandeling te bestuderen.

Isolatie en 3D collageen sandwich cultuur van primaire muis hepatocyten te bestuderen van de rol van Cytoskeleton in Gal Canalicular vorming in vitro

Dit protocol beschrijft het gebruik van een speciale intraveneuze katheter, gestandaardiseerde steriele wegwerpslangen, temperatuurregeling aangevuld met real-time monitoring en een alarmsysteem voor tweestaps collagenaseperfusieprocedure om de consistentie in de levensvatbaarheid, opbrengst en functionaliteit van geïsoleerde primaire rathepatocyten te verbeteren.

Isolatie van primaire rattenhepatocyten met multiparameterperfusiecontrole

Vetzuur β-oxidatie is een essentiële metabole route die verantwoordelijk is voor het genereren van energie in veel verschillende celtypen, waaronder hepatocyten. Hier beschrijven we een methode om vetzuur β-oxidatie te meten in vers geïsoleerde primaire hepatocyten met behulp van 14C-gelabeld palmitinezuur.

Meting van vetzuur β-oxidatie in een suspensie van vers geïsoleerde muizenhepatocyten

Hier schetsen en demonstreren we een protocol voor primaire muis lever sinusoïdale endotheelcel (LSEC) isolatie. Het protocol is gebaseerd op levercollageaseperfusie, niet-parenchymale celzuivering door centrifugeren met lage snelheid en CD146 magnetische kraalselectie. We fenotyperen en karakteriseren deze geïsoleerde LSEC's ook met behulp van flowcytometrie en scanning elektronenmicroscopie.

Isolatie en karakterisering van primaire leverbijholteelcellen van muizen

Met lipiden beladen hepatocyten zijn inherent aan leverregeneratie, maar gaan meestal verloren bij centrifugatie van dichtheidsgradiënt. Hier presenteren we een geoptimaliseerd celisolatieprotocol dat steatotische hepatocyten behoudt, wat representatieve populaties van regenererende hepatocyten oplevert na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen.

Isolatie van regenererende hepatocyten na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen

Dit protocol presenteert een geoptimaliseerde tweestaps collagenase-leverperfusietechniek in een rattenmodel en toont het gebruik van geïsoleerde hepatocyten voor in vitro langdurige kweek van 3D-organoïden.

Perfusie van rattenlever en isolatie van primaire hepatocyten: een oude procedure die cruciaal is voor geavanceerde 3D-organoïdencultuur

Leer humane hepatocyten isoleren via een twee-staps collageenase-perfusieprocedure voor leveronderzoek en farmacologie. Deze methode levert levende cellen op voor toxicologische en regeneratieve studies.

Isolatie van humane hepatocyten door een twee-stap Collagenase Perfusie Procedure

Meer video's verkennen