Isolatie van humane hepatocyten door een twee-stap Collagenase Perfusie Procedure

Het algemene doel van deze procedure is om humane hepatocyten te isoleren met behulp van een twee-staps collagenase-perfusieprocedure. Dit wordt bereikt door eerst de bloedvaten in een stuk lever te canuleren met een irrigatiecanule. Hierop volgt de perfusie en digestie van het leverstuk met behulp van collagenase.

De derde stap is het verwijderen van het glisten-kapsel, waardoor de gedissocieerde levercellen vrijkomen. De laatste stap is een centrifugatie op lage snelheid om de hepatocyten te isoleren. Uiteindelijk kunnen hepatocyten worden geïdentificeerd met fasecontrastmicroscopie of door albuminekleuring middels immunocytochemie, waarbij de levensvatbaarheid en opbrengst van de hepatocyten worden bepaald met een trypaanblauw-uitsluitingstest.

Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen voor canulatie en digestie moeilijk aan te leren zijn. Dit komt doordat canulatie een zekere finesse vereist en het voltooid zijn van de digestie moeilijk te identificeren kan zijn. Voor personen die nieuw zijn aan deze techniek, zal Natalie Lun, een technicus uit mijn laboratorium, de procedure demonstreren.

In deze demonstratie gebruiken we een stuk schapenlever in plaats van een menselijk leverstuk. Stel de apparatuur voor de perfusie van het leverstuk als volgt in: stel het waterbad in op een passende temperatuur zodat de oplossingen 37 °C zijn wanneer ze het leverstuk bereiken. 41 °C is geschikt voor oplossingen één, twee en drie; voor de mantelglascondensor moet oplossing vier echter 37 °C zijn om het verlies van collagenase-activiteit te beperken. Zet kort voor de perfusie de gasregelaar aan. Verkrijg van een patholoog een leverstuk dat idealiter een grotendeels of volledig intact kapsel van Glisson heeft en slechts één snijvlak.

Plaats dit leverstuk op de Büchner-trechter die een geperforeerde filterdisk bevat; het perfusiesysteem moet nu worden geprepareerd met oplossing één met een lage stroomsnelheid. Voer gebogen irrigatiecanules met olijftips in de grotere bloedvaten aan het snijvlak van het leverstuk. Terwijl het bloed uit de lever wordt gespoeld, wordt het weefsel lichter in gebieden met een goede perfusie. Het aantal gebruikte canules varieert afhankelijk van de grootte van de lever.

In het algemeen moeten vier tot acht canules worden gebruikt voor levers met een gewicht variërend van minder dan 20 gram tot meer dan 80 gram. Kies de maat van de canule zodat deze strak en stevig past. Laat de kleinere bloedvaten open zodat de buffer uit het weefsel kan weglopen.

Verhoog nu de stroomsnelheid van de peristaltische pomp naar een waarde tussen 110 en 460 milliliter per minuut. Er is sprake van een goede perfusie als het leverstuk over de gehele gebruikte stroomsnelheid een lichtere kleur heeft. De snelheid is afhankelijk van de grootte van de lever, waarbij hogere perfusiesnelheden worden gebruikt voor grotere levers.

Over het algemeen is een gemiddelde perfusiesnelheid van 44 milliliters per minuut per canule ideaal voor een reeks verschillende levergewichten. De gekozen stroomsnelheid moet resulteren in een lichte zwelling van het leverstuk. Houd het leverstuk tijdens de perfusie vochtig door het te bedekken met een stukje gaas gedrenkt in fysiologische zoutoplossing.

Na het perfunderen van het weefsel met één liter van oplossing één, om alle resterende bloed in het leverstuk uit te spoelen, wordt de perfusievloeistof vervangen door oplossing twee en wordt er gedurende 10 minuten geperfundeerd. Schakel vervolgens de perfusievloeistof over naar oplossing drie en perfundeer met een halve liter.

Vervang nu de perfusievloeistof door oplossing vier, die collagenase bevat. Voer deze perfusie uit in een recirculerende modus gedurende 9 tot 12 minuten of totdat de lever voldoende is verteerd. Het leverweefsel moet eruitzien alsof het onder het glanzende kapsel licht uiteenvalt.

De lever moet ook zacht aanvoelen wanneer deze met de stompe zijde van een scalpel wordt aangeraakt. Het is belangrijk om het leverstuk gedurende de juiste tijd te verteren, aangezien overmatigevertering kan leiden tot een lage levensvatbaarheid van hepatocyten en onvoldoende vertering kan leiden tot een lage opbrengst van hepatocyten. Begin met het uitschakelen van de peristaltische pomp en het verwijderen van de canule uit het leverstuk.

Plaats het weefsel vervolgens in een crystallisatieschaal met 100 tot 200 milliliters oplossing. Vijf. Verwijder het glanzende kapsel voorzichtig en schud de cellen zachtjes uit. Indien er regio's zijn die niet goed geperfuseerd zijn, kan een scalpel worden gebruikt om door deze regio's te snijden om de daarin vervatte cellen vrij te maken.

Voeg indien nodig tijdens het proces meer van oplossing vijf toe, en breng het volume van oplossing vijf uiteindelijk tot 500 milliliters. Filtreer nu de celsuspensie tweemaal. Filtreer de cellen eerst door een nylon gaas van 210 micron in een conische kolf van één liter.

Filter de cellen vervolgens door een nylon gaas van 70 micron in een conische kolf van één liter. Giet twee gelijke volumes van de cellsuspensie in centrifugebuizen van 200 milliliter. Centrifugeer de gefilterde cellsuspensie vervolgens bij 72 Gs gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Suif het supernatant af en resuspendeer het celpellet voorzichtig in ongeveer 200 milliliter oplossing. Vijf. Herhaal de centrifugatie en resuspensie drie keer; resuspendeer de cellen na de laatste centrifugatie in koude bewaaroplossing voor een uiteindelijke concentratie van 2 tot 5 miljoen hepatocyten per milliliter. Een trypaanblauw-assay kan worden gebruikt om het celgetal nauwkeurig te bepalen met behulp van een hemocytometer.

Hier worden trypaanblauw-gekleurde hepatocyten uit 648 isolaties getoond. De gemiddelde levensvatbaarheid van geïsoleerde menselijke hepatocyten was 77 ± 10%. De gemiddelde opbrengst aan hepatocyten was 13 ± 11 miljoen hepatocyten per gram lever. Om de zuiverheid van de hepatocyten te bepalen, werd immunofluorescentie gebruikt; geïsoleerde hepatocyten die positief kleurden voor albumine in het groen hadden een zuiverheid van 94 ± 1%.

Immunofluorescent kleuring werd vier keer uitgevoerd met vijf herhalingen per proef. Fasecontrastmicroscopie toont de morfologische kenmerken van hepatocyten, zoals hun grote celgrootte en polygonale vorm. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe menselijke hepatocyten geïsoleerd kunnen worden met behulp van een twee-staps collagenase-perfusieprocedure.